專利名稱：一種從山莓葉中分離出的新化合物、制備方法及用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及從山莓葉中一種新化合物及其制備方法，以及其在抗腫瘤方面的 作用。
背景技術(shù)：
山莓0fe/ws co/r/ oi^/b力'"s L. f)屬薔薇科懸鉤子屬中一種落葉灌木。多生 長于向陽山坡、溪邊、山谷、荒地和灌叢中，海拔300 m 1500 m。除東北、內(nèi)蒙 古、青海、新疆、西藏外，全國均有分布。福建全省各地均有山莓分布，野生資源 蘊(yùn)藏量相當(dāng)大。我國利用山莓的歷史悠久，在古書《本草拾遺》、《本草綱目》、《名 醫(yī)別錄》、《食療本草》中就有山莓藥用價(jià)值的詳細(xì)記載，其藥用已有上千年歷史。 山莓果、根及葉均可入藥。果以未成熟果入藥，民間常作為覆盆子代用品。果性平 味微甘、酸、溫，具有澀精益腎、助陽明目之功效，能醒酒止渴、化痰解毒、收斂； 主治醉酒、痛風(fēng)、丹毒、燙火傷、腎虛、遺精、遺尿等癥；根性平味微苦澀，具有 活血化瘀、清熱利濕、解毒斂瘡的作用，主治風(fēng)濕腰痛、咯血、崩漏、痔瘡出血、 痢疾、瀉泄、閉經(jīng)、痛經(jīng)、跌打損傷、毒蛇咬傷、瘡瘍腫痛、濕疹、小兒疳積等癥； 葉性平微苦，具有清熱利咽、解毒斂瘡、消腫解毒的功效，主治咽喉腫痛、多發(fā)性 膿腫、乳腺炎等癥。其中地上部分(葉、幼果和莖)所含的香豆素化合物，如東茛 菪內(nèi)酯具有一定的鎮(zhèn)痛、抗炎、祛痰和平喘的作用。在湘西、鄂西北山莓作為常用 的苗族藥，用于醫(yī)治常見的多發(fā)病，如腹瀉、目赤、酒精中毒等，療效確切。
目前有關(guān)山莓的研究主要是集中在資源的開發(fā)利用方面，陳炳華利用其聚合 果，用于食品加工；利用其鞣質(zhì)作為化工原料；陳炳華等對(duì)山莓的營養(yǎng)成分及利 用價(jià)值和莖中香豆素類成分進(jìn)行了初步研究；周雙德報(bào)道了山莓生態(tài)習(xí)性與葉的 解剖結(jié)構(gòu)。除此之外有關(guān)山莓化學(xué)成分方面的研究也有報(bào)道安保禮等人從山莓 葉中提取出茶多酚；陳炳華報(bào)道了山莓全株含鞣質(zhì)、黃酮類化合物，地上部分(葉、 莖、幼果)含香豆素化合物，根中含酚性成分和皂甙，從莖和葉中分離出一種香 豆素成分；董振生對(duì)山莓葉的生物堿進(jìn)行了提取和抑菌作用的研究。張敏從山莓本發(fā)明的目的在于提供一種從山莓中分離出的新化合物，其化學(xué)名為對(duì)映-貝
殼杉-16a， 17二羥基-2酮[ent-kauran(5R， 8S， 9R， IOR， 13R， 16R) -2-one-16 a ， 17-diol]，其結(jié)構(gòu)經(jīng)波譜解析和化學(xué)方法確定，活性實(shí)驗(yàn)證明該化合物具有抗腫瘤 作用。
本發(fā)明提供的新化合物是從山莓葉中經(jīng)過反復(fù)硅膠柱層析、薄層層析和結(jié)晶 分離所得，化學(xué)名為對(duì)映-貝殼杉-16a， 17二羥基-2酮[ent-kauran(5R， 8S， 9R，亂13R， 16R)-2-one-16a ， 17-diol]，經(jīng)波譜解析和化學(xué)方法確定其化 學(xué)結(jié)構(gòu)式為
該化合物的制備方法包括以下步驟
(1 )稱取粉碎的山莓葉，加入10倍體積80%的乙醇，攪勻，先超聲提取30min， 然后于室溫下浸提48h，過濾，濾渣再重復(fù)提取一次，合并濾液，濃縮凍干得精 粗提物浸膏液，備用。
(2) 將精粗提物浸膏液分別用石油醚、氯仿、乙酸乙酯或正丁醇反復(fù)多次萃 取，將萃取液濃縮，冷凍干，收集乙酸乙酯萃取物。
(3) 將乙酸乙酯萃取物進(jìn)行硅膠柱色譜分離，用正已烷與乙酸乙酯和乙酸乙 酯與甲醇進(jìn)行梯度洗脫，合并流出液，經(jīng)TLC檢測，顯色，合并相同組份，經(jīng)重 結(jié)晶后得該化合物。
步驟(3)中，進(jìn)行梯度洗脫時(shí)，正已烷與乙酸乙酯的體積比依次為100: 0，
100: 50，乙酸乙酯與甲醇的體積比依次為100: 0， 80: 1， 40: 1， 10: 1， 5: 1， 1: 1, 0: 1。
該化合物作為制備抗腫瘤藥物的用途。 該化合物作為制備保健品的用途。該化合物作為制備藥物組分之一的用途。 本發(fā)明提供的新化合物的結(jié)構(gòu)鑒定方法為 1、化合物的理化數(shù)據(jù)
(1) 白色針狀晶體，M.p. 150 152°C，旋光度-23.8° :全波段掃描入max
々15nm(甲醇)，用氯仿甲醇=20: 1，石油醚乙酸乙酯=2: 5,環(huán)己垸丙酮 =3: l三種不同溶劑系統(tǒng)上行展開，1%香草醛硫酸溶液顯為單一紅色斑點(diǎn)。在氯 仿甲醇=20: l系統(tǒng)中Rf=0. 38 ，石油醚乙酸乙酯=2: 5系統(tǒng)中Rf=0. 398， 環(huán)己烷丙酮=3: 1系統(tǒng)中Rf-0.25。
(2) IR數(shù)據(jù)(溴化鉀壓片，cm—1): 3540， 3297， 2936， 2863， 1698, 1670, 1469， 1445, 1368， 1272， 1211， 1154， 1068， 1024， 994， 964， 918， 878， 815。 解析3540， 3297 cm—1 (強(qiáng)，寬)，說明分子中含有羥基；1698 cm—t (強(qiáng)，第一 強(qiáng)峰)說明分子中含有羰基。
2、 分子式的確定
APCI-MS給出分子量為320。在'H-NMR，中共有32個(gè)氫信號(hào)，服QC中顯示 共有30個(gè)連碳?xì)?，因此有兩個(gè)活潑質(zhì)子，對(duì)比碳譜數(shù)據(jù)，81.7卯m， 66.2ppm， 應(yīng)該為連氧碳信號(hào)，因此分子中有兩個(gè)羥基，而211 ppm， DEPT顯示為S信號(hào)， 說明為一酮羰基，所以分子中共有20個(gè)碳原子，32個(gè)氫，3個(gè)氧，分子式為C2flH3A， 分子量為320， Q=5。
3、 結(jié)構(gòu)式的確定
分析該化合物的碳譜(COM， DEPT)， 20個(gè)碳原子，發(fā)現(xiàn)其碳譜數(shù)據(jù)與對(duì)映 貝殼杉垸型二萜數(shù)據(jù)吻合，且在前面對(duì)該植物研究中發(fā)現(xiàn)了多個(gè)對(duì)映貝殼杉烷型 二萜類成分。對(duì)映-17-貝殼杉烷的原子編號(hào)如下-
在該類二砲碳譜數(shù)據(jù)對(duì)比研究中，發(fā)現(xiàn)對(duì)于對(duì)映-16 a ， 17-二羥基貝殼杉垸， 第13-17號(hào)碳化學(xué)位移信號(hào)，大概范圍為46， 38， 54， 81， 66 (卯m)左右， 而對(duì)于對(duì)映-16P， 17-二羥基貝殼杉烷，第13-17號(hào)碳化學(xué)位移信號(hào)，大概范圍為42， 38， 53， 80， 70 (ppm)左右，兩者主要對(duì)于17號(hào)碳化學(xué)位移差距明顯， 而該化合物的此五個(gè)碳化學(xué)位移分別為52.8， 81.7， 66.2 (ppm)與對(duì)映-， 17-二羥基貝殼杉烷吻合，故推測16， 17位有兩個(gè)羥基取代，其中16為a構(gòu)型。 進(jìn)一步分析該化合物HMBC圖，證實(shí)了上述分析，而且進(jìn)一步說明，羰基取代在 2為上。
綜合上述分析可推知其為對(duì)映-貝殼杉-16a ， 17 二羥基-2酮 [ent-kauran(5R， 8S， 9R， IOR， 13R， 16R) -2-one-16 a ， 17-diol]。結(jié)構(gòu)為下 圖
化合物結(jié)構(gòu) 化合物HMBC圖
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明所述的新化合物是從山莓葉經(jīng)過反復(fù)硅膠柱層析、薄層層析和結(jié)晶等方 法分離出的，化學(xué)名為對(duì)映-貝殼杉-16a， 17二羥基-2酮[ent-kauran(5R， 8S， 9R， 10R, 13R， 16R)-2-one-16a ， 17-diol]?；衔锏慕Y(jié)構(gòu)式為
<formula>formula see original document page 6</formula>
本發(fā)明提供的化合物的制備方法，包括以下步聚
(1)提取稱取粉碎的山莓葉3500.0 g，加入10倍體積80%的乙醇，攪勻， 先超聲提取30min，然后于室溫下浸提48h，過濾，濾渣再重復(fù)提取一次，合并濾液，濃縮凍干得精粗提物，備用。
(2) 液液萃取分離將浸膏液用依次用石油醚，氯仿、乙酸乙酯、正丁醇反 復(fù)多次萃取，將萃取液分別濃縮，冷凍干。分別得石油醚萃取，氯仿、乙酸乙酯、 正丁醇萃取物。
(3) 柱層析及結(jié)晶分離純化將乙酸乙酯萃取物進(jìn)行硅膠柱色譜分離，用正 已烷與乙酸乙酯和乙酸乙酯與甲醇進(jìn)行梯度洗脫，正已垸與乙酸乙酯的體積比依 次為100: 0， 100: 50，乙酸乙酯與甲醇的體積比依次為100: 0， 80: 1， 40-1， 10: 1， 5: 1， 1: 1， 0: 1。每瓶收集50fflL，共收集173瓶，經(jīng)TLC檢測，
顯色，合并相同組份，共得15個(gè)組份，分別表示為Fr. 1， Fr.2， Fr.3， Fr.4， Fr.5， Fr. 6, Fr.7, Fr.8， Fr.9， Fr.10， Fr.11， Fr. 12， Fr. 13， Fr. 14 Fr. 15， Fr. 2組份，經(jīng)重結(jié)晶后得化合物100mg。 本發(fā)明中化合物抗腫瘤活性測定
1、 實(shí)驗(yàn)材料
l.l藥品上述分離的化合物對(duì)映-貝殼杉-16a， 17二羥基-2酮。 1.2細(xì)胞人肝癌細(xì)胞株H印G2由廣州泰禾生物醫(yī)藥公司提供。 1.3試劑PRMI1640，胎牛血清，96孔板，胰酶，DMS0，MTT， 5-FU,青霉素， 鏈霉素。
2、 方法
將肝癌H印G2細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、lxl05U/L青霉素、鏈霉素的 RPMI1640培養(yǎng)液中，37°C, 5% 0)2培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)傳代培養(yǎng)。細(xì)胞以lxl(T個(gè)/孔 的濃度接種于96孔培養(yǎng)板，于含10%的胎牛血清的RPMI—1640培養(yǎng)液中培養(yǎng)24 小時(shí)，細(xì)胞貼壁后，實(shí)驗(yàn)組(化合物對(duì)映-貝殼杉-16a， 17二羥基-2酮)給藥 量為IOO嗎/mL、 200嗎/raL、 400嗎/mL，陰性對(duì)照組加等量RPMI (DMSO含量 為1%),陽性對(duì)照組加入5-Fu的濃度為100嗎/mL、200昭/mL、400嗎/mL、800昭/mL、 1600嗎/mL。空白對(duì)照組只加等量RPMI。藥物作用24小時(shí)后，于每孔中加入配 制的5% MTT 20pL繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄上清，加入150pL DMSO，在混合振蕩儀上 振藥約10rain，使結(jié)晶物充分溶解后，于酶聯(lián)檢測儀上492mn波長測定各孔吸光 值。
計(jì)算細(xì)胞毒性值(CT%) ， CT%= (1 — 0D處理/0D對(duì)照)X 100%。3、實(shí)驗(yàn)結(jié)果(見下表)
化合物對(duì)肝癌H印G2細(xì)胞的抑制作用
藥物濃度 H印G2
(Pg/mL) 0D值 抑制率
對(duì)照組 0.442
400 0.034 92.4%
200 0.098 77.8%
100 0.282 36.2%
上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明對(duì)映-貝殼杉-16a， 17二羥基-2酮化合物對(duì)肝癌H印G2 細(xì)胞明顯的抑制作用，且具有良好的量效關(guān)系。
權(quán)利要求
1、一種從山莓葉中分離出的新化合物，化學(xué)名為對(duì)映-貝殼杉-16α，17二羥基-2酮，其化學(xué)結(jié)構(gòu)式為
2、 根據(jù)權(quán)利要求l所述的從山莓葉中分離出的新化合物的制備方法，其特 征在于，包括以下步驟(1) 稱取粉碎的山莓葉，加入10倍體積80%的乙醇，攪勻，先超聲提取30min， 然后于室溫下浸提48h，過濾，濾渣再重復(fù)提取一次，合并濾液，濃縮凍干得精 粗提物浸膏液，備用。(2) 將精粗提物浸膏液分別用石油醚、氯仿、乙酸乙酯或正丁醇反復(fù)多次萃 取，將萃取液濃縮，冷凍干，收集乙酸乙酯萃取物。(3) 將乙酸乙酯萃取物進(jìn)行硅膠柱色譜分離，用正已垸與乙酸乙酯和乙酸乙 酯與甲醇進(jìn)行梯度洗脫，合并流出液，經(jīng)TLC檢測，顯色，合并相同組份，經(jīng)重 結(jié)晶后得該化合物。
3、 根據(jù)權(quán)利要求2所述的從山莓葉中分離出的新化合物的制備方法，其特征在于，進(jìn)行梯度洗脫時(shí)，正已垸與乙酸乙酯的體積比依次為100: 0， 100: 50，乙酸乙酯與甲醇的體積比依次為100: 0， 80: 1， 40: 1， 10: 1， 5: 1， 1: 1， 0: 1。
4、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的從山莓葉中分離出的新化合物作為制備抗腫瘤藥 物的用途。
5、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的從山莓葉中分離出的新化合物作為制備保健品的 用途。
6、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的從山莓葉中分離出的新化合物作為制備抗腫瘤藥 物組分之一的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種從山莓葉中分離出的新化合物、制備方法及用途，化合物的化學(xué)名為對(duì)映-貝殼杉-16α，17二羥基-2酮[ent-kauran(5R，8S，9R，10R，13R，16R)-2-one-16α，17-diol]，由山莓經(jīng)過反復(fù)硅膠柱層析、薄層層析和結(jié)晶分離所得，其結(jié)構(gòu)式有波譜解析和化學(xué)方法確定，經(jīng)活性實(shí)驗(yàn)證明該化合物具有抗腫瘤作用。
文檔編號(hào)C07C49/00GK101633609SQ20091004416
公開日2010年1月27日 申請(qǐng)日期2009年8月12日 優(yōu)先權(quán)日2009年8月12日
發(fā)明者庸 曹, 陳雪香 申請(qǐng)人:庸 曹