專利名稱：西地那非單克隆抗體及用于檢測(cè)西地那非的膠體金層析試紙條的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于藥品檢驗(yàn)領(lǐng)域，涉及西地那非單克隆抗體及用于檢測(cè)西地那非的膠體金層析試紙條。
背景技術(shù)：
西地那非(Sildenafil)，又譯昔多芬，是一種研發(fā)治療心血管疾病藥物時(shí)意外發(fā)明出的治療男性勃起功能障礙藥物，一股以其商業(yè)用名Viagra(中國(guó)大陸注冊(cè)名萬(wàn)艾可， 臺(tái)灣和香港注冊(cè)名威而鋼)廣為人知。不過(guò)相對(duì)于商品名西地那非在中國(guó)的俗名“偉哥” 使用的更廣泛，影響也更大。目前，在國(guó)內(nèi)好多中成藥或保健品中非法添加西地那非以達(dá)到臨床的療效，作為患者，在長(zhǎng)期不知情的情況下服用含有西地那非的中成藥或保健品會(huì)引起嚴(yán)重的副作用。目前，檢測(cè)中成藥或保健品中是否含有偉哥成分，采用的是傳統(tǒng)的檢驗(yàn)方法，須將提取的樣品帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行分析，或是使用大型的試驗(yàn)車，這樣都很不方便，而且反應(yīng)時(shí)間長(zhǎng)，實(shí)驗(yàn)耗資較大。西地那非屬于分子量小于1000的小分子化合物，本身不具備反應(yīng)性和免疫原性， 為了實(shí)現(xiàn)西地那非的免疫檢測(cè)，不僅需要合成具備高效價(jià)的西地那非抗原，而且還需要篩選特異性強(qiáng)、敏感度高的西地那非單克隆抗體。但是目前尚沒有有關(guān)西地那非單克隆抗體的相關(guān)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的上述不足，提供一株分泌西地那非單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞系。本發(fā)明的另一目的是提供該雜交瘤分泌的西地那非單克隆抗體及其應(yīng)用。本發(fā)明的有一目的是提供一種用于檢測(cè)西地那非的膠體金層析試紙條。本發(fā)明的目的可通過(guò)如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)一株分泌西地那非單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞系，保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心 (CCTCC)，保藏號(hào)為CCTCC No. C2010123，保藏日期為2010年11月30曰。一種西地那非單克隆抗體，由保藏號(hào)為CCTCC No. C2010123的雜交瘤細(xì)胞系產(chǎn)生。本發(fā)明利用人工合成抗原N-乙酸西地那非-BSA為免疫原，經(jīng)過(guò)Balb/c小白鼠皮下免疫，加強(qiáng)免疫后取小白鼠的脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞做細(xì)胞融合、篩選及克隆化，建立了穩(wěn)定分泌西地那非單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株CCTCC No. C2010123。經(jīng)ELISA、Western Blot、 膠體金免疫層析方法的鑒定，該雜交瘤細(xì)胞株所分泌的單克隆抗體能特異識(shí)別西地那非。本發(fā)明所述的西地那非單克隆抗體在制備西地那非膠體金檢測(cè)試劑中的應(yīng)用。所述的西地那非檢測(cè)試劑為西地那非檢測(cè)用膠體金層析試紙條。一種用于檢測(cè)西地那非的膠體金層析試紙條，包含襯板和在襯板上依次銜接的樣品墊、金標(biāo)結(jié)合墊、包被膜和吸水墊組成，金標(biāo)結(jié)合墊為吸附西地那非金標(biāo)抗體的聚酯纖維
4氈，在包被膜上有N-乙酸西地那非-BSA抗原溶液包被的直線式檢測(cè)線T線，和用羊抗鼠 IgG溶液包被的直線式對(duì)照線C線，兩條線豎向平行排列，所述的西地那非金標(biāo)抗體是本發(fā)明所述的西地那非單克隆抗體的膠體金標(biāo)記物。所述的西地那非抗原為西地那非人工合成抗原。所述的西地那非人工合成抗原為
權(quán)利要求
1.一株分泌西地那非單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株2H5B12C3，保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號(hào)為CCTCC NO :C2010123o
2.一種西地那非單克隆抗體，其特征在于由權(quán)利要求1所述的保藏號(hào)為CCTCCN0 C2010123的雜交瘤細(xì)胞株產(chǎn)生。
3.權(quán)利要求2所述的西地那非單克隆抗體在制備西地那非檢測(cè)試劑中的應(yīng)用。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于所述的西地那非檢測(cè)試劑為西地那非檢測(cè)用膠體金層析試紙條。
5.一種用于檢測(cè)西地那非的膠體金層析試紙條，包含襯板(7)和在襯板(7)上依次銜接的樣品墊(1)、金標(biāo)結(jié)合墊O)、包被膜(3)和吸水墊(6)組成，金標(biāo)結(jié)合墊(2)為吸附西地那非單克隆抗體膠體金標(biāo)記物和鼠IgG單克隆抗體膠體金標(biāo)記物的聚酯纖維氈，在包被膜(3)上有用西地那非抗原溶液包被直線式檢測(cè)線T線G)，和用羊抗鼠IgG溶液包被直線式對(duì)照線C線(5)，兩條線豎向平行排列，其特征在于所述的西地那非單克隆抗體膠體金標(biāo)記物是權(quán)利要求2所述的西地那非單克隆抗體的膠體金標(biāo)記物。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的用于檢測(cè)西地那非的膠體金層析試紙條，其特征在于所述的西地那非抗原為西地那非人工合成抗原。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的用于檢測(cè)西地那非的膠體金層析試紙條，其特征在于所述的西地那非人工合成抗原為
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的用于檢測(cè)西地那非的膠體金層析試紙條，其特征在于所述的載體蛋白為牛血清白蛋白、雞卵清白蛋白或人血藍(lán)蛋白，優(yōu)選牛血清白蛋白或雞卵清白蛋白，進(jìn)一步優(yōu)選牛血清白蛋白。
9.權(quán)利要求5所述的用于檢測(cè)西地那非的膠體金層析試紙條的制備方法，其特征在于包含如下步驟(1)制備式(1)所示的西地那非人工合成抗原；(2)制備西地那非單克隆抗體；(3)制備含抗西地那非單克隆抗體的膠體金標(biāo)記物和鼠IgG單克隆抗體的膠體金標(biāo)記物的混合溶液；(4)利用步驟C3)所述的含抗西地那非單克隆抗體的膠體金標(biāo)記物和鼠IgG單克隆抗體的膠體金標(biāo)記物的混合溶液制備西地那非單克隆抗體的金標(biāo)結(jié)合墊；(5)在包被膜上用所述的西地那非人工合成抗原溶液包被直線式檢測(cè)線T線，用羊抗鼠IgG溶液包被直線式對(duì)照線C線，兩條線豎向平行排列；(6)組裝試紙條。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的膠體金層析試紙條的制備方法，其特征在于a、步驟C3)所述的含抗西地那非單克隆抗體的膠體金標(biāo)記物和鼠IgG單克隆抗體的膠體金標(biāo)記物的混合溶液通過(guò)如下方法制備用檸檬酸三鈉還原劑將氯金酸還原制成 20nm-40nm的膠體金溶液；用0. lmol/LK2C03調(diào)節(jié)所述的膠體金溶液至最適pH 8. 5-9. 0，將純化的本發(fā)明西地那非單克隆抗體純水透析后，按3μ g/ml量加入膠體金溶液中，室溫電磁攪拌15-30min，然后按5μ g/ml的量加入鼠IgG單克隆抗體，室溫電磁攪拌15-30min， 逐滴加入絡(luò)蛋白溶液，使終濃度為0. 1%，持續(xù)攪拌5min，4°C下15000rpm離心lOmin， 棄去上清，將沉淀物用重懸液重新恢復(fù)至原體積混勻，再次離心一次，用重懸溶液將沉淀物混懸至原體積1/20，4°C保存?zhèn)溆?，即獲得所述的含抗西地那非單克隆抗體的膠體金標(biāo)記物和鼠IgG單克隆抗體的膠體金標(biāo)記物的混合溶液，其中所述重懸液為含5%海藻的 0. 02Tris-HCL 緩沖液；b、步驟(4)所述的制備西地那非單克隆抗體的金標(biāo)結(jié)合墊的方法為將1 20-1 10 稀釋的含抗西地那非單克隆抗體的膠體金標(biāo)記物和鼠IgG單克隆抗體的膠體金標(biāo)記物的混合溶液噴涂吸附于聚酯纖維氈中，27°C保溫干燥；c、步驟(6)所述的組裝試紙條的方法為將樣品墊、金標(biāo)組合墊、包被膜和吸水墊依次粘附在襯板上，樣品墊置于襯板的一端，吸水墊置于襯板的另一端，包被膜置于襯板的中間，金標(biāo)結(jié)合墊置于樣品墊和包被膜之間，即得到用于免疫檢測(cè)的西地那非膠體金層析檢測(cè)試驗(yàn)紙大板，將大板按顧客要求分切成2. 5mm-7. Omm寬度規(guī)格的試紙條，密封干燥保存。
全文摘要
本發(fā)明屬于藥品檢驗(yàn)領(lǐng)域，公開了西地那非單克隆抗體及用于檢測(cè)西地那非的膠體金層析試紙條。本發(fā)明西地那非單克隆抗體，由保藏號(hào)為CCTCC No.C2010123的雜交瘤細(xì)胞系產(chǎn)生。本發(fā)明所述的西地那非單克隆抗體理化特性高度均一、生物活性單一、與抗原西地那非結(jié)合的特異性強(qiáng)、便于人為處理和質(zhì)量控制，可在制備西地那非檢測(cè)用膠體金層析試紙條中應(yīng)用。一種用于檢測(cè)西地那非的膠體金層析試紙條，其金標(biāo)結(jié)合墊上包被的金標(biāo)抗體是本發(fā)明所述的西地那非單克隆抗體的膠體金標(biāo)記物。使用本發(fā)明膠體金層析檢測(cè)試紙條，無(wú)需任何其它試劑和儀器，可現(xiàn)場(chǎng)操作，將樣品用提取液混合后，取上清液進(jìn)行檢測(cè)，在5-10min即可判定檢測(cè)結(jié)果簡(jiǎn)便、快速、時(shí)效性強(qiáng)。
文檔編號(hào)C07K16/44GK102174474SQ20111000472
公開日2011年9月7日 申請(qǐng)日期2011年1月11日 優(yōu)先權(quán)日2011年1月11日
發(fā)明者吳迪宏, 歐衛(wèi)軍, 王蕾, 蔣澄 申請(qǐng)人:南通市伊士生物技術(shù)有限責(zé)任公司