專利名稱：英羅霉素在制備抗植物致病真菌藥物中的應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種天然來源的抗霉素類抗生素(Antimycin)在制備抗植物致病真 菌藥物中的應用。
背景技術：
真菌是植物病原菌中最重要的類群，約有70%的植物病害是由真菌引起的。人們 在長期使用化學農藥防治真菌病害的過程中產生了三大難題環(huán)境污染、病原菌耐藥性增 加和植物體內微生物菌群失衡。由于化學農藥的副作用日益凸顯和人們對環(huán)保、綠色食品 需求的提高，研發(fā)符合環(huán)保、健康和可持續(xù)發(fā)展理念的生物農藥已成為當務之急。
農用抗生素由于其高效、易分解、無殘留、與環(huán)境相容等優(yōu)勢而倍受重視。目前，我 國農用抗生素研究已取得一定成果，在篩選方法和產業(yè)化方面有了很大改進和提高。春雷 霉素、井岡霉素、農抗120、多抗霉素、公主嶺霉素、慶豐霉素、武夷霉素、中生霉素等十余種 藥物已成為比較成熟的上市農藥。盡管農用抗生素具有高效低毒無公害的優(yōu)點，但在農藥 市場中，農用抗生素所占份額僅為9%，難點之一在于新農用抗生素的發(fā)現日益困難，目前， 通過新微生物資源發(fā)現新抗生素成為解決方案之一。放線菌是抗生素的主要產生菌，來源 于極端環(huán)境的放線菌為適應特殊的生態(tài)環(huán)境往往產生不同的次級代謝產物，紅樹林生態(tài)環(huán) 境中的紅樹植物為潮灘濕地木本生物群落，處于熱帶亞熱帶海岸潮間帶，近年來，源于紅樹 林生態(tài)環(huán)境中的海泥放線菌和紅樹植物內生放線菌，從"菌"和"素"兩方面均取得了一些研 究進展，如文獻1 :Thawai C， Tanasupawat S， Kudo T. Micromonospora pattaloongensis sp.nov. ， isolated from a Thai mangrove forest. Int JSyst Evol Microbiol. 2008， 58:1516-1521.和文獻2. Schneider K Rose I， Vikineswary S， Jones AL， Goodfellow M， Nicholson G， Beil W， Sussmuth RD， FiedlerHP. Nocardichelins A and B， siderophores from Nocardia strain acta 3026. J. Nat Prod. 2007， 70 :932-935.提示紅樹林是發(fā)現新 抗生素的潛在重要資源之一。 本實驗室在從紅樹植物內生放線菌篩選抗水稻稻瘟菌抗生素的過程中，分離得到 抗生素_英羅霉素，經紫外光譜、紅外光譜、質譜及核磁共振等波譜學數據分析，確定英羅 霉素為首次從天然來源發(fā)現的抗霉素(Antimycin)類抗生素。在對英羅霉素進行抗植物致 病真菌活性評價的過程中，發(fā)現英羅霉素具有極強的真菌抑制活性，如對于豆剌盤孢菌、番 茄早疫病菌和來自草莓的灰霉葡萄胞菌，最低抑菌濃度(MIC)達到了 0. 01-0. 06ii g/6mm紙 片，對水稻稻瘟菌的體外活性優(yōu)于目前已上市的廣譜抗真菌農藥殺稻瘟菌素S。
抗霉素類的抗真菌活性與其結構中8位的氧?；皞孺滈L度相關。Yao等報 道kitamycins A和B、 urauchimycins A和B這四個抗霉素8位僅有羥基而沒有氧酰基 化，因此，只顯示了較弱的抗真菌活性(Yao CB F， Schiebel M， Helmke E， Anke H， Laatsch H. Pref luostatin and new urauchimycin derivatives produced byStr印tomycete isolates. ZEITSCHRIFT FUR NATURF0RSCHUNG B.2006，61 :320-325)。 Hosotani等人 的研究表明，抗霉素的抗真菌活性強弱與8位氧酰基側鏈長度成反比(Hosotani N，Kumagai K， Nakagawa H， Shimatani T， Saji I. Antimycins A10 A16， seven new antimycin antibiotics produced by Str印tomyces spp. SPA—10191 and SPA—8893. J. Antibiot. 2005,58 :460-467)。英羅霉素的8位側鏈為最短的乙酰氧基，這一特殊的結構 特點使其有別與抗霉素類其他成員，顯示出了極強的抗真菌活性，因此，在農作物栽培和食 品保鮮等領域，具有良好的研發(fā)應用前景。迄今為止，除本文外，尚未見到與英羅霉素結構 相同化合物抗真菌活性的相關報道。 本發(fā)明的目的之一是，提供天然來源英羅霉素的制備方法； 本發(fā)明的目的之二是，提供英羅霉素在制備抗植物致病真菌藥物中的應用。 本發(fā)明提供了如式(1)所示結構的英羅霉素
(1)<formula>formula see original document page 4</formula> 通過一系列光譜學分析，確定了英羅霉素的結構。 本發(fā)明所述的英羅霉素是一種白色無定形粉末，分子式為(:23112^09，其結構特征
為具有9元環(huán)雙內酯結構，其中8位為乙酰氧基取代。其易溶于甲醇、乙酸乙酯、氯仿等溶 劑，不易溶于水。當環(huán)己烷乙酸乙酯=2 : l時，英羅霉素在MERCK公司制造的硅膠板上 的Rf = 0. 30。 本發(fā)明所述英羅霉素，是在對采自廣西英羅紅樹自然保護區(qū)的紅樹植物內生放 線菌進行抗水稻稻瘟菌抗生素篩選過程中，由鏈霉菌菌株Str印tomycesalbidoflavus 107A-01824發(fā)酵液中分離得到的。所述產生菌已于2009年09月16日送交位于北京的"中 國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心"進行保藏，其保藏編號為CGMCC No. 3282。

發(fā)明內容
為了獲得英羅霉素及其抗植物致病真菌活性，本發(fā)明采取了以下技術路線與步 驟 1、英羅霉素產生菌的發(fā)酵及培養(yǎng)首先是將生長于斜面的鏈霉菌菌株 Str印tomyces albidoflavus I07A-01824接種于種子培養(yǎng)基，在旋轉搖床上培養(yǎng)，然后轉 入發(fā)酵培養(yǎng)基在旋轉振蕩搖床上培養(yǎng)，收獲發(fā)酵液； 2、英羅霉素的提取，分離將發(fā)酵液離心后，上清液用乙酸乙酯萃取，有機相經無 水Na2S04脫水，減壓濃縮，得到油狀棕褐色粗提物。粗提物干法上樣于正向硅膠色譜柱，用 環(huán)己烷-乙酸乙酯分級洗脫，活性追蹤表明環(huán)己烷-乙酸乙酯2 : l部分顯示較強抗真菌 活性。將環(huán)己烷-乙酸乙酯2 : l部分減壓濃縮，得到黃色的粗品，濕法上樣于反向硅膠色譜柱中，用甲醇_水進行分級梯度洗脫，活性追蹤表明75%甲醇部分具有較強抗水稻稻瘟 菌活性。合并主要活性部分，旋轉蒸發(fā)除去甲醇后，冷凍干燥，得半純品，半純品溶于甲醇， 進行HPLC半制備，收集29min附近的紫外吸收峰(224nm)，合并后，旋轉蒸發(fā)除去甲醇，經過 冷凍干燥獲得英羅霉素純品； 3、英羅霉素的結構鑒定根據UV、 IR、 HR-ESI-MS H-NMR、"C-NMR、 DEPT數據測試 和力」H相關譜CH」H C0SY) H-"C相關譜(HSQC)以及反向檢測遠程力-"C異核多鍵相關 譜(HMBC)的分析，確定了英羅霉素的結構； 4、英羅霉素的抗植物致病真菌活性測定采用瓊脂平板法進行了抗植物致病真菌 活性實驗。研究結果表明，英羅霉素對6株檢定菌株顯示出廣泛抑制活性，活性優(yōu)于陽性對 照殺稻瘟菌素S，對豆剌盤孢菌、番茄早疫病菌和來自草莓的灰霉葡萄胞菌具有極強抑制活 性。 發(fā)明效果 本發(fā)明提供的結構式(1)所示化合物為首次從天然來源發(fā)現的Antimycin類抗生 素，經生物學活性實驗證明，該化合物均具有十分顯著的抗植物致病真菌作用，可望今后研 究開發(fā)成為高效農用抗生素。


附圖l-英羅霉素在MeOH中的紫外光譜；附圖2-英羅霉素的紅外光譜；附圖3-英羅霉素的HR-ESI-MS譜；附圖4-英羅霉素在CDC13中的力-NMR譜；附圖5-英羅霉素在CDC13中的13C-NMR譜；附圖6-英羅霉素在CDC13中的DEPT譜；附圖7-英羅霉素在CDC13中的力」H COSY譜附圖8-英羅霉素在CDC13中的HSQC譜；附圖9-英羅霉素在CDC13中的HMBC譜。
具體實施方案 以下實施例可以使本領域技術人員更全面地理解本發(fā)明，但不以任何方式限制本 發(fā)明。〈實施例1> :英羅霉素產生菌的發(fā)酵 將生長于斜面的(酵母膏0.4%，麥芽膏1%，葡萄糖0.4%，瓊脂1.2%， pH7.2) 鏈霉菌菌株Str印tomyces albidoflavus I07A-0182接種于種子培養(yǎng)基(葡萄糖0. 5%， 酵母膏O. 5%，，蛋白胨0. 5%，牛肉膏0. 5%，玉米槳0. 4%，淀粉2%，黃豆餅粉1%， CaC03 0.4%， CoCl2 0.002%， pH 7. 2)50ml/250ml的搖瓶，在28。C于旋轉搖床上培養(yǎng)36hr，然后 以5%的接種量，轉入發(fā)酵培養(yǎng)基(配方同種子培養(yǎng)基)1L/5L的搖瓶中，在2『C下于旋轉 搖床上培養(yǎng)72小時，收獲發(fā)酵液共40L。
〈實施例2> :英羅霉素的提取 鏈霉菌菌株Str印tomyces albidoflavus I07A-0182的40升發(fā)酵液離心(4Q00r/min， 20min)后，上清液用等體積的乙酸乙酯萃取，有機相經無水Na2S04脫水，減壓濃縮，得
到油狀棕褐色粗提物約20克。〈實施例3> :英羅霉素的分離 上述粗提物干法上樣于正向硅膠色譜柱(250g， 100-200目，柱體積3x40cm)，用
環(huán)己烷-乙酸乙酯i9 : 1，4 : 1，2 : i，i : i各500毫升，分級洗脫，活性追蹤表明環(huán)己 烷-乙酸乙酯2:i部分顯示較強抗水稻稻瘟菌活性。 將環(huán)己烷-乙酸乙酯2 : l部分減壓濃縮，得到黃色的粗品約l克，濕法上樣于反 向硅膠色譜柱(50g， 40-60 ii m，柱體積lx50cm)中，用甲醇_水進行分級梯度洗脫(40%甲 醇100ml ， 60 %甲醇300ml ， 75 %甲醇400ml ， 80 %甲醇300ml ， 90 %甲醇200ml)，活性追蹤表 明，75%甲醇部分具有較強抗稻瘟活性。 合并主要活性部分，旋轉蒸發(fā)除去甲醇后，冷凍干燥，得半純品，半純品溶于lml 甲醇，進行HPLC半制備(色譜柱9. 4X 250mm， 5 y m， YMC ;流動相70%甲醇水溶液；流速 2ml/min)，收集29min附近的紫外吸收峰(224nm)，合并后，旋轉蒸發(fā)除去甲醇，經過冷凍干 燥獲得英羅霉素純品，純 度為99. 3% .
〈實施例4> :英羅霉素的結構鑒定 英羅霉素的理化特性見表1。根據UV(圖1) 、IR(圖2) 、HR-ESI-MS(圖3) H-NMR CDC13為溶劑(圖4) 、 、13C-NMR CDC13為溶劑(圖5) 、DEPT CDC13為溶劑(圖6)數據和'H」H C0SY相關譜CDCl3為溶劑(圖7) H-"C相關譜HSQC CDC13為溶劑(圖8)以及反向檢測遠 程^」3C異核多鍵相關譜HMBCCDCl3為溶劑(圖9)的分析結果，確定了英羅霉素的結構。
本發(fā)明根據HR-ESI-MS (圖3)數據，(M_H)—測量值為477. 1872，理論值為 477. 1878，由此可知其分子量為478，分子式為C23H3。N209，不飽和度為10。 13C_NMR(圖5)數 據(表2)及DEPT (圖6)數據表明其有5個羰基碳(172. 9， 170. 0， 169. 6， 169. 4， 159. 0)和 6個苯環(huán)碳(150. 6， 127. 4， 124. 8， 120. 1， 119. 0， 112. 5)。英羅霉素的"H」H COSY(圖7)和 HMBC(圖9)分析見圖3，在^」HCOSY(圖7)中，化學位移為8. 55的4' -H及化學位移為 7. 24的6' -H分別與化學位移為6. 92的5' -H偶合，形成dd峰，偶合常數分別為7. 8， 7. 2 ; 在HMBC(圖9)中，5'-H分別與化學位移為112. 5的1'_C和化學位移為127.4的3'-C遠 程偶合，4' -H分別與化學位移為150. 6的2' -C和化學位移為120. 1的6' -C遠程偶合，通 過以上力」H COSY (圖7)和HMBC (圖9)結果表明，該苯環(huán)具有鄰三取代結構特征，同時苯環(huán) 和5個羰基占用9個不飽和度，另外剩下的一個不飽和度通過^」H C0SY(圖7)和HMBC(圖 9)的進一步分析表明，是由英羅霉素結構內的一個環(huán)狀結構引起。
表l英羅霉素理化性質
顏色及形狀白色無定型粉末
分子式及分子量C23H30N2O9 MW-478
Negative HRSI-MS (m/z)477,1872 (M-H)-
Found:
477,1878
Calcd:
UVXMe0Hnm(e) max 、 乂227.0(18,230), 319.0 (3，093) 在力」H COSY (圖7)中，化學位移為5. 29的3_H與化學位移為5. 73的4_H存在 偶合；在HMBC (圖9)中，4_H與化學位移為172. 9的6_C存在遠程偶合；而4_H的化學位移 表明，4-C應與氧原子相連，因此推斷存在結構片段I :-3CH」CH-50-6C0-。在'H」H C0SY(圖 7)中，化學位移為2. 51的7-H及化學位移為4. 98的9_H分別與化學位移為5. 07的8_H 偶合，形成dd峰，偶合常數分別為10. 2， 9. 6 ;在HMBC(圖9)中，7-H與化學位移為74. 8的 9-C存在遠程偶合，9-H與化學位移為170. 0的2-C存在遠程偶合；而9_H的化學位移表 明9-C應與氧原子相連，因此推斷存在結構片段II :JC0J0」CH-8CH」CH-。 HMBC中7_H與 6-C的偶合表明片段I與II相連成為結構片段III :-3CH」CH-5()-6C0-7CH-8CH-9CH」0-2C0-。 HMBC(圖9)中4-H與2-C的遠程偶合表明片段III應首尾相連。根據以上數據分析推斷， 該環(huán)狀結構為一個9元雙內酯環(huán)。英羅霉素的紫外吸收為Am^227nm，319nm;紅外在1738， 1684， 1638， 1202cm—1的吸收是酯基和酰胺基的典型吸收，而HMBC (圖9)中化學位移為7. 93 的3' -NH與化學位移為159. 0的3' -NHC0存在偶合，化學位移為7. 07的1' -C0NH與化學
位移為169. 4的r-co存在偶合，進一步驗證了兩個酰胺基的存在。綜合以上信息，推測英
羅霉素屬于抗霉素類抗生素。英羅霉素的力」H COSY和HMBC結果分析如下圖。
<formula>formula see original document page 7</formula> 通過將英羅霉素與Antimycin A13的力-NMR和13C_NMR數據進行比對，發(fā)現除8位 取代基外，大部分"H-NMR和13C-NMR數據一致，見表2。 AntimycinA13的分子量為548，如果將8位4-甲基己酰氧基換為乙酰氧基，則分子量恰好為478。 DEPT (圖6)譜和HMBC (圖9) 譜分析表明，化學位移為5. 07的8-H與化學位移為169. 6的l"' -C存在遠程偶合，化學位 移為2. 13的2"'-H與l"'-C存在偶合，因此確證8位存在乙酰氧基取代。HR-ESI-MS分析 進一步驗證了上述推斷，確證英羅霉素的結構如式(1)所示。英羅霉素的HR-ESI-MS分析 結果如下圖。
H3C-
表2.英羅霉素、in CDC13)和Antimycin A13**(in CDC13) NMR數據比較Position英羅霉素Antimycin A英羅霉素S hAntimycin A 13
sc13 5 csH
2170.0169.8
353.753,75.29 (dd，7.2,7,8 )5.30 (t,7.6 )
471.070.95.73 (m)5.74 (q,7.3)
6172.9172.7
750.150.22.51(dt，11.4，10.2,2,7)2.52 (m)
875.775,45.07 (dd，10.2,9.6)5.07 (t,9.9)
974.874.94.98 Cm)4.99 (m)
15015.21.30 (d,6.6)1.30(d,6.7)
9-CH317.818.01.30(d,6.6)1.27 (d,6.4)
r112.5112.4
2，150.6150.4
3，127.4127.3
4，124.8124.78.55 (d,7.8)8.54 Cd,7,l)
5，119.0118.86.92 (dd， 7.8,7.2)6.92 (t,8.1)
6，120.1120.07.24 (d,7.2)7.24 (d，7,l)
l，-CONH169.4169.1
l，-CONH7.07 (d,7.2)7.08 (d,7.6)
2，-OH12.62 (s)12.62 (s)
3'墨麗CHO7.93 (br s)7.99 (br s)
3'-NHCHO159.0158.88.51 (s)8.51 (s)
r，28.228.31.28 (m), 1.70 (m)1.23
(m),1.68(m)
2，'22.422.61,28 (m)1.23 (m)
3，，29.229.31.28 (m)1.23 (m)
4，，13.814.00.88 (t, 6.6)0.85 (t,7,l)
1"，169.6172,4
2，"20,832.12.13 (s)2,36 (m)
3 "，31.61.47(m)， 1.64(i^)
4,"34.11.30(m)
《"i29.21.23(m)
6"，11.40.87(t,7.0)
7,"18.90.86(d,6.2)"H-NMR為600MHz, 13C_NMR為150MHz. ^H-NMR為500MHz, 13C_NMR為125MHz。
〈實施例5> :英羅霉素的抗植物致病真菌活性實驗 選取6株植物致病真菌作為檢定菌株，以廣譜抗真菌抗生素殺稻瘟菌素S為陽性 對照藥，采用瓊脂平板法對英羅霉素進行抗真菌活性評價。英羅霉素及陽性對照藥的最高 濃度均設為25iig/紙片。 用接種環(huán)從致病菌斜面上刮取菌苔于適量無菌水中，使用磨菌器將菌絲磨碎，得 到孢子濃度約為1 X 106個/ml的菌懸液。吸取該懸液1ml倒入100ml融化并冷卻至40°C 左右的PDA培養(yǎng)基(馬鈴薯30%，葡萄糖2%，瓊脂1.5%，氯霉素0.01%， pH 6.0)中，搖 勻后，吸取10ml迅速平鋪于已含有10ml底層PDA培養(yǎng)基的平皿(直徑9cm)上。待凝固后，取已消毒過的圓形紙片(直徑6mm)，用微量移液器加入定量待測樣品，揮干溶劑后，貼 于平板上。2『C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48hr后觀察并測量抑菌圈直徑。 英羅霉素對6株植物致病真菌的MIC數據見表3，英羅霉素對6株顯示出廣泛抑制 活性，活性優(yōu)于陽性對照殺稻瘟菌素S，對豆剌盤孢菌、番茄早疫病菌和來自草莓的灰霉葡 萄胞菌具有極強抑制活性，MIC分別為0. 01 、0. 03和0. 06 ii g/紙片。
表3.英羅霉素對6株植物致病真菌的MIC結果
檢定真菌英羅霉素的MIC殺稻瘟菌素S的MIC
(Mg/紙片)(Mg/紙片)
水稻稻瘟菌0.250.01
豆刺盤孢菌0.010.25
番茄早疫病菌0.030.12
so/am.
來自草莓的灰霉葡萄胞菌0.060.62
0.781.56
來自板栗的膠胞炭疽菌
來自芒果的膠胞炭疽菌1.566.2權利要求
抗霉素類抗生素英羅霉素的制備方法，主要包括以下步驟A、英羅霉素產生菌的發(fā)酵及培養(yǎng)；B、英羅霉素的提取，分離；C、英羅霉素的結構鑒定。
2. 如權利要求1所述的制備方法，其特征是，產生菌的發(fā)酵及培養(yǎng)，首先是將保藏編號為CGMCC No. 3282生長于斜面的鏈霉菌Str印tomyces sp. I07A-01824接種于種子培養(yǎng)基，在旋轉搖床上培養(yǎng)，然后轉入發(fā)酵培養(yǎng)基，在旋轉振蕩搖床上培養(yǎng)，收獲發(fā)酵液。
3. 如權利要求1所述的制備方法，其特征是，提取、分離是，將發(fā)酵液離心，上清液用乙酸乙酯萃取，有機相經無水Na2S04脫水，減壓濃縮，得到油狀棕褐色粗提物；粗提物干法上樣于正向硅膠色譜柱，用環(huán)己烷-乙酸乙酯分級洗脫，活性追蹤表明環(huán)己烷-乙酸乙酯2 : l部分顯示較強抗稻瘟活性；將環(huán)己烷-乙酸乙酯2 : l部分減壓濃縮，得到黃色的粗品，濕法上樣于反向硅膠色譜柱中，用甲醇-水進行分級梯度洗脫，活性追蹤表明75%甲醇部分具有較強抗稻瘟活性；合并主要活性部分，旋轉蒸發(fā)除去甲醇后，冷凍干燥，得半純品，半純品溶于甲醇，進行HPLC半制備，收集29min 224nm附近的紫外吸收峰，合并后，旋轉蒸發(fā)除去甲醇，經過冷凍干燥獲得英羅霉素純品。
4. 如權利要求1所述的制備方法，其特征是，根據UV、 IR、 HR-ESI-MS H-NMR,C-NMR、DEPT、LC-MS數據測試和^」H相關譜？H-"C相關譜以及反向檢測遠程^-"C異核多鍵相關譜的分析，確定英羅霉素純品結構。
5. 權利要求1所述英羅霉素在制備抗植物致病真菌藥物中的應用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種天然來源的抗霉素類抗生素(Antimycin)英羅霉素在制備抗植物致病真菌藥物中的應用，所說英羅霉素是由鏈霉菌菌株Streptomyces albidoflavus I07A-01824發(fā)酵液中分離得到的，實驗研究證明，該化合物均具有十分顯著的抗植物致病真菌作用，可望進一步研究開發(fā)成為一種高效農用抗生素，應用于農作物栽培和食品保鮮等領域。
文檔編號C07D321/00GK101701233SQ20091018015
公開日2010年5月5日 申請日期2009年11月9日 優(yōu)先權日2009年11月9日
發(fā)明者余利巖, 孫承航, 張玉琴, 金文藻, 閆蕾蕾, 韓寧寧 申請人:中國醫(yī)學科學院醫(yī)藥生物技術研究所