專利名稱：一種花臉蘑蛋白LsAPII及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物農(nóng)藥領(lǐng)域，具體涉及一種花臉蘑蛋白LsAPII以及該蛋白的 制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
植物病毒病是僅次于真菌病的病害，每年給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成嚴重損失，如全 球每年僅煙草花葉病毒所造成的損失就可達1億美元，目前對于煙草花葉病毒 病還沒有有效的防治方法。
食用菌含有的蛋白種類多樣，不僅營養(yǎng)豐富，還含有許多活性物質(zhì)，后者 對于提髙人體免疫力、防癌、抗癌都有一定的作用。目前有關(guān)食用菌屮抗病毒 活性物質(zhì)的研究主要集中于抗動物病毒方面，在抗植物病毒方面的研究很少。
花臉蘑(Ze/^5^aso2Y/jV<a)，屬擔子菌亞門(Basidiomycotina)，層菌綱 (Hymenomycetes)， 傘菌目 (Agaricales ) ， 口蘑禾斗(Tricholomataceae)， 香蘑 屬(Lepista)。其子實體般中等大??；幼嫩時其菌蓋稍上凸，呈鐘狀，成熟的 子實體菌蓋呈平展狀態(tài)。花臉蘑蛋白質(zhì)含量豐富，粗蛋白含量為40.5%，且氨 基酸組成比較齊全。但是其人工培養(yǎng)較困難。在我國，野生花臉蘑的分布較廣， 在黑龍江，河北，河南，甘肅，青海，四川，新疆，西藏，內(nèi)蒙古，廣西，云 南，湖南，福建均有分布。專利申請《花臉蘑提取物以及它的制備方法與應(yīng)用》 (申請3為200810223439. 5)公開了一種花臉蘑提取物和花臉蘑蛋白提取物， 以及它們在防治煙草花葉病毒病上的應(yīng)用，但是并沒有明確具體的活性物質(zhì)， 因此，有待進一步的研究和探索。

發(fā)明內(nèi)容
木發(fā)明目的是提供一種抗植物病毒的花臉蘑蛋白LsAPII。 本發(fā)明另--個目的是提供上述花臉蘑蛋白LsAPII的制備方法。 本發(fā)明第三目的是提供上述花臉蘑蛋白LsAPII在防治煙草花葉病毒病上 的應(yīng)用。
本發(fā)明一種抗植物病毒的花臉蘑蛋白LsAPII，所述花臉蘑蛋白來自花臉蘑(—s。W必，其N端氨基酸序列為DGEYVNDLEGTISVDA (SEQ ID No: 1 )。 上述花臉蘑蛋白LsAPII，按照如下方法制備
(1) 、將花臉蘑子實體粉末加入0.01 0.05mol/L、 pH6. 0 9. 0的磷酸緩 沖液中浸泡l 3h，然后離心，收集上清液；
(2) 、向步驟(1)所得上清液中加入硫酸銨至飽和度為50%，在0 6"下 放置6 16h，然后離心，收集上清液；
(3) 、向歩驟(2)所得的上清液中加入硫酸銨至飽和度為70%，在0 6 。C下放置6 16h,然后離心，收集沉淀；
(4) 、用0. 1 0. 3mol/L、 pH6. 0 9. 0的磷酸緩沖液溶解步驟(3)所得沉 淀，然后經(jīng)1 3倍重量的重蒸餾水透析8 16小時，將透析得到的透析液分別 用3KD和30KD的超濾管進行超濾截留，留取9 90KD之間的蛋白溶液；
(5) 、步驟(4)所得蛋白溶液經(jīng)陰離子交換柱分離，用0.3mol/L氯化鈉 溶液洗脫，收集洗脫液，該洗脫液中所含物質(zhì)即為花臉蘑蛋白LsAPII。
按照通用的命名方法，將上述所得花臉蘑蛋白命名為LsAPII
5"ora^'cfe Antivirus Protein)。
上述花臉蘑蛋白LsAPII步驟(1)中所述的花臉蘑菌絲干粉與磷酸緩沖液
之間的比例為lg: 10 25ml。
所述的花臉蘑菌絲干粉可于市場上購買得到。也可按照專利申請《花臉蘑
提取物以及它的制備方法與應(yīng)用》(申請?zhí)枮?00810223439. 5)所述方法制備。 上述花臉蘑蛋白LsAPII步驟(1)中所述的磷酸緩沖液的pH值優(yōu)選為8. 0。 上述花臉蘑蛋白LsAPII步驟(l)、(2)或(3)中所述離心的速度為10000rpm。 上述花臉蘑蛋白LsAPII步驟(1 )、 (2)或(3)中所述離心的時間為25min。 上述花臉蘑蛋白LsAPII步驟(4)中所述的超濾管可于市場上購買，如
Millipore公司生產(chǎn)的Amicon Ultra-15 30KD和3KD超濾管 上述花臉蘑蛋白LsAPII的制備方法，包括如下步驟
(1) 、將花臉蘑子實體粉末加入0. 01 0. 05mol/L、 p服.0 9. 0的磷酸緩 沖液中浸泡l 3h，然后離心，收集上清液；
(2) 、向步驟(1)所得上清液中加入硫酸銨至飽和度為50%，在0 6。C下 放置6 16h，然后離心，收集上清液；
(3) 、向步驟(2)所得的上清液中加入硫酸銨至飽和度70%，在0 6。C下放置6 16h,然后離心，收集沉淀；
(4) 、用0. 1 0. 3mol/L、 pH6. 0 9. 0的磷酸緩沖液溶解步驟(3)所得沉 淀，然后經(jīng)1 3倍重量的重蒸餾水透析8 16小時，將透析得到的透析液分別 用3KD和30KD的超濾管進行超濾截留，留取9 90KD之間的蛋白溶液；
(5) 、歩驟(4)所得蛋白溶液經(jīng)陰離子交換柱分離，用0. 3mol/L氯化鈉 溶液洗脫，收集洗脫液，該洗脫液中所含物質(zhì)即為花臉蘑蛋白LsAPII。
上述制備方法步驟(1)中所述的花臉蘑菌絲干粉與磷酸緩沖液之間的比例 為lg: 10 25ml。
上述制備方法步驟(1)中所述的磷酸緩沖液的pH值優(yōu)選為8. 0。 上述制備方法步驟(1)、 (2)或(3)中所述的離心的速度為10000rpm。 上述制備方法歩驟(1)、 (2)或(3)中所述的離心的時間為25min。 上述制備方法如無特別說明，均為常規(guī)方法。
本發(fā)明花臉蘑蛋白LsAPII可用于防治植物病毒，如煙草花葉病毒病等。具 體方法為將本發(fā)明花臉蘑蛋白LsAPII用水稀釋至蛋白總濃度為100 200ug/mL，噴施于3 4葉期煙草上。
本發(fā)明具有的優(yōu)點和有益效果(1)本發(fā)明將花臉蘑蛋白提取物中的活性 物質(zhì)具體為一種單一的蛋白，為獲得該蛋白的氨基酸序列及其編碼基因提供了 基礎(chǔ)，進而為其遺傳工程應(yīng)用提供了可能；(2)本發(fā)明花臉蘑蛋白LsAPII對植 物病毒的抑制效果好，如在花臉蘑蛋白LsAPII濃度為100ug/mL，噴施煙草72 小時后，對煙草花葉病毒的抑制率達到76.08%; (3)本發(fā)明花臉蘑蛋白LsAPII 為天然提取物，對人類和環(huán)境均無害，使用安全；(4)本發(fā)明花臉蘑蛋白LsAPII 制備方法簡單，原料易得，成本較低，適于大規(guī)模的生產(chǎn)和應(yīng)用。


圖1為花臉蘑蛋白LsAPII的SDS-PAGE鑒定圖譜，其中1為花臉蘑蛋白 LsAPII， M為分子量標準。
具體實施例方式
下述實施例中所述的方法，如無特別說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中 所述的百分含量，如無特別說明，均為質(zhì)量百分含量。 實施例1花臉蘑蛋白LsAPII的制備
按照如下方法進行(1) 、將花臉蘑子實體粉末2g加入到0. 025M、 pH8. 0的磷酸緩沖液20ml 中浸泡2h， 10000rpm離心25min，棄沉淀，取上清液。
(2) 、向步驟(1)所得上清液中加入硫酸銨至飽和度為50%，在4'C放置 8h， 10000rpm離心25min，棄沉淀，取上清液。
(3) 、向步驟(2)所得上清液中加入硫酸銨至飽和度為70%，在4'C放置 8h， 10000rpm離心25min，收取沉淀。
(4) 、用0.025M、 pH8. 0的磷酸緩沖液溶解步驟(3)所得沉淀，然后經(jīng)3 倍重量的重蒸餾水透析8小時，將透析得到的透析液分別用Amicon Ultra-15 3KD和30KD的超濾管(Millipore公司生產(chǎn))進行超濾截留，留取分子量在9 90KD的蛋白溶液。
(5) 將步驟(4)所得蛋白溶液經(jīng)陰離子交換柱分離，用0.3mol/L的氯 化鈉洗脫，收集洗脫液，洗脫液中所含物質(zhì)即為花臉蘑蛋白LsAPl丄。
實施例2花臉蘑蛋白LsAPII的制備 按照如下方法進行
(1) 將花臉蘑子實體粉末2g加入0. 03mol/L、 pH9. 0的磷酸緩沖液30ml 中浸泡3h， 10000rpm離心25min，棄沉淀，取上清液。
(2) 向步驟(1)所得上清液加入硫酸銨至飽和度為50%，在6。C放置12h， 10000rpm離心25min，棄沉淀，取上清液。
(3) 向步驟(2)所得上清液中加入硫酸銨至飽和度為70%，在6'C放置 12h， 10000rpm離心25min，棄上清，收取沉淀。
(4) 用0.03M、 pH9.0的磷酸緩沖液溶解步驟(3)所得沉淀，然后經(jīng)1 倍重量的重蒸餾水透析16小時，將透析得到的透析液分別用Amicon Ultra-15 3KD和30KD的超濾管(Millipore公司生產(chǎn))進行超濾截留，留取分子量在9 90KD的蛋白溶液。
(5) 歩驟(4)所得蛋白溶液經(jīng)陰離子交換柱分離，用0. 3mol/L氯化鈉洗 脫，收集洗脫液，洗脫液中所含物質(zhì)即為花臉蘑蛋白LsAPII。
實施例3花臉蘑蛋白LsAPII的制備 按照如下方法進行 (l)將花臉蘑子實體粉末2g加入到0. 01mol/L、 PH6. 0的磷酸緩沖液50ml 中浸泡lh， 10000rpm離心25min，取上清液。
7(2) 向歩驟(1)所得上清液加入硫酸銨至飽和度為50%，在2。C放置6h， 10000rpm離心25min，棄沉淀，取上清液。
(3) 向歩驟(2)所得十.清液加入硫酸銨至飽和度為70%，在2"C放置6h， 10000rpm離心25min，棄上清，收取沉淀。
(4) 用0.01mol/L、 p朋.0的磷酸緩沖液溶解步驟(3)中所得沉淀，然后 經(jīng)2倍重量的重蒸餾水透析13小時，將透析得到的透析液分別用Amicon Ultra-15 3KD和30KD的超濾管(MilHpore公司生產(chǎn))進行超濾截留，得到分 子量在9 90KD的蛋白溶液。
(5) 步驟(4)中所得蛋白溶液經(jīng)陰離子交換柱分離，用0. 3mol/L氯化鈉 洗脫，收集洗脫液，洗脫液中所含物質(zhì)即為花臉蘑蛋白LsAPI工。
實施例4花臉蘑蛋白LsAPII的SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定
按照如下方法進行
(1)配制分離膠和濃縮膠分離膠濃度12% (每5mL凝膠中含1. 6mL去 離子水，2. OmL 30%Acrylamide， 1. 3mL 1. 5M pH8. 8 Tris-HCl， 50yL腦SDS, 50nL 10%過硫酸銨，2uL TEMED)，濃縮膠濃度5% (每3mL凝膠中含2. lmL 去離子水，0. 5mL 30%Acrylamide， 0. 38mL 1. 5M pH8. 8 Tris-HCl， 30 u L 10%SDS， 30 uL 10。/。過硫酸銨，3uL TEMED)。
(2) 用微量進樣器取實施例1所制備的花臉蘑蛋白LsAPII，每孔進樣 15 " L。濃縮膠30V/cm，分離膠20V/cm，待指示劑距離凝膠底端lcm時停止電 泳。
(3) 染色及脫色固定(30min)-致敏(30min)-水洗(3次，每次10min) -銀染(20min)-水洗(2次，每次lmin)-顯色(視情況而定)-終止(10min) -保存(1%冰醋酸中，4'C保存)。
結(jié)果(見圖1)電泳顯示只有一條蛋白條帶，無其他雜帶，說明實施例1 中所得花臉蘑蛋白為一種單一的蛋白質(zhì)，通過遷移率計算本發(fā)明花臉蘑蛋白 LsAPII的分子量為17. 8KD。
實施例5花臉蘑蛋白LsAPII的N-端氨基酸序列測定
按照如下方法進行
(1) 取出PVDF膜，用甲醇浸泡數(shù)秒鐘，然后放入CAPS電印跡緩沖液中。
(2) 取出實施例4所得的電泳凝膠，在CAPS緩沖液中浸泡10分鐘。(3) 在50V恒壓條件下(100mA)于室溫下進行電印跡轉(zhuǎn)移2小時。
(4) 取出PVDF膜并用去離子水略為漂洗，用甲醇浸泡數(shù)秒鐘，然后進行染色。
(5) 考馬斯亮藍染色，可將0. 1%考馬斯亮藍R-250溶于40%甲醇/1% 乙酸，染色40秒，用50%甲醇脫色，并用去離子水充分洗滌，然后將剪下待 測序的條帶經(jīng)北京大學生命科學中心進行N端氨基酸序列分析。
(6) 結(jié)果所測得花臉蘑蛋白LsAPII的N端氨基酸序列為 DGEYVNDLEGTISVDA (SEQ ID No:l)，將測得的N末端16個氨基酸序列在NCBI 上進行比對，尋找其和己知蛋白的同源性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)沒有相似性較高的序列出 現(xiàn)，因此推斷LsAPII為一全新的蛋白。
實施例6花臉蘑蛋白LsAPII抗煙草花葉病毒試驗
(1) 噴霧防治處理將實施例1得到的花臉蘑蛋白LsAPII溶液分別用水 稀釋到不同的蛋白濃度(見表l)，分別對三至四葉期的枯斑三生煙進行整株噴 霧，每個處理三個重復(fù)，每個重復(fù)三株，每株三片葉子。同時用清水噴施于三 至四葉期的枯斑三生煙作為對照(CK)，設(shè)置三個重復(fù)，每個重復(fù)三株，每株三 片葉子。
(2) 病毒接種液的制備病毒來源為本研究室保存的TMV普通株系(以普 通煙為寄主，活體保存)，其獲取方法是將感染煙草花葉病毒TMV普通株系的 普通煙的葉片去除主脈，與pH8. 0的0. 01 mol/L的PBS按lg/20ml混合，每 20mlPBS加0.015g金剛砂，將葉片充分研磨，得到接種液。
(3) 接種將按步驟(1)的方法噴霧72小時后得到的枯斑三生煙植株， 用步驟(2)得到的接種液進行摩擦接種(植病研究方法(第三版)，方中達，中 國農(nóng)業(yè)出版社)接種后立即用清水沖洗，于溫室中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為28。C光照 12小時，18"C無光照12小時，交替進行。
(4) 抑制率計算接種72小時后觀察枯斑三生煙葉片產(chǎn)生枯斑數(shù)量，按 下式計算出枯斑抑制率。
X= (CK-Y) /CKX100 (式I) 式I中，X為枯斑抑制率，單位％; CK為清水對照葉片的平均枯斑個數(shù)， 單位個；Y為經(jīng)花臉蘑蛋白LsAPII誘導(dǎo)處理后葉片的平均枯斑個數(shù)，單位表1花臉蘑蛋白LsAPII抗TMV的試驗結(jié)果
處理濃度 枯斑抑制率(％ ) 差異顯著性
((ig/mL)重復(fù)一重復(fù)二重復(fù)三平均值0.05
2028.3021.8623.9724.71±3.28d
4046.3247.7645.1646.41±1.30c
6058.4355,9662.8559.08±3.49bc
8074.6287.3057.6373.18±14.89ba
10084.8269.8773.5476.08士7.79
結(jié)果(見表l)表明花臉蘑蛋白LsAPII對煙草花葉病毒病有很好的抑制作 用，且隨著LsAPII濃度的增大，其抗TMV的抑制活性增加，在濃度為100y g/mL 時，其抑制率平均達76. 08%。序列表
〈110〉北京市農(nóng)林科學院
〈120〉 一種花臉蘑蛋白LsAPII及其制備方法和應(yīng)用 〈160〉 1
〈170> Patentln version 3. 5 〈210〉 1 <211> 16 〈212〉 PRT
〈213〉 Lepista sordida 〈400〉 1
Asp Gly Glu Tyr Val Asn Asp Leu Glu Gly Thr lie Ser Val Asp Ala 15 10 15
li
權(quán)利要求
1、一種抗植物病毒的花臉蘑蛋白LsAPII，所述花臉蘑蛋白來自花臉蘑(Lepista sordida)，其N端氨基酸序列為DGEYVNDLEGTISVDA。
2、 權(quán)利要求l所述的花臉蘑蛋白LsAPII，按照如下方法制備(1) 、將花臉蘑子實體粉末加入0. 01 0. 05mol/L、 pH6. 0 9. 0的磷酸緩 沖液中浸泡l 3h，然后離心，收集上清液；(2) 、向步驟(1)所得上清液中加入硫酸銨至飽和度為50%，在0 6t:下 放置6 16h，然后離心，收集上清液；(3) 、向步驟(2)所得的上清液中加入硫酸銨至飽和度為70%，在0 6 TT下放置6 16h，然后離心，收集沉淀；(4) 、用0. 1 0. 3mol/L、 pH6. 0 9. 0的磷酸緩沖液溶解步驟(3)所得沉 淀，然后經(jīng)1 3倍重量的重蒸餾水透析8 16小時，將透析得到的透析液分別 用3KD和30KD的超濾管進行超濾截留，留取9 90KD之間的蛋白溶液；(5) 、步驟(4)所得蛋白溶液經(jīng)陰離子交換柱分離，用0.3mol/L氯化鈉 溶液洗脫，收集洗脫液，該洗脫液中所含物質(zhì)即為花臉蘑蛋白LsAPII。
3、 按照權(quán)利要求2所述的花臉蘑蛋白LsAPI1，其特征在于其步驟(1)中 所述的花臉蘑菌絲干粉與磷酸緩沖液之間的比例為lg: 10 25ml。
4、 按照權(quán)利要求2或3所述的花臉蘑蛋白LsAPII，其特征在于其步驟(1) 中所述的磷酸緩沖液的pH值為8. 0。
5、 按照權(quán)利要求2或3所述的花臉蘑蛋白LsAPII，其特征在于其步驟(l)、 (2)或(3)中所述離心的速度為10000rpm。
6、 按照權(quán)利要求2或3所述的花臉蘑蛋白LsAPII，其特征在于其步驟(l)、 (2)或(3)中所述離心的時間為25min。
7、 權(quán)利要求l或2花臉蘑蛋白LsAPII的制備方法，包括如下步驟(1) 、將花臉蘑子實體粉末加入0.01 0.05mol/L、 pH6. 0 9. 0的磷酸緩 沖液中浸泡1 3h，然后離心，收集上清液；(2) 、向步驟(1)所得上清液中加入硫酸銨至飽和度為50%，在0 6X:下 放置6 16h，然后離心，收集上清液；(3) 、向步驟(2)所得的上清液中加入硫酸銨至飽和度70%，在0 6。C下 放置6 16h，然后離心，收集沉淀；(4) 、用0. 1 0. 3mol/L、 pH6. 0 9. 0的磷酸緩沖液溶解步驟(3)所得沉 淀，然后經(jīng)1 3倍重量的重蒸餾水透析8 16小時，將透析得到的透析液分別 用3KD和30KD的超濾管進行超濾截留，留取9 90KD之間的蛋白溶液；(5) 、步驟(4)所得蛋白溶液經(jīng)陰離子交換柱分離，用0.3mol/L氯化鈉 溶液洗脫，收集洗脫液，該洗脫液中所含物質(zhì)即為花臉蘑蛋白LsAPII。
8、 按照權(quán)利要求7所述的制備方法，其特征在于其步驟(1)中所述的花 臉蘑菌絲干粉與磷酸緩沖液之間的比例為lg: 10 25ml。
9、 按照權(quán)利要求7所述的制備方法，其特征在于其步驟(1)中所述的磷 酸緩沖液的pH值為8.0;其步驟(l)、(2)或(3)中所述的離心的速度為10000rpm; 其步驟(1)、 (2)或(3)中所述的離心的時間為25min。
10、權(quán)利要求1 6任一所述的花臉蘑蛋白LsAPII在防治煙草花葉病毒病上 的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種花臉蘑蛋白LsAPII，其N端氨基酸序列為DGEYVNDLEGTISVDA；其制備方法為將花臉蘑子實體粉末在磷酸緩沖液中浸泡，離心，取上清液；然后分別加入硫酸銨至飽和度為50％和70％，在0～6℃下放置6～16h，分別離心，收取上清液或沉淀；再用磷酸緩沖液溶解，透析、超濾管超濾、陰離子交換柱分離和0.3mol/L氯化鈉溶液洗脫，即得花臉蘑蛋白LsAPII。本發(fā)明LsAPII對煙草花葉病毒抑制效果好；其次確定LsAPII為單一蛋白，為其遺傳工程應(yīng)用提供了基礎(chǔ)；還有LsAPII為天然提取物，對人類和環(huán)境均無害；另外LsAPII制備方法簡單，原料易得，成本較低。
文檔編號C07K7/08GK101665531SQ200910093039
公開日2010年3月10日 申請日期2009年9月25日 優(yōu)先權(quán)日2009年9月25日
發(fā)明者紅 嚴, 瑩 周, 李興紅, 燕繼曄, 馬鳳金 申請人:北京市農(nóng)林科學院