專利名稱：一種用殼聚糖樹脂分離羥基脯氨酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于反應(yīng)高分子技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及分離羥基脯氨酸的方法。
背景技術(shù)：
羥基脯氨酸是膠原蛋白的特征成分，其吡咯環(huán)的游離4-羥基能清除超氧自由基 和羥基自由基，在保健、化妝品工業(yè)用作抗氧化、抗輻射、防腐和甜味添加劑，在制藥行業(yè)用 抗生素、抗腫瘤、降壓藥及新型胃藥等的合成原料，在臨床上用于治療各種軟組織疾病，如 結(jié)締組織受損、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等；在食品行業(yè)作果汁、清涼飲料、營養(yǎng)飲料等的增味劑、營養(yǎng) 強(qiáng)化劑和香味料；也用于加快傷口愈合、減肥等領(lǐng)域。目前制備羥基脯氨酸的方法，是以魚鱗、豬皮、骨膠及制革廢物等中的膠原蛋白為 原料，通過酸水解產(chǎn)生游離羥基脯氨酸和脯氨酸，再利用離子交換樹脂分離出其中的羥基 脯氨酸。例如1998年《食品科學(xué)》第10期19中施強(qiáng)的“從骨膠中提取L-羥基脯氨酸和 L-脯氨酸”一文中公開的方法，是以骨膠為原料，在常溫下用3倍于骨膠的6mol/L的鹽酸水 解骨膠為游離氨基酸，用1倍于骨膠(w/V)的亞硝酸鈉在45°C以下亞硝化骨膠水解3h，得 亞硝胺溶液，然后再用鹽酸水解亞硝胺為亞氨酸。將亞氨酸溶液用活性炭脫色，用D61[H+] 型離子交換樹脂柱交換脫色液中的亞氨酸，再以0. 2mol/L的氯化銨洗脫，分別濃縮結(jié)晶， 獲得L-HP(即羥基脯氨酸)和L-P(即脯氨酸)粗品；將粗品精制后在酒精中重結(jié)晶，即得 L-HP成品和L-P成品。該方法的主要缺點(diǎn)是大量使用致癌的亞硝酸鈉，產(chǎn)生的一氧化氮 及廢水中的亞硝酸鈉既污染環(huán)境，殘留于氨基酸中的亞硝酸鈉還存在致癌的風(fēng)險(xiǎn)；由于使 用離子交換樹脂分離，其它氨基酸與羥基脯氨酸均帶相同電荷，分離效率低，需多種樹脂柱 串聯(lián)才能得到合格產(chǎn)品，生產(chǎn)成本高，不適宜規(guī)?；I(yè)生產(chǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有制備羥基脯氨酸方法的不足，提供一種殼聚糖樹脂分離 羥基脯氨酸的方法，具有工藝簡單，節(jié)約能源，無有害物質(zhì)排放污染環(huán)境，資源綜合利用率 高，回收活性炭及乙醇可再利用，產(chǎn)品純度高等特點(diǎn)。本發(fā)明的機(jī)理是戊二醛交聯(lián)殼聚糖樹脂中殘存的游離氨基，在二環(huán)己基碳二亞 胺(DCC)催化下，能與游離羥基脯氨酸的羧基反應(yīng)，脫水生成肽鍵，從而制備出羥基脯氨酸 修飾殼聚糖樹脂。該殼聚糖樹脂以羥基脯氨酸的吡咯環(huán)為吸附分離官能團(tuán)，該環(huán)為平面結(jié) 構(gòu)，環(huán)上電子云分布均勻化，形成共平面的5原子疏水域，能與有相同結(jié)構(gòu)的吡咯環(huán)化合物 形成最有效的疏水相互作用。蛋白質(zhì)由20種氨基酸組成，僅脯氨酸和羥基脯氨酸含吡咯 環(huán)，當(dāng)該氨基酸與羥基脯氨酸修飾殼聚糖樹脂的吡咯環(huán)'臨近'，即發(fā)生基于吡咯環(huán)平面 的疏水相互作用。其它氨基酸沒有吡咯環(huán)或與該結(jié)構(gòu)差異較大，不能或只能部分與吡咯環(huán) 形成疏水相互作用，作用力較小，可被隨后擴(kuò)散而至的吡咯氨基酸取代，因此，利用羥基脯 氨酸修飾的殼聚糖樹脂可實(shí)現(xiàn)吡咯氨基酸與其它氨基酸的親和分離。本發(fā)明按上述原理制 備出羥基脯氨酸修飾的殼聚糖樹脂，并以該樹脂吸附蛋白質(zhì)水解液中的羥基脯氨酸，再經(jīng)過洗脫、濃縮及凍干，就獲得分離純化的羥基脯氨酸產(chǎn)品。本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的一種用殼聚糖樹脂制備羥基脯氨酸的方法以殼聚 糖和明膠為原料，先制備殼聚糖樹脂，再制備膠原蛋白水解溶液，然后經(jīng)吸附、洗脫及凍干 而得成品。其具體的方法步驟如下(1)制備殼聚糖樹脂①備料按殼聚糖戊二醛羥基脯氨酸碳酸鈣的質(zhì)量百分比為42 44% 20 22% 34 36%: 1 2%的比例備料，備用。②制備交聯(lián)殼聚糖微球第(1)-①步完成后，先將殼聚糖溶于稀鹽酸溶液中，配制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1 2 %的 殼聚糖溶液。后在攪拌條件下，將殼聚糖溶液分散在等體積的液體石蠟中，繼續(xù)攪拌20 30min，再在攪拌條件下，升溫至40 50°C ；并加入戊二醛交聯(lián)劑和致孔劑碳酸鈣粉末，進(jìn) 行交聯(lián)反應(yīng)60 80min ；然后用稀氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)體系pH至9 10，并在溫度為60 70°C下，繼續(xù)攪拌反應(yīng)2. 5 3. 5h ；最后抽濾，分別收集濾渣，棄濾液。對(duì)濾渣用60 80°C 的蒸餾水洗滌除去液體石蠟，再用稀鹽酸溶解濾渣中的碳酸鈣，然后用蒸餾水、95%乙醇反 復(fù)洗滌至中性，就制備出交聯(lián)殼聚糖微球。收集洗滌液，經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀回收乙醇，再利用。③制備殼聚糖樹脂第(1)-②步完成后，先將(1)-①步備好的34 36%羥基脯氨酸，溶解于乙醇 濃度為50 %的乙醇溶液中，再加入第(1)-②步制備出的交聯(lián)殼聚糖微球，攪拌吸附50 70min;再加入經(jīng)乙醇濃度為70%的乙醇溶液，溶解二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)的溶液，配制 成DCC的摩爾數(shù)為羥基脯氨酸摩爾數(shù)的1 2倍的溶液，然后用稀氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)體系 的pH值為5 7的條件下，反應(yīng)8 12min。最后對(duì)反應(yīng)液進(jìn)行抽濾，收集濾渣，棄濾液。 對(duì)濾渣，先用95%乙醇洗滌除去二環(huán)己基碳二亞胺分解產(chǎn)物異脲，再在60 80°C下進(jìn)行干 燥8 12h，就制備出殼聚糖樹脂(即為羥基脯氨酸修飾的殼聚糖樹脂)。收集洗滌濾渣的 洗滌液，經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀回收乙醇，再利用。(2)制備膠原蛋白水解溶液第(1)步完成后，以明膠為蛋白質(zhì)原料，按明膠(g)鹽酸濃度為6mol/L的鹽酸 溶液(L)的重量-體積之比為1 4. 5 5. 5的比例，先將明膠置于搪瓷反應(yīng)釜中，在攪拌 下加入鹽酸溶液，連接好回流裝置后，密閉，先升溫至110 120°C回流水解19 21h ；后冷 卻至70 80°C，再加入明膠質(zhì)量19 21%的活性炭，攪拌脫色25 35min，然后進(jìn)行真 空過濾，分別收集濾渣和濾液。對(duì)于濾渣，送活性炭再生工廠，進(jìn)行再生后，利用；對(duì)于濾液 (即為膠原蛋白水解物)，用稀氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)其PH值為2 4，并用去離子水稀釋至濾 液中的羥基脯氨酸的濃度為2 6mg/mL的膠原蛋白水解溶液。本步驟采用的蛋白質(zhì)原料， 為所述的明膠外，還用其他蛋白質(zhì)(如骨膠或皮毛或廢棄革制品等)。(3)殼聚糖樹脂吸附羥基脯氨酸第(2)步完成后，將第(1)步制備出的殼聚糖樹脂放置于玻璃層析柱中，先用去離 子水反沖洗，排出殼聚糖樹脂柱中的氣泡，然后以流速為2 6倍樹脂柱體積/小時(shí)(BV/ h)，泵入第(2)步制備出的膠原蛋白水解溶液，過柱，進(jìn)行殼聚糖樹脂吸附羥基脯氨酸，直 至過柱液中羥基脯氨酸的濃度為0. lmg/mL時(shí)止。然后用1倍樹脂柱體積的去離子水洗滌殼聚糖樹脂柱，最后分別收集吸附有羥基脯氨酸的殼聚糖樹脂和過柱液。對(duì)過柱液，用于制 備調(diào)味用水解動(dòng)物蛋白。(4)制備羥基脯氨酸凍干粉第(3)步完成后，對(duì)第(3)步收集的吸附有羥基脯氨酸的殼聚糖樹脂，泵入pH值 為8 10、乙醇濃度為70 80%的乙醇溶液，以2 4倍樹脂柱體積/小時(shí)的流速進(jìn)行洗 脫，分別收集第1 2倍樹脂柱體積的洗脫液和第2 4. 5倍樹脂柱體積的洗脫液(前者含 脯氨酸，后者含羥基脯氨酸)，直至流出的洗脫液中無羥基脯氨酸為止。將卸載羥基脯氨酸 的殼聚糖樹脂柱，用去離子水沖洗后，可再次用于吸附羥基脯氨酸；對(duì)于分別含羥基脯氨酸 和脯氨酸的洗脫流出液，分別泵入真空濃縮裝置中，控制真空度為-0. 6 -0. 9MPa,在75 90°C下濃縮，直至濃縮液波美度達(dá)到15Be時(shí)止，就獲得分別含羥基脯氨酸和脯氨酸的濃縮 液。將含羥基脯氨酸和脯氨酸的濃縮液分別放入冷凍干燥機(jī)中，在溫度為-50 -60°C，真 空度為25 50Pa條件下，干燥24 30h，就制備出羥基脯氨酸的凍干粉，并且得到了副產(chǎn) 品脯氨酸凍干粉。收得率是純度為95. 3 98%的羥基脯氨酸凍干粉。本發(fā)明采用上述技術(shù)方案后，主要有以下效果(1)本發(fā)明依據(jù)吡咯環(huán)與吡咯環(huán)之間的特異疏水相互作用，直接從膠原蛋白水 解溶液中吸附羥基脯氨酸，再經(jīng)過洗脫，濃縮和干燥的簡單工藝，就獲得了純度為95. 3 98%的羥基脯氨酸凍干粉。(2)本發(fā)明省去使用多種離子交換樹脂及其再生活化產(chǎn)生的大量廢水及工時(shí)，工 藝簡單、有利于環(huán)保，生產(chǎn)成本低。(3)本發(fā)明在溫和的條件下進(jìn)行，生產(chǎn)設(shè)備簡單，耗能低?？赏茝V至其它蛋白質(zhì)原 料中含羥基脯氨酸的分離，從而進(jìn)一步降低生產(chǎn)成本，便于推廣應(yīng)用。(4)本發(fā)明產(chǎn)生過程中的膠原蛋白過柱溶液，可用于制造調(diào)味用水解動(dòng)物蛋白，副 產(chǎn)品脯氨酸凍干粉，可用于食品行業(yè)中作增味劑等，從而實(shí)現(xiàn)了原料的充分利用。(5)本發(fā)明制備的殼聚糖樹脂吸附羥基脯氨酸后，可重復(fù)多次使用，再生效果好。 吸附色素的廢活性炭經(jīng)再生后可再次用于脫色，用于洗脫殼聚糖樹脂的廢乙醇可回收再利 用。因此本發(fā)明無“三廢”排放，環(huán)境友好，是高效率、低消耗、低成本的綠色環(huán)保分離方法。采用本發(fā)明方法制備出的產(chǎn)品，可廣泛應(yīng)用于保健、化妝品行業(yè)中作抗氧化、抗 輻射的添加劑等；食品行業(yè)中作增味劑、營養(yǎng)強(qiáng)化劑和香味料；制藥行業(yè)中作抗生素、抗腫 瘤、降壓藥等的合成原料等；在加快傷口愈合、減肥等領(lǐng)域也有著很廣泛的用途。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施方式
進(jìn)一步說明本發(fā)明。實(shí)施例1一種用殼聚糖樹脂分離羥基脯氨酸的方法，其具體的方法步驟如下(1)制備殼聚糖樹脂①備料按殼聚糖戊二醛羥基脯氨酸碳酸鈣的質(zhì)量百分比為 42% 20% 34 的比例備料，備用。②制備交聯(lián)殼聚糖微球
第(1)-①步完成后，先將殼聚糖溶于稀鹽酸溶液中，配制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為的殼 聚糖溶液。后在攪拌條件下，將殼聚糖溶液分散在等體積的液體石蠟中，繼續(xù)攪拌20min， 再在攪拌條件下，升溫至40°C ；并加入戊二醛交聯(lián)劑和致孔劑碳酸鈣粉末，進(jìn)行交聯(lián)反應(yīng) 60min ；然后用稀氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)體系pH至9，并在溫度為60°C下，繼續(xù)攪拌反應(yīng)2. 5h ； 最后抽濾，分別收集濾渣，棄濾液。對(duì)濾渣用60°C的蒸餾水洗滌除去液體石蠟，再用稀鹽 酸溶解濾渣中的碳酸鈣，然后用蒸餾水、95%乙醇反復(fù)洗滌至中性，就制備出交聯(lián)殼聚糖微 球。收集洗滌液，經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀回收乙醇，再利用。③制備殼聚糖樹脂第(1)-②步完成后，先將(1)-①步備好的34%羥基脯氨酸，溶解于乙醇濃度為 50%的乙醇溶液中，再加入第(1)-②步制備出的交聯(lián)殼聚糖微球，攪拌吸附50min ；再加入 經(jīng)乙醇濃度為70%的乙醇溶液，溶解二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)的溶液，配制成DCC的摩爾數(shù) 為羥基脯氨酸摩爾數(shù)的1 2倍的溶液，然后用稀氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)體系的pH值為5的條 件下，反應(yīng)8min。最后對(duì)反應(yīng)液進(jìn)行抽濾，收集濾渣，棄濾液。對(duì)濾渣，先用95%乙醇洗滌 除去二環(huán)己基碳二亞胺分解產(chǎn)物異脲，再在60°C下進(jìn)行干燥8h，就制備出殼聚糖樹脂(即 為羥基脯氨酸修飾的殼聚糖樹脂)。收集洗滌濾渣的洗滌液，經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀回收乙醇，再利 用。(2)制備膠原蛋白水解溶液第(1)步完成后，以明膠為蛋白質(zhì)原料，按明膠(g)鹽酸濃度為6mol/L的鹽酸 溶液(L)的重量-體積之比為1 4. 5的比例，先將明膠置于搪瓷反應(yīng)釜中，在攪拌下加入 鹽酸溶液，連接好回流裝置后，密閉，先升溫至110°C回流水解19h ；后冷卻至70°C，再加入 明膠質(zhì)量19%的活性炭，攪拌脫色25min，然后進(jìn)行真空過濾，分別收集濾漁和濾液。對(duì)于 濾渣，送活性炭再生工廠，進(jìn)行再生后，利用；對(duì)于濾液(即為膠原蛋白水解物)，用稀氫氧 化鈉溶液調(diào)節(jié)其pH值為2，并用去離子水稀釋至濾液中的羥基脯氨酸的濃度為2mg/mL的膠 原蛋白水解溶液。本步驟采用的蛋白質(zhì)原料，為所述的明膠外，還用其他蛋白質(zhì)(如骨膠或 皮毛或廢棄革制品等)。(3)殼聚糖樹脂吸附羥基脯氨酸第(2)步完成后，將第(1)步制備出的殼聚糖樹脂放置于玻璃層析柱中，先用去離 子水反沖洗，排出殼聚糖樹脂柱中的氣泡，然后以流速為2倍樹脂柱體積/小時(shí)(BV/h)，泵 入第(2)步制備出的膠原蛋白水解溶液，過柱，進(jìn)行殼聚糖樹脂吸附羥基脯氨酸，直至過柱 液中羥基脯氨酸的濃度為0. lmg/mL時(shí)止。然后用1倍樹脂柱體積的去離子水洗滌殼聚糖 樹脂柱，最后分別收集吸附有羥基脯氨酸的殼聚糖樹脂和過柱液。對(duì)過柱液，用于制備調(diào)味 用水解動(dòng)物蛋白。(4)制備羥基脯氨酸凍干粉第(3)步完成后，對(duì)第(3)步收集的吸附有羥基脯氨酸的殼聚糖樹脂，泵入pH值 為8、乙醇濃度為70%的乙醇溶液，以2倍樹脂柱體積/小時(shí)的流速進(jìn)行洗脫，分別收集第 1倍樹脂柱體積的洗脫液和第2倍樹脂柱體積的洗脫液(前者含脯氨酸，后者含羥基脯氨 酸)，直至流出的洗脫液中無羥基脯氨酸為止。將卸載羥基脯氨酸的殼聚糖樹脂柱，用去離 子水沖洗后，可再次用于吸附羥基脯氨酸；對(duì)于分別含羥基脯氨酸和脯氨酸的洗脫流出液， 分別泵入真空濃縮裝置中，控制真空度為-0. 6MPa，在75°C下濃縮，直至濃縮液波美度達(dá)到
815Be°時(shí)止，就獲得分別含羥基脯氨酸和脯氨酸的濃縮液。將含羥基脯氨酸和脯氨酸的濃 縮液分別放入冷凍干燥機(jī)中，在溫度為-50°C，真空度為25Pa條件下，干燥24h，就制備出羥 基脯氨酸的凍干粉，并且得到了副產(chǎn)品脯氨酸凍干粉。收得率是純度為95. 3%的羥基脯氨 酸凍干粉。實(shí)施例2一種用殼聚糖樹脂分離羥基脯氨酸的方法的具體步驟，同實(shí)施例1，其中第(1)-①步中，按殼聚糖戊二醛羥基脯氨酸碳酸鈣的質(zhì)量百分比為 43% 21% 35% 1.5%的比例。第(1)-②步中，配制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.5%的殼聚糖溶液。繼續(xù)攪拌25min，升溫至 45°C;進(jìn)行交聯(lián)反應(yīng)70min ；然后用稀氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)體系pH至9. 5，并在溫度為65°C下， 繼續(xù)攪拌反應(yīng)3h。對(duì)濾渣用70°C的蒸餾水洗滌除去液體石蠟。第(1)-③步中，先將(1)-①步備好的35%羥基脯氨酸，溶解于乙醇濃度為50% 的乙醇溶液中。攪拌吸附60min ；配制成DCC的摩爾數(shù)為羥基脯氨酸摩爾數(shù)的1. 5倍的溶 液，然后用稀氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)體系的PH值為6的條件下，反應(yīng)lOmin。再在70°C下進(jìn)行 干燥10h。第⑵步中，按明膠(g)鹽酸濃度為6mol/L的鹽酸溶液(L)的重量-體積之比 為1 5的比例，先升溫至115°C回流水解20h ；后冷卻至75°C，再加入明膠質(zhì)量20%的活 性炭，攪拌脫色30min。對(duì)于濾液，用稀氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)其pH值為3，并用去離子水稀釋 至濾液中的羥基脯氨酸的濃度為4mg/mL的膠原蛋白水解溶液。第(3)步中，以流速為4倍樹脂柱體積/小時(shí)(BV/h)。第⑷步中，泵入pH值為9、乙醇濃度為75%的乙醇溶液，以3倍樹脂柱體積/小 時(shí)的流速進(jìn)行洗脫，分別收集第1. 5倍樹脂柱體積的洗脫液和第3倍樹脂柱體積的洗脫液。 控制真空度為-0. 7MPa，在80°C下濃縮。在溫度為_55°C，真空度為35Pa條件下，干燥27h。 收得率是純度為96. 5%的羥基脯氨酸凍干粉。實(shí)施例3一種用殼聚糖樹脂分離羥基脯氨酸的方法的具體步驟，同實(shí)施例1，其中第(1)-①步中，按殼聚糖戊二醛羥基脯氨酸碳酸鈣的質(zhì)量百分比為 44% 22% 36% 2%的比例。第(1)-②步中，配制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的殼聚糖溶液。繼續(xù)攪拌30min，升溫至 50°C;進(jìn)行交聯(lián)反應(yīng)80min ；然后用稀氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)體系pH至10，并在溫度為70°C下， 繼續(xù)攪拌反應(yīng)3. 5h。第(1)-③步中，先將(1)-①步備好的36%羥基脯氨酸，溶解于乙醇濃度為50% 的乙醇溶液中，攪拌吸附70min ；配制成DCC的摩爾數(shù)為羥基脯氨酸摩爾數(shù)的2倍的溶液， 然后用稀氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)體系的pH值為7的條件下，反應(yīng)12min。再在80°C下進(jìn)行干燥 12h。第⑵步中，按明膠(g)鹽酸濃度為6mol/L的鹽酸溶液(L)的重量-體積之比 為1 5. 5的比例，先升溫至120°C回流水解21h;后冷卻至80°C，再加入明膠質(zhì)量21%的 活性炭，攪拌脫色35min。對(duì)于濾液，用稀氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)其pH值為4，并用去離子水稀 釋至濾液中的羥基脯氨酸的濃度為6mg/mL的膠原蛋白水解溶液。
第(3)步中，以流速為6倍樹脂柱體積/小時(shí)(BV/h)。第⑷步中，泵入pH值為10、乙醇濃度為80%的乙醇溶液，以4倍樹脂柱體積/小時(shí)的流速進(jìn)行洗脫，分別收集第2倍樹脂柱體積的洗脫液和第4. 5倍樹脂柱體積的洗脫 液?？刂普婵斩葹開0.9MPa，在90°C下濃縮。在溫度為_60°C，真空度為50Pa條件下，干燥 30h。收得率是純度為98%的羥基脯氨酸凍干粉。
權(quán)利要求
一種用殼聚糖樹脂分離羥基脯氨酸的方法，其特征在于其具體的方法步驟如下(1)制備殼聚糖樹脂①備料按殼聚糖∶戊二醛∶羥基脯氨酸∶碳酸鈣的質(zhì)量百分比為42～44％∶20～22％∶34～36％∶1～2％的比例備料；②制備交聯(lián)殼聚糖微球第(1)-①步完成后，先將殼聚糖溶于稀鹽酸溶液中，配制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1～2％的殼聚糖溶液，后在攪拌條件下，將殼聚糖溶液分散在等體積的液體石蠟中，繼續(xù)攪拌20～30min，再在攪拌條件下，升溫至40～50℃；并加入戊二醛交聯(lián)劑和致孔劑碳酸鈣粉末，進(jìn)行交聯(lián)反應(yīng)60～80min；然后用稀氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)體系pH至9～10，并在溫度為60～70℃下，繼續(xù)攪拌反應(yīng)2.5～3.5h；最后抽濾，分別收集濾渣，棄濾液，對(duì)濾渣用60～80℃的蒸餾水洗滌除去液體石蠟，再用稀鹽酸溶解濾渣中的碳酸鈣，然后用蒸餾水、95％乙醇反復(fù)洗滌至中性，收集洗滌液，經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀回收乙醇；③制備殼聚糖樹脂第(1)-②步完成后，先將(1)-①步備好的34～36％羥基脯氨酸，溶解于乙醇濃度為50％的乙醇溶液中，再加入第(1)-②步制備出的交聯(lián)殼聚糖微球，攪拌吸附50～70min；再加入經(jīng)乙醇濃度為70％的乙醇溶液，溶解二環(huán)己基碳二亞胺的溶液，配制成DCC的摩爾數(shù)為羥基脯氨酸摩爾數(shù)的1～2倍的溶液，然后用稀氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)體系的pH值為5～7的條件下，反應(yīng)8～12min，最后對(duì)反應(yīng)液進(jìn)行抽濾，收集濾渣，棄濾液，對(duì)濾渣，先用95％乙醇洗滌除去二環(huán)己基碳二亞胺分解產(chǎn)物異脲，再在60～80℃下進(jìn)行干燥8～12h，收集洗滌濾渣的洗滌液，經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀回收乙醇；(2)制備膠原蛋白水解溶液第(1)步完成后，以明膠為蛋白質(zhì)原料，按明膠∶鹽酸濃度為6mol/L的鹽酸溶液的重量-體積之比為1∶4.5～5.5的比例，先將明膠置于搪瓷反應(yīng)釜中，在攪拌下加入鹽酸溶液，連接好回流裝置后，密閉，先升溫至110～120℃回流水解19～21h；后冷卻至70～80℃，再加入明膠質(zhì)量19～21％的活性炭，攪拌脫色25～35min，然后進(jìn)行真空過濾，分別收集濾渣和濾液，對(duì)于濾渣，送活性炭再生工廠進(jìn)行再生；對(duì)于濾液，用稀氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)其pH值為2～4，并用去離子水稀釋至濾液中的羥基脯氨酸的濃度為2～6mg/mL的膠原蛋白水解溶液；(3)殼聚糖樹脂吸附羥基脯氨酸第(2)步完成后，將第(1)步制備出的殼聚糖樹脂放置于玻璃層析柱中，先用去離子水反沖洗，排出殼聚糖樹脂柱中的氣泡，然后以流速為2～6倍樹脂柱體積/小時(shí)，泵入第(2)步制備出的膠原蛋白水解溶液，過柱，進(jìn)行殼聚糖樹脂吸附羥基脯氨酸，直至過柱液中羥基脯氨酸的濃度為0.1mg/mL時(shí)止，然后用1倍樹脂柱體積的去離子水洗滌殼聚糖樹脂柱，最后分別收集吸附有羥基脯氨酸的殼聚糖樹脂和過柱液；(4)制備羥基脯氨酸凍干粉第(3)步完成后，對(duì)第(3)步收集的吸附有羥基脯氨酸的殼聚糖樹脂，泵入pH值為8～10、乙醇濃度為70～80％的乙醇溶液，以2～4倍樹脂柱體積/小時(shí)的流速進(jìn)行洗脫，分別收集第1～2倍樹脂柱體積的洗脫液和第2～4.5倍樹脂柱體積的洗脫液，直至流出的洗脫液中無羥基脯氨酸為止，將卸載羥基脯氨酸的殼聚糖樹脂柱，用去離子水沖洗后，可再次用于吸附羥基脯氨酸；對(duì)于分別含羥基脯氨酸和脯氨酸的洗脫流出液，分別泵入真空濃縮裝置中，控制真空度為-0.6～-0.9MPa，在75～90℃下濃縮，直至濃縮液波美度達(dá)到15Be°時(shí)止，將含羥基脯氨酸和脯氨酸的濃縮液分別放入冷凍干燥機(jī)中，在溫度為-50～-60℃，真空度為25～50Pa條件下，干燥24～30h，收得率是純度為95.3～98％的羥基脯氨酸凍干粉。
2.按照權(quán)利要求1所述的一種用殼聚糖樹脂分離羥基脯氨酸的方法，其特征在于具體 步驟中第(1)-①步中，按殼聚糖戊二醛羥基脯氨酸碳酸鈣的質(zhì)量百分比為 42% 20% 34% 的比例；第(1)-②步中，配制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為的殼聚糖溶液，繼續(xù)攪拌20min，升溫至40°C ； 進(jìn)行交聯(lián)反應(yīng)60min ；然后用稀氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)體系pH至9，并在溫度為60°C下，繼續(xù)攪 拌反應(yīng)2. 5h ；對(duì)濾渣用60°C的蒸餾水洗滌除去液體石蠟；第(1)-③步中，先將(1)-①步備好的34%羥基脯氨酸，溶解于乙醇濃度為50%的乙 醇溶液中，攪拌吸附50min ；配制成DCC的摩爾數(shù)為羥基脯氨酸摩爾數(shù)的1倍的溶液，然后 用稀氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)體系的PH值為5的條件下，反應(yīng)8min，再在60°C下進(jìn)行干燥8h ；第(2)步中，按明膠鹽酸濃度為6mol/L的鹽酸溶液的重量-體積之比為1 4. 5的 比例，先升溫至1IO0C回流水解19h ；后冷卻至70°C，再加入明膠質(zhì)量19%的活性炭，攪拌脫 色30min，對(duì)于濾液，用稀氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)其pH值為2，并用去離子水稀釋至濾液中的羥 基脯氨酸的濃度為2mg/mL的膠原蛋白水解溶液； 第(3)步中，以流速為2倍樹脂柱體積/小時(shí)；第(4)步中，泵入pH值為8、乙醇濃度為70%的乙醇溶液，以2倍樹脂柱體積/小時(shí)的 流速進(jìn)行洗脫，分別收集第1倍樹脂柱體積的洗脫液和第2倍樹脂柱體積的洗脫液，控制真 空度為-0. 6MPa，在80°C下濃縮，在溫度為_50°C，真空度為25Pa條件下，干燥24h，收得率 是純度為95. 3%的羥基脯氨酸凍干粉。
3.按照權(quán)利要求1所述的一種用殼聚糖樹脂分離羥基脯氨酸的方法，其特征在于具體 步驟中第(1)-①步中，按殼聚糖戊二醛羥基脯氨酸碳酸鈣的質(zhì)量百分比為 43% 21% 35% 1.5%的比例；第(1)-②步中，配制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1. 5%的殼聚糖溶液，繼續(xù)攪拌25min，升溫至45°C ； 進(jìn)行交聯(lián)反應(yīng)70min ；然后用稀氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)體系pH至9. 5，并在溫度為65°C下，繼續(xù) 攪拌反應(yīng)3h ；對(duì)濾渣用70°C的蒸餾水洗滌除去液體石蠟；第(1)-③步中，先將(1)-①步備好的35%羥基脯氨酸，溶解于乙醇濃度為50%的 乙醇溶液中，攪拌吸附60min ；配制成DCC的摩爾數(shù)為羥基脯氨酸摩爾數(shù)的1. 5倍的溶液， 然后用稀氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)體系的PH值為6的條件下，反應(yīng)lOmin，再在70°C下進(jìn)行干燥 IOh ；第(2)步中，按明膠鹽酸濃度為6mol/L的鹽酸溶液的重量-體積之比為1 5的比 例，先升溫至115°C回流水解20h ；后冷卻至75°C，再加入明膠質(zhì)量20%的活性炭，攪拌脫色 30min，對(duì)于濾液，用稀氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)其pH值為3，并用去離子水稀釋至濾液中的羥基脯氨酸的濃度為4mg/mL的膠原蛋白水解溶液； 第(3)步中，以流速為4倍樹脂柱體積/小時(shí)；第(4)步中，泵入pH值為9、乙醇濃度為75%的乙醇溶液，以3倍樹脂柱體積/小時(shí)的 流速進(jìn)行洗脫，分別收集第1. 5倍樹脂柱體積的洗脫液和第3倍樹脂柱體積的洗脫液，控制 真空度為-0. 7MPa，在80°C下濃縮，在溫度為_55°C，真空度為35Pa條件下，干燥27h，收得 率是純度為96. 5%的羥基脯氨酸凍干粉。
4.按照權(quán)利要求1所述的一種用殼聚糖樹脂分離羥基脯氨酸的方法，其特征在于具體 步驟中第(1)-①步中，按殼聚糖戊二醛羥基脯氨酸碳酸鈣的質(zhì)量百分比為 44% 22% 36% 2%的比例；第(1)-②步中，配制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的殼聚糖溶液，繼續(xù)攪拌30min，升溫至50°C ； 進(jìn)行交聯(lián)反應(yīng)SOmin ；然后用稀氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)體系pH至10，并在溫度為70°C下，繼續(xù) 攪拌反應(yīng)3. 5h ；對(duì)濾渣用80°C的蒸餾水洗滌除去液體石蠟；第(1)-③步中，先將(1)-①步備好的36%羥基脯氨酸，溶解于乙醇濃度為50%的乙 醇溶液中，攪拌吸附70min ；配制成DCC的摩爾數(shù)為羥基脯氨酸摩爾數(shù)的2倍的溶液，然后 用稀氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)體系的PH值為7的條件下，反應(yīng)12min，再在80°C下進(jìn)行干燥12h ； 第(2)步中，按明膠鹽酸濃度為6mol/L的鹽酸溶液的重量-體積之比為1 5. 5的 比例，先升溫至120°C回流水解21h ；后冷卻至80°C，再加入明膠質(zhì)量21 %的活性炭，攪拌脫 色35min，對(duì)于濾液，用稀氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)其pH值為4，并用去離子水稀釋至濾液中的羥 基脯氨酸的濃度為6mg/mL的膠原蛋白水解溶液； 第(3)步中，以流速為6倍樹脂柱體積/小時(shí)；第(4)步中，泵入pH值為10、乙醇濃度為80%的乙醇溶液，以4倍樹脂柱體積/小時(shí) 的流速進(jìn)行洗脫，分別收集第2倍樹脂柱體積的洗脫液和第4. 5倍樹脂柱體積的洗脫液，控 制真空度為-0. 9MPa，在90°C下濃縮，在溫度為-60°C，真空度為50Pa條件下，干燥30h，收 得率是純度為98%的羥基脯氨酸凍干粉。
全文摘要
一種用殼聚糖樹脂分離羥基脯氨酸的方法，屬于反應(yīng)高分子技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明以殼聚糖和明膠為原料，先制備殼聚糖樹脂，再制備膠原蛋白水解液，然后經(jīng)吸附、洗脫及凍干而得成品。本發(fā)明具有工藝簡單，生產(chǎn)設(shè)備簡單，能耗低，生產(chǎn)成本低，充分利用資源，無“三廢”排放，便于推廣應(yīng)用等特點(diǎn)；采用本發(fā)明制備出的羥基脯氨酸產(chǎn)品的純度高，并能制得脯氨酸及調(diào)味用水解動(dòng)物蛋白等副產(chǎn)品。采用本發(fā)明制備出的產(chǎn)品，可廣泛應(yīng)用于保健、化妝品行業(yè)中坐抗氧化、抗輻射的添加劑；食品行業(yè)中作增味劑；營養(yǎng)強(qiáng)化劑及香味料；制藥行業(yè)中作抗生素、抗腫瘤、降壓藥等的合成原料等；在加快傷口愈合、減肥等領(lǐng)域也有很廣泛的用途。
文檔編號(hào)C07D207/16GK101863816SQ20101019596
公開日2010年10月20日 申請(qǐng)日期2010年6月10日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月10日
發(fā)明者馮濤, 周興, 周小華, 康宏寬, 李曉輝, 趙紅波 申請(qǐng)人:重慶大學(xué)