專利名稱：銅離子半抗原青霉烯酸硫醇銅鹽及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及的是一種化學(xué)合成技術(shù)領(lǐng)域的銅鹽及其制備方法，具體是指一種銅離 子半抗原青霉烯酸硫醇銅鹽及其制備方法。
背景技術(shù)：
重金屬離子是一類有毒的，持久的環(huán)境污染物。伴隨著工業(yè)的發(fā)展，特別是近一 個(gè)世紀(jì)以來(lái)，隨著礦冶，石油化工，機(jī)械制造，微電子等產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展，大量含有重金屬離 子的工業(yè)廢水，廢氣，廢渣未經(jīng)深化處理便隨意排放，造成土壤，水體的嚴(yán)重污染，進(jìn)而威脅 到自然生態(tài)平衡和生命的健康。重金屬主要通過(guò)污染食品、飲用水及空氣而最終進(jìn)入人體。 進(jìn)入人體后的重金屬離子會(huì)與各種功能性蛋白質(zhì)發(fā)生強(qiáng)烈的不可逆作用，對(duì)人類的健康構(gòu) 成嚴(yán)重的威脅。因此，對(duì)環(huán)境中的重金屬離子進(jìn)行有效的檢測(cè)是非常必要的?，F(xiàn)在常用的 重金屬離子檢測(cè)方法是儀器分析法，如原子吸收光譜法(AAS)，電感耦合等離子體質(zhì)譜法 (ICP-MS)，電感耦合等離子體發(fā)射光譜法(ICP-AES)等。儀 器分析法的特點(diǎn)是檢測(cè)準(zhǔn)確靈 敏，可靠性高，但是也存在著成本高，耗時(shí)，前處理復(fù)雜，處理量小等缺點(diǎn)。重金屬離子的免疫檢測(cè)方法集合了生物學(xué)，化學(xué)，免疫學(xué)等多個(gè)學(xué)科，是一種基于 具有親和性和特異性的“抗原-抗體”反應(yīng)的分析方法。重金屬離子由于分子量小且免疫 原性弱而不能直接誘導(dǎo)動(dòng)物產(chǎn)生抗體，因此需要將重金屬離子以一定的方式與蛋白質(zhì)連接 形成重金屬離子全抗原，然后再利用制備出的全抗原誘導(dǎo)免疫動(dòng)物產(chǎn)生針對(duì)重金屬離子的 抗體。與傳統(tǒng)的重金屬離子檢測(cè)方法相比，免疫學(xué)方法具有快速，準(zhǔn)確，處理量大，前處理簡(jiǎn) 單，成本低等特點(diǎn)，在國(guó)內(nèi)外的相關(guān)文獻(xiàn)中已經(jīng)有關(guān)于重金屬離子免疫學(xué)檢測(cè)方面的報(bào)道。 重金屬離子的免疫學(xué)檢測(cè)方法的核心在于制備出高度特異性的單克隆抗體，而制備出特異 的抗體的關(guān)鍵又在于重金屬離子半抗原的制備。就目前而言，在重金屬離子半抗原的制備 方面國(guó)內(nèi)外相關(guān)的研究機(jī)構(gòu)主要通過(guò)使用重金屬離子螯合劑的方法。常用的重金屬離子螯 合劑主要有以下幾種乙二胺四乙酸(EDTA)，二乙烯三胺五乙酸(DTPA)，乙二醇二乙醚二 胺四乙酸(EGTA)，或類似的衍生物作為偶聯(lián)劑。然后重金屬離子與螯合劑之間以一定比例 螯合后形成的籠形結(jié)構(gòu)的絡(luò)合物作為半抗原?，F(xiàn)有技術(shù)制備抗體的缺點(diǎn)主要有1.在重金屬離子與螯合劑形成的籠形結(jié)構(gòu)中， 重金屬離子位于籠形結(jié)構(gòu)的中央。因此，在隨后的免疫應(yīng)答中，針對(duì)重金屬離子的免疫應(yīng)答 作用便會(huì)被其周圍的螯合劑所掩蓋。在這種情況下，免疫反應(yīng)后所產(chǎn)生的多克隆抗體大多 數(shù)是針對(duì)包含金屬離子在內(nèi)的由螯合劑形成的籠形結(jié)構(gòu)，只有少部分的多克隆抗體是針對(duì) 金屬離子的，這就對(duì)后續(xù)的單克隆抗體的篩選增加了難度。2.復(fù)合物不穩(wěn)定，在體外環(huán)境 中，重金屬離子復(fù)合物具有很強(qiáng)的穩(wěn)定性，但是在免疫反應(yīng)中，在體內(nèi)生理生化作用下會(huì)造 成復(fù)合物的解離，這一方面降低了抗原的免疫原性，同時(shí)由于重金屬離子的毒害作用，還會(huì) 造成動(dòng)物的中毒甚至死亡。因此在重金屬離子半抗原的設(shè)計(jì)方面，重金屬離子與螯合劑結(jié) 合所形成的半抗原并不是一種理想的重金屬離子半抗原。在國(guó)外還有研究者使用谷胱甘肽 作為偶聯(lián)劑來(lái)連接重金屬離子和蛋白質(zhì)，這種方法克服了螯合劑做偶聯(lián)劑的缺點(diǎn)，重金屬離子與谷胱甘肽的硫醇基之間通過(guò)共價(jià)鍵連接，在動(dòng)物體內(nèi)具有很高的穩(wěn)定性，不易解離。 但是這種方法也有缺點(diǎn)，因?yàn)楣入赘孰淖鳛榕悸?lián)劑，免疫原性低，產(chǎn)生的抗體效價(jià)也低
發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種銅離子半抗原青霉烯酸硫醇銅 鹽及其制備方法。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于反應(yīng)體系簡(jiǎn)單，制備過(guò)程易操作，制備出的青霉烯酸硫 醇銅鹽性質(zhì)穩(wěn)定，可作為一種穩(wěn)定的銅離子半抗原。本發(fā)明是通過(guò)以下的技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的本發(fā)明涉及銅離子半抗原青霉烯酸硫醇銅鹽，其結(jié)構(gòu)式如下
CuCl
八 ^oI
——NH-^
COOH 其中R為 C6H5-CH2-。本發(fā)明還涉及如上銅離子半抗原青霉烯酸硫醇銅鹽的制備方法，包括以下步驟步驟一，在咪唑的催化作用下，將青霉素G鈉鹽與氯化銅反應(yīng)。步驟二，純化反應(yīng)產(chǎn)物，制備得到青霉烯酸硫醇銅鹽。步驟一中，所述反應(yīng)的pH為6. 8-7. O。步驟一中，所述反應(yīng)在65 °C下進(jìn)行。步驟一中，所述反應(yīng)的時(shí)間為3小時(shí)。步驟二中，所述純化條件為12000r/m離心5min純化反應(yīng)產(chǎn)物。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)反應(yīng)體系及操作方法簡(jiǎn)單，制備反應(yīng)步驟 少。最終得到的產(chǎn)物青霉烯酸硫醇銅鹽性質(zhì)穩(wěn)定，可作為銅離子的半抗原。銅離子通過(guò)共價(jià) 鍵連接到半抗原分子，在體內(nèi)性質(zhì)穩(wěn)定不會(huì)解離，從而不會(huì)引起實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的中毒或者死亡； 半抗原分子中有相鄰的銅離子、惡唑酮環(huán)和苯環(huán)三個(gè)抗原決定簇，免疫原性強(qiáng)；金屬離子完 全暴露在半抗原分子表面，在免疫反應(yīng)中可以與抗體進(jìn)行直接的物理接觸。


圖1為青霉烯酸硫醇銅鹽與青霉素G鈉鹽的紫外可見(jiàn)吸收光譜。圖2為青霉烯酸硫醇銅鹽的紅外圖譜。圖3為青霉素G鈉鹽的紅外圖譜。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合附圖并列舉實(shí)例對(duì)本發(fā)明的相關(guān)內(nèi)容進(jìn)行詳細(xì)闡述。下述的實(shí)驗(yàn)內(nèi)容都 是在以本發(fā)明的相關(guān)內(nèi)容為基礎(chǔ)進(jìn)行試驗(yàn)的，但是本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于下述的實(shí)例。 在下列的實(shí)驗(yàn)中未注明具體的實(shí)驗(yàn)方案和過(guò)程，一般條件下需按照常規(guī)條件，或者是按照 相關(guān)的儀器指標(biāo)或廠商的建議進(jìn)行操作。
實(shí)施例步驟一，青霉烯酸硫醇銅鹽的制備取青霉素G鈉鹽50mg溶解在IOml的超純水中，加入Ig咪唑，通過(guò)攪拌使其完全溶 解，逐滴加入IM HCl將pH調(diào)節(jié)至6. 8.然后加入與青霉素G鈉鹽等物質(zhì)量的CuCl2,即5ml 的10mg/ml的CuCl2溶液，60°C水浴加熱3個(gè)小時(shí)，取出，室溫中冷卻，反應(yīng)完全后會(huì)產(chǎn)生深 藍(lán)色的溶液。步驟二，青霉烯酸硫醇銅鹽的純化青霉烯酸硫醇銅鹽在酸性溶液中是不溶的，可以形成大量絮狀沉淀，利用這個(gè)性 質(zhì)可以分離和純化青霉烯酸硫醇銅鹽。具體過(guò)程如下向反應(yīng)后的溶液中滴加7ml IM HCl, 當(dāng)?shù)渭拥?ml時(shí)可以觀察到燒杯中有大量的白色絮狀沉淀產(chǎn)生，當(dāng)?shù)渭拥?ml時(shí)沉淀不再 增多。將溶液分裝至4ml EP管中，12000r/m離心5min，棄去上清液，加水洗滌，再離心5min， 重復(fù)洗滌沉淀兩次，離心后留在管底的沉淀即是半抗原青霉烯酸硫醇銅鹽。步驟三，產(chǎn)物的檢測(cè)根據(jù)前述的反應(yīng)原理可以看到，青霉烯酸硫醇銅鹽是青霉素和銅離子在咪 唑的催化作用下生成的青霉素類的降解產(chǎn)物。在其化學(xué)結(jié)構(gòu)中，含有一個(gè)惡唑酮環(huán)， 所以在320nm-345nm處有特征的紫外吸收，利用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)的全波長(zhǎng)掃描 (190nm-400nm)就可以判斷出半抗原是否合成成功。對(duì)步驟二中反應(yīng)得到的產(chǎn)物進(jìn)行紫外 檢測(cè)，如圖1所示，在325nm處有特征吸收，證明了青霉烯酸硫醇銅鹽合成成功。由于青霉 烯酸硫醇銅鹽在水和有機(jī)溶劑中的溶解度很低，所以可以使用紅外光譜法來(lái)檢測(cè)產(chǎn)物的結(jié) 構(gòu)和純度。如圖2所示，青霉烯酸硫醇銅鹽不存在Π ^πΤΥβ-內(nèi)酰胺環(huán)的特征吸收峰) 表明β-內(nèi)酰胺環(huán)在合成過(guò)程中被完全降解了。1665CHT1和1677CHT1處的峰表明二者 都是α，β不飽和酮，這是青霉烯酸的特征吸收峰。2500CHT1處的峰證明青霉烯酸中存 在-SH (或-S-Cu2+)其他相應(yīng)的峰還有750cm—1，700cm—1 (單取代苯環(huán))，2927cm"1 (-CH2)， HOOcnT1，1368cm-1 [-C (CH3)2]。如圖3所示，青霉烯酸硫醇銅鹽(CMPA)含有一個(gè)羧基(-C00H)，可以和蛋白質(zhì)的氨 基(-NH2)偶聯(lián)，生成全抗原。在全抗原的的合成過(guò)程中，為了提高反應(yīng)的選擇性和效率，在 反應(yīng)溶液中需要加入一定量的水溶性的EDC-HCl作為催化劑。具體的反應(yīng)過(guò)程如下將純 化后的50mg半抗原轉(zhuǎn)移至燒杯中，滴加IOml 4% NaHCO3,加入200mg EDC-HCl，攪拌lOmin， 使得半抗原上的羧基充分活化。加入50mg BSA(或OVA)，攪拌12個(gè)小時(shí)；反應(yīng)完畢后，離 心兩次，過(guò)濾一次去除未反應(yīng)的固體雜質(zhì)。上清液轉(zhuǎn)移至透析袋中透析2天，期間更換4 次透析液，每次的透析時(shí)間大于5小時(shí)，透析液為IOmMpH 7. 4PBS。透析完畢后，將全抗原 溶液定容，取出一定量的溶液進(jìn)行紫外和ICP-AES檢測(cè)，其余的全抗原溶液分裝并凍成干 粉，-20°C保存。在青霉素類物質(zhì)的衍生物中，青霉烯酸衍生物含有惡唑酮環(huán)，因此在320-345nm 處有特征吸收峰，而其它的青霉素類衍生物或降解產(chǎn)物都沒(méi)有這種特征吸收。所以，紫 外可見(jiàn)分光光度法可以用來(lái)判斷合成的全抗原青霉烯酸硫醇銅鹽-蛋白質(zhì)的連接效果。 BSA-CMPA和OVA-CMPA在325nm附近都有吸收峰，說(shuō)明半抗原CMPA與蛋白質(zhì)偶聯(lián)成功。另 外因?yàn)樵诎肟乖嗝瓜┧崃虼笺~鹽(CMPA)中含有金屬離子，因此我們可以通過(guò)ICP-AES來(lái)檢測(cè)半抗原中重金屬離子的含量。最終ICP-AES檢測(cè)得CMPA-BSA的偶聯(lián)比是28 1. CMPA-OVA的偶聯(lián)比是4 1。該全抗原(CMPA-BSA)可以用于多克隆抗體的制備。在實(shí)驗(yàn)方案上，我們通過(guò) ELISA對(duì)全抗原的免疫原性進(jìn)行了系統(tǒng)化的分析，在實(shí)驗(yàn)中我們選取2只雄性的新西蘭白 兔，每只重量約為3Kg。然后對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行皮下6-8點(diǎn)注射，第一次基礎(chǔ)免疫的抗原劑量 為500 μ g/只，每次加強(qiáng)免疫的劑量為300 μ g/只，具體操作過(guò)程如下第一次免疫為基礎(chǔ) 免疫，使用PBS(10mM，pH 7. 4)將緩沖液稀釋成lmg/ml，與等量的福氏完全佐劑充分乳化， 皮下多點(diǎn)注射；14天后，進(jìn)行第一次加強(qiáng)免疫，等量的全抗原溶液(lmg/ml)與福氏不完全 佐劑充分乳化，皮下多點(diǎn)注射；共加強(qiáng)免疫4次，每次間隔的時(shí)間為14天。從第二次加強(qiáng) 免疫起，每次免疫后7天從兔子的耳緣靜脈取血，取出的全血37°C水浴2h，離心取上清，分 裝，-20°C保存。免疫注射前，每只兔子取血作為陰性對(duì)照。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明1.新型的銅離子全抗原對(duì)動(dòng)物是安全的，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)動(dòng)物的中毒現(xiàn)象；2.新型的銅離子全抗原可以刺激動(dòng)物的免疫系統(tǒng)產(chǎn)生高親和性的抗 體?？乖哂?很高的免疫原性，經(jīng)過(guò)4次加強(qiáng)免疫后，動(dòng)物血清中的抗體的效價(jià)超過(guò)83000 ；3.為了驗(yàn)證血清中抗體針對(duì)Cu2+的特異性，我們用ELISA實(shí)驗(yàn)對(duì)抗體的親和性做 了進(jìn)一步的檢測(cè)。為了檢測(cè)特異性，我們合成了兩種包被抗原，分別為OVA-GSH-Cu(II)和 OVA-GSH0 ICP-AES測(cè)得每個(gè)OVA分子連接9個(gè)Cu或者GSH。具體的檢測(cè)方法是0VA-GSH_Cu 和OVA-GSH分別用50mM的碳酸鹽緩沖液稀釋為20 μ g/ml, 100 μ L/孔，37°C水浴中溫育3小 時(shí)，而后用1 % OVA 300 μ L/孔封閉；每孔滴加100 μ L免疫血清(稀釋300倍)，37°C水浴 中溫育1小時(shí)，然后，用PBST(含0. 05% TWEEN-20的IOmMpH 7. 4PBS)洗滌3次；洗滌完畢 后，每孔滴加100 μ L羊抗兔IgG-HRP，37°C水浴1小時(shí)，PBST洗滌5次；最后加入100 μ L/ 孔TMB顯色劑，顯色后15min后加入50 μ L/孔2MH2S04終止反應(yīng)。使用的酶標(biāo)儀測(cè)量450nm 下的吸光度值。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明抗體與包被抗原OVA-GSH-CuCl反應(yīng)所得的吸光度值(0D值)大于 0VA-GSH，這就表明血清中含有針對(duì)銅離子特異的抗體。半抗原及全抗原的合成步驟簡(jiǎn)單， 且易于表征。該全抗原可以應(yīng)用于銅離子單克隆抗體的制備，具有很大的市場(chǎng)潛力。
權(quán)利要求
一種銅離子半抗原青霉烯酸硫醇銅鹽，其特征在于，其結(jié)構(gòu)式如下其中R為C6H5-CH2-。FDA0000021867370000011.tif
2.一種根據(jù)權(quán)利要求1所述的銅離子半抗原青霉烯酸硫醇銅鹽的制備方法，其特征在 于，包括以下步驟步驟一，在咪唑的催化作用下，將青霉素G鈉鹽與氯化銅反應(yīng)； 步驟二，純化反應(yīng)產(chǎn)物，制備得到青霉烯酸硫醇銅鹽。
3.根據(jù)權(quán)利要求2中所述的銅離子半抗原青霉烯酸硫醇銅鹽的制備方法，，其特征是， 步驟一中，所述的反應(yīng)pH為6. 5-7. 0。
4.根據(jù)權(quán)利要求2中所述的銅離子半抗原青霉烯酸硫醇銅鹽的制備方法，，其特征是， 步驟一中，所述的反應(yīng)溫度為65°C。
5.根據(jù)權(quán)利要求2中所述的銅離子半抗原青霉烯酸硫醇銅鹽的制備方法，，其特征是， 步驟一中，所述的反應(yīng)時(shí)間為3h。
6.根據(jù)權(quán)利要求2中所述的銅離子半抗原青霉烯酸硫醇銅鹽的制備方法，，其特征是， 步驟二中，所述的純化條件為12000r/m離心5min。
全文摘要
一種化學(xué)合成技術(shù)領(lǐng)域的銅離子半抗原青霉烯酸硫醇銅鹽及其制備方法。其結(jié)構(gòu)式如下，其中R為C6H5-CH2-。制備方法步驟一，在咪唑的催化作用下，將青霉素G鈉鹽與氯化銅反應(yīng)。步驟二，純化反應(yīng)產(chǎn)物，制備得到青霉烯酸硫醇銅鹽。本發(fā)明反應(yīng)體系及操作方法簡(jiǎn)單，制備反應(yīng)步驟少。最終產(chǎn)物可作為銅離子的半抗原。半抗原分子中有相鄰的銅離子、惡唑酮環(huán)和苯環(huán)三個(gè)抗原決定簇，免疫原性強(qiáng)；金屬離子完全暴露在半抗原分子表面，在免疫反應(yīng)中可以與抗體進(jìn)行直接的物理接觸。
文檔編號(hào)C07D263/42GK101830860SQ201010186178
公開(kāi)日2010年9月15日 申請(qǐng)日期2010年5月28日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月28日
發(fā)明者周培, 奚濤, 張薇, 徐武, 曹成喜, 樊柳蔭, 謝鵬 申請(qǐng)人:上海交通大學(xué)