專利名稱：人呼吸道合胞病毒的裂解方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種人呼吸道合胞病毒(HRSV)顆粒的裂解方法，屬于生 物學技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
人呼吸道合胞病毒(服SV)是一個世界范圍內(nèi)嚴重危害嬰幼兒健康的 最為常見的呼吸道感染性病原體，首次感染多發(fā)生在l歲以內(nèi)的幼兒，尤其 是2-6個月的嬰幼兒，是造成嬰幼兒期住院的主要原因之一，同時也是兒童 支氣管哮喘發(fā)生的重要危險因素之一。朋SV也能造成成年人感染，大約50% 的成人的哮喘加重是由服SV感染引起的。該病毒經(jīng)空氣飛沫和密切接觸傳 播，易于傳染并形成大爆發(fā)，危害極大。目前對HRSV性哮喘可采用的靜脈用 免疫球蛋白和人源性中和服SV F蛋白的單克隆抗體?？共《綡RSV藥物存在 的缺陷是一旦臨床癥狀和體征出現(xiàn)，病毒復(fù)制就已經(jīng)開始，而抗病毒藥物只 在一定程度上緩解臨床癥狀和縮短患病時間。因此，預(yù)防性給予抗病毒藥 物將會是最有效的措施。而目前針對服SV病毒，尚無理想的疫苗可用?？?慮到HRSV感染的發(fā)病率和死亡率，研制服SV疫苗顯得尤為突出。
由于HRSV傳統(tǒng)的減毒活疫苗及滅活疫苗的研究都難以在短期內(nèi)難有實 質(zhì)性的突破，因此，近年來對RSV疫苗研究主要集中在裂解純化疫苗。HRSV 編碼ll個蛋白質(zhì)，膜表面主要有F蛋白和G蛋白兩個功能蛋白，這2個 膜蛋白能誘導(dǎo)機體產(chǎn)生中和性保護抗體和細胞免疫。
根據(jù)研究，用天然病毒的某些化學成分制成的亞單位疫苗，是比較安 全的，同時由于僅用病毒的部分成分做疫苗，還可去除病毒顆粒中一些會 引起不良反應(yīng)的成分，有針對性的刺激機體的免疫反應(yīng)。因此，通過篩選 及優(yōu)化HRSV的裂解、純化方案，獲得具用免疫原性的ffi SV亞單位蛋白組分F 蛋白及G蛋白，研發(fā)HRSV裂解亞單位疫苗具有重要意義，尤其是研究裂解疫苗的技術(shù)更為必要。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是提供一種人呼吸道合胞病毒的裂解方法，以獲得具
有完全免疫原性的抗原蛋白——人呼吸道合胞病毒(HRSV)的F蛋白和G蛋 白，從而誘導(dǎo)能保護下呼吸道的中和抗體反應(yīng)。
本發(fā)明通過下列技術(shù)方案完成 一種人呼吸道合胞病毒的裂解方法， 其特征在于經(jīng)過下列步驟
A、 將人呼吸道合胞病毒經(jīng)常規(guī)沉淀、濃縮成病毒液；
B、 在上述A步驟的病毒液中，加入NP-40至最終體積濃度為1 2%，或 者加入去氧膽酸鈉至最終質(zhì)量濃度為3 4%，混合均勻后，在20 37'C下裂 解90 120min，得人呼吸道合胞病毒HRSV的F蛋白和G蛋白。
所述人呼吸道合胞病毒(HRSV)采集于發(fā)病2-3天的患者咽式子，經(jīng)常 規(guī)方法分離后，用人二倍體KMBn細胞按常規(guī)方法培養(yǎng)收獲而得。 所述NP-40、去氧膽酸鈉均為市購分析純產(chǎn)品。
本發(fā)明具有下列優(yōu)點和效果采用上述方案，可有效地對人呼吸道合 胞病毒(HRSV)顆粒進行裂解，直接獲得免疫原性較完整的目的蛋白—— 人呼吸道合胞病毒(HRSV) F蛋白和G蛋白，與現(xiàn)有的人呼吸道合胞病毒 (HRSV)的重組疫苗和核酸疫苗相比免疫原性更好，可誘導(dǎo)機體產(chǎn)生有效 的免疫應(yīng)答，同時可以去除減毒活疫苗病毒顆粒中一些引起不良反應(yīng)的成 分，提高疫苗的安全性。
所得蛋白經(jīng)電泳檢測，從電泳圖上能夠觀察到兩條目標蛋白，且目標 蛋白條帶的量較多，并可通過Western- blot實驗鑒別出目標蛋白具有特 異的免疫原性，說明NP-40、去氧膽酸鈉這2種裂解劑對人呼吸道合胞病毒 (HRSV)的裂解效果較其他常用裂解劑好，可作為裂解疫苗的較佳裂解劑。
具體實施例方式
下面通過實施例對本發(fā)明做進一步描述。 實施例1一步驟、病毒的培養(yǎng)
1) 取現(xiàn)有技術(shù)中的常規(guī)人二倍體KMBn細胞致密單層，按1:2的比例傳 代，37。C孵箱培養(yǎng)55小時；
2) 當細胞面積為90%單層時，在250cm2塑料培養(yǎng)瓶中接種1. 5ml人呼 吸道合胞病毒HRSV種子，并加入常規(guī)細胞維持液150ml，靜置于37。C孵箱 中培養(yǎng)，每次均設(shè)立正常細胞對照；其中該人呼吸道合胞病毒HRSV種子 是按常規(guī)采集于發(fā)病2天的患者咽式子，經(jīng)常規(guī)方法分離純化而得，并已 適應(yīng)人二倍體KMBn細胞，其病毒滴度為6. 51ogCCID5。；
3) 顯微鏡下觀察細胞病變達80%時，收獲病毒液凍存于-20'C備用。 二步驟、病毒液初純和濃縮
(1) 將600ml—步驟3)的病毒收獲液融化后，收集于離心管中，以 3000rpm的轉(zhuǎn)速在4。C下離心30min，棄沉淀，取上清；
(2) 在步驟(1)獲得的上清中加入NaCl至終濃度達到0.6mol/L，再 加入PEG-6000至最終質(zhì)量濃度達10% ，充分混勻溶解，靜置于4"C冰箱沉 淀過夜；
(3) 將步驟(2)中經(jīng)過沉淀的病毒液，以10000rpm的轉(zhuǎn)速在4'C下離 心2h，棄上清，取沉淀；
(4) 按30倍濃縮的比例將步驟(3)的沉淀用0.01M PBS溶液溶解， 制成粗純濃縮病毒液，存于-70'C備用。
三步驟、病毒裂解
取二步驟(4)的粗純濃縮病毒液100ml，在其中加入2mlNP-40，使最 終體積濃度達到2%,充分混合后，在35。C下裂解90min,得裂解物。 四步驟、SDS-PAGE蛋白電泳分析
(1)清潔蛋白電泳所用膠條、玻璃板、瓷板和制膠槽均為常規(guī)產(chǎn)品， 按說明書安裝垂直板電泳槽，并檢漏；
(2) 制備分離膠
按常規(guī)配制10ml質(zhì)量濃度為10%的分離膠，混勻該分離膠后，用吸管將分離膠溶液加至瓷板與玻璃板間的縫隙內(nèi)，約4.5cm高，吸取少量蒸餾 水進行密封；30min后，倒掉蒸餾水，得分離膠；
(3) 制備濃縮膠
按常規(guī)配制質(zhì)量濃度為5%的濃縮膠溶液3ml，混勻后將濃縮膠溶液加 到上述(2)的分離膠上，將制膠梳齒插入濃縮膠內(nèi)，避免帶入氣泡，15min 后濃縮膠聚合凝固，拔去制膠梳齒，得帶齒孔的濃縮膠。
(4) 樣品處理及加樣
將三步驟的裂解物與4X蛋白電泳緩沖液按體積比為3:1的比例混勻， 沸水浴加熱5min，冷卻后將裂解物用微量移液器加至四步驟(3)的濃縮膠 齒孔(即樣品孔)中，加樣體積為10yL (含2ug蛋白質(zhì))。
(5) 加電泳緩沖液
將pH 8.3，稀釋5X Tris-甘氨酸電泳緩沖液(工作液為lXTris-甘 氨酸緩沖液)倒入電泳槽中。
(6) 電泳
打開直流穩(wěn)壓電泳儀開關(guān)，將電壓調(diào)至80V后開始電泳，待電泳樣品 進入分離膠時，再將電流調(diào)至120V,當?shù)鞍纂娪揪彌_液中溴酚藍指示劑遷 移至底部時，關(guān)閉電源，終止電泳，取出電泳凝膠，在它的一端切除一角 作為標記，移入培養(yǎng)皿內(nèi)。
(7) 染色及脫色
在培養(yǎng)皿中倒入染色液，使用空氣浴搖床染色lh，取出電泳凝膠，用 蒸餾水漂洗數(shù)次，再用脫色液對其脫色2h，期間更換脫色液數(shù)次，直到蛋 白區(qū)帶清晰后取出，觀察出現(xiàn)在電泳凝膠上63KD和32KD的蛋白條帶，分 析裂解結(jié)果。
五步驟、Western- blot法鑒定裂解后的F蛋白和G蛋白 (1) SDS-PAGE
采用四步驟所得的質(zhì)量濃度為10%的分離膠，質(zhì)量濃度為5%的濃縮膠， 預(yù)染Marker作蛋白Marker,基本方法同步驟四，在裂解樣品電泳完成后，無需考馬斯亮藍染色和麗春紅染色。
(2) 尼龍膜(PVDF膜)和濾紙的預(yù)處理
剪裁出與上一步電泳所得凝膠大小一致的PVDF膜浸泡在100%甲醇溶液 中，待此膜變?yōu)榘胪该鲿r取出，用蒸餾水洗滌數(shù)次，再浸泡在Western- blot 轉(zhuǎn)移緩沖溶液里，中和平衡至少5min，備用；再剪裁同樣大小的濾紙數(shù)張， 用轉(zhuǎn)移緩沖液浸濕備用。
(3) 半干法轉(zhuǎn)膜
將與轉(zhuǎn)膜儀配套的塑料膜置于其底側(cè)，按說明書依次在塑料膜的中央 鏤空處依次放置三層用Western- blot轉(zhuǎn)移緩沖溶液浸濕的濾紙，處理過 的PVDF膜和電泳凝膠，再在膠上覆蓋三層同樣的濾紙。
使用恒流轉(zhuǎn)膜，電流大小為1 cm2X0.8mA。根據(jù)目標蛋白的分子量， 轉(zhuǎn)膜時間應(yīng)為45min。待轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，關(guān)閉電源，取出PVDF膜。若預(yù)染Marker 較清晰地出現(xiàn)在膜上，就證明轉(zhuǎn)膜成功，可以進行下一步實驗。
(4) 封閉
將PDVF膜放入可熱塑封的塑料袋中，根據(jù)PDVF膜的面積以0. lml/cm2 的量加入封閉液，排盡氣泡，密封袋口，平放于37匸溫箱溫育2h。
(5) 抗原抗體反應(yīng)
剪開塑料袋，棄封閉液，用PBST液洗滌膜3次，每次不少于lOmin。 按說明書以1: 500的濃度用封閉液來稀釋小鼠抗HRSV抗體(一抗)，仍 按0. lml/cm2的量在新的塑料袋中加入稀釋過的一抗，排盡氣泡，封閉袋口， 平放于4X:冰箱過夜。
次日，剪開塑料袋，棄一抗稀釋液，取出膜。再次用PBST洗滌膜3次， 每次不少于10min。以1: 200的濃度用封閉液稀釋服P-羊抗鼠IgG抗體偶 聯(lián)物(二抗)。在新塑料袋中加入二抗的稀釋液，排盡氣泡，密封袋口， 平放于37r溫箱溫育60min。
(6) 顯色
剪開塑料袋，取出PDVF膜，用PBST液漂洗膜3次，每次10min。按顯色試劑盒說明，配制成3ml顯色液，將膜放入顯色液中，室溫遮光反應(yīng)， 5-15min內(nèi)出現(xiàn)棕色特異性條帶。當條帶顏色深度達到要求，立即用蒸餾水 洗膜終止反應(yīng)，晾干后觀察結(jié)果，兩種裂解劑裂解的樣品在63KD和32KD 處均可看到有特異性蛋白條帶出現(xiàn)。 所用溶液如下
1. 0.01M的PBS溶液:NaCl 8g, KC1 0. 20g， Na2HP04 1. 44g ， KH2P04
0.24g，蒸餾水600ml混勻后調(diào)整pH值到7.4，加入蒸餾水定容到1L。
2. Western- blot轉(zhuǎn)移緩沖溶液(1L)
Tris堿 3. 0g
甘氨酸 14.4g
甲醇 100ml 200ml
蒸餾水 600ml 調(diào)整PH值到8.2 8.4，加蒸餾水定容到1L。
3. PBST液(1L)
NaCl 8g
KC1 0.20g
Na2HP04 1.44g
KH2P04 0.24g
蒸餾水 600ml
加入500 ul Toween-20，混勻后調(diào)整pH值到7. 4，加入蒸餾水定容到1L。
上述0. 6mol/L NaCl 、 10% PEG-6000、 Tris-甘氨酸緩沖液、蛋白電泳 緩沖液、染色液、脫色液、封閉液均為現(xiàn)有技術(shù)的常規(guī)用液。
上述小鼠抗服SV抗體(一抗)、服P-羊抗鼠IgG抗體偶聯(lián)物(二抗)為 市購產(chǎn)品。
實施例2
一步驟、病毒的培養(yǎng) 同實施例l。二步驟、病毒液初純和濃縮
同實施例2。
三步驟、病毒裂解
取二步驟(4)的粗純濃縮病毒液100ml，在其中加入4g去氧膽酸鈉 使終濃度達到4%，充分混合后，在37t:下裂解90min，得裂解物。 四步驟、SDS-PAGE蛋白電泳分析 同實施例l。
五步驟、Western- blot法鑒定裂解后的F蛋白和G蛋白 同實施例l。 實施例1、 2的優(yōu)點
(1) 從裂解劑類型方面分析，本發(fā)明所選擇的NP-40和去氧膽酸鈉2種 裂解劑與常見的裂解劑相比，對服SV的裂解效果恰到好處，對HRSV作用溫和， 容易控制裂解過程和作用條件，能同時得到HRSV病毒的F蛋白及G蛋白，且2 種蛋白均能被HRSV特異抗體識別。
(2) 以濃度為3-4%的去氧膽酸鈉或濃度為1-2%的NP-40，在20-37°C、 90-120min時的裂解效果最好，F(xiàn)及G蛋白2條目的蛋白的量都較大，蛋白 量明顯高于其他條件，且電泳圖上的雜帶少，有利益后續(xù)純化工藝的實現(xiàn)。
權(quán)利要求
1、一種人呼吸道合胞病毒的裂解方法，其特征在于經(jīng)過下列步驟A、將人呼吸道合胞病毒經(jīng)常規(guī)沉淀、濃縮成病毒液；B、在上述A步驟的病毒液中，加入NP-40至最終體積濃度為1～2％，或者加入去氧膽酸鈉至最終質(zhì)量濃度為3～4％，混合均勻后，在20～37℃下裂解90～120min，得人呼吸道合胞病毒HRSV的F蛋白和G蛋白。
2、 如權(quán)利要求l所述的人呼吸道合胞病毒的裂解方法，其特征在于所 述人呼吸道合胞病毒HRSV按常規(guī)采集于發(fā)病2-3天的患者咽式子，經(jīng)常規(guī)方 法分離后，用人二倍體KMBn細胞按常規(guī)方法培養(yǎng)收獲而得。
3、 如權(quán)利要求1所述的人呼吸道合胞病毒的裂解方法，其特征在于所 述NP-40、去氧膽酸鈉均為市購分析純產(chǎn)品。
全文摘要
本發(fā)明提供一種人呼吸道合胞病毒的裂解方法，將人呼吸道合胞病毒經(jīng)常規(guī)沉淀、濃縮成病毒液后，加入NP-40至最終體積濃度為1～2％，或者加入去氧膽酸鈉至最終質(zhì)量濃度為3～4％，混合均勻后，在20～37℃下裂解90～120min，得人呼吸道合胞病毒HRSV的F蛋白和G蛋白。可有效地對人呼吸道合胞病毒(HRSV)顆粒進行裂解，直接獲得免疫原性較完整的目的蛋白——人呼吸道合胞病毒(HRSV)F蛋白和G蛋白，與現(xiàn)有的人呼吸道合胞病毒(HRSV)的重組疫苗和核酸疫苗相比免疫原性更好，可誘導(dǎo)機體產(chǎn)生有效的免疫應(yīng)答，同時可以去除減毒活疫苗病毒顆粒中一些引起不良反應(yīng)的成分，以及避免返祖現(xiàn)象的產(chǎn)生。
文檔編號C07K14/005GK101659697SQ20091009497
公開日2010年3月3日 申請日期2009年9月15日 優(yōu)先權(quán)日2009年9月15日
發(fā)明者崔萍芳, 華 李, 蓉 楊, 白惠珠, 蔣蕊鞠, 謝忠平, 陳思瑾, 龍潤?quán)l(xiāng) 申請人:中國醫(yī)學科學院醫(yī)學生物學研究所