專利名稱：用于治療炎性關(guān)節(jié)障礙的鈣黏著蛋白-11 ec1結(jié)構(gòu)域拮抗劑的制作方法
用于治療炎性關(guān)節(jié)障礙的鈣黏著蛋白-11EC1結(jié)構(gòu)域拮抗
劑相關(guān)申請本申請要求了于2008年1月11日提交的美國臨時申請?zhí)?1/010，734的權(quán)益。以 上申請的全部傳授內(nèi)容都通過弓I用結(jié)合在此。
背景技術(shù)：
患有晚期慢性關(guān)節(jié)炎癥的患者忍受著嚴重的關(guān)節(jié)退化(包括骨和軟骨破壞)，這 導致長期疼痛、畸形、關(guān)節(jié)功能損失、運動減少、并且縮短的壽命。關(guān)節(jié)炎癥與關(guān)節(jié)中細胞 和炎性物質(zhì)的數(shù)量增加相關(guān)聯(lián)，這引起了刺激、軟骨的磨損、以及關(guān)節(jié)內(nèi)層(joint lining) 的腫脹。已知幾種不同的自身免疫障礙在關(guān)節(jié)中觸發(fā)了不適當?shù)幕蝈e誤導向的炎癥，在遭 受這些疾病的個體的關(guān)節(jié)中導致了慢性炎癥。常見的炎性關(guān)節(jié)障礙(inflammatory joint disorder)包括類風濕性關(guān)節(jié)炎、銀屑病關(guān)節(jié)炎、萊特爾氏綜合征、以及強直性脊柱炎。類風濕性關(guān)節(jié)炎(RA)是最常見的炎性關(guān)節(jié)炎形式，并且據(jù)估計影響美國大約 的人口、或大約210萬美國人。RA是一種慢性病，其特征在于關(guān)節(jié)的內(nèi)層、或滑膜的炎癥，并 且隨著時間可以導致顯著的骨和軟骨的損害。與男性相比，RA在女性中更為常見，并且多 達3%的女性在她們的一生中可能發(fā)展成類風濕性關(guān)節(jié)炎。目前，RA的病因是未知的。RA可以導致長期的關(guān)節(jié)損害，這造成了慢性疼痛、功能損失以及失能。此外，最近 的研究表明患有RA的人、特別是那些疾病沒有被很好控制的人，可能具有更高的心臟病和 中風的風險。因此，RA是一種主要的國家健康負擔，并且對于開發(fā)用于防止和治療類風濕 性關(guān)節(jié)炎、以及其他炎性關(guān)節(jié)障礙的新型藥劑存在著一種迫切的需要。發(fā)明概述在一個實施方案中，本發(fā)明涵蓋了 一種鈣黏著蛋白-11拮抗劑，該鈣黏著蛋 白-11拮抗劑特異性地結(jié)合到一種哺乳動物鈣黏著蛋白-11蛋白的一個細胞外結(jié)構(gòu)域 (ECl)上，并且抑制了表達該哺乳動物鈣黏著蛋白-11的細胞的聚集。在一個具體的實施 方案中，該鈣黏著蛋白-11拮抗劑是一種抗體或抗體片段。在另一個實施方案中，該鈣黏著 蛋白-11拮抗劑是一種融合蛋白，該融合蛋白包括一種鈣黏著蛋白-11蛋白的ECl結(jié)構(gòu)域 (例如，SEQ ID NO :3)。在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及治療哺乳動物受試者(例如，人)體內(nèi)的炎性關(guān) 節(jié)障礙的多種方法。該方法包括對該哺乳動物受試者給予本發(fā)明的治療有效量的一種鈣黏 著蛋白-11拮抗劑，由此在該哺乳動物中產(chǎn)生一種令人希望的治療效應。在一種具體的實 施方案中，本發(fā)明的這些方法可用于治療類風濕性關(guān)節(jié)炎。在另一個實施方案中，本發(fā)明涵蓋了一種藥物組合物，該藥物組合物包括本發(fā)明 的一種鈣黏著蛋白-11拮抗劑以及一種藥學上可接受的載體。在一個實施方案中，該藥物 組合物進一步包括一種第二試劑，如，一種緩解疾病(disease-modifying)的抗風濕藥或 抗炎劑。附圖簡要說明本專利或申請文件包含至少一個彩繪的圖。帶有彩圖的本專利或?qū)＠暾埞_文件的副本在要求和支付必要的費用時將由局方(the Office)將提供。圖IA是一種蛋白質(zhì)印跡，示出了使用抗Cad-Il抗體23C6、13C2、以及27F3來檢測 鈣黏著蛋白-ll-ECl-5-Fc融合蛋白(見實心箭頭)。這些抗體并未識別也存在于該膜上的 鈣黏著蛋白-Il-ECl-Fc以及鈣黏著蛋白-ll-ECl/2-Fc融合蛋白(見空心箭頭，指出在該 印跡上鈣黏著蛋白-Il-ECl-Fc以及鈣黏著蛋白-ll-ECl/2-Fc蛋白的位置)。圖IB是一個圖示，描繪了公布的鈣黏著蛋白-11抗體13C2、23C6、以及5F82與人 類Cad-ll-ECl-5-Fc融合蛋白(而非Cad-ll-ECl-Fc融合蛋白)的結(jié)合，正如通過ELISA 所確定。相比之下，ECl抗體HlMl與Cad-Il-ECl-Fc融合蛋白以及Cad-11-ECl_5_Fc融合 蛋白這兩者相結(jié)合。圖2是涉及到鈣黏著蛋白結(jié)合的人類Cad-11的ECl結(jié)構(gòu)域的前34個氨基酸(SEQ ID NO 3) ,MN-Cad 的 ECl 結(jié)構(gòu)域的前 34 個氨基酸(SEQ ID NO 4)、以及 Cad-8 (SEQ ID NO 5)的ECl結(jié)構(gòu)域的前34個氨基酸的氨基酸序列比對。包含延伸至一種鈣黏著蛋白反受體 的口袋中的多個殘基的供體序列是通過在序列的左側(cè)一半作下劃線來表示的，并且該口袋 序列的多個殘基是通過在SEQ ID NO :3中的序列的右側(cè)一半作下劃線來表示的。圖3是一個圖示，描繪了一種鈣黏著蛋白-11-結(jié)合Fab與一種人類Cad-Il-ECl 結(jié)構(gòu)域肽、連同Cad-Il-ECl-Fc融合蛋白(而非Cad_8或MN-Cad ECl結(jié)構(gòu)域肽)的結(jié)合， 正如通過ELISA所確定?？寺?證明了顯著結(jié)合到Cad-IlECl結(jié)構(gòu)域肽以及融合蛋白上， 而非MN-Cad或Cad-8EC1結(jié)構(gòu)域肽。圖4是一個圖示，描繪了來自體外Cad-Il細胞聚集測定的數(shù)據(jù)。加入到培養(yǎng)基中 的Cad-Il拮抗劑(如，由抗Cad-Il抗體13C2制備的一種Fab)、或不同濃度的抗鈣黏著蛋 白-IlEClFab (它針對鈣黏著蛋白-11的ECl結(jié)構(gòu)域的前35個氨基酸)(被指定為EClFab 克隆7)阻止了 Cad-Il介導的431-D-11細胞的聚集。抗鈣黏著蛋白-IlEClFab (克隆7) 在所有測試濃度(在0.3yg/ml至10yg/ml的范圍內(nèi))下抑制了一種431-D-11表皮樣癌 細胞的聚集。相比之下，由13C2抗鈣黏著蛋白-11抗體制備的Fab僅在10 μ g/ml的濃度 下抑制細胞的聚集。圖5是一個圖示，描繪了來自第二種體外Cad-Il細胞聚集測定的數(shù)據(jù)。431_D_11 細胞的聚集百分率是在加入SME培養(yǎng)基(被指定為對照)、不同濃度的一種融合蛋白(包 括融合至人類IgG2鉸鏈域、CH2以及CH3結(jié)構(gòu)域上的Cad-Il的ECl結(jié)構(gòu)域)(被指定為 Cad-ll-ECl-Fc)、不同濃度的一種抗鈣黏著蛋白-IlEClFab (它針對鈣黏著蛋白-11的ECl 結(jié)構(gòu)域的前35個氨基酸)(被指定為Cad-IIEClFab)、或不同濃度的一種對照抗綠色熒光蛋 白(抗-GFP) Fab (被指定GFPfAb)之后40分鐘示出的。抗鈣黏著蛋白_1 IEClFab (克隆7) 在3μ g/ml、1 μ g/ml、以及0. 1 μ g/ml的濃度下抑制了表達Cad-Il的431-D-11細胞的聚 集。ECl-Fc融合蛋白在3 μ g/ml的濃度下抑制了 431-D-11細胞的聚集。相比之下，抗-GFP Fab在任何這些測試濃度下都沒有顯著地抑制細胞的聚集。圖6是一個圖示，描繪了通過不同的抗鈣黏著蛋白-1 IEClFab來抑制Cad-11介導 的細胞聚集，這些抗鈣黏著蛋白-IlEClFab具有對于單獨的Cad-ll(EClfAb克隆7以及克 隆 4)、Cad-Il 與 Cad-8 (EClfAb 克隆 6)、或 Cad-Il 與 MN-Cad(EClfAb 克隆 5)的結(jié)合特異 性，這是使用體外細胞聚集測定來進行的。相對于對照物(D-11SME;左柱)所測試的所有 Fab抑制了 431-D-11細胞的聚集。
7
圖7是一個圖示，描繪了通過抗-Cad-IlFab來抑制Cad-Il介導的細胞的聚集，這 些抗-Cad-IlFab 具有對于單獨的 Cad-11 (EClfAb 克隆 7)、或 Cad-Il 與 MN-Cad(EClfAb 克 隆8)的結(jié)合特異性，這是使用體外細胞聚集測定來進行的。所測試的這些Fab的特異性在 每種Fab名稱旁邊的括號中示出。相對于對GFP特異性的對照Fab (左柱)，這兩種鈣黏著 蛋白特異性Fab均抑制了細胞聚集(中間柱和右柱)。圖 8 顯示人類 Cad-ll-ECl-hIgG2_Fcl 融合蛋白(Cad-11-ECl-Fe)的核苷酸(DNA) 序列(SEQ ID NO :6)。這種人類鈣黏著蛋白-11胞外域的序列以斜體字顯示，BglII位點是 加下劃線的，并且對這種人類IgG2-Fcl區(qū)域進行編碼的序列以黑體字母顯示。圖9 示出 了人類 Cad-11-EC 1-hIgG2_Fcl 融合蛋白(Cad-ll-ECl-Fc)的氨基酸序 列(SEQ ID NO :7)。這種人類鈣黏著蛋白-11胞外域的序列以斜體字顯示，由BglII位點 編碼的序列是加下劃線的，并且這種人類IgG2-Fcl區(qū)的序列以黑體字母顯示。

圖10是已經(jīng)用考馬斯藍染色的SDS聚丙烯酰胺凝膠的圖像，它對應地示出了對應 于純化的 Cad-I I-EC 1-h I gG2-Fcl (中間泳道)以及 Cad-11-EC l/2_h I gG2_Fcl (右側(cè)泳道) 融合蛋白的單體形式的主導強條帶，之后使用蛋白A柱從細胞培養(yǎng)基中純化。分子量標準 顯示在左側(cè)泳道中。圖11是蛋白質(zhì)印跡，示出了使用偶聯(lián)辣根過氧化物酶(HRP)的抗人IgG抗體來檢 測人類 Cad-I I-EC 1-h I gG2-Fcl (中間泳道)以及 Cad-11-EC l/2_h I gG2_Fcl (右側(cè)泳道)融 合蛋白。在每個泳道中所觀察到的主導條帶對應于這些融合蛋白的單體形式的位置。這些 融合蛋白的二聚體形式的位置由于不完全的還原條件也是可見的(見不太強的更高的分 子量條帶)。分子量標準顯示在左側(cè)泳道中。圖12是一個圖示，描繪了與未經(jīng)處理的細胞相比Cadd-Il-ECl-Fc融合蛋白以及 小鼠抗-Cad-Il抗體13C2在所指示的濃度下抑制了表達Cad-Il的人類成纖維細胞樣滑膜 細胞侵入到基質(zhì)膠塞中，標記為侵入。數(shù)據(jù)是從兩個獨立實驗匯集的。圖13A和B是圖示，描繪了來自兩種體外Cad-Il細胞聚集測定的數(shù)據(jù)。表達 Cad-Il的431-D-11細胞的聚集百分率是在加入SME培養(yǎng)基(被指定為對照)或一種 Cad-Il融合蛋白之后40分鐘而示出的。圖13A示出了在不同濃度的一種融合蛋白(包 括融合至人類IgG 2鉸鏈域、CH2以及CH3結(jié)構(gòu)域上的Cad-Il的5個胞外域)(被指定為 Cad-Il-ECl-5-Fc)的存在下對聚集的抑制。圖13B示出了不同濃度的一種融合蛋白(包括 融合至人類IgG2鉸鏈域、CH2以及CH3結(jié)構(gòu)域的Cad-Il的N端胞外域(ECl結(jié)構(gòu)域))(被 指定為 Cad-ll-ECl-Fc)、或 Cad-Il-ECl-5-Fc)對聚集的抑制。圖14A至C示出了人類鈣黏著蛋白-IlcDNA序列(SEQ ID NO 1 ；見Genbank登記 號 NM 001797)。圖15示出了人類鈣黏著蛋白-11蛋白序列(SEQ ID NO :2 ；見Genbank登記號 NP001788)。圖16是一個圖示，描繪了在來自肽4雜交瘤(HL)的培養(yǎng)基、或?qū)φ针s交瘤培養(yǎng)基 (Media)中的抗體與包含Cad-11、Cad_8、或MN-Cad的EC1-2結(jié)構(gòu)域的蛋白的結(jié)合水平，正 如通過ELISA所確定。圖17A至C是代表性的圖示，描繪了細胞染色的強度(MFI ；平均熒光強度)作為 H14抗體與表達Cad-Il-的431-D-11細胞的結(jié)合的一種量度。
圖17D至F是代表性的圖示，描繪了相對于圖17A至C、431_D細胞染色的缺失 (MFI ；平均熒光強度)，這表明H14抗體與Cad-Il陰性細胞的結(jié)合的缺乏。圖17G至I是代表性的圖示，描繪了細胞染色的強度(MFI ；平均熒光強度)作為 HlMl抗體與表達Cad-Il-的431-D-11細胞的結(jié)合的一種量度。圖18A是一個圖示，描繪了在不同濃度的抗體下H14抗體與表達Cad-Il-的細胞 的結(jié)合、以及H14與Cad-Il陰性對照細胞結(jié)合的缺失，正如由細胞染色的強度(MFI ；平均 熒光強度)所測量。圖18B是一個圖示，描繪了在不同濃度的抗體下HlMl抗體與表達Cad-Il-的細胞 的結(jié)合、以及HlMl與Cad-Il陰性對照細胞結(jié)合的缺失，正如由細胞染色的強度(MFI ；平均 熒光強度)所測量。圖19A是一個圖示，描繪了在不同的抗體濃度下H14抗Cad-Il抗體與Cad-Il以 及Cad-8EC1結(jié)構(gòu)域肽的結(jié)合程度，正如通過ELISA所確定。圖19B是一個圖示，描繪了在不同的抗體濃度下H14抗Cad-11抗體與Cad7、 MNCad, Cad9、Cadl8、Cad20、或Cad24ECl結(jié)構(gòu)域肽的結(jié)合的缺失，正如通過ELISA所確定。圖20是一個圖示，描繪了在不同的抗體濃度下HlMl抗Cad-Il抗體與Cad-Il以 及Cad-8EC1結(jié)構(gòu)域肽的結(jié)合，正如通過ELISA所確定。圖21A是一個圖示，描繪了 HlMl抗Cad-Il抗體與不同的Cad_lIECl結(jié)構(gòu)域肽免 疫原(PEPU PEP2、PEP3、以及PEP4)、連同Cad-IlECl結(jié)構(gòu)域融合蛋白(EFL)以及人類IgG 對照(Fe段)(Fe block)的結(jié)合程度，正如通過ELISA所確定。圖2IB是一個圖示，描繪了 H14抗Cad-Il抗體與不同的Cad_l IECl結(jié)構(gòu)域肽免疫 原(PEP1、PEP2、PEP3、以及PEP4)、連同Cad-IlECl結(jié)構(gòu)域融合蛋白(EFL)以及人類IgG對 照(Fe段)的結(jié)合程度，正如通過ELISA所確定。圖22個是一種示意圖，描繪了人類鈣黏著蛋白-11的ECl結(jié)構(gòu)域的前37個氨基 酸的序列、以及由肽1-4中的每一個所涵蓋的這種序列的部分。肽3上游的由肽2和4共 有的氨基酸殘基在加框區(qū)中被加強顯示。直接參與Cad-Il與Cad-Il結(jié)合的多個氨基酸是 加下劃線的。圖23A是一個照片，示出了用一種對照同種型抗體處理的聚集的表達Cad-Il的細 胞大塊。圖23B是一個照片，示出了 HlMl處理的表達Cad-Il-的細胞小簇，這些細胞小簇 未發(fā)展形成在圖23A中所觀察到的大塊。圖23C是一個照片，示出了未經(jīng)處理的親本Cad-Il陰性細胞保持為單細胞群或雙 細胞群。圖23A是一個照片，描繪了表達Cad-Il的細胞的培養(yǎng)物，該培養(yǎng)物具有聚集的細 胞大塊。圖23B是一個照片，描繪了在用HHCad-IlECl結(jié)構(gòu)域抗體處理之后表達Cad-Il 的細胞的培養(yǎng)物，該培養(yǎng)物主要具有單細胞，這些單細胞相對于在圖24A中所示的細胞具 有小而稀少的細胞簇。圖25是一個圖示，描繪了與未經(jīng)處理的對照小鼠相比在用增加劑量的HIM1抗 Cad-Il抗體處理的小鼠中對與關(guān)節(jié)炎相關(guān)的關(guān)節(jié)腫脹的抑制。
圖26是一個圖示，描繪了與未經(jīng)處理的對照小鼠相比在每隔一天用0. 3mg的H14 或HlMl抗Cad-Il抗體處理的小鼠中對與關(guān)節(jié)炎相關(guān)的關(guān)節(jié)腫脹的抑制。圖27是一個圖示，示出了與未經(jīng)處理的對照物相比在小鼠模型中用0. 3mg的HlMl 或H14抗體進行處理延遲了關(guān)節(jié)炎的發(fā)展。圖28是一個圖示，描述了來自肽3雜交瘤的培養(yǎng)基(HL)或?qū)φ针s交瘤培養(yǎng)基 (Media)、包含抗體的培養(yǎng)基與Cad-Il、Cad_8、以及MN-鈣黏著蛋白、或Cad_lIECl-Fc融合 蛋白的EC1-2結(jié)構(gòu)域的結(jié)合程度。圖29是一個圖示，描繪來自這些肽3雜交瘤的抗Cad-Il抗體與表達人類Cad-Il 蛋白的細胞(見箭頭)以及表達Neos、未表達Cad-Il的對照細胞的結(jié)合程度。發(fā)明詳細說明定義如在此所使用的，術(shù)語“鈣黏著蛋白-11”、“Cad-11”、以及“OB-鈣黏著蛋白”是指 一種自然發(fā)生的或內(nèi)源性鈣黏著蛋白-ι ((例如，哺乳動物，例如人類)蛋白，并且指具有一 種氨基酸序列的多個蛋白，該氨基酸序列與自然發(fā)生的或內(nèi)源性鈣黏著蛋白-11蛋白的氨 基酸序列相同(例如，重組蛋白、合成的蛋白)。因此，術(shù)語“鈣黏著蛋白-ll”、“cad-ll”、以 及“0B-鈣黏著蛋白”(它們在此是可互換使用的)包括一種鈣黏著蛋白-11蛋白(例如，哺 乳動物、人類)的多態(tài)的或等位基因的變體以及其他同種型，它們是通過(例如)在哺乳動 物(例如人類、非人的靈長類)中自然發(fā)生的替代性剪接或其他細胞加工所產(chǎn)生的。優(yōu)選 地，這種鈣黏著蛋白-11蛋白是一種人類蛋白，該蛋白具有SEQ IDNO :2的氨基酸序列(見 Genbank 登記號 NP001788 和圖 15)。如在此所定義的，一種“鈣黏著蛋白-11拮抗劑”是一種試劑(例如，抗體、融合蛋 白、肽、模擬肽、小分子、核酸)，該試劑特異性地結(jié)合到一種鈣黏著蛋白-11蛋白的一個ECl 結(jié)構(gòu)域上并且在細胞中抑制(例如，減少、防止)一種或多種鈣黏著蛋白-Ii-介導的活性。 鈣黏著蛋白-11-介導的活性包括但不限于一種鈣黏著蛋白-11蛋白以一種同型方式與一 種或多種其他鈣黏著蛋白-11蛋白的結(jié)合、表達鈣黏著蛋白-11的細胞的聚集、酶(例如， 膠原酶、絲氨酸蛋白酶、MMP1、MMP3、MMP13)的表達或活性的誘導、以及細胞因子或生長因子 (例如，IL-6、IL-8、或RANKL、或TRANCE)的誘導。在一個實施方案中，該鈣黏著蛋白_11拮 抗劑可以抑制一種鈣黏著蛋白-11蛋白與一種或多種其他鈣黏著蛋白-11蛋白的結(jié)合，這 是通過(例如)阻斷在一種Cad-Il蛋白(例如，在一種細胞的表面上表達的一種Cad-Il 蛋白)的ECl結(jié)構(gòu)域中的供體序列與一個或多個其他Cad-Il蛋白(例如，在另一種細胞的 表面上表達的一種或多種Cad-Il蛋白)的ECl結(jié)構(gòu)域中的口袋序列之間的相互作用來進 行的。如在此所使用的，“特異性地結(jié)合”到一種鈣黏著蛋白-11蛋白的一個ECl結(jié)構(gòu)域 上的鈣黏著蛋白-11拮抗劑是指一種鈣黏著蛋白-11拮抗劑，該鈣黏著蛋白-11拮抗劑以 一種親和力(例如，一種結(jié)合親和力)結(jié)合到(例如，在生理條件下)一種鈣黏著蛋白-11 蛋白的一個ECl結(jié)構(gòu)域上，該親和力比該鈣黏著蛋白-11拮抗劑結(jié)合到另一種鈣黏著蛋白 蛋白(例如，MN--鈣黏著蛋白、鈣黏著蛋白-8)的一個ECl結(jié)構(gòu)域上的親和力大至少約5 倍、優(yōu)選至少約10倍。在一種具體的實施方案中，特異性地結(jié)合到一種鈣黏著蛋白-11蛋 白的一個ECl結(jié)構(gòu)域上的鈣黏著蛋白-11拮抗劑以一種親和力與一種表位相結(jié)合，該表位存在于SEQ IDNO :3、人類鈣黏著蛋白-11的ECl結(jié)構(gòu)域的N端部分中，該親和力比該鈣黏 著蛋白-11拮抗劑與存在于SEQ ID NO :4、人類麗鈣黏著蛋白的ECl結(jié)構(gòu)域的N端部分中 的一種表位相結(jié)合的親和力以及該鈣黏著蛋白-11拮抗劑與存在于SEQ ID N0:5、人類鈣 黏著蛋白_8的ECl結(jié)構(gòu)域的N端部分中的一種表位相結(jié)合的親和力大至少約5倍、優(yōu)選至 少約10倍。如在此使用的，術(shù)語“抗體”旨在涵蓋整個抗體以及抗體片段(例如，抗體的抗原 結(jié)合片段，例如Fv、FC、Fd、Fab、Fab'、F(ab')、以及dAb片段)?！翱贵w”是指多克隆和單 克隆抗體，并且包括自然發(fā)生的以及工程化處理的抗體。因此，術(shù)語“抗體”包括例如人類 的、嵌合的、人源化的、靈長源化的(primatized)、鑲飾的(veneered)、單鏈的、以及結(jié)構(gòu)域 抗體(dAb) ο (參見例如 Harlow et al. ,Antibodies A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,1988)。術(shù)語“表位”是指由一種免疫球蛋白VH/\對常規(guī)地結(jié)合的一種結(jié)構(gòu)單元。一種表 位限定了對一種抗體的最小結(jié)合部位，并且因此代表一種抗體的靶特異性。術(shù)語“融合蛋白”是指一種自然發(fā)生的、合成的、半合成的、或重組的單一蛋白分 子，該蛋白分子包括兩種或多種異源多肽的的全部或一部分。術(shù)語“多肽”是指一種氨基酸聚合體，而沒有特定的長度；因此，肽、低聚肽、以及蛋 白是包括在一種多肽的定義之內(nèi)的。如在此所使用的，術(shù)語“肽”是指一種化合物，該化合物由從大約2個至大約100個 氨基酸殘基組成，其中一個氨基酸的氨基基團是通過一種肽鍵而連接至另一種氨基酸的羧 基基團上的。此類肽在長度上典型地是小于約100個氨基酸殘基，并且優(yōu)選為約10、約20、 約30、約40、或約50個殘基。如在此使用的，術(shù)語“模擬肽”是指多種分子，這些分子不是肽或蛋白、但是它們模 擬了這些肽或蛋白的結(jié)構(gòu)的多個方面。模擬肽拮抗劑可以是通過常規(guī)的化學方法來制備的 (參見，例如 Damewood J. R. “Peptide Mimetic Design with the Aid of Computational Chemistry，，in Reviews in Computational Biology，2007，Vol. 9, pp. 1-80, John Wiley and Sons，Inc.，New York，1996 ；Kazmierski W. K.，“Methods of Molecular Medicine Peptidomimetic Protocols，，，Humana Press, New Jersey，1999)。如在此所定義的、“治療”是將一種具體的治療性或預防性(prophalytic)試劑給 予受試者(例如，一種哺乳動物、人)，這產(chǎn)生了對于該受試者的一種令人希望的治療性或 預防性益處。如在此所定義的，一種“治療方案”是一種方案，其中將一種或多種治療性或預防 性試劑以一種具體的劑量(例如，水平、量值、數(shù)量)并且在一種具體的時間表上或以具體 的間隔(例如，數(shù)分鐘、數(shù)天、數(shù)周、數(shù)月)給予哺乳動物受試者。如在此所定義的，一種“治療有效量”是一種量值，該量值足以在給藥條件下達到 所希望的治療性或預防性效應，例如足以在一個關(guān)節(jié)中抑制(即降低、防止)炎癥(例如， 通過抑制細胞(例如，表達鈣黏著蛋白-11的滑膜細胞)的聚集)的一種量值。一種治療 效力(例如，在一個關(guān)節(jié)中降低炎癥和/或在一個關(guān)節(jié)中防止炎癥)可以是通過適當?shù)姆?法(例如，成像方法，如MRI、NMR、CT)來確定的。鈣黏著蛋白
11
鈣黏著蛋白屬于Ca2+依賴性黏附分子大家族，這些分子以一種同型的方式通過結(jié) 合到其他鈣黏著蛋白上而介導了細胞黏附(MJ Wheelock and KR Johnson, Ann. Rev. Cell Dev. Biol. 19 =207-235 (2003)) 0經(jīng)典的鈣黏著蛋白是單次跨膜蛋白質(zhì)，它們含有五個細胞 外鈣黏著蛋白(EC)結(jié)構(gòu)域(每個的長度大約為110個氨基酸)、一個跨膜區(qū)、以及一個保守 的胞質(zhì)域。鈣黏著蛋白基于在這些EC結(jié)構(gòu)域之間的同源性程度而被分成I型或II型鈣黏 著蛋白。II型鈣黏著蛋白包括人類鈣黏著蛋白-5、_6、-8、-11、以及-12、以及MN-鈣黏著 蛋白。這些胞外域中的每一個在介導細胞間結(jié)合中的作用的相對重要性是不清楚的。鈣黏著蛋白-11在滑膜細胞中的活性鈣黏著蛋白-11在可活動的關(guān)節(jié)的滑液內(nèi)層中介導了滑膜細胞與滑膜細胞的 結(jié)合(Valencia et al.，J. Exp. Med. 200(12) 1673-1679 (2004) ；Kiener and Brenner, Arthritis Res Ther. 7 (2) :49_54 (2005))。一種融合蛋白(該融合蛋白包括人類鈣黏著蛋 白-11的所有五種細胞外鈣黏著蛋白結(jié)構(gòu)域、融合至人類IgG2的鉸鏈-CH2-CH3結(jié)構(gòu)域上) 在體外抑制了滑膜細胞內(nèi)層的形成(Kiener et al.，Am. J. Pathol. 168 (2006))。另外，拮 抗性的抗鈣黏著蛋白-11抗體以及一種融合蛋白(包括鼠鈣黏著蛋白-11的EC1-5、融合至 鼠IgG2a的鉸鏈-CH2-CH3結(jié)構(gòu)域上)在類風濕性關(guān)節(jié)炎的鼠模型中抑制了炎癥和關(guān)節(jié)腫 脹(Lee et al.，Science 315:1006-1010(2007))。鈣黏著蛋白-11拮抗劑本發(fā)明的一種鈣黏著蛋白-11拮抗劑可以是特異性地結(jié)合到一種鈣黏著蛋白-11 蛋白的一個ECl結(jié)構(gòu)域上、并且在細胞中抑制(例如，減少、防止)一種或多種鈣黏著蛋 白-11-介導的活性的任何試劑。鈣黏著蛋白-11-介導的活性包括但不限于在細胞表面上 表達鈣黏著蛋白-11的細胞的聚集、以及多種因子(例如像，膠原酶、絲氨酸蛋白酶、MMP1、 匪 3、11^-6、11^-8、或1^瓶17^1^^^)的表達或分泌。該試劑除其他之外還可以是一種抗體、 融合蛋白、肽、模擬肽、小分子、或核酸。鈣黏著蛋白-11抗體如在此所說明的，與人類鈣黏著蛋白-11的ECl結(jié)構(gòu)域的N端部分(它包括Cad-Il 的供體序列和鈣黏著蛋白結(jié)合口袋)(例如SEQ IDNO 3)內(nèi)的一種表位相結(jié)合的抗體與結(jié) 合到這種蛋白的其他區(qū)域中的表位的抗體相比，在體外更加有效地阻斷了鈣黏著蛋白-11 活性(見實例1和2)。因此，在一個實施方案中，本發(fā)明提供看一種抗體或它的抗原結(jié)合片段，它與一種 表位相結(jié)合(例如，特異性地結(jié)合)，該表位存在于一種鈣黏著蛋白-11蛋白的ECl結(jié)構(gòu) 域的N端部分中，該部分包括Cad-Il的供體序列和鈣黏著蛋白結(jié)合口袋。術(shù)語“抗體”旨 在涵蓋所有類型的多克隆和單克隆抗體(例如，人類的、嵌合的、人源化的、靈長源化的、鑲 飾的、單鏈、結(jié)構(gòu)域抗體(dAb))、以及抗體的抗原結(jié)合片段(例如Fv、Fe、Fd、Fab、Fab'、 F(ab' )、dAb)。(參見，例如 Harlow et al. , Antibodies A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory，1988)。在一種具體的實施方案中，這種Cad-IlECl結(jié)構(gòu)域特 異性抗體是一種人類抗體或人源化抗體。Cad-IlECl結(jié)構(gòu)域特異性抗體還可以被直接或間 接地連接至一種細胞毒劑上。特異性地結(jié)合到一種Cad-Il蛋白的ECl結(jié)構(gòu)域的N端部分上并且抑制該Cad-Il 蛋白活性的其他抗體或抗體片段還可以通過常規(guī)的方法或其他適用的技術(shù)來進行生產(chǎn)、構(gòu)建、工程化處理、和/或分離。例如，對于一種鈣黏著蛋白-11的ECl結(jié)構(gòu)域特異的抗體可 以對抗一種適當?shù)拿庖咴a(chǎn)生，例如一種重組哺乳動物(例如，人類)鈣黏著蛋白-IlECl 結(jié)構(gòu)域肽(例如SEQ ID NO 3)或它的一部分(包括合成分子，例如合成肽)。已經(jīng)說明了不 同的方法(參見，例如Kohler et al. ,Nature, 256 :495_497 (1975)以及Eur. J. Immunol. 6 511-519(1976) ；Milstein et al. , Nature 266 550-552(1977) ；Koprowski et al., U.S.Patent No. 4, 172, 124 ；Harlow, Ε.and D.Lane,1988, Antibodies :A Laboratory Manual,(ColdSpring Harbor Laboratory :Cold Spring Harbor,NY) ；Current Protocols In Molecular Biology,Vol. 2(Supplement 27,Summer' 94),Ausubel,F. M. et al. ,Eds., (John Wiley & Sons =New York, NY)，Chapter 11，(1991))?？贵w還可以通過用表達鈣黏 著蛋白-11的ECl結(jié)構(gòu)域的細胞(例如，癌細胞/細胞系)或被工程化處理為表達鈣黏著 蛋白-11的ECl結(jié)構(gòu)域的細胞(例如，轉(zhuǎn)染的細胞)對一種適當?shù)乃拗?例如，小鼠)進 行免疫而產(chǎn)生。(參見，例如 Chuntharapai et al. , J. Immunol, 152 1783-1789 (1994)； Chuntharapai等的美國專利號5，440，021)。為了生產(chǎn)單克隆抗體，可以通過將一種適當?shù)?無限增殖性細胞系(例如，一種骨髓瘤細胞系，如SP2/0或P3X63Ag8. 653)與產(chǎn)生抗體的細 胞進行融合而產(chǎn)生一種雜交瘤。這些產(chǎn)生抗體的細胞可以是從用所感興趣的抗原進行免疫 的人或其他適當?shù)膭游锏耐庵苎?、或?yōu)選脾或淋巴結(jié)而獲得的。這些融合的細胞(雜交瘤) 可以是使用選擇性培養(yǎng)條件來分離的，并且通過有限稀釋而被克隆。具有所希望的特異性 的、產(chǎn)生抗體的細胞可以通過一種適當?shù)臏y定來進行選擇(例如，ELISA)?？贵w片段可以是通過酶促切割或通過重組技術(shù)而產(chǎn)生的。例如，木瓜蛋白酶或胃 蛋白酶切割可以對應地產(chǎn)生Fab或F(ab' )2片段。具有必要的底物特異性的其他蛋白酶 也可以用于產(chǎn)生Fab或F(ab' )2片段。還可以使用抗體基因來產(chǎn)生不同的平截形式的抗 體，在這些基因中一種或多種終止密碼子已經(jīng)被引入該自然的終止位點的上游。例如，對一 個F(ab' )2重鏈部分進行編碼的嵌合基因可以被設計成包括對該重鏈的CH1結(jié)構(gòu)域和絞 鏈區(qū)進行編碼的DNA序列。單鏈抗體，以及人類的、嵌合的、人源化的、或靈長源化的(CDR 移植的)、或鑲飾的抗體，連同嵌合的、CDR移植的、或鑲飾的單鏈抗體(包括由不同物種衍 生的部分)，以及類似物也由本發(fā)明以及術(shù)語“抗體”所涵蓋。這些抗體的不同部分可以 由常規(guī)技術(shù)通過化學方式連接在一起，或可以使用遺傳工程技術(shù)制備為一種連續(xù)蛋白。例 如，可以對編碼了一種嵌合的或人源化的鏈的核酸進行表達以產(chǎn)生一種連續(xù)蛋白。參見， 例如Cabilly等人，美國專利號4，816，567 ；Cabilly等人，歐洲專利號O, 125，023B1 ；Boss 等人，美國專利號4，816，397 ；Boss等人，歐洲專利號O, 120，694B1 ；Neuberger, M. S.等 人，WO 86/01533 ；Neuberger, M. S.等人，歐洲專利號 O, 194，276B1 ；Winter，美國專利號 5，225，539 ；Winter,歐洲專利號 O, 239，400B 1 ；Queen 等人，歐洲專利號 O 451 216B1 ；以 R Padlan, Ε. A.等人，EP O 519 596A1。還參見 Newman，R. . et al.，BioTechnology, 10 1455-1460 (1992)(關(guān)于靈長源化的抗體)，以及Ladner等人，美國專利號4，946，778和 Bird, R. Ε. et al.，Science, 242 :423_426 (1988))(關(guān)于單鏈抗體)。人源化的抗體可以使用標準方法或其他適當?shù)募夹g(shù)、使用合成或重組DNA技術(shù) 來進行生產(chǎn)。對人源化的可變區(qū)進行編碼的核酸(例如cDNA)序列還可以使用PCR誘變 方法進行構(gòu)建，從而改變對一種人類或人源化的鏈進行編碼的DNA序列，例如來自一種之 前被人源化的可變區(qū)的DNA模板(參見，例如Kamman, M.，et al.，Nucl. Acids Res.，17 5404(1989)) ；Sato, K. ,et al. , Cancer Research，53 :851_856(1993) ；Daugherty,B. L. et al.，Nucleic Acids Res. , 19(9) :2471_2476 (1991)；以及 Lewis，A. P. and J. S. Crowe, Gene,101 =297-302 (1991)) 0使用這些或其他適當?shù)姆椒?，還可以容易地產(chǎn)生多種變體。在 一個實施方案中，可以對經(jīng)克隆的可變區(qū)(例如dAb)進行突變，并且可以選擇具有令人希 望的特異性的編碼變體的序列(例如，來自一種噬菌體文庫；參見，例如Krebber等人，美國 5，514，548 ；Hoogenboom 等人，WO 93/06213，于 1993 年 4 月 1 日公布)。可以使用產(chǎn)生或分離具有這些必需特異性的抗體的其他適當方法，包括例如從 一個文庫(例如，噬菌體展示文庫)中選擇一種重組抗體或抗體結(jié)合片段(例如，dAb) 的方法、或依賴于對轉(zhuǎn)基因動物(例如，小鼠)進行免疫的方法。能夠生產(chǎn)人類抗體表達 譜的轉(zhuǎn)基因動物在本領(lǐng)域中是眾所周知的(例如，[Xenomouse (Abgenix，F(xiàn)remont, CA))，并且是可以使用適當?shù)姆椒▉砩a(chǎn)的(參見，例如Jakobovits et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA,90 2551-2555(1993) Jakobovits et al. , Nature,362 255-258(1993)； Lonberg等人，美國專利號5，545，806 ；Surani等人，美國專利號5，545，807 ；Lonberg等人， WO 97/13852)。在一個實施方案中，本發(fā)明涵蓋了一種Cad-Il抗體，該Cad-Il抗體與一種表位相 結(jié)合，該表位存在于人類Cad-Il的ECl結(jié)構(gòu)域的前大約37個氨基酸(SEQ ID NO :13)中。 在一種具體的實施方案中，本發(fā)明涉及一種Cad-Il抗體，該Cad-Il抗體與一種表位相結(jié) 合，該表位存在于SEQ ID N0:10中。在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及一種Cad-Il抗體， 該Cad-Il抗體與一種表位相結(jié)合，該表位包括SEQ ID NO=Il0在另一個實施方案中，本發(fā) 明涉及一種Cad-Il抗體，該Cad-Il抗體與一種表位相結(jié)合，該表位存在于SEQ ID NO 12 中。
在一個實施方案中，本發(fā)明涉及由雜交瘤HlMl ( ATCC登錄號
_)產(chǎn)生的一種Cad-Il抗體，該抗體已經(jīng)于2009年1月8日保存
在美國種質(zhì)保存中心(ATCC), P. O. Box 1549，Manassas，Virginia 20108, 美國。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了由雜交瘤Η14 (ATCC登錄
號_)產(chǎn)生的一種Cad-Il抗體，該抗體已經(jīng)于2009年1月8日保
存在美國種質(zhì)保存中心(ATCC)，P. O. Box 1549，Manassas, Virginia 20108,美國。本發(fā)明還涵蓋多種抗體，這些抗體與由雜交瘤HlMl產(chǎn)生的一種Cad-Il抗體和/ 或由雜交瘤H14產(chǎn)生的一種Cad-11抗體特異性地競爭結(jié)合到一種人類Cad-11蛋白或它的 一種含ECl-結(jié)構(gòu)域的部分上(例如SEQID N0:3、10、12、13)。在一個具體的實施方案中， 特異性地與由雜交瘤HlMl和/或雜交瘤H14產(chǎn)生的一種Cad-Il抗體進行競爭的抗體阻斷 (例如，抑制、減少、防止)由雜交瘤HlMl和/或雜交瘤H14產(chǎn)生的一種Cad-Il抗體與一種 人類Cad-Il蛋白或它的含ECl-結(jié)構(gòu)域的部分(例如，SEQ ID NO :3、10、12、13)的結(jié)合。此外，本發(fā)明涵蓋了多種抗體，這些抗體具有對于一種人類Cad-Il蛋白或它的含 ECl-結(jié)構(gòu)域的部分(例如，SEQ ID NO :3、10、12、13)的結(jié)合親和力，該結(jié)合親和力是至少與由雜交瘤HlMl產(chǎn)生的一種Cad-Il抗體和/或由雜交瘤H14產(chǎn)生的一種Cad-Il抗體對于 一種人類Cad-Il蛋白或它的含ECl-結(jié)構(gòu)域的部分的結(jié)合親和力一樣大。鈣黏著蛋白-11融合蛋白此外，與包括Cad-Il的EC區(qū)域的一種更大部分的一種融合蛋白(它包含所有5 個EC結(jié)構(gòu)域)相比，僅包含人類Cad-Il的ECl結(jié)構(gòu)域(例如，與人類IgG的一部分相融合 的人類Cad-Il的ECl結(jié)構(gòu)域)的免疫球蛋白融合蛋白在體外更加有效地抑制了 Cad-Il活性。鈣黏著蛋白-11拮抗劑還涵蓋了嵌合的、或融合的蛋白，這些蛋白包括可操作地 連接至一種異源蛋白質(zhì)的全部或一部分上的人類Cad-Il的ECl結(jié)構(gòu)域的至少約N-端的35 個氨基酸(SEQ ID NO :2)?！翱刹僮鞯剡B接”是指該Cad-IlECl結(jié)構(gòu)域的部分與該異源蛋白 質(zhì)被框內(nèi)融合(fused in-frame)。該異源蛋白質(zhì)可以被融合至該蛋白的N-端或C-端上。 例如，該融合蛋白可以是一種GST融合蛋白，其中這些蛋白序列被融合到一種GST序列的C 端上。其他類型的融合蛋白包括但不限于酶性的融合蛋白，例如半乳糖苷酶融合蛋 白、酵母雙雜交GAL融合蛋白、聚組氨酸融合體、FLAG-標記的融合蛋白、GFP融合蛋白、以 及免疫球蛋白(Ig)融合蛋白。這種融合蛋白可以促進純化(例如，一種重組融合蛋白的純 化)。在某些宿主細胞中(例如，哺乳動物的宿主細胞)，可以通過使用一種異源的信號序 列來增加一種蛋白的表達和/或分泌。因此，在另一個實施方案中，該融合蛋白在其N端包 含一種異源的信號序列。EP-A-0464533披露了多種融合蛋白，這些融合蛋白包括免疫球蛋白恒定區(qū)的不 同部分。該Fc在治療和診斷方面是有用的，并且因此產(chǎn)生了(例如)改進的藥物代謝 動力學特性(參見，例如EP-A0232262)。在藥物發(fā)現(xiàn)方面，例如，出于高通量篩選測定的 目的，已經(jīng)將人類蛋白與Fc部分進行融合以識別拮抗劑(Bennett et al. , Journal of Molecular Recognition 8:52-58(1995) ； Johanson et al. , J. Biol. Chem. , 270 (16) 9459-9471(1995))。因此，這項發(fā)明還涵蓋了可溶的融合蛋白，這些融合蛋白包含本發(fā)明的 一種蛋白Cad-Il拮抗劑、以及不同子類的免疫球蛋白的重鏈和/或輕鏈的恒定區(qū)的不同部 分(例如，IgG, IgM, IgA, IgE)。本發(fā)明的免疫球蛋白融合蛋白的優(yōu)點包括以下各項中的一 個或多個(1)由于得到的二價的二聚融合蛋白，對于多價配體的增加的親合力，(2)更長 的血清半衰期，(3)經(jīng)由該Fc結(jié)構(gòu)域激活效應細胞的能力，(4)易于純化(例如，通過蛋白 A層析)、(5)對于Cad-Il的親和力以及，(6)阻斷Cad-Il介導的活性的能力。因此，在具體的實施方案中，該Cad-Il拮抗劑是一種融合蛋白，該融合蛋白包括 一種鈣黏著蛋白-11蛋白的胞外區(qū)的一部分，它包括可操作地連接至一種哺乳動物免疫球 蛋白的全部或一部分上的ECl結(jié)構(gòu)域的N-端部分(SEQ ID NO 2的氨基酸54-90)。在一 個具體的實施方案中，本發(fā)明的這些免疫球蛋白融合蛋白并不包括鈣黏著蛋白-11的胞外 區(qū)的一部分，該部分包括在SEQ ID NO 2的氨基酸1-609內(nèi)所包含的全部5個EC結(jié)構(gòu)域。 在某些實施方案中，該人類鈣黏著蛋白-11胞外區(qū)的部分可以包括例如SEQ ID N0:2的氨 基酸1-160、氨基酸1-259、或氨基酸1-269。在一個具體的實施方案中，該融合蛋白缺乏人 類鈣黏著蛋白-11的前導序列和前體區(qū)域(pro-region) (SEQ ID NO 2的氨基酸1-53)，并 且使用了一種異源性(heterogologous)前導序列。該免疫球蛋白部分可以來自任何脊椎 動物來源，如鼠類，但優(yōu)選地是一種人類免疫球蛋白。在一個實施方案中，該哺乳動物免疫球蛋白是一種人類IgG2蛋白或它的一部分，例如人類IgG2的鉸鏈-CH2-CH3部分。本發(fā)明的一種嵌合的或融合的蛋白可以通過標準的重組DNA技術(shù)進行生產(chǎn)。例 如，對不同的蛋白序列(例如，一種Cad-IlECl結(jié)構(gòu)域肽以及一種哺乳動物免疫球蛋白)進 行編碼的DNA片段按照常規(guī)的技術(shù)一起進行框內(nèi)連接在另一個實施方案中，該融合基因可 以通過多種常規(guī)技術(shù)(包括自動化的DNA合成儀)進行合成?？商娲兀梢允褂缅^定引物 進行核酸片段的PCR擴增，這些錨定引物在兩個連續(xù)的核酸片段之間產(chǎn)生互補的突出端， 這些核酸片段隨后可以進行退火和再擴增從而產(chǎn)生一種嵌合的核酸序列(參見，Ausubel et al. , Current Protocols in Molecular Biology, 1992)。此夕卜,許多表達載體是可商 購獲得的，它們已經(jīng)編碼了一個融合部分(例如，一個GST部分、一個Fc部分)。可以將編 碼了蛋白Cad-Il拮抗劑的一種核酸分子克隆到這種表達載體中，這樣使得該融合部分(例 如，免疫球蛋白)被框內(nèi)連接至該蛋白上。本發(fā)明的免疫球蛋白融合蛋白可以作為單體、二聚體、四聚體、或其他多聚體(例 如，聚合體)進行提供。例如，該融合蛋白的免疫球蛋白部分的可變域可以通過以下方式連 接在一起以形成多價配體，例如在每個V結(jié)構(gòu)域的C端提供一種絞鏈區(qū)以及在這些絞鏈區(qū) 中的半胱氨酸之間提供二硫鍵；或提供多種重鏈，這些重鏈中的每一個在該結(jié)構(gòu)域的C端 上具有一個半胱氨酸，這些半胱氨酸由二硫鍵連接在一起；或產(chǎn)生V-CH和V-CL以產(chǎn)生一種 Fab形式；或使用肽接頭(例如，Gly4Ser接頭)從而產(chǎn)生二聚體、三聚體、以及其他多聚體。 例如，這類配體可以與一種抗體Fc區(qū)相連接，該Fc區(qū)域包括CH2和CH3結(jié)構(gòu)域的一個或這 兩者、以及可任選的一個絞鏈區(qū)。例如，對多種配體進行編碼的載體(作為一種單一的核苷 酸序列與一個Fc區(qū)相連接)可以用于制備此類配體(例如，通過表達)。本發(fā)明的免疫球蛋白融合蛋白可以與其他部分相偶聯(lián)，這些部分包括但不限于 聚乙二醇(PEG)的多聚體或它們的衍生物(例如，聚甲基乙二醇)、放射性核素、細胞毒性試 劑和藥物，并且隨后用于體內(nèi)治療。放射性核素的例子除其他之外還包括包括212Bi、mI、 186Re,以及9°Y。這些放射性核素通過局部照射這些細胞來發(fā)揮它們的細胞毒性效應，導致 不同的細胞內(nèi)損害，正如放療領(lǐng)域內(nèi)所已知?？梢耘c這些融合蛋白相偶聯(lián)的細胞毒性藥物 包括但不限于柔紅霉素、阿霉素、甲氨蝶呤、以及絲裂霉素C。細胞毒性藥物類妨礙了關(guān)鍵 的細胞加工，包括DNA、RNA、以及蛋白質(zhì)合成。對于這些類別的藥物(它們在本領(lǐng)域中是 已知的)、以及它們的作用機制的更加充分的展示，參見Goodman，A. G.，et al.，Goodman and Gilman ‘ s The Pharmacological Basis of Therapeutics,8th Ed. , Macmillan Publishing Col,1990,Katzung,ed. ,Basic and Clinical Pharmacology,Fifth Edition, ρ 768-769，808-809，896，Appleton and Lange，Norwalk，Conn。如在此所使用的，術(shù)語“免疫球蛋白融合蛋白，，包括本發(fā)明的這些免疫球蛋白融合 蛋白的片段。此類片段旨在本發(fā)明的范圍內(nèi)。例如，一旦這些分子被分離，可以用蛋白酶對 它們進行切割從而產(chǎn)生仍然能夠與人類Cad-Il的ECl結(jié)構(gòu)域相結(jié)合的片段。肽拮抗劑本發(fā)明的鈣黏著蛋白-11拮抗劑還可以是與一種鈣黏著蛋白-11蛋白的ECl結(jié) 構(gòu)域相結(jié)合的肽。這種肽可以包括任何適當?shù)腖-和/或D-氨基酸，例如常見的α-氨基 酸(例如，丙氨酸、甘氨酸、纈氨酸)、非-α-氨基酸(例如，β-丙氨酸、4-氨基丁酸、6-氨 基己酸、肌氨酸、抑胃酶氨酸(statine))、以及不常見的氨基酸(例如，瓜氨酸、同型瓜氨
16酸(homocitruline)、同型絲氨酸、正亮氨酸、正纈氨酸、鳥氨酸)。在一種肽上的氨基、羧 基和/或其他官能團可以是游離的(例如，未被修飾)或用一種適當?shù)谋Ｗo基團進行保護 的。針對氨基基團和羧基基團的適當?shù)谋Ｗo基團、以及用于加入或去除保護基團的方法在 本領(lǐng)域內(nèi)是已知的，并且被披露于例如Green and ffuts,"Protecting Groups in Organic Synthesis”，John Wiley and Sons，1991。一種肽的官能團還可以使用領(lǐng)域已知的多種方 法進行衍生(例如，烷基化)。若希望，這種肽Cad-Il拮抗劑可以包括一種或多種修改(例如，氨基酸接頭、?；?作用、乙?；饔?、酰胺化作用、甲基化作用、末端修飾劑(例如，環(huán)化修飾作用))。這種肽 還可以含有化學修飾作用(例如，N-甲基-α-氨基取代)。此外，這種肽拮抗劑可以是一 種已知的和/或自然發(fā)生的肽的類似物，例如具有一種或多種保守的氨基酸殘基取代的肽 類似物。這些修飾可以改進這種肽的不同的特性(例如，溶解度、結(jié)合性)，包括它的鈣黏著 蛋白-11拮抗劑活性。Cad-Il拮抗劑(它們是肽)可以是直鏈的、支鏈或環(huán)狀的，例如具有一種雜原子 環(huán)狀結(jié)構(gòu)(包括若干酰胺鍵)的肽。在一個具體的實施方案中，該肽是一種環(huán)肽。此類肽 可以由本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員使用標準的技術(shù)來進行產(chǎn)生。例如，一種肽可以通過酶促 或化學切割從一種天然蛋白衍生或去除，或可以通過適當?shù)姆椒ㄟM行合成，例如固相肽合 成(例如，梅里菲爾德型合成(Merrifield-type synthesis)(參見，例如Bodanszky et al. "Peptide Synthesis，，，John Wiley & Sons, Second Edition，1976))。作為鈣黏著蛋 白-11拮抗劑的肽還可以使用(例如)重組DNA方法學或其他適當?shù)亩喾N方法進行生產(chǎn) (參見，例如 Sambrook J. and Russell D. W. , Molecular Cloning :A Laboratory Manual, 3rd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 2001)。這些肽可以被合成并且裝配到文庫種，這些文庫包括少許至許多離散的分子種 類。此類文庫可以使用組合化學的方法戶必須報告制備，并且可以使用任何適當?shù)姆椒ㄟM 行篩選以確定該文庫是否包括具有一種令人希望的生物活性的肽。然后，可以使用適當?shù)?方法將此類肽拮抗劑分離。模擬肽拮抗劑鈣黏著蛋白-11拮抗劑還可以是模擬肽。例如，可以制備具有與肽類具有相同官 能團的多糖?？梢詫Χ喾N模擬肽進行設計，這是(例如)通過在該環(huán)境中建立一種肽試劑 的三維結(jié)構(gòu)來進行的，其中該試劑結(jié)合到或?qū)⒁Y(jié)合到一種靶分子上。該模擬肽包括至少 兩種組分這種或這些結(jié)合部分以及主鏈或支撐結(jié)構(gòu)。這些結(jié)合部分是以下化學原子或基團，它們將與一種靶分子(例如，與Cad-Il的 ECl結(jié)構(gòu)域中具有氨基酸)進行反應或與其形成一種復合物(例如，通過疏水性或離子相互 作用)。例如，在一種模擬肽中這些結(jié)合部分可以與在一種肽或蛋白拮抗劑中的那些相同。 這些結(jié)合部分可以是一種原子或化學基團，它與該受體按照與該肽拮抗劑中的結(jié)合部分相 同或相似的方式進行反應。例如，計算化學可用于設計一種鈣黏著蛋白-11蛋白的ECl結(jié) 構(gòu)域的供體序列的肽模擬物，例如它可以與在Cad-Il蛋白的ECl結(jié)構(gòu)域中的口袋序列相結(jié) 合。適合用于針對一種肽中的堿性氨基酸進行設計的模擬肽的結(jié)合部分的例子包括含氮基 團，如胺類、銨類、胍類、以及酰胺類或磷鐺類。適合用于針對一種酸性氨基酸進行設計的模擬肽的結(jié)合部分的例子包括例如羧基、低級烷基羧酸酯、磺酸、一種低級烷基磺酸酯、或亞 磷酸或它的酯。該支撐結(jié)構(gòu)是以下化學實體，該化學實體當這種或這些結(jié)合部分結(jié)合時提供了該 模擬肽的三維構(gòu)型。該支撐結(jié)構(gòu)可以是有機的或無機的。有機支撐結(jié)構(gòu)的例子包括多糖、 聚合物、或有機合成的聚合物的寡聚體(如聚乙烯醇或聚丙交酯)。優(yōu)選的是該支撐結(jié)構(gòu)基 本上具有與該肽主鏈或支撐結(jié)構(gòu)相同的大小和尺寸。這可以通過計算或測量這種肽和模擬 肽的原子和鍵的大小而確定。在一個實施方案中，這種肽鍵的氮可以用氧或硫取代，例如形 成一條聚酯主鏈。在另一個實施方案中，該羰基可以用一種磺酰基基團或亞磺?；鶊F取 代，從而形成一種聚酰胺(例如，一種聚磺酰胺)?？梢灾苽溥@種肽的反向酰胺(例如，將一 種或多種-CONH-基團置換為一種-NHCO-基團)。在又另一個實施方案中，這種肽主鏈可以 用一條聚硅烷主鏈取代。可以通過已知的方法來制造這些化合物。例如，一種聚酯模擬肽可以通過將一種 羥基基團取代為在多種氨基酸上的對應的α-氨基基團來進行制備，由此制備了一種羥 酸，并且將這些羥酸順序地酯化、可任選地將這種堿性和酸性側(cè)鏈阻擋以使副反應最小化。 確定一種適當?shù)幕瘜W合成路線大體上很容易在確定該化學結(jié)構(gòu)時進行鑒定?？梢院铣啥喾N模擬肽并且將其裝配到文庫中，這些文庫包括少許至許多離散的分 子種類?？梢允褂檬熘慕M合化學方法來制備此類文庫，并且可以對其進行篩選以確定該 文庫是否包括一種或多種模具有所希望的活性的擬肽。然后，可以通過適當?shù)姆椒▽⒋祟?模擬肽拮抗劑分離。小分子拮抗劑鈣黏著蛋白-11拮抗劑還可以是多種小分子。多種小分子的例子包括有機化合 物類，有機金屬化合物類，無機化合物類，以及有機物的、有機金屬化合物的或無機化合物 的鹽類。在一種小分子中的原子典型地通過共價的和/或離子鍵連接在一起。在一種小的 有機分子中原子的安排可以表示一條鏈(例如，一條碳_碳鏈或一條碳_雜原子鏈)、或可 以表示一種包含多個碳原子的環(huán)，例如苯或一種聚環(huán)的系統(tǒng)、或碳與多個雜原子的組合，即 多個雜環(huán)，例如嘧啶或喹唑啉。盡管小分子可以具有任何分子量，它們大體上包括小于約 5，000道爾頓的分子。例如，此類小分子可以是小于約1000道爾頓，并且優(yōu)選是小于約750 道爾頓、或更優(yōu)選是小于約500道爾頓。多種小分子以及其他非肽性鈣黏著蛋白-11拮抗劑 可以在自然界中發(fā)現(xiàn)(例如，識別的、分離的、純化的)和/或合成產(chǎn)生的(例如，通過傳統(tǒng) 的有機合成、生物-介導的合成、或它們的一種組合)。參見，例如Ganesan，Drug Discov. Today 7(1) :47_55 (2002 年 1 月)；Lou, Drug Discov. Today, 6 (24) :1288_1294 (2001 年 12 月)。自然發(fā)生的多種小分子的例子包括但不限于激素類、神經(jīng)遞質(zhì)類、核苷酸類、氨基酸 類、糖類、脂質(zhì)類、以及它們的衍生物。根據(jù)本發(fā)明的一種小分子鈣黏著蛋白-11拮抗劑以及它的生理學可接受的鹽類 可以抑制一種鈣黏著蛋白-11蛋白的同型結(jié)合(例如，通過直接與一種Cad-Il的ECl結(jié)構(gòu) 域中的供體序列競爭結(jié)合到另一種鈣黏著蛋白-11的結(jié)合口袋上，通過直接與一種Cad-Il 蛋白的ECl結(jié)構(gòu)域中的結(jié)合口袋競爭結(jié)合到另一種鈣黏著蛋白-11的供體序列上)。核酸拮抗劑本發(fā)明的Cad-Il拮抗劑還可以是與一種人類鈣黏著蛋白-11的ECl結(jié)構(gòu)域相結(jié)合的核酸分子(例如，寡核苷酸)。適當?shù)暮怂酑ad-Il拮抗劑包括適體類，它們能夠以高親 和力以及特異性通過除經(jīng)典的沃森-克里克(Watson-Crick)堿基配對以外的交互作用結(jié) 合到一種具體的感興趣的分子上(例如，人類鈣黏著蛋白-11的ECl結(jié)構(gòu)域)(Tuerk and Gold, Science 249:505(1990) ；Ellington and Szostak, Nature 346:818(1990))。適體類，與通過噬菌體展示或單克隆抗體(MAb)所產(chǎn)生的肽類一樣能夠特異性地 結(jié)合到選定的靶標上，并且通過結(jié)合、阻斷它們的靶標發(fā)揮作用的能力。已經(jīng)針對超過100 種蛋白產(chǎn)生了由一種體外選擇過程從隨機序列寡核苷酸的集合體中生成的多種適體，這些 蛋白包括生長因子類、轉(zhuǎn)錄因子類、酶類、免疫球蛋白類、以及受體類。一種典型的適體其大 小為10至15kDa (30至45個核苷酸)、以亞納摩爾的親和力與其靶標相結(jié)合、并且與密切相 關(guān)的靶標相區(qū)分(例如，將典型地不與來自相同基因家族的其他蛋白相結(jié)合)。一系列的結(jié) 構(gòu)性研究已經(jīng)顯示多種適體能夠使用在抗體-抗原復合物中驅(qū)動親和力和特異性的相同 類型的結(jié)合相互作用(氫鍵、靜電的互補性、疏水性接觸、位阻排阻、等等)。與所感興趣的一種靶標相結(jié)合的適體(例如，一種人類Cad-Il蛋白的一種ECl結(jié) 構(gòu)域)可以使用一種被稱為“通過指數(shù)富集對配體的系統(tǒng)進化”(SELEX)的標準方法而進行 產(chǎn)生和鑒定，該方法說明于(例如)美國專利號5，475，096和美國專利號5，270，163。鈣黏著蛋白-11拮抗劑的鑒定具有鈣黏著蛋白-11結(jié)合特異性的多種試劑(包括多種小分子)可以在一種篩選 中進行鑒定，例如多種化學化合物和/或文庫(例如，化學的、肽、核酸文庫)的高通量篩 選。特異性地結(jié)合到人類鈣黏著蛋白-11的ECl結(jié)構(gòu)域上的多種抗體可以(例如)通 過篩選可商購的組合抗體文庫進行鑒定(Dyax Corp. , MorphoSys AG)。篩選這些文庫的 多種適當?shù)慕M合抗體文庫和標準方法說明于Hoet et al. ,Nature Biotechnology 23(3) 344-348(2005)以及 Rauchenberger et al. , J. Biol. Chem. 278(40) :38194_38205 (2003)， 通過引用將其內(nèi)容結(jié)合在此。此類文庫或多種分子的集合還可以使用熟知的化學方法進行 制備。可替代地，特異性地結(jié)合到人類鈣黏著蛋白-11的ECl結(jié)構(gòu)域上的多種鼠抗體可 以(例如)通過用多種ECl蛋白結(jié)構(gòu)域或ECl肽連同一種佐劑對小鼠進行免疫從而破壞對 該抗原的耐受性來進行鑒定?？梢詫@些抗體篩選所希望的特異性和活性，并接著使用已 知的技術(shù)使其人源化以產(chǎn)生用于治療人類疾病的適當試劑?？梢詮脑S多可供使用的化學化合物文庫中鑒定多種化合物或小分子，這些文庫例 如來自國家癌癥研究所的化學資料檔案庫(the Chemical Repository of the National Cancer Institute)、以及分子文庫小分子資料檔案庫(the Molecular Libraries Small Molecules Repository) (PubChem)、連同哈佛大學化學和細胞生物學研究所文庫、以及 可以從商業(yè)來源中獲得的其他文庫(例如Chembridge, Peakdale, CEREP，MayBridge, Bionet)。此類文庫或多種分子的集合還可以使用熟知的化學方法(例如，熟知的組合化學 方法)進行制備。可以對這些文庫進行篩選以鑒定結(jié)合并抑制鈣黏著蛋白-11的多種化合 物。經(jīng)鑒定的多種化合物可以充當前導化合物用于使用藥物化學的多種熟知的方法 來進行進一步多樣化。例如，可以制備和篩選用于鈣黏著蛋白-11結(jié)合和/或抑制活性的
19多種化合物的集合(它們是該前導物的結(jié)構(gòu)變體)。這可以導致將這些化合物的結(jié)構(gòu)與生 物活性聯(lián)系起來的一種結(jié)構(gòu)活性關(guān)系的開發(fā)。具有適當?shù)慕Y(jié)合和抑制活性的化合物可以被 進一步開發(fā)用于體內(nèi)用途?？梢詫τ阝}黏著蛋白-11相結(jié)合的試劑進一步評價鈣黏著蛋白-11拮抗劑活性。 例如，包括一種鈣黏著蛋白-11蛋白的組合物可用于一種篩選或結(jié)合測定，從而檢測和/或 鑒定結(jié)合并拮抗該鈣黏著蛋白-11蛋白的多種試劑。適合使用的多種組合物包括，例如自 然表達一種鈣黏著蛋白-11蛋白的細胞(例如，一種滑膜細胞)、此類細胞的提取物、以及重 組鈣黏著蛋白-11蛋白?？梢栽谝环N競爭性結(jié)合測定中鑒定與一種鈣黏著蛋白-11蛋白相結(jié)合的試劑，例 如其中評估了一種測試試劑抑制鈣黏著蛋白-11與一種參比試劑進行結(jié)合的能力。該參比 試劑可以是一種全長Cad-Il蛋白或它的包括該ECl結(jié)構(gòu)域的一部分。該參比試劑可以用 一種適當?shù)臉擞浳?例如，放射性同位素、表位標記物、親和力標簽(例如，生物素和抗生物 素蛋白或鏈霉親和素)、自旋標簽、酶、熒光基團、化學發(fā)光基團、染料、金屬(例如金、銀)、 磁珠)進行標記，并且可以確定在該測定中要求對該鈣黏著蛋白-11蛋白進行飽和的經(jīng)標 記的參比試劑的量值。在該鈣黏著蛋白-11蛋白與該測試試劑之間的復合物的形成的特異 性可以使用一種適當?shù)膶φ瘴?例如，未標記的試劑、單獨的標簽)進行確定。一種測試試劑抑制在該參比試劑與一種鈣黏著蛋白-11蛋白之間形成一種復合 物的能力可以被確定為對于經(jīng)標記的參比試劑的特異性結(jié)合的50%抑制作用(IC5tl值)所 要求的測試試劑的濃度。特異性結(jié)合被優(yōu)選地定義為總結(jié)合(例如，在復合物中總標簽) 減去該非特異性結(jié)合。非特異性結(jié)合被優(yōu)選地定義為在過量的未標記參比試劑存在下所形 成的仍可在復合物中檢出的標簽的量值。在該方法中適合使用的參比試劑包括多種分子和 化合物，它們特異性地結(jié)合到鈣黏著蛋白-11上，例如與鈣黏著蛋白-11相結(jié)合的抗體。拮抗一種鈣黏著蛋白-11蛋白的試劑可以通過對以下試劑進行篩選來鑒定，這些 試劑具有一種拮抗(降低、防止、抑制)鈣黏著蛋白-11的一種或多種活性(例如像一種結(jié) 合活性(例如，同型的Cad-Il結(jié)合))的能力。此類活性可以使用一種適當?shù)捏w外或體內(nèi) 測定來進行評估。對于鈣黏著蛋白-11活性的示例性測定之前已經(jīng)進行了說明(Patel，SD， et al. , Cell 124 _1255-1268(2006) ；Lee et al.，Science 315:1006-1010(2007))。一旦鑒定了一種鈣黏著蛋白-11拮抗劑，可以評估該鈣黏著蛋白-11拮抗劑在細 胞中干擾(例如，降低、抑制、防止)與鈣黏著蛋白-11活性相關(guān)聯(lián)的一種或多種生物學功 能或特性的能力，這是例如使用一種基于細胞的、被設計成測量與鈣黏著蛋白-11相關(guān)聯(lián) 的一種具體的生物學功能或特性的測定來進行的。已知與鈣黏著蛋白-11表達和/或活性 相關(guān)聯(lián)的多種生物學功能和特性包括但不限于細胞黏附、細胞遷移、細胞侵入、細胞分選、 細胞凝聚、細胞重排、組織完整性和結(jié)構(gòu)的維持、細胞增殖的接觸抑制、以及多種癌(例如 腫瘤)細胞的惡性轉(zhuǎn)化(Kiener and Brenner, Arthritis Res Ther. 7 (2) 49-54 (2005)) 此外，Cad-Il拮抗劑在此被顯示為抑制由多種滑膜細胞所產(chǎn)生的活性MMP。用于評估鈣 黏著蛋白的一種或多種生物學功能的適當測定對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員而言是已知的 (參見，例如Patel，SD, et al.，Cell 124 :_1255_1268 (2006))，并且包括例如在此說明的 細胞聚集測定(見例證、材料和方法部分)。治療的方法
不希望被任何一種理論所束縛，據(jù)信Cad-Il的ECl結(jié)構(gòu)域的前大約35個氨基酸 (例如，大約33至大約37個氨基酸)是同型的鈣黏著蛋白結(jié)合所要求的，并且特異性地結(jié) 合到Cad-Il的這個區(qū)域的多種試劑可以有效地抑制在多個Cad-Il分子之間的結(jié)合。因此， 此類試劑在多種炎性關(guān)節(jié)障礙(例如，類風濕性關(guān)節(jié)炎)的治療和預防方面是有用的，這些 疾病與發(fā)炎關(guān)節(jié)中的滑膜細胞以及其他細胞類型中的Cad-Il表達和活性相關(guān)聯(lián)。因此，本 發(fā)明的一個方面涉及一種用于治療哺乳動物受試者體內(nèi)的炎性關(guān)節(jié)障礙的方法，包括對該 受試者給予治療有效量的一種Cad-Il拮抗劑，該Cad-Il拮抗劑結(jié)合到一種人類Cad-IlECl 結(jié)構(gòu)域肽(SEQ ID NO 3)上。使用本發(fā)明的這些方法，哺乳動物(例如，人)體內(nèi)的炎性關(guān)節(jié)障礙可以通過給予 一個量值的本發(fā)明的一種鈣黏著蛋白-11拮抗劑(例如，抗體類、融合蛋白類、小分子類、核 酸類、肽類、模擬肽類)來進行治療，該量值足以提供一種治療益處，這是例如通過抑制細 胞的聚集、或抑制細胞的遷移、或抑制由在一個可活動的關(guān)節(jié)中表達鈣黏著蛋白-11的細 胞(例如，滑膜細胞)中所表達的活性蛋白酶或多種炎性分子來進行。因此，本發(fā)明的一個方面涉及一種用于治療哺乳動物受試者體內(nèi)的炎性關(guān)節(jié)障礙 的方法，包括對該受試者給予本發(fā)明的治療有效量的一種Cad-Il拮抗劑。該炎性關(guān)節(jié)障礙 可以是與一個可活動的關(guān)節(jié)的細胞(例如，滑膜細胞)中鈣黏著蛋白-11表達相關(guān)聯(lián)、或以 其為特征的任何障礙。可以由本發(fā)明治療的多種炎性關(guān)節(jié)障礙的例子包括但不限于類風 濕性關(guān)節(jié)炎、銀屑病關(guān)節(jié)炎、萊特爾氏綜合征、以及強直性脊柱炎。在一種具體的實施方案 中，該炎性關(guān)節(jié)障礙是類風濕性關(guān)節(jié)炎。在一個方面，治療有效量的一種鈣黏著蛋白-11拮抗劑被給予需要它的患者。有 待給藥的鈣黏著蛋白-11拮抗劑的量值(例如，一種治療有效量)可以由臨床醫(yī)生使用在 此提供的指導及在本領(lǐng)域內(nèi)的其他已知的方法來進行確定，并且取決于幾種因素，包括例 如所選定的具體試劑、該受試者的年齡、敏感性、對藥物的耐受性、以及總體健康狀況。例 如，對于作為抗體的Cad-Il拮抗劑的適當?shù)膭┝靠梢允敲看沃委煆拇蠹s0. 01mg/kg至大 約300mg/kg體重，并且優(yōu)選每次治療從大約0. 01mg/kg至大約100mg/kg、從大約0. Olmg/ kg至大約10mg/kg、從大約lmg/kg至約10mg/kg體重。對于一種小分子Cad-Il拮抗劑適 當?shù)膭┝靠梢允敲看酥委煆拇蠹s0. 00lmg/kg至大約100mg/kg、從大約0. 0lmg/kg至大約 100mg/kg、從大約0. 0 lmg/kg至大約10mg/kg、從大約0. 0 lmg/kg至大約lmg/kg體重。對于 作為蛋白或肽(直鏈的、環(huán)狀的、模擬的)的鈣黏著蛋白-11拮抗劑的適當?shù)膭┝繉е略?肽從大約0. 1 μ g/ml至大約200 μ g/mL的血漿濃度。確定針對一種具體的試劑、患者以及癌 癥的劑量是完全在本領(lǐng)域中的普通技術(shù)人員的能力之內(nèi)的。優(yōu)選地，該劑量并未引起、或產(chǎn) 生最小限度的不良副作用(例如，免疫原性應答、惡心、眩暈、胃部不適(gastric upset)、 高粘稠度綜合征、充血性心力衰竭、中風、肺水腫)。治療有效量的一種鈣黏著蛋白-11拮抗劑可以被單獨給藥、或與一種或多種其他 的治療劑(例如，抗炎性劑)進行組合。用于治療多種炎性關(guān)節(jié)障礙(特別是RA)的適當 的抗炎劑(它們可以與本發(fā)明的Cad-Il拮抗劑相組合而進行給藥)包括但不限于⑴非 甾體抗炎藥物(NSAID;例如，酮洛芬(detoprofen)、雙氯芬酸、二氟尼柳、依托度酸、非諾洛 芬、氟比洛芬、布洛芬、吲哚美辛、酮洛芬、甲氯芬那酸(meclofenameate)、甲芬那酸、美洛 昔康、萘丁美酮(nabumeone)、萘普生鈉、奧沙普秦、吡羅昔康、舒林酸、托美丁、塞來考昔、羅非考昔、阿司匹林、水楊酸膽堿、雙水楊酸酯(salsalte)、以及水楊酸鈉和水楊酸鎂)； (II)類固醇類(例如，可的松、地塞米松、氫化可的松、甲潑尼龍、潑尼松龍、潑尼松、曲安西 龍)；(iii)DMARD，即緩解疾病的抗風濕性藥物(例如，環(huán)孢霉素、硫唑嘌呤、甲氨蝶呤、來 氟米特、環(huán)磷酰胺、羥氯喹、柳氮磺吡啶、D-青霉胺、米諾環(huán)素、以及金)；或(iv)重組蛋白 質(zhì)類(例如，ENBREL (依那西普，一種可溶的TNF受體)、REMICADE (英利昔 單抗，一種嵌合的單克隆抗TNF抗體)、ORENCIA (阿巴西普(abatabac印t)，一種可 溶的CTLA4受體)、ACTEMRA (妥珠單抗，針對IL-6受體的一種單克隆抗體)、以及 RITUXAN (利妥昔單抗，針對CD20的一種單克隆抗體)。因此，一種鈣黏著蛋白-11拮抗劑可以作為一種聯(lián)合治療的部分(例如，與一種或 多種其他治療劑一起)進行給藥。該Cad-Il拮抗劑可以在一種或多種其他的治療劑之前 或同時被給藥的。在一些實施方案中，該鈣黏著蛋白-11拮抗劑以及其他治療劑可以作為 單獨的配制品或作為一種聯(lián)合配制品被同時地(例如，共同地)進行共同給藥?？商娲?， 這些試劑可以作為單獨的組合物、在由有經(jīng)驗的臨床醫(yī)生所確定的一個適當?shù)臅r間框(例 如，足以允許這些療法的藥物效應的疊加的一段時間)之內(nèi)進行順序地給藥。該鈣黏著蛋 白-11拮抗劑以及一種或多種其他治療劑能夠以一種單一劑量或以多個劑量、以一種次序 并且在適于達到一種令人希望的治療效應(例如，關(guān)節(jié)炎癥的減少和/或抑制)的時間表 上進行給藥。適當?shù)膭┝恳约敖o藥方案可以由臨床醫(yī)生來確定，并且取決于所選擇的這種 或這些試劑、藥物配制品以及給藥途徑、不同的患者因素以及其他考慮。一種治療效力(例如，關(guān)節(jié)炎癥的減少或消除和/或關(guān)節(jié)炎癥的防止或抑制)可 以通過任何適當?shù)姆椒?例如，成像(MRI、NMR))被確定。根據(jù)本發(fā)明的這些方法，將治療有效量的一種Cad-Il拮抗劑給予哺乳動物受試 者以治療一種炎性關(guān)節(jié)障礙。術(shù)語“哺乳動物受試者”在此被定義為包括多種哺乳動物如 靈長類動物(例如，人類)、牛、綿羊、山羊、馬、犬、貓、兔子、豚鼠、大鼠、小鼠、或其他的牛、 綿羊、馬、犬科、貓科、嚙齒動物以及鼠科物種。作為Cad-Il拮抗劑的試劑可以由不同的途徑給予哺乳動物受試者。例如，該試劑 可以由任何適當?shù)奈改c外的或非胃腸外的途徑進行給藥，包括例如局部的(例如，乳劑、軟 膏)、或鼻的(例如，溶液、懸浮液)。腸胃外給藥可以包括例如關(guān)節(jié)內(nèi)、肌內(nèi)、靜脈內(nèi)、心室 內(nèi)、動脈內(nèi)、鞘內(nèi)、皮下、或腹膜內(nèi)的給藥。該試劑還可以通過以下途徑進行給藥口服(例 如，以膠囊、懸浮液、片劑、或飲食)、經(jīng)皮、真皮內(nèi)、局部、通過吸入(例如，支氣管內(nèi)、鼻內(nèi)、 口服吸入或鼻內(nèi)滴劑)、穿粘膜、或經(jīng)直腸。給藥在適當時可以是局部的或全身性的，并且 若希望，可以同時使用超過一種途徑。一種Cad-Il拮抗劑的局部化給藥可以通過關(guān)節(jié)內(nèi)注 射(例如，將該試劑直接注射到一個關(guān)節(jié)中)而實現(xiàn)。優(yōu)選的給藥模式可以根據(jù)所選擇的 具體試劑而發(fā)生變化。然而，全身性靜脈內(nèi)的或皮下的給藥對于抗體是大體上優(yōu)選的。遞送還可以是通過注到患者的腦部或體腔內(nèi)、或通過使用一種定時釋放或持續(xù)釋 放的基質(zhì)遞送系統(tǒng)、或通過使用微粒、凝膠以及脂質(zhì)體的原位遞送。霧化裝置、粉末吸入器、 以及氣溶膠化的溶液是代表性的方法，這些方法可以用于將此類制備品給予呼吸道。遞送 可以在體外、在體內(nèi)、或離體。作為蛋白(例如，融合蛋白)的多種試劑可以是經(jīng)由重組蛋白的體內(nèi)表達來進行 給藥的。體內(nèi)表達可以根據(jù)適當?shù)姆椒?、通過體細胞表達來實現(xiàn)(參見，例如美國專利號5，399，346)。此外，還可以將對該蛋白進行編碼的一種核酸結(jié)合到逆轉(zhuǎn)錄病毒的、腺病毒 的、或其他適當?shù)妮d體種(優(yōu)選的是，一種復制缺陷型感染性載體)用于遞送，或可以將其 引入到能夠表達該蛋白的一種轉(zhuǎn)染的或轉(zhuǎn)化的宿主細胞中用于遞送。在后者的實施方案 中，可以將這些細胞以一個量值進行植入(單獨或在一種阻擋裝置中)、注射或以其他方式 引入，該量值對于以一種治療有效量表達該蛋白是有效的。基于核酸的鈣黏著蛋白-11拮抗劑(例如，適體)能夠以多種方式引入到所感 興趣的一種哺乳動物受試者中。例如，核酸可以從表達載體或PCR產(chǎn)物在宿主細胞中內(nèi) 源性地表達，或被包裝到合成的或工程化處理的組合物中(例如，脂質(zhì)體、聚合體、納米顆 粒)，然后這些組合物可以被直接引入到哺乳動物受試者的血流中(通過，例如，注射、輸 注)。抗鈣黏著蛋白-11核酸或核酸表達載體(例如，逆轉(zhuǎn)錄病毒的、腺病毒的、腺相關(guān)的 以及單純性皰疹病毒的載體、工程化處理的載體、非病毒介導的載體)還可以使用已建立 的基因治療策略和科學試驗計劃而直接引入到哺乳動物受試者中(參見，例如Tochilin V. P.Annu Rev BiomedEng 8 :343_375，2006 ；Recombinant DNA and Gene Transfer，Office ofBiotechnology Activities, National Institutes of Health Guidelines)。作為鈣黏著蛋白-11拮抗劑的試劑(例如，小分子)可以作為一種藥物的或生理 學的組合物的一部分來給予哺乳動物受試者，例如作為包括一種鈣黏著蛋白-11拮抗劑以 及一種藥學上可接受的載體的藥物組合物的一部分。包括一種鈣黏著蛋白-11拮抗劑的配 制品或組合物，或包括一種鈣黏著蛋白-11拮抗劑以及一種或多種其他治療劑(例如，一種 抗炎劑)的組合物將根據(jù)所選擇的給藥途徑(例如，溶液、乳劑、或膠囊)而發(fā)生變化。適 當?shù)乃幱幂d體可以含有惰性成份，這些成分并未與這種鈣黏著蛋白-11拮抗劑相互作用。 可以采用多種標準的藥物配制品技術(shù)，如在Remington's Pharmaceutical Sciences,Mack Publishing Company, Easton, PA中所說明的那些方法。用于腸胃外給藥的適當?shù)乃幱幂d 體包括，例如無菌水、生理鹽水、抑菌鹽水(含大約0. 9% mg/ml苯甲醇的鹽水)、磷酸鹽緩 沖鹽水、Hank' s溶液、林格氏乳酸鹽以及類似物。配制品還可以包括少量的物質(zhì)，這些物 質(zhì)增強了該活性成分(例如，乳化劑、增溶劑、PH緩沖劑、潤濕劑)的效力。膠囊化組合物 的方法(如，在硬明膠或環(huán)葡聚糖的包衣中)在本領(lǐng)域內(nèi)是已知的。為了吸入，可以將該試 劑溶解并且載入到一種適當?shù)挠糜诮o藥的分配器中(例如，一種霧化器或噴霧器或加壓氣 溶膠分配器)。該藥用試劑可以作為一種中性化合物或作為一種鹽或酯來進行給藥。藥學上可接 受的鹽類包括與多種游離的氨基基團形成的那些鹽，如衍生自鹽酸、磷酸、乙酸、草酸、或酒 石酸的那些鹽；以及與多種游離的羧基基團形成的那些鹽，如衍生自氫氧化鈉、氫氧化鉀、 氫氧化銨、氫氧化鈣、氫氧化鐵、異丙胺、三乙胺、2-乙氨基乙醇、組氨酸、普魯卡因、等等的 那些鹽。可以獲得含有一種胺或其他堿性基團的化合物的鹽類，這是例如通過與一種適當 的有機酸或無機酸(如，氯化氫、溴化氫、乙酸、高氯酸以及類似物)反應來進行的。具有一 種季銨基團的化合物還包含一種反陰離子，如氯離子、溴離子、碘離子、醋酸根、高氯酸根以 及類似物。包含一種羧酸或其他酸性官能團的化合物的鹽類可以通過與一種適當?shù)膲A(例 如，一種氫氧化物堿)反應來制備。酸性官能團的鹽類包含一種反陽離子，如鈉離子或鉀離 子。本發(fā)明現(xiàn)在將通過以下實例進行說明，這些實例并非旨在以任何方式進行限制。
例證實例1 具有針對人類鈣黏著蛋白-11的ECl結(jié)構(gòu)域的N端35個氨基酸內(nèi)一種表 位的結(jié)合特異性的Fab的鑒定。材料和方法蛋白質(zhì)印跡法通過SDS-PAGE將多種蛋白分離，并且使用標準方法將它們轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素 (NC)膜上。簡言之，用Tris緩沖的-鹽水-吐溫(TBST) (8. 8g/L的NaCUO. 2g/L的KCl、 3g/L的Tris堿、500ul/L的Tween-20、pH至7. 4)漂洗NC膜。將該膜用溶解于TBST中的 4% BSA在22°C下封閉小時。將該NC膜用TBST漂洗3次，每次5分鐘。將小鼠抗人Cad-Il 抗體在TBST中稀釋至0. 5 μ g/ml，并且在22°C下將該NC孵育達1小時。將該NC膜用TBST 漂洗3次，每次5分鐘。將偶聯(lián)著辣根過氧化物酶(HRP)的山羊抗小鼠Ig抗體在TBST中 稀釋至1 μ g/ml，并且在22°C下在室溫(RT)下將該NC在第二溶液中孵育最短1小時。將 該NC膜在TBST中漂洗3次，每次5分鐘。使用標準HRP方法使信號顯色。ELISA將該抗原(5 μ g/ml或50 μ g的Cad-1 l-EC-l-Fc或5 μ g/ml的鈣黏著蛋白肽)在 一種緩沖液中稀釋并且將其用于在4°C下對這些板包被過夜。將這些板洗滌并且用1.5% BSA、5%低脂奶粉(處于PBS稀釋緩沖液中BSA、2. 5%低脂奶粉、0. Tween-20，在 PBS中)封閉。然后，將這些板用包含該抗Cad-Il人fAb或純化的抗Cad-Il人fAb的細菌 裂解液孵育達小時。洗滌之后，將二抗(Cy5-偶聯(lián)的一種人Fab，1/100稀釋)施用達25分 鐘。然后，洗滌這些板，并接著讀取得到的熒光。結(jié)果對三組之前報道的鈣黏著蛋白-11-特異性抗體測試與人類鈣黏著蛋白-11的 ECl結(jié)構(gòu)域相結(jié)合的能力。這些抗體包括對抗鈣黏著蛋白-11敲除或缺陷的小鼠中的 一種小鼠鈣黏著蛋白-Il-Fc融合蛋白免疫原所產(chǎn)生的抗體(Lee et al. , Science 315 1006-1010(2007))，在鈣黏著蛋白-11野生型小鼠中產(chǎn)生的抗體，這些抗體對抗已經(jīng)在CHO 細胞中產(chǎn)生的一種人類鈣黏著蛋白-Il-Fc融合蛋白免疫原(Valencia et al. , J Exp. Med. 200 (12) 1673-1679 (2004))，以及在鈣黏著蛋白-11野生型小鼠中產(chǎn)生的抗體，這些 抗體對抗包含人類鈣黏著蛋白-11的EC1-3結(jié)構(gòu)域的一種通過細菌產(chǎn)生的蛋白。通過蛋 白質(zhì)分析對這些抗體測試了結(jié)合融合蛋白的能力，這些融合蛋白僅包含人類Cad-Il的ECl 結(jié)構(gòu)域(鈣黏著蛋白-11-ECl-Fc)、Cad-Il的ECl以及EC2結(jié)構(gòu)域(Cadll-ECl/2-Fc)、或 Cad-Il的所有5個EC結(jié)構(gòu)域(鈣黏著蛋白-ll-ECl-5-Fc)。在蛋白質(zhì)印跡上，所測試的這 些抗體都沒有識別ECl-Fc或ECl-2-Fc融合蛋白(圖1A)。然而，來自所測試的三組中每一 組的抗體識別了包括胞外域1至5的人類Cad-Il-Fc融合蛋白(圖1B)。這些結(jié)果表明所 測試的這些抗體并不結(jié)合人類Cad-Il的ECl或EC2結(jié)構(gòu)域，但卻識別在這種蛋白的胞外區(qū) 中其他地方的多種表位?？梢垣@得的已公布的抗Cadll抗體(這些抗體結(jié)合了表達Cadll的細胞)13C2、 23C6、5F82 (Lifespan Science)以及 283416 (R&D Systems)、連同 CadllECl-結(jié)合抗體 HlMl、以及對照抗體MOPC是通過ELISA針對與以下融合蛋白相結(jié)合的能力進行測試，這些 融合蛋白僅包含人類Cad-Il的ECl結(jié)構(gòu)域(鈣黏著蛋白-11-ECl-Fc)或Cad-Il的所有5種EC結(jié)構(gòu)域(鈣黏著蛋白-ll-ECl-5-Fc)。所測試的可以獲得的已公布的抗Cadll抗體都 沒有識別ECl-Fc (圖1B，空心柱)(在此沒有顯示對于283416的數(shù)據(jù))。然而，CadlIECl結(jié) 合的HlMl抗體結(jié)合了鈣黏著蛋白-Il-ECl-Fc以及鈣黏著蛋白-ll-ECl-5-Fc這兩者(圖 IB實心柱)。對照MOPC抗體對兩種融合蛋白均不結(jié)合。這些結(jié)果表明這些可以獲得的已 公布的抗Cadll抗體沒有與人類Cad-Il的ECl結(jié)構(gòu)域相結(jié)合，但卻在這種蛋白的胞外區(qū)中 的其他地方識別了多種表位。為了產(chǎn)生對人類鈣黏著蛋白-11的ECl結(jié)構(gòu)域的N端35個氨基酸之內(nèi)的一種表位 具有特異性的抗體，對編碼了人類Fab的噬菌體展示文庫(MorphoSys AG)進行篩選。使用 兩個選擇指標對候選的Fab進行鑒定針對與一種肽(該多肽包括人類鈣黏著蛋白-IlECl 結(jié)構(gòu)域的前35個氨基酸)相結(jié)合的一種陽性選擇，以及針對與相應肽(來自兩個密切相關(guān) 的并且高度同源的鈣黏著蛋白(鈣黏著蛋白_8和MN-鈣黏著蛋白)的ECl結(jié)構(gòu)域)相結(jié) 合的一種陰性選擇(圖2)。使用ELISA來評估結(jié)合。進行兩種篩選。在第一種篩選中，通過ELISA對結(jié)合鈣黏著蛋白-IlECl肽的96種 Fab克隆進行鑒定。七(7)種候選的Fab結(jié)合了 Cad-IlEC-I肽；然而，這些Fab中僅有兩種 與EC-I肽以及ECl-2-Fc融合蛋白這二者相結(jié)合。這兩種Fab之一還與MN-Cad肽相結(jié)合。 因此，這7種Fab克隆中僅有一種特異性地結(jié)合到ECl-Fc融合蛋白上，但不結(jié)合到MN-Cad 以及鈣黏著蛋白-8EC1結(jié)構(gòu)域肽這兩者上。在第二篩選中，觀察到了相似的結(jié)果，因為96 種Fab中僅有1種(克隆F9)顯示對于鈣黏著蛋白-IlECl肽和ECl_2_Fc融合蛋白的特異 性，不能結(jié)合到MN-Cad和鈣黏著蛋白-8EC1結(jié)構(gòu)域肽上(圖3)。所測試的結(jié)合Cad-IlECl 結(jié)構(gòu)域的Fab中的大多數(shù)顯示出與MN-Cad肽的交叉反應性，這種肽含有與Cad-Il的EEY CAR序列重疊的EEY CAR序列。實例2 與鈣黏著蛋白-11的ECl結(jié)構(gòu)域相結(jié)合的Fab在體外測定中抑制了 Cad-Il 介導的細胞聚集材料和方法體外鈣黏著蛋白-11聚集測定431-D細胞懸浮生長并且在正常情況下不表達任何鈣黏附蛋白并且不聚集。已 經(jīng)將431-D-11細胞進行遺傳修飾以表達Cad-11。431-D-11細胞在培養(yǎng)基中單獨孵育，并 且它們開始聚集超過40分鐘，并且這些細胞簇沉積在孔的底部，并且可以測量剩余的未 聚集的、處于懸浮狀態(tài)的細胞，并且計算聚集的431-D-11的百分數(shù)。對于這項聚集測定， 431-d-ll細胞(D-11細胞)在燒瓶中生長至亞會合狀態(tài)，并接著使用0. 05%胰蛋白酶加上 0. 53mM EDTA將其從該燒瓶移出。將大約2xl06個431-D-11細胞加到2ml的SME培養(yǎng)基中 (Dulbecco's Modified Eagle’ s 高葡萄糖培養(yǎng)基、0. IM H印es、pH7. 4、以及 5U/mlDNA 酶)， 并且在一種測試試劑(例如，抗體、Fab、融合蛋白)不存在或存在時在冰上將其預孵化15 分鐘。在與該測試試劑預孵化之后，將這些細胞轉(zhuǎn)移至24-孔板上的一種圓底孔中并且在 37°C下進行孵育，同時在旋轉(zhuǎn)搖床上以130rpm進行旋轉(zhuǎn)。當細胞聚集時，它們沉到該孔的 底部。在0分鐘和40分鐘時，從該孔中、從該樣品的中央去除200 μ 1并且將其與25 μ 1的 8%戊二醛進行混合以固定這些細胞。將200 μ 1的所固定的細胞樣品加入到9.8ml的庫爾 特粒度儀等滲鹽水溶液中，并且使用設置在8 μ m至24 μ m閾值的庫爾特粒度儀進行計數(shù)。 每個樣品記錄了 3次細胞計數(shù)。計算了與在0分鐘時間點相比在40分鐘時間點時細胞減
25少或聚集細胞的百分比。結(jié)果具有對于在鈣黏著蛋白-IlECl結(jié)構(gòu)域的N端35個氨基酸之內(nèi)的一種表位的結(jié)合 特異性的候選Fab (克隆F9)(它不與MN-Cad或Cad_8的ECl結(jié)構(gòu)域相結(jié)合)，是使用一種 體外鈣黏著蛋白-11細胞的聚集測定對于抑制Cad-Il介導的細胞聚集的能力進行測試。 該候選的Fab在1 μ g/ml或更低的濃度下顯著地抑制了鈣黏著蛋白-11介導的細胞聚集。 (圖4和5)。相比之下，由13C2抗體(它結(jié)合到EC1/2結(jié)構(gòu)域之外的Cad-Il胞外區(qū)中的 一種表位上)制備的Fab僅僅在10μ g/ml的濃度下就抑制了鈣黏著蛋白_11的聚集，這提 示F9Fab與結(jié)合到Cad-Il胞外域的其他部分上的多種抗體相比以更低的濃度更加有效地 抑制了 Cad-Il活性。Cad-Il介導的細胞聚集也被不同的抗-鈣黏著蛋白-IlECl結(jié)構(gòu)域Fab抑制，這些 Fab 對于單獨的 Cad-11、Cad-Il 與 Cad_8，Cad-Il 與 MN-CacU或 Cad-1 l、Cad_8 與 MN-Cad 是 特異的(圖6和7)。相對于這些對照樣品(例如，SME培養(yǎng)基)(圖6))、對GFP特異的一 種Fab (圖7)，所測試的所有鈣黏著蛋白-ECl-結(jié)構(gòu)域特異性Fab都在體外抑制了細胞的聚集。實例3 包含人類鈣黏著蛋白-11的ECl結(jié)構(gòu)域的鈣黏著蛋白-11/免疫球蛋白融 合蛋白的產(chǎn)生。這種鈣黏著蛋白-IlECl區(qū)是從一種載體制備的，該載體編碼了全長人類鈣黏著 蛋白-1 IcDNA (將人類Cad-Iι克隆到Invitrogen pCEP4 載體的Noti和κρη-ι位點)，這 是在標準條件下使用聚合酶鏈式反應(PCR)進行的，使用1以下寡核苷酸引物從而將EcoRl 和BglII位點(參見，對應地在正向和反向引物中的下劃線序列)引入到所擴增的產(chǎn)物中 正向引物Tttttttttgaattcatgaaggagaactactgtttacaagc(SEQ ID NO 8)EcoRl反向引物Tttttttttagatctctggaccttgacaatgaattccgacgg(SEQ ID NO 9)BglII用限制性內(nèi)切酶EcoRl和BglII將所擴增的產(chǎn)物消化，并且將這種消化產(chǎn)物分離 并且使用對應的EcoRl和BglII位點將其連接到pFUSE-hIgG2el-Fcl載體中(InvivoGen)。 按照制造商所說明的用這種連接產(chǎn)物將TOPlO感受態(tài)細菌(Invitrogen)轉(zhuǎn)化，并且用新霉 素(zeomycin)選擇具有鈣黏著蛋白-ll-ECl-Fc質(zhì)粒的細菌。將鈣黏著蛋白-ll-ECl-Fc 質(zhì)粒分離、測序、并接著用于瞬時轉(zhuǎn)染293F細胞。收集條件培養(yǎng)基，并且使用切向流過濾 之后跟隨在50/50混合的A/蛋白G柱(在20mM HEPES、pH7. 4、137mM NaCl、3mM KCl、以及 ImM CaCl2中平衡)上分離而將鈣黏著蛋白-ll-ECl-Fc融合蛋白(SEQ ID NO 9)純化。使 用0. IM甘氨酸(pH 3)和ImM CaCl2將純化的鈣黏著蛋白-Il-ECl-Fc融合蛋白從該柱子 中洗脫，并且進入包含200μ 1的IM Tris、pH7.4、以及ImM CaCl2W管中。然后，將這些具 有 Cad-Il 融合蛋白的洗脫液對 20mM Hepes (pH7. 4) U37mM NaCl、3mM KCl、以及 ImMCaCl2 進行透析。通過SDS PAGE證實了這種蛋白的大小(圖10)，并且使用識別這種人類Fc區(qū)域 的抗體通過蛋白質(zhì)印跡分析以及對N端進行測序(未顯示)證實了身份(圖11)。使用與如上說明的那些相似的技術(shù)和條件產(chǎn)生Cad-I l-ECl-2-Fc。實例4 =Cad-Il-ECl-Fc免疫球蛋白融合蛋白在體外測定中抑制了 Cad-Il介導的 細胞聚集材料和方法細胞侵入/遷移到基質(zhì)膠塞中在FLS 培養(yǎng)基(Dulbecco，s Modified Eagle's 高葡萄糖培養(yǎng)基[Sigma#D7777]、 10 % 胎牛血清[Benchmark#100-106]、l % 青霉素(Pencillin)-鏈霉素[Gibco 315140-122]、1% L-谷氨酰胺[Gibco#25030]、0. 5%慶大霉素[Gibco#15710-064])中在基 質(zhì)膠ECM包被的轉(zhuǎn)移孔(transwell)中評定了 FLS的遷移活性。將在包含IxlO4個細胞的 FLS培養(yǎng)基中的人類FLS細胞懸液加入到設置在24孔板的孔中的對照插入物或基質(zhì)膠包 被的插入物中，該24-孔板含有0. 750mL的FLS培養(yǎng)基。然后，將這些板在37°C下、5% CO2 大氣壓下、在一種增濕的組織培養(yǎng)孵育器中孵育達22個小時。為了計算遷移的細胞的數(shù)目，通過用棉簽擦拭將非侵入性細胞從對照插入物的膜 的上表面移出。使用由FLS培養(yǎng)基沾濕的棉簽重復第二次擦拭。然后，將對照插入物固定， 并且使用分化染色試劑盒[Fisher#122-911]進行染色。插入物允許被干燥，并且使用具有 IOx物鏡的顯微鏡在該對照插入物的4個象限中對細胞進行計數(shù)。對插入物進行計數(shù)，重復 三次，并且將總數(shù)進行平均。為了計算侵襲這些基質(zhì)膠插入物的細胞的數(shù)目，通過用棉簽進行擦拭將非侵入性 細胞從該基質(zhì)膠插入物的表面輕輕地去除。使用由FLS培養(yǎng)基沾濕的棉拭重復進行第二次 擦拭。然后，將插入物固定，并且使用分化染色試劑盒[Fisher#122-911]進行染色。插入 物允許被干燥，并且使用具有IOx物鏡的顯微鏡在該對照插入物的4個象限中對細胞進行 計數(shù)。對插入物進行計數(shù)，重復三次，并且將總數(shù)進行平均。結(jié)果Cad-I I-ECl-Fc在3 μ g/ml的濃度下顯著地抑制了細胞的聚集，而包含人類 Cad-Il的全部5個EC結(jié)構(gòu)域的全長Cad-Il-ECl-5-Fc蛋白在100 μ g/ml的濃度下抑制了 Cad-Il介導的聚集(圖13)。這些數(shù)據(jù)顯示Cad-Il-ECl-Fc免疫球蛋白融合蛋白在體外測 定中有效地抑制了 Cad-Il介導的細胞聚集。此外，體外測試了 Cad-Il-ECl-Fc免疫球蛋白融合蛋白抑制人類成纖維細胞樣滑 膜細胞(FLS)侵入基質(zhì)膠塞的能力。FLS侵入到基質(zhì)膠中是一種復雜的過程，該過程涉及 由FLS表達的MMP1、MMP-3、MMP-13、絲氨酸蛋白酶、及其他蛋白以降解該基質(zhì)膠連同F(xiàn)LS遷 移到基質(zhì)膠中。在一種分開的測定中，我們沒有看見對FLSA遷移通過正常纖維插入物的抑 制。這提示這種EC-Fc或13C2單克隆抗體的作用是抑制該基質(zhì)膠(一種關(guān)節(jié)軟骨的代用 品)的降解。在兩個獨立的實驗中，Cad-Il-ECl-Fc以及鼠抗Cad-Il單克隆抗體13C2這 兩者均抑制了 FLS侵入到基質(zhì)膠塞中。實例5 對抗人類鈣黏著蛋白-11的一種ECl結(jié)構(gòu)域肽的抗體的產(chǎn)生。材料和方法用0. Olmg的一種肽在足墊處對Balb/c小鼠進行免疫，每周兩次(bi-weekly)，一 個月9次，這種肽與人類Cad-IlECl結(jié)構(gòu)域的前33個氨基酸(GWVWN QFFVI EEYTG PDPVL VGRLH SDIDS⑶G(SEQID NO 10))相對應，以共價鍵與BSA連接。這種肽在此被稱為肽4。從經(jīng)免疫的小鼠得到脾，并且將其與一種鼠融合伴侶P3X63-Ag8. 653進行融合，從而生 成產(chǎn)生抗體的雜交瘤。以10、3或0.個5細胞/孔將這些雜交瘤擴展并且亞克隆，并且在 ELISA中對來自這些雜交瘤的、含有抗Cad-Il抗體的培養(yǎng)基篩選與在細菌中產(chǎn)生的、包含 Cad-llECl-2結(jié)構(gòu)域的蛋白特異性地結(jié)合的能力。同時，對來自這些肽4雜交瘤的、包含 抗-Cad-Il抗體的培養(yǎng)基篩選與涵蓋人類Cad-8和MN-鈣黏著蛋白的EC1-2結(jié)構(gòu)域的蛋 白相結(jié)合的缺失。在4°C下用0. 05ml的0. 0至0. 3mg/ml的ECl_2Cad蛋白中的每一種將 96-孔EIA板包被過夜，并接著用鹽水緩沖液洗滌若干次。然后，用0. 25ml的酪蛋白-PBS 緩沖液封閉這些板，并且用鹽水緩沖液洗滌若干次。在22°C下將包含這種抗Cad-Il抗體 的雜交瘤培養(yǎng)基在每個孔中進行未稀釋地孵育達1小時，并接著用PBS-Tween(0. 05% )洗 滌兩次。將100 μ 1的一種羊抗小鼠IgG 二抗的1/1000稀釋液加入到每個孔中，在22°C下 孵育30分鐘，并接著用PBS-Tween (0.05% )洗滌兩次。將100 μ 1/孔的室溫TMB (3，3’，5， 5’-四甲基聯(lián)苯胺)試劑加入到每個孔中，并且允許在22°C下顯色5分鐘。用100 μ 1的室 溫的2Ν硫酸將該反應終止，并且在Wallac 1420酶標儀上在450nm下讀取該板。使用ELISA 進一步測試了 HlMl 和 H14 抗 Cad-Il 抗體對抗 Cad-ll、Cad-7、Cad_8、 Cad-20、Cad-24、Cad-9、Cad-18、以及MN-Cad的ECl結(jié)構(gòu)域的前33個氨基酸的特異性。合 成了與 Cad-7、Cad-8、Cad-20、Cad-24、Cad-9、Cad-18、MN-Cad 的區(qū)域(該區(qū)域與 Cad-IlECl 結(jié)構(gòu)域的G1-G33區(qū)域重疊)相對應的肽，并且將這些肽與生物素相偶聯(lián)。將100 μ 1的這 些肽中每一種的在PBS-Tween中(0. 05% )的30ng/ml溶液在4°C下在96-孔Netravidin 板的每個孔中孵育2-3小時，并接著用PBS-Tween (0. 05% )洗滌兩次。在22°C下將不同濃 度的抗Cad-Il抗體在每個孔中孵育1小時，并接著用PBS-Tween(0.05% )洗滌兩次。將 100 μ 1的一種羊抗小鼠IgG 二抗的1/1000稀釋液加入到每個孔中，在22°C下孵育30分鐘， 并接著用PBS-Tween (0. 05% )洗滌兩次。將IOOul/孔的室溫TMB (3，3’，5，5’ -四甲基聯(lián) 苯胺)試劑加入到每個孔中，并且允許在22°C下顯色5分鐘。用100 μ 1的室溫的2Ν硫酸 將該反應終止，并且在Wallac 1420酶標儀上在450nm下讀取該板。對來自含有陽性抗Cad-Il抗體雜交瘤的多個孔的培養(yǎng)基測試與Cad-Il表達細胞 相結(jié)合的能力。使冰凍的表達Cad-Il的431D細胞解凍，并且在Hanks平衡鹽水溶液(HBSS) 中洗滌兩次，這種 HBSS 含有 Ca2+(0. 137M NaCl、5. 4mM、KCl 0. 25mM Na2HPO4、0. 44mM KH2PO4, 1. 3mM CaCl2U. OmM MgSO4,以及 4. 2mM NaHCO)，并接著在含有 Ca2+ 的 HBSS 中以 IO6 個細胞 /ml進行重懸。用50%或16%的抗Cad-Il抗體培養(yǎng)基在冰上將IO5個細胞/孔染色45分 鐘，在含有Ca2+的HBSS中洗滌兩次，用一種與藻紅蛋白(phytoerytherin)相偶聯(lián)的羊抗鼠 IgG 二抗(Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA)以 1 % 的濃度在冰上染色 45 分鐘，并 接著在含由Ca2+的HBSS中再洗滌兩次。然后，在含有Ca2+和甲醛的400 μ 1 HBSS中將 這些細胞重懸，并且隨后在 FACScalibur (Becton Dickenson, Franklin Lakes, NJ)上對于 PE陽性細胞進行分析。結(jié)果來自這些肽4雜交瘤的、包含抗-Cad-Il抗體的培養(yǎng)基與Cad_l 1EC1-2蛋白相結(jié) 合(圖16，HL對比Cadll)，但不結(jié)合包含Cad-8和MN-Cad的EC1-2結(jié)構(gòu)域的蛋白(圖16， 對應地為HL對比CadS以及HL對比MNCAD)。對照雜交瘤培養(yǎng)基不與所測試的鈣黏著蛋白 中的任何相結(jié)合(圖16，Media對比CADll、Media對比CAD8、以及Media對比MNCAD)。這些數(shù)據(jù)證明了在這些雜交瘤中存在針對肽4的Cad-Il特異性抗體。兩種肽4雜交瘤(在此被稱為HlMl和H14)與表達人類Cad-Il蛋白的細胞相結(jié) 合(圖17A至C和17G至I)，但不與非Cad-Il對照431-D
細胞相結(jié)合(圖17D至17F )。被稱為HlMl的雜交瘤細胞系具有Α. T.
C. C.命名號_，已經(jīng)于2009年1月8日保存。被稱為H14的雜交
瘤細胞系具有A.T.C.C.命名號_，已經(jīng)于2009年1月9日保存。
這些雜交瘤包含體外識別肽4以及表達Cad-Il的細胞的抗Cad-Il抗體。
這些抗體與表達Cad-Il-的細胞的結(jié)合是用所使用的肽4抗體的量進行滴定來顯示的，正 如在HlMl的滴定(圖18A)和H14的滴定(圖18B)對比來自平均熒光強度(MFI)的細胞 染色強度的曲線圖所示。與所測試的任何其他鈣黏著蛋白(它們包括Cad-7、Cad-8、Cad-20、Cad-24、 Cad-9、Cad-18、以及 MN-Cad)相比，HlMl 和 H14 肽 4 抗-Cad-Il 抗體證明了與 Cad-Il 相結(jié) 合高出超過100倍。在大多數(shù)情況下，沒有觀察到HlMl和H14抗Cad-Il抗體與其他鈣黏 著蛋白的結(jié)合。抗Cad-Il抗體H14顯示出對Cad-Il的強結(jié)合(圖19A)，對Cad_8的結(jié)合 低 468 倍(圖 19A)，并且?guī)缀醪唤Y(jié)合 Cad-7、MN-Cad、Cad-9、Cad-18、Cad-20、或 Cad-24 (圖 19B)。類似的，抗Cad-Il抗體HlMl顯示出對Cad-Il的強結(jié)合(圖20)，對Cad_8的結(jié)合 低 365 倍(圖 20)，并且不結(jié)合 Cad-7、MN-Cad、Cad_9、Cad-18、Cad-20、或 Cad_24(數(shù)據(jù)未 顯不)。實例6 這些抗Cad-IlECl結(jié)構(gòu)域抗體HlMl和H14與包括氨基酸序列GPDP的 Cad-IlECl結(jié)構(gòu)域中的表位相結(jié)合。材料和方法為了確定在肽4Cad_llECl抗體HlMl和H14所結(jié)合的Cad-IlECl結(jié)構(gòu)域內(nèi)的表 位，將跨越ECl區(qū)域的前37個氨基酸的4種不同的肽(見圖22)以一種ELISA形式進 行固定，并且確定了 HlMl和H14抗體與這4種肽中的每一種相結(jié)合的能力。在4°C下用 0. 3ng/孔的肽1 (Cad-IlECl結(jié)構(gòu)域的氨基酸G1-P18)、0. 3ng/孔的肽2 (Cad-llECl結(jié)構(gòu)域 的氨基酸G15-N34)、0. 3ng/孔的肽3 (Cad-IlECl結(jié)構(gòu)域的氨基酸V19-Y37)、0. 3ng/孔的 免疫原肽4(Cad-1 IECl結(jié)構(gòu)域的氨基酸G1-G33)、20ng的一種融合蛋白(包括整個ECl結(jié) 構(gòu)域(EFL))、或20ng的對照人類Ig(Fe-段)將96-孔再反應結(jié)合板包被過夜。將這些 孔用PBS-Tween(0. 05% )洗滌兩次、在22°C下用在dH20中的酪蛋白封閉3小時，并接著 用PBS-Tween(0. 05% )再次洗滌兩次。將不同稀釋的這些不同的肽4CAD-11EC1結(jié)構(gòu)域抗 體轉(zhuǎn)移到這些肽或蛋白包被的孔中，在22°C下孵育45分鐘，并接著用PBS-Tween(0. 05% ) 洗滌兩次。將 100 μ 1 的羊抗小鼠 IgG 二抗(Jackson ImmunoResearch, WestGrove, PA)的 1/1000稀釋液加入到每個孔中，在22°C下孵育30分鐘，并接著用PBS-Tween(0. 05% )洗 滌兩次。將100 μ 1/孔的室溫TMB試劑加入到每個孔，并且允許在22°C下顯色5分鐘。用 100 μ 1的室溫的2Ν硫酸將該反應終止，并且在Wallac 1420酶標儀上在450nm的波長下讀 取該板。結(jié)果在該ELISA中，肽4抗-Cad-Il 抗體HlMl 在 1 11 下(圖 21A)并且H14在 1 23下(圖21B)均與肽4(PEP4)免疫原、連同ECl結(jié)構(gòu)域融合蛋白(EFL)相結(jié)合，正如通過相 對于對照物提高的0D450孔板讀數(shù)所指示。這些抗體中沒有一種與這種人類IgG對照(Fe 段)相結(jié)合。此外，在該ELISA中這兩種抗體均與肽2 (PEP2)相結(jié)合，但不結(jié)合肽1 (PEPl) 或肽 3 (PEP3)(圖 21A 和 21B)。這些結(jié)果提示這些抗Cad-IlECl結(jié)構(gòu)域抗體(H1M1和H14)與一種常見表位 (common epitope)相結(jié)合，該表位在肽2和4中、但不存在于重疊的肽3中。作為肽3的上 游、由肽2和4共有的氨基酸在圖22所示的加框區(qū)域中被突出顯示。從Cad-IlECl結(jié)構(gòu)域 的G15開始，這四個氨基酸GPDP(SEQ ID NO 11)可能是由HlMl和H14抗體所識別的表位 的一部分。實例7 抗Cad-IlECl結(jié)構(gòu)域抗體HlMl和H14體外抑制了表達Cad-Il的細胞的聚集。材料和方法為了評估這些Cad-Il抗體抑制Cad-Il介導的細胞聚集的能力，將30 μ g/ml的 HlMl肽4抗體與75，000個表達Cad-Il的A-431-D表皮樣癌細胞在24-孔圓底聚丙烯板 中、在0. 5ml的DMEM-高葡萄糖、20mMH印es pH 7. 4、10% FCS、以及10U/ml DNA酶中培養(yǎng)。 將這些24-孔板放置在旋轉(zhuǎn)的平臺上(以大約60rpm)，并且在37°C下用5% CO2孵育過夜。 第二天，在IOOx (對于HlMl實驗)或40x (對于H14實驗)放大倍數(shù)下對這些板拍照之后 評定細胞的聚集。結(jié)果在對照同種型抗體(30 μ g/ml)的存在下，這些表達Cad-Il的細胞形成了大塊 (圖23A)，而這些親本的Cad-Il陰性細胞保持著單細胞群或雙細胞群(圖23C)。這些HlMl 處理的Cad-Il細胞保持為小的細胞簇(圖23B)，這些細胞簇沒有發(fā)展形成使用該對照抗體 所獲得的大的團塊。使用相同的測定，抗Cad-Il抗體H14還顯示出抑制Cad-Il-介導的聚集。盡管這 些親本的表達Cad-Il的細胞形成了大的聚集的細胞簇(圖24A)，這種H14抗體(圖24B) 在30 μ g/ml的濃度下抑制了聚集，因為細胞簇是小的并且稀少的。這些結(jié)果表明這些抗 Cad-Il抗體(H1M1和H14)在體外抑制了 Cad-Il介導的細胞聚集。實例8 抗Cad-IlECl結(jié)構(gòu)域抗體(H1M1和H14)在類風濕性關(guān)節(jié)炎的鼠模型中在 體內(nèi)抑制與關(guān)節(jié)炎相關(guān)聯(lián)的關(guān)節(jié)腫脹。材料和方法研究1-在第0天和第2天用150 μ 1的KBN血清注射六周齡的雄性C57/B16小鼠。 經(jīng)KBN血清處理的小鼠接受了鹽水注射液(圖25，空心的三角形)或用不同劑量的HlMl 抗-Cad-IlECl抗體進行治療。治療方案包括在第0天用0. 5mg的抗體/小鼠進行給藥， 并且在這之后每隔一天(q2d)用0. Img的抗體/小鼠(0. 5mg+0. Img)進行給藥(圖25，實 心三角形)；在第0天用0. 5mg的抗體/小鼠(0. 5mg)進行給藥(圖25，菱形)；每隔一天 (q2d)用0. Img的抗體/小鼠(0. lmg+0. Img)進行給藥(圖25，正方形)；或每隔一天(q2d) 用0. 3mg的抗體/小鼠(0. 3mg+0. 3mg)進行給藥(圖25，圓形)。對照組由5只小鼠組成， 并且治療組由7只小鼠組成。與關(guān)節(jié)炎相關(guān)聯(lián)的關(guān)節(jié)腫脹是通過每隔一天采取的卡尺測量 來確定的。
研究2-在第0天和第2天用150 μ 1的KBN血清注射六周齡的雄性C57/B16小 鼠，并接著每隔一天(q2d)用鹽水治療(圖26，三角形)、或用抗Cad-Il抗體HlMl (圖26， 正方形)或H14(圖26，圓形)之一以0. 3mg/劑量q2d治療。對照組由5只小鼠組成，并且 治療組由7只小鼠組成。與關(guān)節(jié)炎相關(guān)聯(lián)的關(guān)節(jié)腫脹是通過每隔一天采取的卡尺測量來確 定的。結(jié)果研究1-相對于對照小鼠，HlMl抗-Cad-Il抗體抑制了關(guān)節(jié)腫脹。與關(guān)節(jié)炎相關(guān) 聯(lián)的關(guān)節(jié)腫脹的最大抑制是通過每隔一天用0. 3mg的HlMl抗體對經(jīng)KBN處理的小鼠進行 給藥來進行觀察的(圖25，圓形)。研究2-相對于對照，這兩種抗-Cad-Il抗體均抑制了關(guān)節(jié)腫脹。在這項研究中， 與這些對照動物相比，這種H14抗體顯著地延遲了關(guān)節(jié)炎的發(fā)作(圖27)。在對照組中所有 小鼠都在第3天發(fā)展成了關(guān)節(jié)炎，而在所有這些動物發(fā)展成關(guān)節(jié)炎之前H14治療的小鼠要 求6天。這些研究表明對抗人類Cad-Il的ECl結(jié)構(gòu)域的抗體可以在體內(nèi)抑制關(guān)節(jié)炎的發(fā)
展和嚴重程度。實例9 對抗人類鈣黏著蛋白-11的另一種ECl結(jié)構(gòu)域肽的抗體的產(chǎn)生。材料和方法用0. Olmg 的肽 V19_Y37(VL VGRLH SDIDS GDGNI KY (SEQ IDNO 12))在足墊處對 Balb/c小鼠進行免疫，一周兩次，一個月9次，這種肽與人類Cad-I IECl結(jié)構(gòu)域的19個氨基 酸相對應、以共價鍵與BSA相連接。這種肽在此被稱作肽3。從經(jīng)免疫的小鼠中得到脾，并 且將其與一種鼠融合伴侶P3X63-Ag8. 653融合，從而生成產(chǎn)生抗體的雜交瘤。將這些雜交 瘤擴展，并且對來自這些雜交瘤的、包含抗Cad-Il抗體的培養(yǎng)基篩選與一種蛋白相結(jié)合的 能力，該蛋白對應于在細菌中產(chǎn)生的Cad-Il的EC1-2結(jié)構(gòu)域。同時，對來自這些肽3雜交 瘤的、包含抗-Cad-Il抗體的培養(yǎng)基篩選與涵蓋Cad-8和MN-鈣黏著蛋白的EC1-2結(jié)構(gòu)域 的蛋白相結(jié)合的缺失。在4°C下用0. 05ml的0至300mg/ml的ECl_2Cad蛋白中每一種蛋 白、或CHO細胞產(chǎn)生的ECl-Fc融合蛋白將96-孔EIA板包被過夜，并接著用鹽水緩沖液洗 滌若干次。然后，用0. 25ml的酪蛋白-PBS緩沖液封閉這些板，并且隨后用鹽水緩沖液洗滌 若干次。在22°C下將含有這些肽3抗Cad-Il抗體的雜交瘤培養(yǎng)基在每個孔中未稀釋地孵 育1小時，并接著用PBS-Tween (0. 05% )洗滌兩次。將100 μ 1的一種羊抗小鼠IgG 二抗的 1/1000稀釋液加入到每個孔中，在22°C下孵育30分鐘，并接著用PBS-Tween (0. 05% )洗滌 兩次。將ΙΟΟμΙ/孔的室溫TMB(3，3’，5，5’_四甲基聯(lián)苯胺)試劑加入到每個孔，并且允許 在22°C下顯色5分鐘。用100 μ 1的室溫的2Ν硫酸將該反應終止，并且在Wallac 1420酶 標儀上在450nm下讀取該板。還對來自這些肽3雜交瘤的培養(yǎng)基測試了與在細胞上表達的人類Cad-Il蛋白相 結(jié)合的能力。冰凍的表達Cad-Il的431D細胞被解凍，并且在含有Ca2+的HBSS中洗滌兩次， 并接著以IO6個細胞/ml在含有Ca2+的HBSS中重懸。用50%或16%抗Cad-Il抗體培養(yǎng)基 在冰上將IO5個細胞/孔染色45分鐘，在含有Ca2+的HBSS中洗滌兩次，并接著用一種與藻 紅蛋白相偶聯(lián)的羊抗小鼠IgG 二抗以的濃度在冰上染色45分鐘，并接著在含有Ca2+的 HBSS中再次洗滌兩次。然后，在含有Ca2+和甲醛的400 μ 1 HBSS中將這些細胞重懸，并且隨后在FACScalibur上對PE陽性細胞進行分析。結(jié)果來自來自這些肽3雜交瘤的、包含抗-Cad-Il抗體的培養(yǎng)基與Cad_l 1EC1-2蛋白 以及ECl-Fc融合蛋白相結(jié)合(圖28，對應地是HL對比Cadll以及HL對比Cadll-ECl)，但 不結(jié)合包含Cad-8和MN-Cad的EC1-2結(jié)構(gòu)域的蛋白(圖28，對應地是HL對比Cad8、以及 HL對比MNCAD)。對照雜交瘤培養(yǎng)基不結(jié)合任何鈣黏著蛋白蛋白(圖28，Media對比CAD11、 Media 對比 CAD8、并且 Media 對比 MNCAD)。來自這些肽3雜交瘤的抗-Cad-Il抗體還與表達人類Cad-Il蛋白的細胞相結(jié)合 (圖29，見箭頭)，但未與不表達Cad-Il的對照細胞(表達Neos)相結(jié)合。這種結(jié)果證實 在這些雜交瘤中存在體外識別肽3和表達Cad-Il-的細胞的抗Cad-Il抗體。所有專利、公開的申請以及參考文獻的有關(guān)傳授內(nèi)容都通過引用將其全文進行結(jié)
權(quán)利要求
一種鈣黏著蛋白 11拮抗劑，該鈣黏著蛋白 11拮抗劑特異性地結(jié)合到一種哺乳動物鈣黏著蛋白 11蛋白的一個EC1結(jié)構(gòu)域上，其中該鈣黏著蛋白 11拮抗劑抑制了表達所述哺乳動物鈣黏著蛋白 11蛋白的細胞的聚集。
2.如權(quán)利要求1所述的鈣黏著蛋白-11拮抗劑，其中該鈣黏著蛋白-11拮抗劑結(jié)合到 SEQ ID NO 3 上。
3.如權(quán)利要求1所述的鈣黏著蛋白-11拮抗劑，其中該鈣黏著蛋白-11拮抗劑是選自 下組，其組成為一種抗體、融合蛋白、肽、模擬肽、核酸、以及小分子。
4.一種分離的抗體，該分離的抗體特異性地結(jié)合到一種哺乳動物鈣黏著蛋白-11蛋白 的一個ECl結(jié)構(gòu)域上，其中該抗體抑制了表達所述哺乳動物鈣黏著蛋白-11蛋白的細胞的聚集。
5.如權(quán)利要求4所述的分離的抗體，其中該抗體與一種表位相結(jié)合，該表位存在于SEQ ID NO :3 中。
6.如權(quán)利要求5所述的分離的抗體，其中該表位不包括氨基酸序列EEY。
7.如權(quán)利要求4所述的分離的抗體，其中該抗體是選自下組，其組成為一種單克隆抗 體、多克隆抗體、人源化抗體、嵌合抗體、單鏈抗體、以及抗體片段。
8.如權(quán)利要求7所述的分離的抗體，其中該抗體是一種抗體片段。
9.如權(quán)利要求8所述的分離的抗體，其中該抗體片段是選自下組，其組成為一種Fab、 Fab，、F(ab，)2 以及 ScFv0
10.一種融合蛋白，包括一種哺乳動物免疫球蛋白的至少一部分以及一種人類鈣黏著 蛋白-11胞外區(qū)的一部分，該部分包括SEQ ID NO :2的氨基酸54-90，其中該人類鈣黏著蛋 白-11胞外區(qū)的部分不包括由SEQ IDNO 2的氨基酸1_609組成的整個人類鈣黏著蛋白-11 胞外區(qū)。
11.如權(quán)利要求10所述的融合蛋白，其中該融合蛋白包括SEQID N0:2的氨基酸 1-150。
12.如權(quán)利要求10所述的融合蛋白，其中該融合蛋白包括SEQID NO :2的氨基酸 1-160。
13.如權(quán)利要求10所述的融合蛋白，其中該融合蛋白包括SEQID N0:2的氨基酸 1-259。
14.如權(quán)利要求10所述的融合蛋白，其中該融合蛋白包括SEQID NO :2的氨基酸 1-269。
15.如權(quán)利要求10所述的融合蛋白，其中該融合蛋白缺乏SEQID NO :2的氨基酸1-53。
16.如權(quán)利要求10所述的融合蛋白，其中該哺乳動物免疫球蛋白是一種人類IgG2蛋白。
17.如權(quán)利要求16所述的融合蛋白，其中該融合蛋白包括人類IgG2的鉸鏈-CH2-CH3部分。
18.如權(quán)利要求10所述的融合蛋白，其中該融合蛋白是一種單體、一種二聚體、或一種 四聚體。
19.一種對有需要的哺乳動物受試者體內(nèi)的炎性關(guān)節(jié)障礙進行治療的方法，該方法包 括對該受試者給予治療有效量的一種鈣黏著蛋白-11拮抗劑，該鈣黏著蛋白-11拮抗劑特異性地結(jié)合到一種哺乳動物鈣黏著蛋白-11蛋白的一個ECl結(jié)構(gòu)域上，其中該鈣黏著蛋 白-11拮抗劑抑制了細胞的聚集，這些細胞在所述受試者的一個或多個關(guān)節(jié)中表達所述哺 乳動物鈣黏著蛋白-11蛋白。
20.如權(quán)利要求19所述的方法，其中該鈣黏著蛋白-11拮抗劑結(jié)合到SEQIDN0:3上。
21.如權(quán)利要求19所述的方法，其中該炎性關(guān)節(jié)障礙是選自下組，其組成為類風濕性 關(guān)節(jié)炎、骨性關(guān)節(jié)炎、銀屑病關(guān)節(jié)炎、萊特爾氏綜合征、以及強直性脊柱炎。
22.如權(quán)利要求19所述的方法，其中該炎性關(guān)節(jié)障礙是類風濕性關(guān)節(jié)炎。
23.如權(quán)利要求19所述的方法，其中該鈣黏著蛋白-11拮抗劑是一種分離的抗體。
24.如權(quán)利要求19所述的方法，其中該鈣黏著蛋白-11拮抗劑是一種融合蛋白，該融合 蛋白包括一種哺乳動物免疫球蛋白的至少一部分以及一種人類鈣黏著蛋白-11胞外區(qū)的 一部分，該部分包括SEQ ID NO :2的氨基酸54-90，其中該人類鈣黏著蛋白-11胞外區(qū)的部 分不包括由SEQ IDNO 2的氨基酸1-609組成的整個人類鈣黏著蛋白-11胞外區(qū)。
25.如權(quán)利要求19所述的方法，其中該哺乳動物受試者是人。
26.如權(quán)利要求19所述的方法，其中對該鈣黏著蛋白-11拮抗劑進行全身給藥。
27.如權(quán)利要求19所述的方法，其中對該鈣黏著蛋白-11拮抗劑進行靜脈內(nèi)給藥。
28.如權(quán)利要求19所述的方法，其中將該鈣黏著蛋白-11拮抗劑通過直接注射到一個 關(guān)節(jié)中來進行給藥。
29.如權(quán)利要求19所述的方法，其中該鈣黏著蛋白-11拮抗劑抑制了細胞的遷移、黏 附、侵入到軟骨中、或細胞間信號傳導，這些細胞在所述受試者的一個或多個關(guān)節(jié)中表達所 述哺乳動物鈣黏著蛋白-11蛋白。
30.如權(quán)利要求19所述的方法，其中該鈣黏著蛋白-11拮抗劑抑制了誘導一種酶的 表達或活性，該酶選自下組，其組成為細胞中的一種膠原酶、一種絲氨酸蛋白酶、以及一種 基質(zhì)金屬蛋白酶，這些細胞在所述受試者的一個或多個關(guān)節(jié)中表達所述哺乳動物鈣黏著蛋 白-11蛋白。
31.如權(quán)利要求19所述的方法，其中該鈣黏著蛋白-11拮抗劑抑制了誘導一種細胞 因子或生長因子的表達或活性，該細胞因子或生長因子選自下組，其組成為細胞中的一種 IL-6、IL-8、RANKL、以及TRANCE，這些細胞在所述受試者的一個或多個關(guān)節(jié)中表達所述哺乳 動物鈣黏著蛋白-11蛋白。
32.如權(quán)利要求19所述的方法，其中將該鈣黏著蛋白-11拮抗劑與一種緩解疾病的抗 風濕藥相組合進行給藥。
33.如權(quán)利要求32所述的方法，其中該緩解疾病的抗風濕藥是甲氨蝶呤。
34.如權(quán)利要求19所述的方法，其中將該鈣黏著蛋白-11拮抗劑與一種抗炎劑相組合 進行給藥。
35.如權(quán)利要求34所述的方法，其中該抗炎劑是一種NSAID或類固醇。
36.如權(quán)利要求34所述的方法，其中該抗炎劑是一種緩解疾病的抗風濕藥物或一種重組蛋白。
37.一種藥物組合物，包括一種鈣黏著蛋白-11拮抗劑，該鈣黏著蛋白-11拮抗劑特 異性地結(jié)合到一種哺乳動物鈣黏著蛋白-11蛋白的一個ECl結(jié)構(gòu)域上，并且抑制了表達所 述哺乳動物鈣黏著蛋白-11的細胞的聚集；以及一種藥學上可接受的載體。
38.如權(quán)利要求37所述的藥物組合物，其中該鈣黏著蛋白-11拮抗劑結(jié)合到SEQID NO 3 上。
39.如權(quán)利要求37所述的藥物組合物，其中該鈣黏著蛋白-11拮抗劑是一種分離的抗體。
40.如權(quán)利要求37所述的藥用組合物，其中該鈣黏著蛋白-11拮抗劑是一種融合蛋白， 該融合蛋白包括一種哺乳動物免疫球蛋白的至少一部分以及一種人類鈣黏著蛋白-11胞 外區(qū)的一部分，該部分包括SEQ ID NO :2的氨基酸54-90，其中該人類鈣黏著蛋白-11胞外 區(qū)的部分不包括由SEQID NO 2的氨基酸1-609組成的整個人類鈣黏著蛋白-11胞外區(qū)。
41.如權(quán)利要求37所述的藥物組合物，進一步包括一種緩解疾病的抗風濕藥。
42.如權(quán)利要求41所述的藥物組合物，其中該緩解疾病的抗風濕藥是甲氨蝶呤。
43.如權(quán)利要求37所述的藥物組合物，進一步包括一種抗炎劑。
44.如權(quán)利要求43所述的藥物組合物，其中該抗炎劑是一種NSAID或類固醇。
45.如權(quán)利要求43所述的藥物組合物，其中該抗炎劑是一種緩解疾病的抗風濕藥物或 重組蛋白。
46.如權(quán)利要求4所述的分離的抗體，其中該抗體與一種表位相結(jié)合，該表位存在于 SEQ ID NO 10 中。
47.如權(quán)利要求4所述的分離的抗體，其中該抗體與一種表位相結(jié)合，該表位包括SEQ ID NO :11ο
48.如權(quán)利要求4所述的分離的抗體，其中該抗體與一種表位相結(jié)合，該表位存在于 SEQ ID NO 12 中。
49.如權(quán)利要求23所述的方法，其中該分離的抗體與一種表位相結(jié)合，該表位包括SEQ ID NO :11ο
50.如權(quán)利要求23所述的方法，其中該分離的抗體與一種表位相結(jié)合，該表位存在于 選自下組的至少一種序列中，該組的組成為=SEQ IDNO 10, SEQ ID Ν0:12、以及SEQ ID NO: 13。
51.如權(quán)利要求39所述的藥物組合物，其中該分離的抗體與一種表位相結(jié)合，該表位 包括 SEQ ID NO =Ilo
52.如權(quán)利要求39所述的藥物組合物，其中該分離的抗體與一種表位相結(jié)合，該表位 存在于選自下組的至少一種序列中，該組的組成為SEQ IDNO 10, SEQ ID Ν0:12、以及SEQ ID NO :13。
53.一種分離的核酸，該核酸編碼了如權(quán)利要求4所述的抗體。
54.如權(quán)利要求53所述的分離的核酸，其中所述核酸存在于一種載體中。
55.一種分離的細胞，該細胞表達如權(quán)利要求4所述的抗體。
56.一種雜交瘤HlMl的細胞(ATCC登錄號_)。
57.一種雜交瘤Η14的細胞(ATCC登錄號_)。
58.一種由雜交瘤HlMl產(chǎn)生的抗體(ATCC登錄號_)。
59.一種由雜交瘤H14產(chǎn)生的抗體(ATCC登錄號_)。
60.一種鈣黏著蛋白-11拮抗劑的用途，該鈣黏著蛋白-11拮抗劑特異性地結(jié)合到一種 哺乳動物鈣黏著蛋白-11蛋白的一個ECl結(jié)構(gòu)域上，用于對有需要的哺乳動物受試者體內(nèi)的炎性關(guān)節(jié)障礙進行治療。
61. 一種鈣黏著蛋白-11拮抗劑在藥物制造中的用途，該鈣黏著蛋白-11拮抗劑特異性 地結(jié)合到一種哺乳動物鈣黏著蛋白-11蛋白的一個ECl結(jié)構(gòu)域上，用于對有需要的哺乳動 物受試者體內(nèi)的炎性關(guān)節(jié)障礙進行治療。
全文摘要
本發(fā)明涉及鈣黏著蛋白-11拮抗劑以及包括鈣黏著蛋白-11拮抗劑的組合物。本發(fā)明還涉及通過給予治療有效量的一種鈣黏著蛋白-11拮抗劑來治療哺乳動物受試者體內(nèi)的炎性關(guān)節(jié)障礙(例如，類風濕性關(guān)節(jié)炎)的方法。
文檔編號C07K16/28GK101952316SQ200980101955
公開日2011年1月19日 申請日期2009年1月9日 優(yōu)先權(quán)日2008年1月11日
發(fā)明者J·G·麥卡瑟 申請人:希諾維克斯公司