專利名稱：：用于捕獲和修飾基因組dna大片段和用合成葉綠體構(gòu)建生物體的系統(tǒng)的制作方法用于捕獲和修飾基因組DNA大片段和用合成葉綠體構(gòu)建生物體的系統(tǒng)交叉參考本申請(qǐng)要求美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?0/978，024(在2007年10月5日提交)的優(yōu)先權(quán)和權(quán)益，其申請(qǐng)通過(guò)引用并入本文。
背景技術(shù)：
：對(duì)于許多基因的功能分析，研究者需要分離和操作大DNA片段。基因組學(xué)的出現(xiàn)和DNA基因組區(qū)域的研究已經(jīng)產(chǎn)生了對(duì)能攜帶大DNA區(qū)域的載體的需要。一般地，兩種類型的酵母載體系統(tǒng)目前是可得到的。第一種類型的載體是能在酵母和細(xì)菌之間轉(zhuǎn)移小的插入DNA的載體。第二種類型的載體是在酵母人工染色體(YACs)中產(chǎn)生中間缺失或末端缺失的片段化載體。小的插入穿梭載體能與同源序列重組并且回收同源序列。它們以著絲粒為基礎(chǔ)并且在酵母中穩(wěn)定且自主地復(fù)制，但是也包含用于維持為細(xì)菌質(zhì)粒的高拷貝復(fù)制起點(diǎn)。然而，這些載體受限于它們小的插入能力。第二種類型的載體(也被稱為片段化載體)具有重組發(fā)生序列，但是不能將回收的插入DNA轉(zhuǎn)移到細(xì)菌用于DNA的大量制備。研究者采用片段化技術(shù)以縮小YACs中的目標(biāo)區(qū)域。然而，從瓊脂糖膠中分離足量的YACDNA以微注射或電穿孔保留著絲粒。當(dāng)YAC與內(nèi)源染色體共同遷移時(shí)提純就存在問(wèn)題。此外，YACs可能是嵌合的或者包含對(duì)于特定功能研究來(lái)說(shuō)不需要的其它DNA區(qū)域?？傻玫降挠糜诳寺〈笃蔚妮d體類型是粘粒、Pls和細(xì)菌人工染色體(BACs)。這些載體限于細(xì)菌并且對(duì)于通過(guò)同源重組進(jìn)行的修飾來(lái)說(shuō)可能不能穿梭到酵母。細(xì)菌載體也限于其在轉(zhuǎn)化植物和藻類中的應(yīng)用。例如，盡管葉綠體被認(rèn)為起源于光合細(xì)菌向真核宿主的內(nèi)共生，但是葉綠體的翻譯更加復(fù)雜。具有多拷貝葉綠體基因組的多個(gè)葉綠體的存在增加了遺傳工程化植物和藻類的復(fù)雜性。因此，需要開(kāi)發(fā)一種從植物和藻類的葉綠體中的DNA大片段表達(dá)蛋白質(zhì)的方法。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明涉及分離、表征和/或修飾包括細(xì)菌和葉綠體的整個(gè)基因組在內(nèi)的大DNA的組合物和方法。組合物包括穿梭載體，可以向穿梭載體中插入靶DNA。方法包括通過(guò)去除、添加或重排部分靶DNA來(lái)修飾或操作靶DNA，以及將修飾的DNA引入宿主。本發(fā)明的一方面提供分離的載體，其包括酵母元件、細(xì)菌復(fù)制起點(diǎn)和至少20kb基因組DNA。在一些載體中，酵母元件是酵母著絲粒、酵母自主復(fù)制序列、酵母營(yíng)養(yǎng)缺陷型標(biāo)記或其組合。DNA可來(lái)自非維管光合生物體，例如宏觀藻類、微觀藻類、小球藻(Ch.vulgaris)、萊茵衣藻(C.reinhardtii)、杜氏鹽藻(D.salina)、四尾柵藻(S.quadricanda)或雨生紅球藻(H.pluvalis)。在一些實(shí)施方式中，基因組DNA被修飾，例如通過(guò)異源或同源多核苷酸的插入、一個(gè)或多個(gè)核酸堿基的缺失、一個(gè)或多個(gè)核酸堿基的突變、一個(gè)或多個(gè)多核苷酸的重排或其組合。在一些情況下，修飾是合成的。當(dāng)轉(zhuǎn)化到宿主細(xì)胞時(shí)，本發(fā)明的載體可導(dǎo)致產(chǎn)生宿主細(xì)胞不自然產(chǎn)生的產(chǎn)物。這種產(chǎn)物的一些實(shí)例包括生物質(zhì)降解酶、脂肪酸、萜或類萜。在一些宿主細(xì)胞中，載體的表達(dá)導(dǎo)致所述宿主細(xì)胞自然生產(chǎn)的產(chǎn)物的產(chǎn)量增加，例如生物質(zhì)降解酶、萜烯或萜類。本發(fā)明的載體可進(jìn)一步包括一種或多種選擇標(biāo)記，例如酵母標(biāo)記、酵母抗生素抗性標(biāo)記、酵母營(yíng)養(yǎng)缺陷型標(biāo)記、細(xì)菌標(biāo)記、細(xì)菌抗生素抗性標(biāo)記、細(xì)菌營(yíng)養(yǎng)缺陷型標(biāo)記、藻類標(biāo)記、藻類抗生素抗性標(biāo)記、藻類營(yíng)養(yǎng)缺陷型標(biāo)記或其組合。本發(fā)明的載體還可包含葉綠體基因組DNA，其包括1)1-200個(gè)基因；2)全部必需的葉綠體基因；和/或3)30-400kb。本文還描述了宿主細(xì)胞，其包括本文所述的載體。示例性的宿主細(xì)胞可以是自然地非光合或光合型，并且包括例如釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、大腸桿菌(Escherichiacoli)、宏觀藻類、微觀藻類、小球藻、萊茵衣藻、杜氏鹽藻、四尾柵藻或雨生紅球藻。在本發(fā)明的另一方面，提供了產(chǎn)生載體的方法，其中所述方法涉及將靶向DNA插入載體中——其中所述載體包括酵母著絲粒、酵母自主復(fù)制序列和細(xì)菌復(fù)制起點(diǎn)；用所述載體轉(zhuǎn)化生物體和捕獲一部分葉綠體基因組；由此產(chǎn)生具有一部分葉綠體基因組的載體。在一些情況下，靶向DNA是葉綠體基因組DNA。該方法可被用于捕獲一部分基因組，其長(zhǎng)度為10-400kb。在一些情況下，捕獲步驟通過(guò)重組發(fā)生。葉綠體基因組的捕獲部分可與載體共同轉(zhuǎn)化到生物體中，因此重組步驟可在體內(nèi)發(fā)生。用于實(shí)施本文所公開(kāi)的方法的生物體可以是真核類和/或光合類生物體。在一些情況下，生物體是非維管光合生物體，例如宏觀藻類、微觀藻類、小球藻、萊茵衣藻、杜氏鹽藻、四尾柵藻或雨生紅球藻。用于實(shí)施本文所公開(kāi)的方法的生物體可以是非光合類生物體，例如酵母。在一些情況下，非光合生物體可包含外源葉綠體DNA。在一些實(shí)施方式中，采用修飾一部分葉綠體基因組的其它步驟。修飾可通過(guò)同源重組實(shí)現(xiàn)。這樣的重組可發(fā)生在生物體中，例如真核生物和/或光合生物。在一些情況下，生物體是非維管光合生物體，例如宏觀藻類、微觀藻類、小球藻、萊茵衣藻、杜氏鹽藻、四尾柵藻或雨生紅球藻。在其他情況下，生物體可以是非光合類生物體，例如酵母。在具有修飾步驟的實(shí)施方式中，該步驟可包括多核苷酸的添加、一個(gè)或多個(gè)核酸堿基的缺失、一個(gè)或多個(gè)核酸堿基的突變、多核苷酸的重排或其組合。本文還公開(kāi)分離的載體，其包括必需葉綠體基因、選擇標(biāo)記和所述載體中一個(gè)或多個(gè)核酸的操作。在一些情況下，必需葉綠體基因克隆自非維管光合生物體，如宏觀藻類、微觀藻類、小球藻、萊茵衣藻、杜氏鹽藻、四尾柵藻或雨生紅球藻。用于本文所述載體中的必需葉綠體基因可以是合成的。本文所述載體可進(jìn)一步包括表達(dá)盒，其可進(jìn)一步包括整合到靶DNA的區(qū)域，例如細(xì)胞器DNA。本文所述載體還可包含一個(gè)或多個(gè)選擇標(biāo)記，例如營(yíng)養(yǎng)缺陷型標(biāo)記、抗生素抗性標(biāo)記、葉綠體標(biāo)記或其組合。在一些情況下，必需葉綠體基因是葉綠體功能、光合作用、碳固定、產(chǎn)生一種或多種烴或其組合所必需的那些。必需葉綠體基因可包括高達(dá)200個(gè)基因和/或由高達(dá)400kb組成。在本文所述的一些載體中，在一個(gè)或多個(gè)核酸中的操作是添加、缺失、突變或重排。在一些情況下，宿主細(xì)胞中載體的表達(dá)產(chǎn)生所述宿主細(xì)胞不自然產(chǎn)生的產(chǎn)物。在一些情況下，本發(fā)明載體的表達(dá)導(dǎo)致所述宿主細(xì)胞自然產(chǎn)生的產(chǎn)物的產(chǎn)量增加。這樣產(chǎn)物的實(shí)例是生物質(zhì)降解酶、脂肪酸、萜或類萜。如本文所述，本發(fā)明的一方面是分離的葉綠體，其包括本發(fā)明的載體。在另一方面，提供了宿主細(xì)胞，其包括本發(fā)明的載體。用在本發(fā)明中的宿主細(xì)胞可以是自然非光合類或自然光合類宿主細(xì)胞。用于本發(fā)明的生物體的實(shí)例包括釀酒酵母、大腸桿菌、宏觀藻類、微觀藻類、小球藻、萊茵衣藻、杜氏鹽藻、四尾柵藻或雨生紅球藻。在本發(fā)明的另一方面，提供了轉(zhuǎn)化細(xì)胞或生物體的方法，其中所述方法包括將一載體插入到所述細(xì)胞或生物體，所述載體包括所有必需葉綠體基因和任選地在所述細(xì)胞或生物體中非自然發(fā)生的一個(gè)或多個(gè)基因。在一些實(shí)施方式中，所述方法進(jìn)一步包括消除所述細(xì)胞或生物體中基本所有的葉綠體基因組的步驟。用于該方法的細(xì)胞或生物體可以是光合類、非光合類和/或真核類細(xì)胞或生物體。用于該方法的細(xì)胞或生物體可以是非維管類細(xì)胞或生物體。在一些情況下，用于該方法的載體還可包括表達(dá)盒，并且表達(dá)盒可以能整合到非核DNA中。在一種實(shí)施方式中，在所述細(xì)胞或生物體中非自然存在的一個(gè)或多個(gè)基因是類異戊二烯途徑、MVA途徑或MEP途徑中的基因。在另一實(shí)施方式中，必需葉綠體基因是葉綠體功能、光合作用、碳固定、產(chǎn)生一種或多種烴或其組合所必需的那些。本文進(jìn)一步提供了修飾生物體的方法，其包括用包含足以進(jìn)行葉綠體功能的一個(gè)或多個(gè)多核苷酸的載體轉(zhuǎn)化生物體的步驟。在一些情況下，用于該方法的載體進(jìn)一步包括用于從所述生物體生產(chǎn)或分泌化合物的序列。在一些情況下，化合物是類異戊二烯。在其它情況下，載體包括所有必需葉綠體基因。在仍然其它情況下，必需葉綠體基因被重排或突變。用于一些實(shí)施方式的生物體在轉(zhuǎn)化前基本上不包含葉綠體基因組。本文所提供的又一方法是從生物體制備產(chǎn)物的方法，其包括用載體轉(zhuǎn)化所述生物體的步驟，所述載體包括至少20kb的基因組DNA和下列中一個(gè)或多個(gè)(i)所述生物體中非自然存在的基因；(ii)所述生物體中自然存在的基因中的缺失；(iii)所述生物體中自然存在的基因的重排；和(iv)所述生物體中自然存在的基因中的突變。在一些情況下，生物體是自然光合類生物體。在其他情況下，另外的基因編碼類異戊二烯途徑、MVA途徑或MEP途徑中的酶。在又一實(shí)施方式中，本公開(kāi)內(nèi)容提供轉(zhuǎn)化細(xì)胞或生物體的方法，其包括向所述細(xì)胞或生物體中插入葉綠體和包括所有必需葉綠體基因的載體。本公開(kāi)內(nèi)容還提供生產(chǎn)人工葉綠體基因組的方法，其包括下列步驟(a)提供包含一個(gè)或多個(gè)必需葉綠體基因的載體；(b)向所述載體添加DNA片段；(c)用步驟(b)所產(chǎn)生的載體轉(zhuǎn)化細(xì)胞或生物體；和(d)測(cè)定在所述添加的DNA片段存在下葉綠體功能是否存在。在一些情況下，所述添加的DNA片段包括對(duì)于類異戊二烯、MVA或MEP途徑中的酶的一個(gè)或多個(gè)編碼區(qū)域。本公開(kāi)內(nèi)容還提供穿梭載體，其包括葉綠體基因組。基因組可以被修飾。本文還提供了載體，其包括分離的功能葉綠體基因組。用在這樣的載體中的葉綠體基因組可以被修飾。本文還提供了生產(chǎn)人工葉綠體基因組的方法，其包括下列步驟(a)提供包括所有必需葉綠體基因的載體；和(b)去除、添加、突變或重排來(lái)自所述葉綠體基因組的DNA。該方法可進(jìn)一步包括下列步驟將編輯的基因組轉(zhuǎn)化入宿主生物體；和(d)在所述宿主生物體中測(cè)定葉綠體功能。在一些情況下，重復(fù)步驟(b)、(c)和(d)。在還有其它情況中，葉綠體基因組來(lái)自選自下列的生物體宏觀藻類、微觀藻類、小球藻、萊茵衣藻、杜氏鹽藻、四尾柵藻或雨生紅球藻。在一些情況下，宿主生物體選自宏觀藻類、微觀藻類、小球藻、萊茵衣藻、杜氏鹽藻、四尾柵藻或雨生紅球藻。對(duì)于一些實(shí)施方式，方法可進(jìn)一步包括從葉綠體基因組去除多余DNA的步驟。在其它實(shí)施方式中，載體包括所有或基本上所有的葉綠體基因組。用在本發(fā)明的葉綠體基因組可以克隆自光合生物體或者可以是合成的葉綠體基因組。在一些情況下，載體進(jìn)一步包括宿主生物體中非自然存在的基因，例如來(lái)自類異戊二烯途徑、MVA途徑或MEP途徑的基因。本文提供的又一方法是生產(chǎn)人工葉綠體基因組的方法，其包括下列步驟(a)提供包括全部葉綠體基因組的載體；(b)刪除所述全部葉綠體基因組的一部分；和(C)測(cè)定在沒(méi)有所述刪除的部分的情況下葉綠體功能是否存在。在本發(fā)明的另一方面，提供了包括分離的功能葉綠體基因組的組合物。在一些情況下，組合物包括對(duì)所述葉綠體基因組的修飾。本文還提供了離體載體，其包括核酸，所述核酸包括至少大約10%的葉綠體基因組以及所述載體中一個(gè)或多個(gè)核酸中的操作。在一些情況下，核酸克隆自非維管光合生物體，例如宏觀藻類、微觀藻類、小球藻、萊茵衣藻、杜氏鹽藻、四尾柵藻或雨生紅球藻。在一些情況下，核酸是合成的。本發(fā)明的載體可進(jìn)一步包括表達(dá)盒，并且表達(dá)盒可進(jìn)一步包括整合到靶DNA的區(qū)域。在一些情況下，靶DNA是細(xì)胞器DNA。用在本發(fā)明的載體可進(jìn)一步包括一種或多種選擇標(biāo)記，例如營(yíng)養(yǎng)缺陷型標(biāo)記、抗生素抗性標(biāo)記、葉綠體標(biāo)記或其組合。在一些實(shí)施方式中，在載體的一個(gè)或多個(gè)核酸中的操作可以是添加、缺失、突變或重排。載體的表達(dá)可導(dǎo)致產(chǎn)生宿主細(xì)胞非自然產(chǎn)生的產(chǎn)物和/或宿主細(xì)胞自然產(chǎn)生的產(chǎn)物的產(chǎn)量增加。本發(fā)明一些產(chǎn)物的實(shí)例包括萜、類萜、脂肪酸或生物質(zhì)降解酶。本文還提供了離體載體，其包括核酸，所述核酸包括至少大約20千對(duì)堿基的葉綠體基因組以及所述載體中一個(gè)或多個(gè)核酸中的操作。在一些情況下，核酸克隆自非維管光合生物體，例如宏觀藻類、微觀藻類、小球藻、萊茵衣藻、杜氏鹽藻、四尾柵藻或雨生紅球藻。在一些情況下，核酸是合成的。本發(fā)明的載體可進(jìn)一步包括表達(dá)盒，并且表達(dá)盒可進(jìn)一步包括整合到靶DNA的區(qū)域。在一些情況下，靶DNA是細(xì)胞器DNA。用在本發(fā)明的載體可進(jìn)一步包括一種或多種選擇標(biāo)記，例如營(yíng)養(yǎng)缺陷型標(biāo)記、抗生素抗性標(biāo)記、葉綠體標(biāo)記或其組合。在一些實(shí)施方式中，在載體的一個(gè)或多個(gè)核酸中的操作可以是添加、缺失、突變或重排。載體的表達(dá)可導(dǎo)致產(chǎn)生宿主細(xì)胞非自然產(chǎn)生的產(chǎn)物和/或宿主細(xì)胞自然產(chǎn)生的產(chǎn)物的產(chǎn)量增加。本發(fā)明一些產(chǎn)物的實(shí)例包括萜、類萜、脂肪酸或生物質(zhì)降解酶。本文還提供了產(chǎn)生包括重構(gòu)基因組的載體的方法，其包括將兩個(gè)或多個(gè)載體引入到宿主細(xì)胞，其中所述載體包括基因組的片段；將所述載體重組到包括至少大約90%基因組的單個(gè)載體，由此產(chǎn)生包括重構(gòu)基因組的載體。在一些情況下，宿主細(xì)胞是真核類宿主細(xì)胞，例如釀酒酵母。在一些情況下，基因組是細(xì)胞器基因組。細(xì)胞器可以是葉綠體，例如來(lái)自藻類的葉綠體，尤其微藻類如小球藻、萊茵衣藻、杜氏鹽藻、四尾柵藻或雨生紅球藻。在一些情況下，兩個(gè)或多個(gè)載體包括選擇標(biāo)記。在其它情況下，所述片段中至少一個(gè)是合成的。在還有其它情況中，包括修飾基因組的一部分的另外步驟可用在該方法中。這種修飾可包括添加、缺失、突變或重排。在其它實(shí)施方式中，修飾是外源核酸的添加，其導(dǎo)致萜、類萜、脂肪酸或生物質(zhì)降解酶的產(chǎn)生或產(chǎn)量增加。通過(guò)引用并入本說(shuō)明書中提到的所有出版物和專利申請(qǐng)?jiān)诖送ㄟ^(guò)引用并入至這樣相同的程度，如同各個(gè)出版物或?qū)＠暾?qǐng)都明確地且單獨(dú)地顯示通過(guò)引用并入。本發(fā)明的新穎特征明確地在所附權(quán)利要求中提出。通過(guò)參考闡明示例性實(shí)施方式的下列詳述和其附圖，將獲得對(duì)本發(fā)明特征和優(yōu)點(diǎn)的更好理解，在詳述中采用了本發(fā)明的原理，如下在圖中使用了下列縮寫HIS3酵母HIS3基因；TRPl酵母TRPl基因；URA3酵母URA3基因；ADE2酵母ADE2基因；LYS2酵母LYS2基因；TEL酵母端粒；CEN酵母著絲粒；ARS自主復(fù)制序列，酵母復(fù)制起點(diǎn)；5F0A5-氟乳清酸；Kan卡那霉素抗性基因；Pl質(zhì)粒rep=Pl質(zhì)粒復(fù)制子；pilyticrep:pl裂解復(fù)制子。圖1提供了本發(fā)明的雜合載體的一般描述。圖1A)載體示意圖。圖1B)生物體之間DNA穿梭。圖2是顯示雜合載體的構(gòu)建的示意圖。圖3是顯示葉綠體基因組DNA中整合位點(diǎn)的示意圖。圓中的數(shù)字表示修飾的靶位點(diǎn)。方框表示雜合填空載體所靶向的位點(diǎn)。圖4A、B和C是用于修飾和/或穩(wěn)定的選擇標(biāo)記的示意圖。圖5是將雜合載體引入葉綠體基因組DNA的示意圖。圖6是顯示藻類中雜合載體的整合(以及穩(wěn)定載體)的PCR數(shù)據(jù)。圖7顯示對(duì)捕獲的DNA的分析。圖7A)對(duì)包含葉綠體的分離載體用EcoRI進(jìn)行限制酶切消化(L，梯度；C，親本雜合載體；1，克隆1；和2，克隆2)。圖7B)對(duì)通過(guò)酵母?jìng)鞔目寺?的分離體群用EcoRI進(jìn)行限制酶切消化(L，梯度；C，；1，克隆1；和A-M，酵母分離體)。圖7C)克隆1和2的DNA分析，其用EcoRI進(jìn)行消化并且用來(lái)自萊茵衣藻的放射性HindIII消化的總DNA進(jìn)行探測(cè)。圖8A和B是顯示包含葉綠體基因組DNA的分離的離體載體結(jié)構(gòu)的示意圖。圖9顯示在各種選擇條件下親本和轉(zhuǎn)化藻類細(xì)胞的生長(zhǎng)。圖10是用于操作載體的限制性分析的示意圖。圖10A)載體結(jié)構(gòu)的示意圖。圖10B)通過(guò)用EcoRI限制性分析的修飾載體的分析。圖11顯示葉綠體基因組的修飾以產(chǎn)生生物質(zhì)降解酶。圖11A)分離的轉(zhuǎn)化體的PCR篩選。圖11B)來(lái)自分離的轉(zhuǎn)化體的內(nèi)切木聚糖酶活性。圖12顯示攜帶FPP合酶表達(dá)盒、經(jīng)修飾以產(chǎn)生類異戊二烯的分離轉(zhuǎn)化體的PCR篩選，其中FPP合酶表達(dá)盒靶向位點(diǎn)3(圖12A)或位點(diǎn)4(圖12B)。圖13是顯示利用酵母中的重組捕獲部分葉綠體基因組的示意圖。圖14是顯示利用酵母中的重組捕獲全部葉綠體基因組的示意圖。圖15是顯示利用酵母中的重組對(duì)全部葉綠體基因組進(jìn)行重新組裝的示意圖。具體實(shí)施例方式盡管本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式已經(jīng)在本文中顯示和描述，但是對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)顯而易見(jiàn)的是這樣的實(shí)施方式僅僅是通過(guò)實(shí)施例的方式提供。現(xiàn)在本領(lǐng)域技術(shù)人員在沒(méi)有脫離本發(fā)明的情況下將會(huì)想到許多變化、改變和取代。應(yīng)當(dāng)理解，本文所述的本發(fā)明實(shí)施方式的各種供選方案可用于實(shí)施本發(fā)明。這意味著，所附權(quán)利要求限定本發(fā)明的范圍并且這些權(quán)利要求和其等價(jià)物范圍內(nèi)的方法和結(jié)構(gòu)將被其包含。除非另外指明，本文所用的技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)具有本發(fā)明所述領(lǐng)域普通技術(shù)人員所通常理解的含義。本文參考了本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的各種材料和方法。闡明重組DNA技術(shù)的一般原理的標(biāo)準(zhǔn)參考文獻(xiàn)作品包括Sambrook等，“MolecularCloning=ALaboratoryManual“,第二版，ColdSpringHarborLaboratoryPress,Plainview,N.Y.,1989；Kaufmaneds.,"HandbookofMolecularandCellularMethodsinBiologyandMedicine",CRCPress,BocaRaton，1995；禾口McPherson，ed.,"DirectedMutagenesis:APracticalApproach"，IRLPress,Oxford,19910教導(dǎo)對(duì)本發(fā)明所選方面有用的酵母遺傳學(xué)的一般方法和原理的標(biāo)準(zhǔn)參考文獻(xiàn)包括Sherman等，‘‘LaboratoryCourseManualMethodsinyeastgenetics",ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,N.Y.,1986禾口Guthrie等，"GuidetoyeastgeneticsandMolecularBiology",Academic,NewYork,1991。技術(shù)人員所知的任何合適的材料和/或方法都可用于實(shí)施本發(fā)明。描述了實(shí)施本發(fā)明的材料和/或方法。除非另外指明，下列說(shuō)明書和實(shí)施例中所提及的材料、試劑等都可從商業(yè)來(lái)源得到。本發(fā)明教導(dǎo)了捕獲和修飾DNA大片段的方法并且描述了捕獲和修飾DNA大片段的工具。它尤其可用于修飾基因組DNA，其包括生物體或細(xì)胞器的全部基因組或其部分。還描述了本發(fā)明新的預(yù)期用途。本發(fā)明涉及大核酸的操作和遞送。本發(fā)明進(jìn)一步涉及重組克隆載體及使用其的系統(tǒng)和方法。用于遺傳改造基因組(如葉綠體基因組)的當(dāng)代方法是時(shí)間密集型的(>1月)并且同時(shí)僅允許有限數(shù)目的操作。如果期望對(duì)靶基因組多次修飾，步驟就必須進(jìn)行重復(fù)，進(jìn)一步增加產(chǎn)生期望菌株所需的時(shí)間。因?yàn)榇x工程和/或合成生物學(xué)需要對(duì)基因組多次修飾，所以這些方法并不適合于將修飾快速引入基因組。因此，允許在短時(shí)間中對(duì)葉綠體基因組多次修飾的新方法將能夠使代謝工程和/或合成生物學(xué)應(yīng)用于葉綠體基因組。本文的公開(kāi)內(nèi)容描述了這樣的技術(shù)。本發(fā)明提供一種從靶細(xì)胞和細(xì)胞器(如葉綠體)中捕獲、克隆和操作大核酸的通用重組方法。本發(fā)明的一方面提供重組克隆系統(tǒng)。更具體地，本發(fā)明提供載體，其在一些實(shí)施方式中依賴于同源重組技術(shù)以介導(dǎo)大核酸片段的分離和操作。本發(fā)明的另一方面提供利用這樣的重組克隆載體去克隆、操作和遞送大核酸到靶細(xì)胞和細(xì)胞器如葉綠體的方法。在一優(yōu)選的實(shí)施方式中，同源重組是在體外進(jìn)行的。在本發(fā)明特別優(yōu)選的實(shí)施方式中，同源重組是在體內(nèi)進(jìn)行的。在一更優(yōu)選的實(shí)施方式中，同源重組發(fā)生在藻類細(xì)胞中。在另一更優(yōu)選的實(shí)施方式中，同源重組發(fā)生在酵母細(xì)胞中。在一優(yōu)選的實(shí)施方式中，同源重組發(fā)生在釀酒酵母或粟酒酵母(Saccharomycespombe)。在酵母中，有效重組方法和許多選擇標(biāo)記的可用性的組合提供了靶DNA序列的快速且復(fù)雜的工程改造。一旦對(duì)包含葉綠體基因組DNA的離體載體進(jìn)行所有修飾，整個(gè)載體可在單個(gè)轉(zhuǎn)化步驟中引入到葉綠體中。因此，利用酵母技術(shù)將能夠使代謝工程和/或合成生物學(xué)應(yīng)用于葉綠體基因組。本發(fā)明的一方面提供分離載體，其包括酵母元件、細(xì)菌復(fù)制起點(diǎn)和至少20kb基因組DNA。在一些載體中，酵母元件是酵母著絲粒、酵母自主復(fù)制序列或其組合。DNA可來(lái)自非維管光合生物體，例如宏觀藻類、微觀藻類、小球藻、萊茵衣藻、杜氏鹽藻、四尾柵藻或雨生紅球藻。在一些實(shí)施方式中，基因組DNA被修飾，例如通過(guò)異源或同源多核苷酸的插入、一個(gè)或多個(gè)核酸堿基的缺失、一個(gè)或多個(gè)核酸堿基的突變、一個(gè)或多個(gè)多核苷酸的重排或其組合。在一些情況下，修飾是合成的。本發(fā)明的載體當(dāng)轉(zhuǎn)化到宿主細(xì)胞時(shí)可導(dǎo)致產(chǎn)生宿主細(xì)胞不自然產(chǎn)生的產(chǎn)物。這種產(chǎn)物的一些實(shí)例包括生物質(zhì)降解酶、脂肪酸、萜或類萜。在一些宿主細(xì)胞中，載體的表達(dá)導(dǎo)致由所述宿主細(xì)胞自然生產(chǎn)的產(chǎn)物的產(chǎn)量增加，例如生物質(zhì)降解酶、萜或類萜。本發(fā)明的載體可進(jìn)一步包括一種或多種選擇標(biāo)記，例如酵母標(biāo)記、酵母抗生素抗性標(biāo)記、酵母營(yíng)養(yǎng)缺陷型標(biāo)記、細(xì)菌標(biāo)記、細(xì)菌抗生素抗性標(biāo)記、細(xì)菌營(yíng)養(yǎng)缺陷型標(biāo)記、藻類標(biāo)記、藻類抗生素抗性標(biāo)記、藻類營(yíng)養(yǎng)缺陷型標(biāo)記或其組合。本發(fā)明的載體還可包含葉綠體基因組DNA，其包括1)1-200個(gè)基因；2)全部必需的葉綠體基因；和/或3)30-400kb。本文還描述了宿主細(xì)胞，其包括本文所述的載體。示例性的宿主細(xì)胞可以是自然地非光合或光合型宿主細(xì)胞，并且包括例如釀酒酵母、大腸桿菌、宏觀藻類、微觀藻類、小球藻、萊茵衣藻、杜氏鹽藻、四尾柵藻或雨生紅球藻。在本發(fā)明的另一方面，提供了產(chǎn)生載體的方法，其中所述方法涉及將靶向DNA插入載體中——其中所述載體包括酵母著絲粒、酵母自主復(fù)制序列和細(xì)菌復(fù)制起點(diǎn)；用所述載體轉(zhuǎn)化生物體和捕獲一部分葉綠體基因組；由此產(chǎn)生具有一部分葉綠體基因組的載體。在一些情況下，靶向DNA是葉綠體基因組DNA。該方法可被用于捕獲一部分基因組，其長(zhǎng)度為10-400kb。在一些情況下，捕獲步驟通過(guò)重組發(fā)生。葉綠體基因組的捕獲部分可與載體共同轉(zhuǎn)化到生物體中，因此重組步驟可發(fā)生在體內(nèi)。用于實(shí)施本文所公開(kāi)的方法的生物體可以是真核類或光合類生物體。在一些情況下，生物體是非維管光合生物體，例如宏觀藻類、微觀藻類、小球藻、萊茵衣藻、杜氏鹽藻、四尾柵藻或雨生紅球藻。用于實(shí)施本文所公開(kāi)的方法的生物體可以是非光合類生物體，例如酵母。在一些情況下，非光合生物體可包含外源葉綠體DNA。在一些實(shí)施方式中，采用修飾一部分葉綠體基因組的其它步驟。修飾可通過(guò)同源重組實(shí)現(xiàn)。這樣的重組可發(fā)生在生物體中，例如真核生物和/或光合生物。在一些情況下，生物體是非維管光合生物體，例如宏觀藻類、微觀藻類、小球藻、萊茵衣藻、杜氏鹽藻、四尾柵藻或雨生紅球藻。在一些情況下，生物體可以是非光合類生物體，例如酵母。在具有修飾步驟的實(shí)施方式中，該步驟可包括多核苷酸的添加、一個(gè)或多個(gè)核酸堿基的缺失、一個(gè)或多個(gè)核酸堿基的突變、多核苷酸的重排或其組合。本文還公開(kāi)分離的載體，其包括必需葉綠體基因、選擇標(biāo)記和在所述載體的一個(gè)或多個(gè)核酸中的操作。在一些情況下，必需葉綠體基因克隆自非維管光合生物體，如宏觀藻類、微觀藻類、小球藻、萊茵衣藻、杜氏鹽藻、四尾柵藻或雨生紅球藻。用于本文所述載體中的必需葉綠體基因可以是合成的。本文所述載體可進(jìn)一步包括表達(dá)盒，其可進(jìn)一步包括整合到靶DNA的區(qū)域，例如細(xì)胞器DNA。本文所述載體還可包含一個(gè)或多個(gè)選擇標(biāo)記，例如營(yíng)養(yǎng)缺陷型標(biāo)記、抗生素抗性標(biāo)記、葉綠體標(biāo)記或其組合。在一些情況下，必需葉綠體基因是葉綠體功能、光合作用、碳固定、一種或多種烴的產(chǎn)生或其組合所必需的那些。必需葉綠體基因可包括高達(dá)200個(gè)基因和/或由高達(dá)400kb組成。在本文所述的一些載體中，一個(gè)或多個(gè)核酸中的操作是添加、缺失、突變或重排。在一些情況下，宿主細(xì)胞中載體的表達(dá)產(chǎn)生所述宿主細(xì)胞不自然產(chǎn)生的產(chǎn)物。在一些情況下，本發(fā)明載體的表達(dá)導(dǎo)致由所述宿主細(xì)胞自然產(chǎn)生的產(chǎn)物的產(chǎn)量增加。這樣產(chǎn)物的實(shí)例是生物質(zhì)降解酶、脂肪酸、萜或類萜。如本文所述，本發(fā)明的一方面是分離的葉綠體，其包括本發(fā)明的載體。在另一方面，提供了宿主細(xì)胞，其包括本發(fā)明的載體。用在本發(fā)明中的宿主細(xì)胞可以是自然非光合類或自然光合類宿主細(xì)胞。用于本發(fā)明的生物體的實(shí)例包括釀酒酵母、大腸桿菌、宏觀藻類、微觀藻類、小球藻、萊茵衣藻、杜氏鹽藻、四尾柵藻或雨生紅球藻。14在本發(fā)明的另一方面，提供了轉(zhuǎn)化細(xì)胞或生物體的方法，其中所述方法包括將一載體插入到所述細(xì)胞或生物體，所述載體包括所有必需葉綠體基因和任選地在所述細(xì)胞或生物體中非自然存在的一個(gè)或多個(gè)基因。在一些實(shí)施方式中，所述方法進(jìn)一步包括消除所述細(xì)胞或生物體中基本所有的葉綠體基因組的步驟。用于該方法的細(xì)胞或生物體可以是光合類、非光合類和/或真核類細(xì)胞或生物體。用于該方法的細(xì)胞或生物體可以是非維管類細(xì)胞或生物體。在一些情況下，用于該方法的載體還可包括表達(dá)盒，并且表達(dá)盒可以能整合到非核DNA。在一種實(shí)施方式中，在所述細(xì)胞或生物體中非自然存在的一個(gè)或多個(gè)基因是類異戊二烯途徑、MVA途徑或MEP途徑中的基因。在另一實(shí)施方式中，必需葉綠體基因是葉綠體功能、光合作用、碳固定、產(chǎn)生一種或多種烴或其組合所必需的那些。本文進(jìn)一步提供了修飾生物體的方法，其包括用包括足以進(jìn)行葉綠體功能的一個(gè)或多個(gè)多核苷酸的載體轉(zhuǎn)化生物體的步驟。在一些情況下，用于該方法的載體進(jìn)一步包括用于從所述生物體生產(chǎn)或分泌化合物的序列。在一些情況下，化合物是類異戊二烯。在其它情況下，載體包括所有必需葉綠體基因。在還有其它情況下，必需葉綠體基因被重排或突變。用于某些實(shí)施方式的生物體在轉(zhuǎn)化前基本上不包含葉綠體基因組。本文所提供的又一方法是從生物體制備產(chǎn)物的方法，其包括用載體轉(zhuǎn)化所述生物體的步驟，所述載體包括至少20kb的基因組DNA和下列中一個(gè)或多個(gè)(i)所述生物體中非自然存在的基因；(ii)所述生物體中自然存在的基因中的缺失；(iii)所述生物體中自然存在的基因的重排；和(iv)所述生物體中自然存在的基因中的突變。在一些情況下，生物體是自然光合類生物體。在一些情況下，另外的基因編碼類異戊二烯途徑、MVA途徑或MEP途徑中的酶。在還有又一實(shí)施方式中，本公開(kāi)內(nèi)容提供轉(zhuǎn)化細(xì)胞或生物體的方法，其包括向所述細(xì)胞或生物體中插入葉綠體和包括所有必需葉綠體基因的載體。本公開(kāi)內(nèi)容還提供生產(chǎn)人工葉綠體基因組的方法，其包括下列步驟(a)提供包含一個(gè)或多個(gè)必需葉綠體基因的載體；(b)向所述載體添加DNA片段；(c)用步驟(b)所產(chǎn)生的載體轉(zhuǎn)化細(xì)胞或生物體；和(d)測(cè)定在所述添加的DNA片段存在下葉綠體功能是否存在。在一些情況下，所述添加的DNA片段包括對(duì)于類異戊二烯、MVA或MEP途徑中的酶的一個(gè)或多個(gè)編碼區(qū)域。本公開(kāi)內(nèi)容還提供穿梭載體，其包括葉綠體基因組。基因組可以被修飾。本文還提供了載體，其包括分離的功能葉綠體基因組。用在這樣的載體中的葉綠體基因組可以被修飾。本文還提供了生產(chǎn)人工葉綠體基因組的方法，其包括下列步驟(a)提供包括所有必需葉綠體基因的載體；和(b)去除、添加、突變或重排來(lái)自所述葉綠體基因組的DNA。該方法可進(jìn)一步包括下列步驟將編輯的基因組轉(zhuǎn)化到宿主生物體；和(d)在所述宿主生物體中測(cè)定葉綠體功能。在一些情況下，重復(fù)步驟(b)、(c)和(d)。在還有其它情況中，葉綠體基因組來(lái)自選自下列的生物體宏觀藻類、微觀藻類、小球藻、萊茵衣藻、杜氏鹽藻、四尾柵藻或雨生紅球藻。在一些情況下，宿主生物體選自宏觀藻類、微觀藻類、小球藻、萊茵衣藻、杜氏鹽藻、四尾柵藻或雨生紅球藻。對(duì)于一些實(shí)施方式，該方法可進(jìn)一步包括從葉綠體基因組去除多余DNA的步驟。在其它實(shí)施方式中，載體包括所有或基本上所有的葉綠體基因組。用在本發(fā)明的葉綠體基因組可以克隆自光合生物體或者可以是合成的葉綠體基因組。在一些情況下，載體進(jìn)一步包括宿主生物體中非自然存在的基因，例如來(lái)自類異戊二烯途徑、MVA途徑或MEP途徑的基因。本文提供的又一方法是生產(chǎn)人工葉綠體基因組的方法，其包括下列步驟(a)提供包括全部葉綠體基因組的載體；(b)刪除所述全部葉綠體基因組的一部分；和(C)測(cè)定在沒(méi)有所述刪除的部分的情況下葉綠體功能是否存在。在本發(fā)明的另一方面，提供了包括分離的功能葉綠體基因組的組合物。在一些情況下，組合物包括對(duì)所述葉綠體基因組的修飾。本文還提供了離體載體，其包括核酸，所述核酸包括至少大約10%的葉綠體基因組以及所述載體中一個(gè)或多個(gè)核酸中的操作。在一些情況下，核酸克隆自非維管光合生物體，例如宏觀藻類、微觀藻類、小球藻、萊茵衣藻、杜氏鹽藻、四尾柵藻或雨生紅球藻。在一些情況下，核酸是合成的。本發(fā)明的載體可進(jìn)一步包括表達(dá)盒，并且表達(dá)盒可進(jìn)一步包括整合到靶DNA的區(qū)域。在一些情況下，靶DNA是細(xì)胞器DNA。用在本發(fā)明的載體可進(jìn)一步包括一種或多種選擇標(biāo)記，例如營(yíng)養(yǎng)缺陷型標(biāo)記、抗生素抗性標(biāo)記、葉綠體標(biāo)記或其組合。在一些實(shí)施方式中，載體中一個(gè)或多個(gè)核酸的操作可以是添加、缺失、突變或重排。載體的表達(dá)可導(dǎo)致產(chǎn)生宿主細(xì)胞非自然產(chǎn)生的產(chǎn)物和/或宿主細(xì)胞自然產(chǎn)生的產(chǎn)物的產(chǎn)量增加。本發(fā)明一些產(chǎn)物的實(shí)例包括萜、類萜、脂肪酸或生物質(zhì)降解酶。本文還提供了體外載體，其包括核酸，所述核酸包括至少大約20千對(duì)堿基的葉綠體基因組以及所述載體中一個(gè)或多個(gè)核酸中的操作。在一些情況下，核酸克隆自非維管光合生物體，例如宏觀藻類、微觀藻類、小球藻、萊茵衣藻、杜氏鹽藻、四尾柵藻或雨生紅球藻。在一些情況下，核酸是合成的。本發(fā)明的載體可進(jìn)一步包括表達(dá)盒，并且表達(dá)盒可進(jìn)一步包括整合到靶DNA的區(qū)域。在一些情況下，靶DNA是細(xì)胞器DNA。用在本發(fā)明的載體可進(jìn)一步包括一種或多種選擇標(biāo)記，例如營(yíng)養(yǎng)缺陷型標(biāo)記、抗生素抗性標(biāo)記、葉綠體標(biāo)記或其組合。在一些實(shí)施方式中，載體中一個(gè)或多個(gè)核酸的操作可以是添加、缺失、突變或重排。載體的表達(dá)可導(dǎo)致產(chǎn)生宿主細(xì)胞非自然產(chǎn)生的產(chǎn)物和/或宿主細(xì)胞自然產(chǎn)生的產(chǎn)物的產(chǎn)量增加。本發(fā)明一些產(chǎn)物的實(shí)例包括萜、類萜、脂肪酸或生物質(zhì)降解酶。本文還提供了產(chǎn)生包括重構(gòu)基因組的載體的方法，其包括將兩個(gè)或多個(gè)載體引入到宿主細(xì)胞，其中所述載體包括基因組的片段；將所述載體重組到包括至少大約90%基因組的單個(gè)載體中；由此產(chǎn)生包括重構(gòu)基因組的載體。在一些情況下，宿主細(xì)胞是真核類宿主細(xì)胞，例如釀酒酵母。在其他情況下，基因組是細(xì)胞器基因組。細(xì)胞器可以是葉綠體，例如來(lái)自藻類的葉綠體，尤其微藻類如小球藻、萊茵衣藻、杜氏鹽藻、四尾柵藻或雨生紅球藻。在一些情況下，所述兩個(gè)或多個(gè)載體包括選擇標(biāo)記。在其他情況下，所述片段中至少一個(gè)是合成的。在還有其它情況中，包括修飾基因組的一部分的另外步驟可用在該方法中。這種修飾可包括添加、缺失、突變或重排。在其它實(shí)施方式中，修飾是外源核酸的添加，其導(dǎo)致萜、類萜、脂肪酸或生物質(zhì)降解酶的產(chǎn)生或產(chǎn)量增加。大DNA克隆和含量本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是它提供了克隆、操作和遞送包含葉綠體基因組DNA的載體，所述葉綠體基因組DNA由至多所有葉綠體基因(或序列)組成。載體中包含的葉綠體基因組DNA可以通過(guò)雜合克隆載體與一個(gè)鄰接的DNA片段的重組或者通過(guò)兩個(gè)或多個(gè)鄰接的DNA片段的重組而獲得。本發(fā)明的方法和組合物可包括捕獲和/或修飾的DNA大片段，其可包括來(lái)自細(xì)胞器的DNA，如線粒體DNA或質(zhì)體DNA(如葉綠體DNA)。捕獲和/或修飾的DNA大片段還可包括細(xì)胞器的基因組的全部，如葉綠體基因組。在其它實(shí)施方式中，捕獲和/或修飾的DNA大片段包括一部分的葉綠體基因組。葉綠體基因組可源自任何維管或非維管植物，其包括藻類、苔蘚類植物(如苔蘚、蕨類植物)、裸子植物(如針葉樹(shù))和被子植物(如開(kāi)花植物-樹(shù)、草、草本、灌木)。葉綠體基因組或其必需部分可包括合成的DNA、重排的DNA、缺失、添加和/或突變。葉綠體基因組或其必需部分可包括一個(gè)或多個(gè)缺失、添加、突變和/或重排。缺失、添加、突變和/或重排可在生物體中自然發(fā)現(xiàn)，例如自然發(fā)生的突變，或者不能在自然中天然發(fā)現(xiàn)。許多生物體的葉綠體或質(zhì)體基因組是可普遍得到的，例如在NCBI細(xì)胞器基因ΠW^^^MWNJathttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/static/euk_o.html得到。本文所述的靶DNA序列與對(duì)照序列(自然發(fā)生的序列)相比可包括至少1個(gè)、2個(gè)、3個(gè)、4個(gè)或5個(gè)缺失、添加、突變和/或重排。在一些實(shí)施方式中，突變可以是功能性的或非功能性的。例如，功能性突變與沒(méi)有該突變的對(duì)照細(xì)胞相比當(dāng)其存在于宿主細(xì)胞中時(shí)可對(duì)細(xì)胞功能產(chǎn)生影響。非功能性突變?cè)诠δ苌峡赡苁浅聊模?，與具有該突變的細(xì)胞相比，沒(méi)有該突變的宿主細(xì)胞在表型上沒(méi)有可辨別的區(qū)別。捕獲和/或修飾的DNA大片段(如靶DNA)可包括最小的或最小化的葉綠體基因組(如對(duì)于葉綠體功能來(lái)說(shuō)所必需的最小數(shù)目的基因和/或DNA片段)。捕獲和/或修飾的DNA可包括必需葉綠體基因，它可包括一部分或全部或基本上全部的必需葉綠體基因。必需基因可以是一種或多種代謝過(guò)程或生物化學(xué)途徑所必需的基因。必需基因可以是葉綠體功能如光合作用、碳固定或烴生產(chǎn)所必需的基因。必需基因還可以是基因表達(dá)如轉(zhuǎn)錄、翻譯或影響基因表達(dá)的其它過(guò)程所必需的基因。必需基因可包括突變或重排。必需基因還可包括執(zhí)行一功能的最小功能基因組。例如，特定功能(如光合作用)可由一組基因或基因產(chǎn)品無(wú)效率地執(zhí)行，然而該組仍將包括必需基因，因?yàn)樵摴δ苋员粓?zhí)行。修飾的DNA可包括至少5、10、15、20、25、30、40或50個(gè)必需基因。在一些實(shí)施方式中，DNA可包括長(zhǎng)度達(dá)150kb的必需葉綠體基因組序列。DNA可包括必需葉綠體基因以及非必需葉綠體基因序列。DNA可以是單鏈的或雙鏈的，線形的或環(huán)形的，松弛的或超螺旋的。DNA還可以是表達(dá)盒的形式。例如，表達(dá)盒可包括將在宿主細(xì)胞中表達(dá)的必需基因。表達(dá)盒可包括一個(gè)或多個(gè)必需基因以及促進(jìn)必需基因表達(dá)的DNA序列。表達(dá)盒還可包括整合到宿主靶DNA中的區(qū)域。表達(dá)盒還可包括一個(gè)或多個(gè)必需基因以及包括該表達(dá)盒的宿主細(xì)胞中非自然發(fā)生的一個(gè)或多個(gè)基因。本領(lǐng)域技術(shù)人員將容易確定表達(dá)盒前述各個(gè)方面的各種組I=Iο在其他情況下，捕獲和/或修飾的DNA片段可包括質(zhì)體或細(xì)胞器的整個(gè)基因組。例如，質(zhì)體基因組的大約10%,11%>12%,13%,14%,15%,16%,17%,18%,19%,20%,30%,31%,32%,33%,34%,35%,36%,37%,38%,39%,40%,41%,42%,43%,44%,45%,46%,47%,48%,49%,50%,51%,52%,53%,54%,55%,56%,57%,58%,59%,60%,61%,62%,63%,64%,65%,66%,67%,68%,69%,70%,71%,72%,73%,74%,75%,76%,77%,78%,79%,80%,81%,82%,83%,84%,85%,86%,87%,88%,89%,90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多。在一種實(shí)施方式中，捕獲和/或修飾的DNA大片段可包括質(zhì)體或細(xì)胞的整個(gè)基因組的10-100%、20-100%、30-100%,40-100%,50-100%,60-100%,70-100%,80-100%^；90-100%在還有其它情況下，捕獲和/或修飾的DNA大片段可包括大約10kb、llkb、12kb、13kb、14kb、15kb、16kb、17kb、18kb、19kb、20kb、21kb、22kb、23kb、24kb、25kb、26kb、27kb、28kb、29kb、30kb、3Ikb、32kb、33kb、34kb、35kb、36kb、37kb、38kb、39kb、40kb、4Ikb、42kb、43kb、44kb、45kb、46kb、47kb、48kb、49kb、50kb、5Ikb、52kb、53kb、54kb、55kb、56kb、57kb、58kb、59kb、60kb、6Ikb、62kb、63kb、64kb、65kb、66kb、67kb、68kb、69kb、70kb、7Ikb、72kb、73kb、74kb、75kb、76kb、77kb、78kb、79kb、80kb、81kb、82kb、83kb、84kb、85kb、86kb、87kb、88kb、89kb、90kb、91kb、92kb、93kb、94kb、95kb、96kb、97kb、98kb、99kb、100kb、101kb、102kb、103kb、104kb、105kb、106kb、107kb、108kb、109kb、110kb、lllkb、112kb、113kb、114kb、115kb、116kb、117kb、118kb、119kb、120kb、121kb，122kb、123kb、124kb、125kb、126kb、127kb、128kb、129kb、130kb、131kb、132kb、133kb、134kb、135kb、136kb、137kb、138kb、139kb、140kb、141kb、142kb、143kb、144kb、145kb、146kb、147kb、148kb、149kb、150kb、151kb、152kb、153kb、154kb、155kb、156kb、157kb、158kb、159kb、160kb、161kb、162kb、163kb、164kb、165kb、166kb、167kb、168kb、169kb、170kb、171kb、172kb、173kb、174kb、175kb、176kb、177kb、178kb、179kb、180kb、181kb、182kb、183kb、184kb、185kb、186kb、187kb、188kb、189kb、190kb、191kb、192kb、193kb、194kb、195kb、196kb、197kb、198kb、199kb、200kb、201kb、202kb、203kb、204kb、205kb、206kb、207kb、208kb、209kb、210kb、211kb、212kb、213kb、214kb、215kb、216kb、217kb、218kb、219kb、220kb、221kb、222kb、223kb、224kb、225kb、226kb、227kb、228kb、229kb、230kb、231kb、232kb、233kb、234kb、235kb、236kb、237kb、238kb、239kb、240kb、241kb、242kb、243kb、244kb、245kb、246kb、247kb、248kb、249kb、50kb、51kb、252kb、253kb、254kb、255kb、256kb、257kb、258kb、259kb、260kb、261kb、262kb、263kb、264kb、265kb、266kb、267kb、268kb、269kb、270kb、271kb、272kb、273kb、274kb、275kb、276kb、277kb、278kb、279kb、280kb、281kb、282kb、283kb、284kb、285kb、286kb、287kb、288kb、289kb、290kb、291kb、292kb、293kb、294kb、295kb、296kb、297kb、298kb、299kb、300kb、301kb、302kb、303kb、304kb、305kb、306kb、307kb、308kb、309kb、310kb、311kb、312kb、313kb、314kb、315kb、316kb、317kb、318kb、319kb、320kb、321kb、322kb、323kb、324kb、325kb、326kb、327kb、328kb、329kb、330kb、331kb、332kb、333kb、334kb、335kb、336kb、337kb、338kb、339kb、340kb、341kb、342kb、343kb、344kb、345kb、346kb、347kb、348kb、!M9kb、350kb、351kb、352kb、353kb、354kb、355kb、356kb、357kb、358kb、359kb、360kb、361kb、362kb、363kb、364kb、365kb、366kb、367kb、368kb、369kb、370kb、371kb、372kb、373kb、374kb、375kb、376kb、377kb、378kb、379kb、380kb、381kb、382kb、383kb、384kb、385kb、386kb、387kb、388kb、389kb、390kb、391kb、392kb、393kb、394kb、395kb、396kb、397kb、398kb、399kb、400kb或更大的基因組(如，細(xì)胞核或細(xì)胞器)DNA。在一些實(shí)施方式，捕獲和/或修飾的DNA大片段可包括大約10-400kb、50-350kb、100-300kb、100-200kb、200"300kb、150-200kb、200-250kb的基因組DNA。在還有其它情況下，捕獲和/或修飾的DNA大片段可包括大約15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121，122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182，183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、50、51、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300或更大的開(kāi)放閱讀框、部分開(kāi)放閱讀框、假基因和/或重復(fù)序列。本發(fā)明還提供載體，其包括可表達(dá)盒(cassette-able)的葉綠體基因組或其部分(如包括葉綠體基因組或其功能部分的可去除DNA片段)。本發(fā)明的載體可包括功能葉綠體單元(如代謝過(guò)程、光合作用、基因表達(dá)、光合系統(tǒng)I、光合系統(tǒng)II所必需的單元)。本發(fā)明的載體可包括可移植的葉綠體基因組或其部分。此外，本發(fā)明的載體可包括可轉(zhuǎn)移的葉綠體基因組或其部分。在其它實(shí)施方式中，載體包括1)一個(gè)或多個(gè)修飾DNA的大片段；2)進(jìn)行光合作用所必須的所有基因；3)葉綠體生存和/或功能所必需的所有基因；4)必需葉綠體基因；和/或5)足以執(zhí)行一個(gè)或多個(gè)葉綠體功能如光合作用的自然發(fā)生或修飾的葉綠體基因。載體可包括一部分、基本上所有的或所有的必需葉綠體基因。載體可包括至少5、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100或更多的必需基因。載體可包括長(zhǎng)度10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250kb或更長(zhǎng)的葉綠體DNA。載體可包括必需葉綠體基因以及非必需葉綠體基因序列。載體可包括一個(gè)或多個(gè)或所有的必需葉綠體基因和/或一個(gè)或多個(gè)在包括載體的宿主細(xì)胞中非自然存在的基因。在一些實(shí)施方式中，載體可包括葉綠體基因以及葉綠體中非自然存在的基因。載體可包括一個(gè)或多個(gè)必需葉綠體基因和/或一個(gè)或多個(gè)涉及葉綠體功能、光合作用、碳固定或烴生產(chǎn)的DNA序列或基因。例如，載體可包括光合作用所必需的序列以及涉及類異戊二烯產(chǎn)生、MVA和/或MEP途徑的序列，如編碼萜烯合酶的DNA序列或產(chǎn)生烴如萜烯或類異戊二烯的其它多肽。本發(fā)明進(jìn)一步提供向細(xì)胞或顆粒諸如，例如酵母或細(xì)菌克隆、操作和傳遞大的靶核酸的方法。該方法的某些實(shí)施方式利用了雜合酵母-細(xì)菌克隆系統(tǒng)(參見(jiàn)，例如美國(guó)專利號(hào)5，866，404和7，083，971以及Hokanson等，(2003)HumanGeneTher.14:329_339)。本文的載體(如克隆系統(tǒng))由穿梭載體組成，所述穿梭載體包含酵母和細(xì)菌中用于起功能和復(fù)制的元件，其允許它在任一生物體中穩(wěn)定地起發(fā)揮功能和復(fù)制。這種功能性和可復(fù)制元件的組合物產(chǎn)生雜合系統(tǒng)，其享有遺傳學(xué)工程系統(tǒng)的益處。酵母的遺傳學(xué)(如釀酒酵母)是熟知的并且對(duì)于酵母中的遺傳工程存在一種強(qiáng)大的分子生物學(xué)工具。在另一方面，本發(fā)明通過(guò)在兩臂和靶核酸之間的同源重組產(chǎn)生空位填補(bǔ)載體。在又一實(shí)施方式中，至少一個(gè)臂包括復(fù)制起點(diǎn)。在本發(fā)明的另一實(shí)施方式中，各個(gè)臂進(jìn)一步包括稀少的限制酶識(shí)別位點(diǎn)。同源重組可以在體外或體內(nèi)如在真菌細(xì)胞(如釀酒酵母、粟酒裂殖酵母(Sz.pombe)或玉蜀黍黑粉菌(U.maydis))中進(jìn)行。本發(fā)明還提供真核宿主細(xì)胞，其包埋根據(jù)本發(fā)明的重組克隆系統(tǒng)或載體，例如在真菌細(xì)胞(如釀酒酵母、粟酒裂殖酵母或玉蜀黍黑粉菌)中?？瘴惶钛a(bǔ)線形載體可在體外(如利用T4連接酶)或體內(nèi)如在細(xì)菌中被轉(zhuǎn)化成環(huán)狀載體。目標(biāo)環(huán)狀載體可以被擴(kuò)增、純化、切割并且被用于回收足量的DNA以直接引入到細(xì)胞或合適的傳遞系統(tǒng)以隨后傳遞到靶細(xì)胞。該方法給克隆和修飾任何大細(xì)菌或非細(xì)菌基因組提供巨大的通用性，并且容易促進(jìn)其作為重組載體的應(yīng)用。空位填補(bǔ)載體向細(xì)胞中的直接傳遞可通過(guò)本領(lǐng)域熟知的方法進(jìn)行，諸如，例如磷酸鈣轉(zhuǎn)化方法或電穿孔(參見(jiàn)Sambrook等，同上)。因此，本發(fā)明提供產(chǎn)生重組傳遞單元的方法，其包括下列步驟(a)產(chǎn)生包含靶序列的空位填補(bǔ)載體；(b)任選地使本發(fā)明的空位填補(bǔ)載體片段成環(huán)狀；(C)使所述載體繁殖；和(d)在傳遞單元中引入空位填補(bǔ)載體。細(xì)菌系統(tǒng)被用于擴(kuò)增和提純DNA，以及對(duì)遺傳修飾和其對(duì)途徑的影響進(jìn)行功能測(cè)試。本發(fā)明的一種實(shí)施方式將提供有助于任何大基因組的克隆和修飾并且容易促進(jìn)途徑的克隆和引入的克隆系統(tǒng)。在具備傳遞全部途徑的能力下，本發(fā)明的某些實(shí)施方式允許解決問(wèn)題的系統(tǒng)生物學(xué)方法。一般地，靶DNA(如基因組DNA)可通過(guò)在載體中產(chǎn)生允許同源重組的位點(diǎn)而捕獲。例如，這樣的位點(diǎn)可通過(guò)但不限于缺口修復(fù)克隆產(chǎn)生，其中缺口是通常在轉(zhuǎn)化到酵母之前通過(guò)限制酶消化在載體中產(chǎn)生的。當(dāng)靶DNA與載體混合時(shí)，靶DNA被重組到載體中。這個(gè)操作被稱為“空位填補(bǔ)(gapfilling)”。該重組可發(fā)生在細(xì)菌、酵母、原宿主生物體、另一生物體或體外。在一些實(shí)施方式中，由于高速度的同源重組，重組在酵母中進(jìn)行。一旦捕獲，靶DNA可以以包括添加、變更或去除DNA序列在內(nèi)的許多方式進(jìn)行修飾。在一些實(shí)施方式中，靶DNA是基因組DNA。在其它實(shí)施方式中，靶DNA是細(xì)胞器(如線粒體或葉綠體)DNA。在一些實(shí)施方式中，靶DNA通過(guò)添加、變更或去除基因、編碼序列、部分編碼序列、調(diào)節(jié)元件、陽(yáng)性和/或陰性選擇標(biāo)記、重組位點(diǎn)、限制位點(diǎn)、和/或密碼子偏好位點(diǎn)。例如，靶DNA序列可以是對(duì)于被轉(zhuǎn)化生物體中表達(dá)來(lái)說(shuō)偏好的密碼子。技術(shù)人員熟知由特定宿主細(xì)胞對(duì)指定給定氨基酸的核苷酸密碼子的使用展示的“密碼子偏好”。不受理論束縛，通過(guò)使用宿主細(xì)胞的優(yōu)選密碼子，翻譯速度可更大。因此，當(dāng)合成用于在宿主細(xì)胞中改進(jìn)表達(dá)的基因時(shí)，可以期望設(shè)計(jì)這樣的基因，以致于其密碼子使用頻率接近宿主細(xì)胞的優(yōu)選密碼子使用頻率。本發(fā)明的密碼子可以富含A/T，例如，在密碼子的第三核苷酸位置富含A/T。一般地，富含A/T的密碼子偏好被用于藻類。在一些實(shí)施方式中，密碼子的第三核苷酸位置的至少50%是A或T。在其它實(shí)施方式中，密碼子的第三核苷酸位置的至少60%、70%、80%、90%或99%是A或T。(還可參見(jiàn)美國(guó)公布號(hào)2004/0014174)。這樣的操作在本領(lǐng)域中是熟知的并且可以以眾多方式進(jìn)行。在一些實(shí)施方式中，修飾可利用克隆序列進(jìn)行。在其它實(shí)施方式中，修飾可利用合成DNA進(jìn)行。遺傳操作包括克隆靶DNA(如染色體、基因組)的大片段和/或基于基因之間的功能關(guān)系如代謝途徑或操縱子分開(kāi)和重新組織靶DNA。遺傳操作還包括引入和去除代謝途徑、將DNA重組為功能單元(如代謝途徑、合成操縱子)、和/或測(cè)定DNA大片段中的不穩(wěn)定位點(diǎn)(如天然或非天然宿主傾向于刪除或重組DNA的序列的位點(diǎn))。20靶DNA可以是來(lái)自原核生物的DNA。靶DNA可以是來(lái)自真核生物的基因組DNA、線粒體DNA或葉綠體DNA。其基因組和/或細(xì)胞器DNA可作為靶DNA的這樣的生物體的實(shí)例包括但不限于運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單孢菌(Z.mobilis)、藻類(如宏觀藻類或微觀藻類，如萊茵衣藻(Chlamydomonasreinhardtii))、紅藻門類、綠藻門類(chlorophyte)、不等鞭毛門類(heterokontophyte)、黃綠藻門類(tribophyte)、單鞭毛門類(glaucophyte)、絲足蟲(chóng)門類(chlorarachniophyte)、裸藻類(euglenoid)、隱藻類(haptophyte)、囊泡藻類(cryptomonad)、溝鞭藻類(dinoflagellum)或浮游植物。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到，這些生物體僅僅作為實(shí)例列出，并且本文公開(kāi)的方法可適用于來(lái)自任何生物體的大DNA，包括細(xì)菌、植物、真菌、原生生物和動(dòng)物。本發(fā)明的遺傳操作可包括通過(guò)去除或插入序列來(lái)穩(wěn)定DNA的大片段，所述序列促使轉(zhuǎn)化的細(xì)胞保持DNA的某些序列并且在其后代中穩(wěn)定地保持該序列。遺傳操作還可包括改變靶DNA、載體DNA和/或合成DNA的密碼子以反映宿主生物體的任何密碼子偏好。另外，本發(fā)明的遺傳操作可包括測(cè)定生物體能夠生存所必需的最小基因組。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明的遺傳操作可包括要產(chǎn)生和維持某一代謝途徑所必需的最小基因組。本發(fā)明的遺傳操作可包括測(cè)定基因組內(nèi)以及兩個(gè)基因組之間的多余基因(如細(xì)胞核和葉綠體基因組之間的冗余)。另外，本發(fā)明的遺傳操作可包括測(cè)定可被人工合成的DNA功能序列(如某一代謝途徑中的基因、功能基因組的基因)。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明的遺傳操作包括產(chǎn)生包裝到表達(dá)盒中的DNA和基因組(如載體內(nèi)可容易插入或去除基因的位點(diǎn))。本發(fā)明的遺傳操作還可包括產(chǎn)生能在多物種中生存的細(xì)胞核或細(xì)胞器基因組(如可移植葉綠體基因組)。此外，本發(fā)明的遺傳操作可包括測(cè)試這些操作或產(chǎn)生中任何一種的生存能力的方法(如，將穿梭載體轉(zhuǎn)移回宿主系統(tǒng)并且測(cè)試生存)。載體、標(biāo)記和轉(zhuǎn)化載體或其它重組核酸分子可包括編碼選擇標(biāo)記的核苷酸序列。該術(shù)語(yǔ)或“可選擇標(biāo)記(selectablemarker)”或“選擇標(biāo)記(selectionmarker)”是指賦予可檢測(cè)表型的多核苷酸(或編碼的多肽)。選擇標(biāo)記一般編碼可檢測(cè)多肽，例如綠色熒光蛋白或酶如熒光素酶，其當(dāng)與合適的試劑(分別為特定波長(zhǎng)的光或熒光素)接觸時(shí)產(chǎn)生可通過(guò)眼睛或使用合適的儀表檢測(cè)的信號(hào)(Giacomin,PlantSci.116=59-72,1996；Scikantha,J.Bacteriol.178:121，1996；Gerdes,FEBSLett.38944-47,1996；還可參見(jiàn)Jefferson,EMBOJ.6=3901-3907,1997，f1-glucuronidase)。選擇標(biāo)記一般是這樣的分子，其當(dāng)在細(xì)胞中存在或表達(dá)時(shí)給包含該標(biāo)記的細(xì)胞提供選擇性優(yōu)點(diǎn)(或缺點(diǎn))，例如能在否則將殺死細(xì)胞的試劑存在下生長(zhǎng)的能力。選擇標(biāo)記可提供獲得表達(dá)該標(biāo)記的原核細(xì)胞或植物細(xì)胞或兩者的方法，并且因此可被用作本發(fā)明的載體的成分(參見(jiàn)例如Bock，同上，2001)。選擇標(biāo)記的實(shí)例包括但不限于賦予抗代謝藥抗性的那些，例如二氫葉酸還原酶，其賦予氨甲蝶呤抗性(Reiss，PlantPhysiol.(LifeSci.Adv.)13143-149,1994)；新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶，其賦予氨基糖苷新霉素、卡那霉素和巴龍霉素抗性(Herrera-Estrella,EMBOJ.2=987-995,1983)；hygro，其賦予潮霉素抗性(Marsh,Gene32=481-485,1984)；trpB，其允許細(xì)胞能夠利用吲哚代替色氨酸；hisD，其允許細(xì)胞能夠利用組氨醇代替組氨酸(Hartman，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA85=8047,1988)；甘露糖_6_磷酸異構(gòu)酶，其允許細(xì)胞能夠利用甘露糖(W094/20627)；鳥(niǎo)氨酸脫羧酶，其賦予鳥(niǎo)氨酸脫羧酶抑制劑2_(二氟甲基)-DL-鳥(niǎo)氨酸抗性(DFM0；McConlogue,1987，InCurrentCommunicationsinMolecularBiology,ColdSpringHarborLaboratoryed.);禾口來(lái)自土曲毒(Aspergillusterreus)的脫氛醜，其貝武予滅痕素S(BlasticidinS)抗性(Tamura,Biosci.Biotechnol.Biochem.59:2336_2338，1995)。另外的選擇標(biāo)記包括賦予除草劑抗性的那些，例如膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因，其賦予膦絲菌素抗性(White等，Nucl.AcidsRes.18:1062，1990；Spencer等，Theor.Appl.Genet.79625-631,1990)；突變體EPSPV-合酶，其賦予草甘膦抗性(Hinchee等，BioTechnology91915-922,1998)；突變體乙酰乳酸合酶，其賦予咪唑啉酮或碘酰脲類抗性(Lee等，EMBOJ.71241-1248，1988)；突變體psbA，其賦予莠去津抗性(Smeda等，PlantPhysiol.103911-917,1993)；或突變體原卟啉原氧化酶(參見(jiàn)美國(guó)專利號(hào)5，767，373)；或其它賦予除草劑抗性的標(biāo)記，如草丁膦。選擇標(biāo)記包括多核苷酸，其賦予二氫葉酸還原酶(DHFR)或?qū)τ谡婧思?xì)胞的新霉素抗性和四環(huán)素；對(duì)于原核生物如大腸桿菌氨比西林抗性；以及在植物中博來(lái)霉素、慶大霉素、草甘膦、潮霉素、卡那霉素、氨甲蝶呤、腐草霉素、膦絲霉素、奇放線菌素、鏈霉素、磺酰胺和碘酰脲類抗性(參見(jiàn)例如，Maliga等，MethodsinPlantMolecularBiology,ColdSpringHarborLaboratoryPress,1995，第39頁(yè))。核和質(zhì)體轉(zhuǎn)化方法對(duì)于將多核苷酸引入植物細(xì)胞葉綠體來(lái)說(shuō)是常規(guī)和熟知的(參見(jiàn)美國(guó)專利號(hào)5，451，513,5,545，817和5，545，818；W095/16783；McBride等，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA91:7301_7305，1994)。在一些實(shí)施方式中，葉綠體轉(zhuǎn)化涉及引入期望核苷酸序列側(cè)翼的葉綠體DNA區(qū)域，允許外源DNA同源重組到靶葉綠體基因組。在一些情況中，可以使用1至1.5kb葉綠體基因組DNA側(cè)翼核苷酸序列。采用這種方法，葉綠體16SrRNA和rps12基因中的點(diǎn)突變——其賦予奇放線菌素和鏈霉素抗性——可被用作用于轉(zhuǎn)化的選擇標(biāo)記(Svab等，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA87:8526_8530，1990)，并且可在靴葉子大約一百分之一的轟擊頻率下產(chǎn)生穩(wěn)定的同質(zhì)轉(zhuǎn)化體。微粒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化也可被用于將多核苷酸引入植物細(xì)胞葉綠體(Klein等，Nature327:70-73，1987)。該方法利用微粒如金或鎢，其通過(guò)用氯化鈣、亞精胺或聚乙二醇沉積而涂布有期望的多核苷酸。微粒利用裝置如BIOLISTICPD-1000粒子槍(BioRad^erculesCalif.)在高速下加速進(jìn)入植物組織。利用生物發(fā)射方法的轉(zhuǎn)化方法在本領(lǐng)域中是熟知的(參見(jiàn)例如Christou，TrendsinPlantScience1:423_431，1996)。微粒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化已經(jīng)被用于例如產(chǎn)生各種轉(zhuǎn)基因植物品種，其包括棉花、煙草、玉米、雜交白楊和木瓜。重要的谷類作物如小麥、燕麥、大麥、高粱和稻也已經(jīng)采用微粒介導(dǎo)的輸送進(jìn)行轉(zhuǎn)化(Dimn等，NatureBiotech.14:494_498，1996；Shimamoto，Curr.Opin.Biotech.5158-162，1994)。大部分雙子葉植物的轉(zhuǎn)化利用上述方法是可能的。單子葉植物的轉(zhuǎn)化也可以利用例如上述生物發(fā)射方法、原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化、部分滲透性細(xì)胞的電穿孔、利用玻璃纖維引入DNA、玻璃珠攪動(dòng)法等進(jìn)行轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化頻率可通過(guò)用顯性選擇標(biāo)記——其包括但不限于細(xì)菌aadA基因——替換隱性rRNA或r-蛋白抗生素抗性基因而增加(SvabandMaliga,Proc.Natl.Acad.Sci.，USA90=913-917,1993)。達(dá)到同質(zhì)狀態(tài)一般需要大約15至20個(gè)細(xì)胞分化循環(huán)接著轉(zhuǎn)化。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)明顯的是，葉綠體可包含多拷貝的它的基因組，并且因此，術(shù)語(yǔ)“同質(zhì)(homoplasmic)”或“同型異源性(homoplasmy)”是指所有的特定目標(biāo)基因座拷貝基本相同的狀態(tài)。質(zhì)體表達(dá)——其中基因通過(guò)同源重組插入到各個(gè)植物細(xì)胞中存在的所有幾千拷貝環(huán)狀質(zhì)體基因組中——相比核表達(dá)的基因利用了巨大拷貝數(shù)的優(yōu)勢(shì)，以使表達(dá)水平能夠容易地超過(guò)總可溶植物蛋白的10%。本發(fā)明載體上靶DNA、載體DNA或合成DNAs的任何核苷酸序列可進(jìn)一步包括對(duì)于轉(zhuǎn)化生物體中核苷酸序列的表達(dá)來(lái)說(shuō)偏好的密碼子。在一些情況下，核苷酸序列中的密碼子在密碼子的第三核苷酸位置富含A/T。例如，密碼子的第三核苷酸位置至少50%可以是A或T。在其他況下，密碼子富含G/C，例如密碼子的第三核苷酸位置至少50%可以是G或C0本發(fā)明穿梭載體的核苷酸序列可適用于葉綠體表達(dá)。例如，本文的核苷酸序列可包括葉綠體特異性啟動(dòng)子或葉綠體特異性調(diào)控區(qū)域。核苷酸序列還可適用于細(xì)胞核表達(dá)。例如，核苷酸序列可包括細(xì)胞核特異性啟動(dòng)子或細(xì)胞核特異性調(diào)控區(qū)域。細(xì)胞核序列可編碼具有編碼葉綠體靶向蛋白(如葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽)的靶向序列的蛋白質(zhì)，或?qū)⒌鞍踪|(zhì)導(dǎo)向內(nèi)膜系統(tǒng)以定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)或質(zhì)膜的信號(hào)肽。在實(shí)施方式——其中載體編碼能產(chǎn)生燃料的基因，燃料產(chǎn)品通過(guò)改變細(xì)胞的酶含量以增加特定燃料分子的生物合成而產(chǎn)生。例如，編碼生物合成酶的核苷酸序列(例如從外源分離的0RF)可被引入到光合生物體的葉綠體中。編碼燃料生物合成酶的核苷酸序列也可被引入到光合生物體的細(xì)胞核基因組中。引入到細(xì)胞核基因組中的核苷酸序列可指引生物合成酶在細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中的積累，或者可指引生物合成酶在光合生物體的葉綠體中的積累。本文的任何核苷酸序列可進(jìn)一步包括調(diào)控序列。調(diào)控序列可包括下列中一個(gè)或多個(gè)啟動(dòng)子、內(nèi)含子、外顯子、加工元件、3’非翻譯區(qū)、5’非翻譯區(qū)、RNA穩(wěn)定元件或翻譯增強(qiáng)子。啟動(dòng)子可以是下列中一個(gè)或多個(gè)適于在生物體中表達(dá)的啟動(dòng)子、藻類啟動(dòng)子、葉綠體啟動(dòng)子和細(xì)胞核啟動(dòng)子，其中任何一種可以是天然或合成的啟動(dòng)子。調(diào)控序列可以是誘導(dǎo)型或自身調(diào)節(jié)型。調(diào)控序列可包括自身和/或異源序列。在一些情況中，控制序列可被第一同源序列和第二同源序列側(cè)面相接。第一和第二同源序列每個(gè)的長(zhǎng)度可為至少500個(gè)核苷酸。同源序列可允許同源重組或者可起到隔離異源序列的作用以促進(jìn)基因表達(dá)。載體還可包括涉及產(chǎn)生用作生物醫(yī)藥的產(chǎn)物的序列，諸如但不限于抗體(包括其功能部分)、白介素和其它免疫調(diào)節(jié)劑以及抗生素。參見(jiàn)例如Mayfield等，(2003)Proc.Nat，1Acad.Sci.100(438-42)和美國(guó)公布號(hào)2004/0014174。本發(fā)明的載體可包括可表達(dá)盒的細(xì)菌基因組或其部分(如包括細(xì)菌基因組或其部分的可去除DNA片段)。此外，本發(fā)明的載體可包括功能基因組單元(如代謝過(guò)程、生物化學(xué)途徑、基因表達(dá)所必需的單元)。本發(fā)明的載體可包括可移植細(xì)菌基因組或其部分。本發(fā)明的載體可包括可轉(zhuǎn)移細(xì)菌基因組或其部分。在一些實(shí)施方式中，靶DNA的大片段被修飾。修飾的DNA可包括進(jìn)行乙醇發(fā)生所必需的所有基因，ED(Entner-Duodorff)途徑、葡糖耐性途徑、酒精耐性途徑、羧酸副產(chǎn)物抗性途徑、醋酸耐性途徑、糖運(yùn)輸途徑、糖發(fā)酵途徑和/或纖維素和半纖維素消化途徑所必需的所有基因。本發(fā)明的雜合克隆系統(tǒng)和方法結(jié)合了酵母作為捕獲和操作給定核酸的系統(tǒng)的高通用性以及細(xì)菌系統(tǒng)用于擴(kuò)增這種核酸的高效性。構(gòu)建了重組載體，其依靠同源重組以介導(dǎo)大核酸片段的分離、操作和傳遞。本文所述的發(fā)明還提供利用這種重組克隆載體來(lái)克隆、操作和傳遞大核酸的方法。最后，本發(fā)明提供將這種重組克隆系統(tǒng)用作生物化學(xué)途徑分析、細(xì)胞器分析和合成葉綠體構(gòu)建的增效劑的方法。本發(fā)明的載體可被引入到酵母中。酵母可以是合適的釀酒酵母菌株；然而，可以利用其它酵母類型。向酵母中引入載體可允許載體的遺傳操作。酵母載體在文獻(xiàn)中已經(jīng)被廣泛描述，并且其操作方法如下文所討論也是熟知的(參見(jiàn)例如Ketner等(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)9161866190)。遺傳操作后，克隆系統(tǒng)可允許轉(zhuǎn)移到細(xì)菌環(huán)境，適于制備較大量的核酸。細(xì)菌型載體的代表性實(shí)例包括但不限于Pl人工染色體、細(xì)菌人工染色體(BAC)和單拷貝質(zhì)粒F因子(Shizuya等(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.8987948797)。類似地，細(xì)菌載體在本領(lǐng)域中是熟知的(例如Ioarmou等(1994)Nature6:8489)。本發(fā)明還提供穿梭載體，其包括酵母選擇標(biāo)記、細(xì)菌選擇標(biāo)記、端粒、著絲粒、酵母復(fù)制起點(diǎn)、和/或細(xì)菌復(fù)制起點(diǎn)。本發(fā)明的穿梭載體可使酵母中的同源重組在目標(biāo)載體中捕獲和整合目標(biāo)靶核酸。穿梭載體可允許在可引入載體的任何宿主中操作靶DNA。在一些實(shí)施方式中，期望的操作后，可以去除穿梭載體成分，僅留下修飾的靶DNA。載體序列的這種提取可采用標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行并且可發(fā)生在任何宿主細(xì)胞中。目標(biāo)靶核酸可以是大核酸，并且可包括例如載體，諸如病毒載體，其包括本文包含的目標(biāo)外來(lái)基因。靶核酸還可以是細(xì)菌(包括古細(xì)菌和真細(xì)菌)、病毒、真菌、原生生物、植物或動(dòng)物基因組或其部分。例如，本發(fā)明一種實(shí)施方式的靶核酸包括整個(gè)原核基因組。作為另外的實(shí)例，本發(fā)明的靶核酸可包括真核生物體的葉綠體基因組。根據(jù)本發(fā)明的穿梭載體可包括適當(dāng)定向的DNA，其起到酵母中的端粒和著絲粒的作用。可以使用任何合適的端粒。合適的端粒非限制性地包括來(lái)自許多生物體的端粒重復(fù)，其可提供酵母中的端粒功能。人中的端粒重復(fù)序列(TTAGGG)n與錐體蟲(chóng)中的相同并且類似于酵母((TG)η)N和四膜蟲(chóng)(TTGGG)n中的(Szostak和Blackburn(1982)Cell29245255；Brown(1988)EMBOJ.723772385；和Moyzis等(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.85:66226626)。術(shù)語(yǔ)“著絲?！痹诒疚闹杏糜谧R(shí)別核酸，其調(diào)節(jié)本發(fā)明的載體在減數(shù)分裂和有絲分裂中穩(wěn)定的復(fù)制和精確的分配，由此確保正確地分離成子代細(xì)胞。合適的著絲粒非限制性地包括酵母著絲粒CEN4，其在大的線狀質(zhì)粒上賦予有絲分裂和減數(shù)分裂穩(wěn)定性(Murray&Szostak(1983)Nature305:189193；Carbon(1984)Cell37:351353；和Clark等(1990)Nature287504509))。在一些實(shí)施方式中，根據(jù)本發(fā)明的環(huán)狀載體兩片段中至少一個(gè)包括至少一個(gè)復(fù)制系統(tǒng)，其在選擇的宿主細(xì)胞和/或顆粒中起作用。正如在下文將變得明顯的，技術(shù)人員將會(huì)認(rèn)識(shí)到選擇的靶核酸的操作、擴(kuò)增和/或傳遞可依需要利用一個(gè)以上的宿主細(xì)胞/顆粒。因此，可以包括一個(gè)以上在各個(gè)選擇的宿主細(xì)胞和/或顆粒中起作用的復(fù)制系統(tǒng)。當(dāng)宿主細(xì)胞(或多個(gè))是原核生物尤其大腸肝菌時(shí)，復(fù)制系統(tǒng)(或多個(gè))包括在原核生物中起作用的那些，諸如，例如Pl質(zhì)粒復(fù)制子、復(fù)制起點(diǎn)(ori)、Pl裂解性復(fù)制子、ColEUBAC、單拷貝質(zhì)粒F因子等。一個(gè)或兩個(gè)片段和/或環(huán)狀載體可進(jìn)一步包括酵母復(fù)制起點(diǎn)，其能支持大核酸的復(fù)制。根據(jù)本發(fā)明的復(fù)制區(qū)域的非限制性實(shí)例包括自主復(fù)制序列或“ARS元件”。ARS元件被鑒定為賦予高頻轉(zhuǎn)化性能的酵母序列。四膜蟲(chóng)DNA末端已經(jīng)與ARSl和ARS4被用作酵母中的ARS元件(Kiss等(1981)Mol.CellBiol.1535543；Stinchcomb等(1979)Nature28239；和Barton和Smith(1986)Mol.CellBiol.6:2354)。對(duì)于各個(gè)片段(如，與缺失填補(bǔ)穿梭載體的酵母和細(xì)菌元件對(duì)應(yīng)的那些)，可能有兩個(gè)或以上的復(fù)制起點(diǎn)。根據(jù)本發(fā)明一個(gè)方面的第一和/或第二片段可被連接成環(huán)化載體形式(如質(zhì)粒形式)。環(huán)化可利用目標(biāo)片段在體內(nèi)或體外發(fā)生?？蛇x地，可以使用目標(biāo)環(huán)狀載體。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“載體”指DNA或其它核酸可被克隆到其中的質(zhì)?；蚴删wDNA或其它核酸。載體可在宿主細(xì)胞中自主復(fù)制，并且可進(jìn)一步表征為一個(gè)或少量的限制酶識(shí)別位點(diǎn)，在其上這樣的核酸可以以可測(cè)定的形式進(jìn)行切割，并且核酸片段可被插入其中。載體還可包含選擇標(biāo)記，其適于識(shí)別用載體轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。本發(fā)明的靶核酸可在復(fù)雜性上顯著變化。靶核酸可包括病毒、原核或真核DNA、cDNA、外顯子(編碼)和/或內(nèi)含子(非編碼)序列。因此，本發(fā)明的靶核酸可包括一個(gè)或多個(gè)基因。靶核酸可以是染色體、基因組或操縱子和/或染色體、基因組或操縱子的一部分。靶核酸可包括途徑中所有基因的編碼序列、細(xì)胞器生存所必需的基因最小補(bǔ)體、和/或生物體生存所必需的基因最小補(bǔ)體。靶核酸可包括運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單孢菌DNA序列，其包括但不限于基因組DNA和/或cDNA。靶核酸可包括真核葉綠體DNA序列，其包括但不限于葉綠體基因組DNA和/或cDNA。靶核酸可包括藍(lán)細(xì)菌DNA，其包括但不限于基因組DNA和/或cDNA。靶核酸還可以是任何起源或特性的。可以期望基因還包括與編碼序列可操作連接的啟動(dòng)子，以便有效地促進(jìn)轉(zhuǎn)錄。還可包括增強(qiáng)子、阻遏物和其它調(diào)節(jié)序列，以便調(diào)節(jié)基因的活性，如本領(lǐng)域所熟知。本文所提供的基因可以指在單個(gè)宿主細(xì)胞的基因組中發(fā)現(xiàn)的基因(即內(nèi)源的)或者在單個(gè)宿主細(xì)胞的基因組中未發(fā)現(xiàn)的基因(即外源或“外來(lái)基因”)。外來(lái)基因可以來(lái)自與宿主相同的物種或不同的物種。對(duì)于利用包含一基因的DNA進(jìn)行細(xì)胞的轉(zhuǎn)染——其意圖是所述基因?qū)⒃谒黾?xì)胞中被表達(dá)，DNA可包括對(duì)于基因在所需要的表達(dá)方向上的表達(dá)來(lái)說(shuō)必需的任何控制序列。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“內(nèi)含子”是指在沒(méi)有被翻譯成蛋白的給定基因中存在的DNA序列并且一般在外顯子之間發(fā)現(xiàn)。遺傳元件；或多核苷酸，其包括編碼多肽的區(qū)域或調(diào)節(jié)對(duì)多肽在宿主細(xì)胞中的表達(dá)來(lái)說(shuō)重要的轉(zhuǎn)錄或翻譯或其它過(guò)程的區(qū)域；或多核苷酸，其包括編碼多肽的區(qū)域或與其可操作連接的區(qū)域，調(diào)節(jié)著表達(dá)。遺傳元件可被包括在載體內(nèi)，其作為附加型元件復(fù)制，即，作為物理上獨(dú)立于宿主細(xì)胞基因組的分子。它們可被包含在小型染色體內(nèi)，諸如在真核細(xì)胞中在轉(zhuǎn)染DNA通過(guò)氨甲蝶呤選擇的擴(kuò)增期間出現(xiàn)的那些。遺傳元件還可被包含在宿主細(xì)胞基因組內(nèi)；不是在其自然狀態(tài)下，但是相反地是在操作諸如以純化DNA形式或者在載體中等形式分離、克隆或引入到宿主細(xì)胞等等之后。本發(fā)明的載體可包含足夠的線性同一性或類似性(同源性)，以具有與靶核酸部分雜交的能力，所述靶核酸是制備的或者是單鏈的，諸如基因、轉(zhuǎn)錄控制元件或基因內(nèi)DNA。不受理論約束，這種雜交通常是互補(bǔ)鏈之間堿基特異性氫鍵的結(jié)果，優(yōu)選地形成Watson-Crick堿基對(duì)。作為實(shí)事，這種同源性可從同源重組事件的觀察中推斷出來(lái)。在一些實(shí)施方式中，這種同源性為線性核酸的大約8個(gè)至大約1000個(gè)堿基。在其它實(shí)施方式中，這種同源性為大約12個(gè)至大約500個(gè)堿基。本領(lǐng)域技術(shù)人員將了解同源性可在較長(zhǎng)段的核酸上延伸。同源重組是一種遺傳重組，在兩條DNA鏈之間發(fā)生的物理重排過(guò)程。同源重組涉及相似序列的匹配、匹配的DNA鏈之間的交叉、以及DNA的斷裂和修補(bǔ)以在鏈之間產(chǎn)生物質(zhì)的交換。同源重組過(guò)程自然地發(fā)生在生物體中并且還被用作分子生物學(xué)技術(shù)，用于將遺傳變化引入到生物體中。本發(fā)明的載體可被進(jìn)一步修飾以包括除靶序列外的功能實(shí)體，其可在構(gòu)建物(或多個(gè))的制備、擴(kuò)增、宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染中找到應(yīng)用，以及，如果適用的話，用于宿主細(xì)胞中的整合。例如，載體可包括整合到宿主DNA中的區(qū)域。整合可整合到宿主細(xì)胞的核DNA。在一些實(shí)施方式中，可整合到非核DNA，如葉綠體DNA。載體的其它功能實(shí)體可以包括但不限于標(biāo)記、連接體和限制位點(diǎn)。靶核酸可包括調(diào)節(jié)核酸。這是指任何序列或核酸，其調(diào)節(jié)(直接地或間接地，以及向上或向下)由其控制的核酸的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和/或表達(dá)。通過(guò)這種調(diào)節(jié)核酸進(jìn)行的控制可使核酸被組成型地或誘導(dǎo)型地轉(zhuǎn)錄和/或翻譯。本文的任何核苷酸序列可進(jìn)一步包括調(diào)控序列。調(diào)控序列的實(shí)例可非限制性地包括下列中一個(gè)或多個(gè)啟動(dòng)子、內(nèi)含子、外顯子、加工元件、3’非翻譯區(qū)、5’非翻譯區(qū)、RNA穩(wěn)定元件或翻譯增強(qiáng)子。啟動(dòng)子可以是下列中一個(gè)或多個(gè)適于在生物體(如細(xì)菌、真菌、病毒、植物、哺乳動(dòng)物或原生生物)中表達(dá)的啟動(dòng)子、藻類啟動(dòng)子、葉綠體(或其它質(zhì)體)啟動(dòng)子、線粒體啟動(dòng)子和核啟動(dòng)子，其中任何一種可以是天然或合成的啟動(dòng)子。調(diào)控序列可以是誘導(dǎo)型或自身調(diào)節(jié)型。調(diào)控序列可包括自身和/或異源序列。在一些情況中，控制序列可被第一同源序列和第二同源序列側(cè)面相接。第一和第二同源序列每個(gè)的長(zhǎng)度可為至少500個(gè)核苷酸。同源序列可允許同源重組或者可起到隔離異源序列的作用以促進(jìn)基因表達(dá)。在一些情況下，在本發(fā)明的穿梭載體中存在的靶DNA、載體DNA或其它DNA不導(dǎo)致產(chǎn)生多肽產(chǎn)物但相反地允許從細(xì)胞中分泌該產(chǎn)物。在這些情況中，核苷酸序列可編碼蛋白，其增強(qiáng)或促使或增加從生物體向外部環(huán)境分泌產(chǎn)物的速度。因此，本發(fā)明的載體片段和/或載體可包括轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)域，諸如，例如轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)區(qū)域。本領(lǐng)域技術(shù)人員將了解，許多轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)序列已經(jīng)被分離并且可得到，其包括胸苷激酶啟動(dòng)子、肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子、免疫球蛋白啟動(dòng)子、金屬硫蛋白啟動(dòng)子、人巨細(xì)胞病毒啟動(dòng)子和SV40啟動(dòng)子。本發(fā)明的一種實(shí)施方式提供產(chǎn)生空位填補(bǔ)載體的方法。空位填補(bǔ)載體可經(jīng)歷根據(jù)本發(fā)明的靶核酸的同源重組和插入，這是通過(guò)填充在與靶核酸的5'和3'區(qū)域同源的序列之間的區(qū)域(空位)。因此，在一些實(shí)施方式中，技術(shù)人員將使本克隆系統(tǒng)在允許同源重組的條件下與靶核酸接觸。另一方法在允許同源重組的條件下結(jié)合(i)第一片段，其包括與靶核酸的5'末端同源的第一核酸、第一選擇標(biāo)記和第一環(huán)化元件；(ii)靶核酸；和(iii)第二片段，其包括與靶核酸的3'末端同源的第二核酸、第二選擇標(biāo)記和第二環(huán)化元件。本發(fā)明的一種實(shí)施方式通過(guò)兩臂和靶核酸之間的同源重組產(chǎn)生空位填補(bǔ)載體。在臂和靶核酸中發(fā)現(xiàn)的同源區(qū)域之間的交換受到同源核酸之間任意點(diǎn)上的同源重組的影響。關(guān)于本發(fā)明的環(huán)狀載體，“空位填補(bǔ)”本質(zhì)上是向載體中插入(即亞克隆)靶序列。根據(jù)本領(lǐng)域中熟知的方法，同源重組可在體外實(shí)現(xiàn)。例如，本發(fā)明的方法可利用酵母溶菌產(chǎn)物制備物進(jìn)行實(shí)施。同源重組可發(fā)生在體內(nèi)。因此，本發(fā)明的方法可利用任何能CN支持同源重組事件的宿主細(xì)胞進(jìn)行實(shí)施，諸如，例如細(xì)菌、酵母和哺乳動(dòng)物細(xì)胞。本領(lǐng)域技術(shù)人員將了解，合適宿主的選擇取決于該方法的克隆系統(tǒng)中使用的選擇標(biāo)記的特定組合。向目標(biāo)宿主細(xì)胞中引入載體可使用的技術(shù)包括磷酸鈣/DNA共沉淀、電穿孔、細(xì)菌_原生質(zhì)體融合、向細(xì)胞核中微注射DNA等等。技術(shù)人員將了解，許多方案實(shí)質(zhì)上可互換地用于例如轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物細(xì)胞，如在例如Keown等(Meth.Enzymol.185527537，1990)中所述。轉(zhuǎn)化可通過(guò)利用土壤細(xì)菌如根癌農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)實(shí)現(xiàn)。根癌農(nóng)桿菌可攜帶工程化質(zhì)體載體或選擇的超基因的載體。植物組織如葉子被切成小片，如IOX10mm，并且在包含懸浮農(nóng)桿菌的流體中浸濕10分鐘。沿著切口的一些細(xì)胞被細(xì)菌轉(zhuǎn)化，所述細(xì)菌將其DNA插入到該細(xì)胞中。放置在選擇生根發(fā)芽的培養(yǎng)基中，植物將再生長(zhǎng)。一些植物物種僅僅通過(guò)將花浸在農(nóng)桿菌懸浮液中并且然后將種子種在選擇型培養(yǎng)基中就可被轉(zhuǎn)化。另一方法是使用“基因槍”方法?；驑屖潜环Q為生物射擊(也被稱為生物彈道(bioballistic))方法的一部分，并且在一定條件下，DNA(或RNA)變“粘”，其粘附于生物惰性顆粒如金屬原子(通常地是鎢或金)。通過(guò)在部分真空中加速這種DNA-顆粒復(fù)合體并且將靶組織放在加速通道中，DNA被有效地引入。未涂布的金屬顆粒還可通過(guò)包含細(xì)胞周圍的DNA的溶液進(jìn)行射擊，因此挑選遺傳物質(zhì)并且進(jìn)入活細(xì)胞。穿孔板止動(dòng)殼筒但允許金屬碎片穿過(guò)并進(jìn)入另一側(cè)的活細(xì)胞中。吸收期望DNA——通過(guò)使用標(biāo)記基因(在植物中GUS的使用是最常見(jiàn)的)進(jìn)行鑒別——的細(xì)胞然后被培養(yǎng)以復(fù)制基因并且也許被克隆。生物射擊方法最常被用于將基因插入到植入細(xì)胞以獲得如殺蟲(chóng)劑或除草劑抗性。已經(jīng)采用不同的方法加速顆粒這些方法包括氣動(dòng)設(shè)備；利用機(jī)械沖力或宏觀轟擊粒子的儀器；向心力、磁力或靜電力；噴射或接種疫苗槍；和基于通過(guò)沖擊波如放電進(jìn)行加速的裝置(例如參見(jiàn)ChristouandMcCabe,1992,Agracetus,Inc.ParticleGunTransformationofCropPlantsUsingElectricDischarge(ACCELLTechnology))。轉(zhuǎn)化可按照下列方法進(jìn)行例如當(dāng)宿主是細(xì)菌(大腸桿菌、枯草桿菌(Bacillussubtilis)等)時(shí)按照Cohen等的方法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA,69:2110(1972))、原生質(zhì)體方法(Mol.Gen.Genet.，168111(1979))或感受態(tài)方法(J.Mol.Biol.,56209(1971))，當(dāng)宿主是釀酒酵母時(shí)按照Hinnen等的方法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA,751927(1978))或鋰方法(J.Bacteriol.，153163(1983))，當(dāng)宿主是動(dòng)物細(xì)胞時(shí)按照Graham的方法(Virology，52:456(1973))，以及當(dāng)宿主是昆蟲(chóng)細(xì)胞時(shí)按照Summers等的方法(Mol.Cell.Biol.，3:2156-2165(1983))。一般地，轉(zhuǎn)化事件后，潛在的轉(zhuǎn)化體在營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基上進(jìn)行鋪板以進(jìn)行選擇和/或培養(yǎng)。營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基優(yōu)選地包括宿主細(xì)胞(轉(zhuǎn)化體)生長(zhǎng)所必需的碳源、無(wú)機(jī)氮源或有機(jī)氮源。碳源的實(shí)例是葡萄糖、葡聚糖、可溶淀粉和蔗糖，并且無(wú)機(jī)或有機(jī)氮源的實(shí)例是銨鹽、硝酸鹽、氨基酸、玉米漿、蛋白胨、酪蛋白、肉膏、豆餅和土豆提取物。如果期望的話，培養(yǎng)基可包括其它營(yíng)養(yǎng)物(例如無(wú)機(jī)鹽(例如氯化鈣、磷酸二氫鈉和氯化鎂)、維生素、抗生素(例如四環(huán)素、新霉素、氨比西林、卡那霉素等)。一些光合生物體的培養(yǎng)基可能不需要碳源，因?yàn)檫@樣的生物體可以是光合自養(yǎng)生物并且因此可產(chǎn)生其自己的碳源。培養(yǎng)和/或選擇通過(guò)本領(lǐng)域已知的方法進(jìn)行。對(duì)于本發(fā)明的載體、宿主細(xì)胞和方法，適當(dāng)選擇培養(yǎng)和選擇條件諸如培養(yǎng)基的溫度、PH和培養(yǎng)時(shí)間。本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)認(rèn)識(shí)到，根據(jù)宿主細(xì)胞(轉(zhuǎn)化體)的種類以及載體的特性(例如其存在選擇標(biāo)記)，有許多可用的特定培養(yǎng)基和培養(yǎng)/選擇條件。本文的培養(yǎng)基僅僅是以實(shí)例的方式進(jìn)行描述并且不具限制性。當(dāng)宿主是細(xì)菌、放線菌、酵母或絲狀真菌時(shí)，包括上述提及的營(yíng)養(yǎng)源(或多個(gè))的培養(yǎng)基是適當(dāng)?shù)?。?dāng)宿主是大腸桿菌時(shí)，優(yōu)選培養(yǎng)基的實(shí)例是LB培養(yǎng)基、M9培養(yǎng)基(Miller等Exp.Mol.Genet.，ColdSpringHarborLaboratory，p.431(1972))等等。當(dāng)宿主是酵母時(shí)，培養(yǎng)基的實(shí)例是Burkhoter基本培養(yǎng)基(Bostian,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,774505(1980))。酵母中載體的選擇可通過(guò)使用酵母選擇標(biāo)記完成。實(shí)例包括但不限于HIS3、TRP1、URA3、LEU2和ADE標(biāo)記。在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，載體或其片段可包括兩個(gè)或多個(gè)選擇標(biāo)記。因此，在一種實(shí)施方式中，本發(fā)明載體的片段可包括與靶核酸同源重組后要丟失的ADE標(biāo)記，以及HIS3標(biāo)記。其它片段可包括TRPl標(biāo)記。通過(guò)在合適的營(yíng)養(yǎng)缺陷型選擇培養(yǎng)基上生長(zhǎng)轉(zhuǎn)化細(xì)胞完成選擇(參見(jiàn)例如Watson等(1992)RecombinantDNA,2.sup.nded.，F(xiàn)reemanandCo.，NewYork,N.Y.)。例如，HIS3允許選擇包含第一片段的細(xì)胞。TRPl允許選擇包含第二片段的細(xì)胞。ADE允許篩選和選擇其中發(fā)生同源重組的克隆。ADE使得能進(jìn)行顏色選擇(紅色)。重組酵母細(xì)胞可按照本領(lǐng)域熟知的方法利用本文所述的選擇標(biāo)記進(jìn)行選擇。因此，本領(lǐng)域技術(shù)人員將了解，包埋本發(fā)明的空位填補(bǔ)載體的重組酵母細(xì)胞可基于其中包括的選擇標(biāo)記進(jìn)行選擇。例如，攜帶HIS3和TRPl的重組載體可通過(guò)在缺少組氨酸和色氨酸的營(yíng)養(yǎng)缺陷型選擇培養(yǎng)基的存在下生長(zhǎng)轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞而進(jìn)行選擇。分離的陽(yáng)性克隆可以被進(jìn)一步提純并且通過(guò)例如限制性分析、電穿孔、DNA印跡分析、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)或類似方法進(jìn)行分析以確定本發(fā)明重組載體的存在和結(jié)構(gòu)。本發(fā)明進(jìn)一步提供按照本發(fā)明方法人工改造的空位填補(bǔ)載體。這種載體是本發(fā)明的片段或載體與選擇的靶核酸之間同源重組的產(chǎn)物。本發(fā)明還提供包埋按照本發(fā)明的克隆系統(tǒng)或載體的原核細(xì)胞和/或真核宿主細(xì)胞。生物體可以是單細(xì)胞的或多細(xì)胞的。生物體可以是自然光合類生物體或自然非光合類生物體?？杀晦D(zhuǎn)化的生物體的其它實(shí)例包括維管或非維管生物體。當(dāng)使用宿主諸如植物、酵母、動(dòng)物、藻類或昆蟲(chóng)細(xì)胞時(shí)，本發(fā)明的載體可至少包含啟動(dòng)子、起始密碼子、編碼蛋白質(zhì)的多核苷酸以及終止密碼子。如果需要的話，本發(fā)明的載體還可包含通常使用的用于基因擴(kuò)增的多核苷酸(標(biāo)記)。產(chǎn)物本發(fā)明的載體可包括這樣的序列，其導(dǎo)致在包括載體的生物體中產(chǎn)生自然產(chǎn)生或不自然產(chǎn)生的產(chǎn)物。在一些情況中，由載體上一個(gè)或多個(gè)序列編碼的產(chǎn)物是多肽，例如酶。在實(shí)施本發(fā)明中利用的酶可以由來(lái)自任何生物體的核苷酸序列編碼，所述生物體包括細(xì)菌、植物、真菌和動(dòng)物。載體還可包括這樣的核苷酸序列，其影響來(lái)自生物體的產(chǎn)物的生產(chǎn)或分泌。在一些情況下，這樣的核苷酸序列(或多個(gè))編碼一個(gè)或多個(gè)在類異戊二烯生物合成途徑中起作用的酶。類異戊二烯生物合成途徑中多肽的實(shí)例包括合酶，諸如C5、C10、C15、C20、C30和C40合酶。在一些情況下，酶是類異戊二烯生產(chǎn)酶。在一些情況下，類異戊二烯生產(chǎn)酶產(chǎn)生帶有兩個(gè)磷酸酯基的類異戊二烯(如GPP合酶、FPP合酶、DMAPP合酶)。在其他情況下，類異戊二烯生產(chǎn)酶產(chǎn)生帶有零個(gè)、一個(gè)、三個(gè)或更多的磷酸酯基的類異戊二烯或者可產(chǎn)生帶有其它官能團(tuán)的類異戊二烯。編碼用在本發(fā)明中的酶或其它蛋白質(zhì)的多核苷酸可以進(jìn)行分離和/或通過(guò)本領(lǐng)域已知的任何方法合成，所述方法包括但不限于克隆、亞克隆和PCR。用在本發(fā)明中的類異戊二烯生產(chǎn)酶還可以是葡萄烴(botryococcene)合酶、β-石竹烯合酶、大根香葉烯A合酶、8-表雪松醇合酶、朱欒倍半萜合酶、(+)_δ-杜松烯合酶、大根香葉烯C合酶、(Ε)-β-金合歡烯合酶、蓖麻烯(casbene)合酶、巖蘭螺旋二烯(vetispiradiene)合酶、5-表-馬兜鈴烯(5-印i-aristolochene)合酶、馬兜鈴烯合酶、α-律草烯、(Ε，Ε)-α-金合歡烯合酶、(-)-β-菔烯合酶、Y-萜品烯合酶、苧烯環(huán)化酶、芳樟醇合酶、(+)_冰片基二磷酸合酶、左旋海松二烯合酶、異海松二烯合酶、(E)-Y-紅沒(méi)藥烯合酶、柯巴基焦磷酸(copalylpyrophosphate)合酶、貝殼杉烯合酶、長(zhǎng)葉烯合酶、Y-律草烯合酶、S-蛇床烯合酶、β-水芹烯合酶、萜品油烯合酶、(+)-3_蒈烯合酶、順式-柯巴基焦磷酸(syn-copalyldiphosphate)合酶、α-萜品醇合酶、順式海松-7，15-二烯合酶、ent-sandaaracopimaradienesterner-13-eneE-β-、S—胃才章酉享香葉醇合酶、Y-萜品烯合酶、芳樟醇合酶、Ε-β-羅勒烯合酶、表雪松醇合酶、α-姜烯合酶、愈創(chuàng)木二烯(guaiadiene)合酶、卡藜二烯合酶、順式依蘭油二烯(cis-muuroladiene)合Bi、aphidicolan-16b-ol合Bi、elizabethatriene合Bi、擅香醇合Bi、綠口十醇合Bi、zinzanol合酶、雪松醇合酶、香紫蘇醇合酶、柯巴醇合酶或淚柏醇合酶?？捎杀景l(fā)明的載體產(chǎn)生的其它酶包括生物質(zhì)降解酶。生物質(zhì)降解酶的非限制性實(shí)例包括纖維素分解酶、半纖維素分解酶、果膠分解酶、木聚糖酶、木質(zhì)素分解酶、纖維素酶、纖維二糖酶、軟化酶(如內(nèi)聚半乳糖醛酸酶)、淀粉酶、蛋白酶、核糖核酸酶、脫氧核糖核酸酶、旋復(fù)花粉酶、裂解酶、磷脂酶、果膠酶、支鏈淀粉酶、葡萄糖異構(gòu)酶、內(nèi)切木聚糖酶、β_木糖苷酶、α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶、α-葡萄糖醛酸酶、α-半乳糖苷酶、乙酰木聚糖酯酶和阿魏酸酯酶。編碼這種酶的基因的實(shí)例包括但不限于淀粉酶、纖維素酶、半纖維素酶、(如β“葡萄糖苷酶、內(nèi)切纖維素酶、外切纖維素酶)、外切_β_葡聚糖酶、內(nèi)切_β_葡聚糖酶和木聚糖酶(內(nèi)切木聚糖酶和外切木聚糖酶)。木質(zhì)素分解酶的實(shí)例包括但不限于來(lái)自黃孢原毛平革菌(Phanerochaetechrysosporium)的木質(zhì)素過(guò)氧化物酶和錳過(guò)氧化物酶。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到這些酶只是可用于本發(fā)明的部分酶。本發(fā)明打算通過(guò)用編碼一種或多種不同酶的核酸轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞(如，藻類細(xì)胞，諸如萊茵衣藻、杜氏鹽藻、雨生紅球藻以及藍(lán)細(xì)菌細(xì)胞)和/或包括宿主細(xì)胞的生物體，制備有助于產(chǎn)生脂肪酸、類脂或油的酶。在一些實(shí)施方式中，有助于產(chǎn)生脂肪酸、類脂或油的酶是合成代謝酶。有助于脂肪酸合成的合成代謝酶的一些實(shí)例包括但不限于乙酰輔酶A羧化酶、酮還原酶、硫代酸酯酶、丙二?；D(zhuǎn)移酶、脫水酶、?；o酶A連接酶、酮酰基合酶、烯?；€原酶和去飽合酶。在一些實(shí)施方式中，酶是分解代謝或生物降解酶。在一些實(shí)施方式中，生產(chǎn)的是單一酶。一些宿主細(xì)胞可以用多個(gè)編碼一種或多種酶的基因進(jìn)行轉(zhuǎn)化。例如，單一轉(zhuǎn)化細(xì)胞可包含外源核酸，其編碼組成整個(gè)脂肪酸合成途徑的酶。一種途徑的一實(shí)例可包括基因，其編碼乙酰輔酶A羧化酶、丙二酰基轉(zhuǎn)移酶、酮?；厦负土虼狨ッ?。用整個(gè)途徑和/或從其中萃取的酶轉(zhuǎn)化的細(xì)胞可合成完全脂肪酸或脂肪酸合成途徑的中間體。在一些實(shí)施方式中，構(gòu)建物可包含多份相同的基因、和/或編碼來(lái)自不同生物體的相同酶的多個(gè)基因、和/或多個(gè)在編碼序列的一個(gè)或多個(gè)部分具有突變的基因。在一些情況下，產(chǎn)物(如燃料、香味、殺蟲(chóng)劑)是富含烴的分子，如萜。萜(按照異戊二烯單元的數(shù)目進(jìn)行分類)可以是半萜、單萜、倍半萜、二萜、三萜或四萜。在特定實(shí)施方式中，萜是類萜(也稱為類異戊二烯)，諸如類固醇或類胡蘿卜素。類胡蘿卜素的亞類包括胡蘿卜素和葉黃素。在特定實(shí)施方式中，燃料產(chǎn)品是苧烯、1，8_桉樹(shù)腦、α-菔烯、(+)_檜烯、月桂烯、松香二烯、紫杉二烯、法呢基焦磷酸酯、紫穗槐二烯、(Ε)-α-紅沒(méi)藥烯、β胡蘿卜素、α胡蘿卜素、番茄紅素或二八氫番茄紅素(diapophytoene)。這些萜中的一些是純的烴(如苧烯)并且其它的是烴衍生物(如桉樹(shù)腦)。燃料產(chǎn)品的實(shí)例是石化產(chǎn)品和它們的前體及所有其它可用在石化工業(yè)上的物質(zhì)。燃料產(chǎn)品包括例如石油產(chǎn)品和石油的前體以及石化產(chǎn)品和其前體。燃料產(chǎn)品可被用于產(chǎn)生用在石化工業(yè)上的物質(zhì)或原料，其包括石油產(chǎn)品和石化產(chǎn)品。燃料或燃料產(chǎn)品可被用在燃燒室中，如鍋爐、窯爐、干燥器或熔爐。燃燒室的其它實(shí)例是內(nèi)部燃燒發(fā)動(dòng)機(jī)如車輛發(fā)動(dòng)機(jī)或發(fā)電機(jī)，其包括汽油發(fā)動(dòng)機(jī)、柴油發(fā)動(dòng)機(jī)、噴氣式發(fā)動(dòng)機(jī)和其它。燃料產(chǎn)品還可被用于生產(chǎn)塑料、樹(shù)脂、纖維、合成橡膠、潤(rùn)滑劑和凝膠。本文預(yù)期的產(chǎn)品的實(shí)例包括烴產(chǎn)品和烴衍生物產(chǎn)品。烴產(chǎn)品是只由氫分子和碳分子組成的產(chǎn)品。烴衍生物產(chǎn)品是具有一個(gè)或多個(gè)雜原子的烴產(chǎn)品，其中雜原子為不是氫或碳的任何原子。雜原子的實(shí)例包括但不限于氮、氧、硫和磷。一些產(chǎn)物是富含烴的，其中按重量計(jì)產(chǎn)物的至少50%、60%、70%、80%、90%或95%是由碳和氫組成。燃料產(chǎn)品如烴可以是通常從原油或石油得到的前體或產(chǎn)物，諸如但不限于液體石油氣、石腦油(輕石油)、汽油、煤油、煤油、柴油、潤(rùn)滑油、重瓦斯油、焦炭、浙青、焦油和蠟。例如，燃料產(chǎn)品可包括小烷烴(例如1個(gè)至大約4個(gè)碳)，如甲烷、乙烷、丙烷或丁烷，其可被用于加熱(如烹飪)或制備塑料。燃料產(chǎn)品還可包括具有大約5個(gè)至大約9個(gè)碳原子的碳鏈的分子，諸如石腦油或輕石油，或它們的前體。其它燃料產(chǎn)品可以為被用作汽油或發(fā)動(dòng)機(jī)燃料的大約5個(gè)至大約12個(gè)碳原子或環(huán)烷烴。大約10個(gè)至大約18個(gè)碳的分子和芳香烴如煤油、或其前體，也可以是燃料產(chǎn)品。燃料產(chǎn)品還可包括具有12個(gè)以上的碳的分子或它們的前體，諸如被用作潤(rùn)滑油。其它燃料產(chǎn)品包括重瓦斯油或燃料油或它們的前體，其一般包含大約20個(gè)至大約70個(gè)碳的烷烴、環(huán)烷烴和芳香烴。燃料產(chǎn)品還可包括來(lái)自原油的其它殘余產(chǎn)物，諸如焦炭、浙青、焦油和蠟，其一般包含大約70個(gè)或以上的碳的多個(gè)環(huán)，和它們的前體。宿主細(xì)胞和生物體可利用本文的載體和方法轉(zhuǎn)化的生物體的實(shí)例包括維管和非維管生物體。生物體可以是原核類或真核類。生物體可以是單細(xì)胞類或多細(xì)胞類。真核細(xì)胞諸如真菌細(xì)胞(如釀酒酵母、粟酒裂殖酵母或玉蜀黍黑粉菌可利用本發(fā)明的方法和組合物進(jìn)行轉(zhuǎn)化。在真菌/酵母細(xì)胞中引入核酸的方法在本領(lǐng)域中是熟知的。因此，這種步驟可通過(guò)傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)化方法完成。合適的方法的非限制性實(shí)例包括電穿孔、堿性陽(yáng)離子方案和原生質(zhì)球轉(zhuǎn)化。非維管光合生物體的實(shí)例包括苔蘚類植物，諸如葉苔門或角苔門。在一些情況中，生物體是藍(lán)細(xì)菌。在一些情況下，生物體是藻類(如宏觀藻類或微藻類)。藻類可以是單細(xì)胞或多細(xì)胞藻類。在一些情況下，生物體是紅藻門類、綠藻門類(chlorophyte)、不等鞭毛門類(heterokontophyte)、黃綠藻門類(tribophyte)、單鞭毛門類(glaucophyte)、絲足蟲(chóng)門類(chlorarachniophyte)、裸藻類(euglenoid)、隱藻類(haptophyte)、囊泡藻類(cryptomonad)、溝鞭藻類(dinoflagellum)或浮游植物。本發(fā)明的方法利用微藻類萊茵衣藻進(jìn)行舉例說(shuō)明。按照本發(fā)明的方法將微藻用于表達(dá)多肽或蛋白復(fù)合物提供下列優(yōu)點(diǎn)可以生長(zhǎng)大量微藻，其包括商業(yè)上可得到的(CyanotechCorp.；KaiIua-KonaHI)，因此允許生產(chǎn)以及如果期望的話分離大量期望的產(chǎn)物。然而，在任何植物的葉綠體中表達(dá)例如包括蛋白復(fù)合物在內(nèi)的功能多肽和/或修飾葉綠體或任何植物的能力允許生產(chǎn)這樣的植物作物，并且因此便利地產(chǎn)生大量多肽的能力。因此，本發(fā)明的方法可利用任何具有葉綠體的植物進(jìn)行實(shí)施，其包括，例如宏觀藻類，例如海生藻類和海草，以及生長(zhǎng)在土壤中的植物，例如玉米(Zeamays)、蕓苔屬(Brassicasp.)(如甘藍(lán)型油菜(B.napus)、白菜型油菜(B.rapa)、芥菜(B.jimcea))，尤其那些可用作種子_白勺IIM·禾中，(Medicagosativa)4S(Oryzasativa)(Secalecereale)>高梁(Sorghumbicolor、Sorghumvulgare)、粟(女口珍珠粟(Pennisetumglaucum)、泰稷(Panicummiliaceum)>SHH>(Setariaitalica)>^fcJTlI^(Eleusinecoracana))>(n|日葵(Helianthusannuus)、紅花(Carthamustinctorius)、小麥(Triticumaestivum)、大豆、(Glycinemax)、煙草(Nicotianatabacum)、土豆(Solanumtuberosum)、花生(Arachishypogaea)、棉花(海島棉(Gossypiumbarbadense)、陸地棉(Gossypiumhirsutum))、(Ipomoeabatatus)、L(Manihotesculenta)(Cofeaspp.)子(Cocosnucifera)、菠蘿(Ananascomosus)、柑桔樹(shù)(Citrusspp·)、可可(Theobromacacao)、茶(Camelliasinensis)、香蕉(Musaspp·)、魚萼梨(Perseaultilane)、無(wú)花果(Ficuscasica)、番石槽(Psidiumguajava)、芒果(Mangiferaindica)、橄欖(Oleaeuropaea)(Caricapapaya)、！(Anacardiumoccidentale)>^yjfl(Macadamiaintegrifolia)、杏豐對(duì)(Prunusamygdalus)、舌甘菜(Betavulgaris)、甘鹿(Saccharumspp.)、燕麥、浮萍(Lemna)、大麥、番爺(Lycopersiconesculentum)、萵苣(如Lactucasativa)>綠豆(Phaseolusvulgaris)、禾丨J馬豆(Phaseoluslimensis)、豆類(Lathyrusspp.)以及黃瓜屬的成員如黃瓜(C.sativus)、羅馬甜瓜(C.cantalupensis)和香瓜(C.melo)。也包括觀賞植物諸如杜鵑(Rhododendronspp.)、八仙花(Macrophyllahydrangea)、芙蓉(Hibiscusrosasanensis)、攻瑰(Rosaspp·)、郁金香(Tulipaspp.)、7jC仙花(Narcissusspp·)、ΜΨΨ^Ε(Petuniahybrida)>^Λβ(Dianthuscaryophyllus)>(Euphorbiapulcherrima)和菊花。用于實(shí)施本發(fā)明的另外的觀賞植物包括鳳仙花、秋海棠、天竺葵、堇菜、櫻草、馬鞭草、長(zhǎng)春花、萬(wàn)壽菊、櫻草、圣保羅花、藿香薊、莧、金魚草、耬斗菜、瓜菊、三葉草、波斯菊、豇豆、大麗花、曼陀羅、飛燕草、大丁草、劍蘭、大巖桐、孤挺花、松葉菊、喇叭舌草和魚尾菊。可用于實(shí)施本發(fā)明的針葉樹(shù)包括例如松樹(shù)諸如火炬松(Pinustaeda)、沼澤松(Pinuselliotii)、西黃豐公(Pinusponderosa)、黑豐公(Pinuscontorta)禾口$高身寸豐公(Pinusradiata)、花方萁松(Pseudotsugamenziesii)；力口洲鐵杉(Tsugaultilane)；云杉(Piceaglauca)；紅杉(Sequoiasempervirens)；冷杉諸如銀揪(Abiesamabilis)和香脂冷杉(Abiesbalsamea)；和雪松諸如西紅杉(Thujaplicata)和阿拉斯加黃檜(Chamaecyparisnootkatensis)。用于實(shí)施本發(fā)明方法的豆科植物包括豆形果實(shí)植物(beans)和豌豆屬植物(peas)。豆形果實(shí)植物包括瓜爾豆、角豆、胡蘆巴、黃豆、四季豆、豇豆、綠豆、利瑪豆、蠶豆、扁豆、鷹嘴豆等。豆科作物包括但不限于落花生屬，如花生；蠶豆屬，如小冠花、毛野豌豆、赤豆、綠豆和鷹嘴豆；羽扁豆屬，如羽扁豆；三葉草；菜豆屬如常見(jiàn)的豆和利馬豆；豌豆屬，如四季豆；草木樨屬，如三葉草；苜蓿屬，如紫花苜蓿；蓮屬，如車軸草；扁豆屬，如扁豆；和紫穗槐。用于本發(fā)明方法的優(yōu)選草料和草皮草包括紫花苜蓿、果園草、高羊茅、黑麥草、匍匐剪股穎和小糠草。用于本發(fā)明方法的其它植物包括阿拉伯樹(shù)膠、茴香、朝鮮薊、芝麻菜、黑莓、芥菜油、芫荽葉、小柑橘、菊苣、桉樹(shù)、茴香、葡萄柚、蜜汁、豆薯、獼猴桃、檸檬、酸橙、蘑菇、堅(jiān)果、黃秋葵、桔子、歐芹、柿子、車前草、石榴、白楊、輻射松、菊苣、南方松、楓香、橘子、黑小麥、葡萄樹(shù)、山藥、蘋果、梨、溫柏、櫻桃、杏樹(shù)、甜瓜、大麻、蕎麥、葡萄、木莓、藜屬、越桔、油桃、桃樹(shù)、李子、草莓、西瓜、茄子、胡椒、菜花；蕓苔，如椰菜、卷心菜、ultilansprouts、洋蔥、胡蘿卜、韭菜、甜菜、蠶豆、芹菜、蘿卜、南瓜、菊苣、葫蘆、大蒜、食莢菜豆、菠菜、南瓜、蕪菁、ultilane、菊苣、落花生和西葫蘆。因此，本文預(yù)期的組合包括宿主生物體，其包括上述核酸中任一種。宿主生物體可以是任何包含葉綠體的生物體。術(shù)語(yǔ)“植物”在本文廣泛地用于指包含質(zhì)體尤其葉綠體的真核生物并且包括任何生長(zhǎng)階段的這種生物體，或者指植物的部分，其包括植物插枝、植物細(xì)胞、植物細(xì)胞培養(yǎng)、植物器官、植物種子和小植物。植物細(xì)胞是植物的結(jié)構(gòu)和生理單元，其包括原生質(zhì)體和細(xì)胞壁。植物細(xì)胞可以是分離的單細(xì)胞或人工培養(yǎng)的細(xì)胞的形式，或者可以是高級(jí)組織單位的部分，例如植物組織、植物器官或植物。因此，植物細(xì)胞可以是原生質(zhì)體、配子產(chǎn)生細(xì)胞或可再生成整個(gè)植物的細(xì)胞或細(xì)胞集。同樣地，種子——其包括多個(gè)細(xì)胞并且能再生成整個(gè)植物——被認(rèn)為是用于本公開(kāi)內(nèi)容目的的植物細(xì)胞。植物組織或植物器官可以是種子、原生質(zhì)體、胼胝體或任何其它的被組織成結(jié)構(gòu)或功能單元的植物細(xì)胞集。特別有用的植物部分包括可收割部分以及用于后代植物繁殖的部分。植物的可收割部分可以是任何有用的植物部分，例如花、花粉、幼苗、塊莖、葉、莖、果實(shí)、種子、根等。用于后代繁殖的植物部分包括例如種子、果實(shí)、插枝、幼苗、塊莖、根莖等。真核宿主細(xì)胞可以是真菌細(xì)胞(如釀酒酵母、粟酒裂殖酵母或玉蜀黍黑粉菌)。原核宿主細(xì)胞的實(shí)例包括大腸桿菌和枯草芽孢桿菌、藍(lán)細(xì)菌和光合細(xì)菌(如集胞藻屬(Synechocystis)或聚球藻屬(Synechococcus)或節(jié)螺藻屬(Athrospira)的種)?？蔀樗拗魃矬w(或靶DNA源)的非維管植物的實(shí)例包括苔蘚類植物(bryophtyes)，諸如葉苔門(marchantiophytes)或角苔門(anthocerotophytes)。在一些情況下，生物體是藻類(如宏觀藻類、微觀藻類、萊茵衣藻、小球藻、杜氏鹽藻、雨生紅球藻、柵藻屬)。藻類可以是單細(xì)胞或多細(xì)胞藻類。在一些情況中，生物體是紅藻門類、綠藻門類、不等鞭毛門類、黃綠藻門類、單鞭毛門類、絲足蟲(chóng)門類、裸藻類、隱藻類、囊泡藻類、溝鞭藻類或浮游植物。在其它情況中，本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到，這些生物體僅僅作為實(shí)例給出并且可以用其它生物體替換，如果合適的陽(yáng)性和陰性選擇標(biāo)記是可得到的話。盡管為了清楚地理解前述發(fā)明已經(jīng)通過(guò)例證和實(shí)例的方式在一些細(xì)節(jié)上進(jìn)行了描述，但是對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員非常明顯的是，根據(jù)本發(fā)明的教導(dǎo)，可以對(duì)其進(jìn)行一定的變化和改變，而不脫離所附權(quán)利要求的精髓或范圍。實(shí)施例32實(shí)施例1:DNA提純和分析DNA按照本領(lǐng)域已知的方法進(jìn)行分離和分析。為了從萊茵衣藻制備DNA以用作PCR的模板，IO6個(gè)藻類細(xì)胞(來(lái)自瓊脂板或液體培養(yǎng)基)被懸浮在IOmMEDTA中并且加熱至95°C10分鐘，然后冷卻至接近23°C。該溶液被直接加入到PCR混合物中。為了從萊茵衣藻制備純化的葉綠體DNA，通過(guò)在3000Xg下離心過(guò)濾IOmin從液體培養(yǎng)基中收集5XIO8個(gè)藻類細(xì)胞，用水洗滌一次，在3000Xg下離心過(guò)濾lOmin，再懸浮于IOmL溶胞溶液(IOmMTrispH=8.O,IOmMEDTA,150mMNaCl,2%SDS，2%十二烷基肌酸鈉和25ug/mL鏈霉蛋白酶(Roche))并且在37°C下溫育1小時(shí)。裂解物然后用苯酚/氯仿逐漸萃取，接著兩次氯仿洗滌?？偟腄NA通過(guò)乙醇沉淀和再懸浮于再懸浮緩沖液(IOmMTrispH=7.4，ImMEDTA和0.lmg/mL核酶(RNase))中進(jìn)行分離。葉綠體DNA可通過(guò)向再懸浮的DNA中加入變性溶液(200mMNaOH和1%SDS(w/v))并且顛倒幾次進(jìn)行提純。加入中和溶液(3.OM醋酸鉀，pH=5.5)，混合，在冰上溫育IOmin并且在15000RPM下離心過(guò)濾30min。上清液被輕輕倒出并且施加到QIAGEN-tip500，并且DNA按照QIAGENPlasmidMaxiKit進(jìn)行分離。從萊茵衣藻制備純化的葉綠體DNA的可選方法涉及在低熔點(diǎn)的瓊脂糖塞中包埋藻類細(xì)胞或純化的葉綠體以防止DNA剪切。葉綠體通過(guò)下列步驟進(jìn)行分離在氮減壓室中裂解全細(xì)胞，和通過(guò)Percoll密度梯度離心將完整細(xì)胞和碎片與葉綠體分開(kāi)。為了裂解細(xì)胞和/或葉綠體，該塞在裂解緩沖液(0.5MEDTA、1%十二烷基肌酸鈉、0.2mg/mL蛋白酶K)中55°C下溫育36小時(shí)。當(dāng)裂解完全時(shí)，該塞用TE洗滌3次，然后在儲(chǔ)存緩沖液(IOmMTrisPH=7.4，ImMEDTA)中儲(chǔ)存。為了將葉綠體DNA釋放到溶液中，該塞用30mMNaCl洗滌3次，并且在65°C下熔化lOmin。熔化的塞被變溫至42°C并且用β瓊脂糖酶(NewEnglandBiolabs)處理1小時(shí)。DNA的溶液可被直接用于下游應(yīng)用或者經(jīng)乙醇沉淀以濃縮樣品。為了從酵母制備DNA以用作PCR的模板，IO6個(gè)藻類細(xì)胞(來(lái)自瓊脂板或液體培養(yǎng)基)被懸浮在裂解緩沖液(6mMKHP04,pH=7.5，6mMNaCl，3%甘油，lU/mL酵母裂解酶(zymolyase))中，并且加熱至37°C30min，95°C10分鐘，然后冷卻至接近23°C。該溶液被直接加入到PCR混合物中。為了從酵母中制備質(zhì)粒DNA，期望的克隆在選擇液體培養(yǎng)基(如CSM-Trp)中30°C下生長(zhǎng)至飽和。細(xì)胞通過(guò)在3000Xg下離心過(guò)濾IOmin進(jìn)行收集，并且再懸浮于150uL裂解緩沖液(1M山梨糖醇、0.IM檸檬酸鈉、0.06MEDTApH=7.OUOOmMβ-巰基乙醇和2.5mg/mL酵母裂解酶)。溶液在37°C下溫育1小時(shí)。加入300uL變性溶液(1%SDS和0.2NNaOH)并且溶液在60°C下溫育15min。加入150uL中和溶液(3M醋酸鉀，pH=4.8)并且溶液在冰上溫育lOmin。溶液在14，000RPM下離心過(guò)濾IOmin并且上清液被轉(zhuǎn)移至另一管中。加入ImL異丙醇，混合物被輕輕混合并且在14，000RPM下離心lOmin。沉淀物用ImL70%乙醇洗滌一次并且在14，000RPM下離心IOmin。DNA沉淀物被風(fēng)干并且再懸浮于60uL再懸浮緩沖液(IOmMTrispH=7.4，ImMEDTA和0.lmg/mL核酶)。為了從細(xì)菌中制備質(zhì)粒DNA，細(xì)胞在包含適當(dāng)抗生素(Kan或Amp)的LB中37°C下生長(zhǎng)至飽和。如果目標(biāo)DNA包含標(biāo)準(zhǔn)的復(fù)制元件，細(xì)胞就通過(guò)離心收獲。如果目標(biāo)DNA包含Pl復(fù)制元件，飽和的細(xì)胞培養(yǎng)基在LB+Kan+IPTG中以120稀釋并且在37°C下生長(zhǎng)4小時(shí)，然后收獲。采用PlasmidMaxikit(QIAGEN)從細(xì)胞沉淀物中制備質(zhì)粒DNA。為了例證性目的并且在沒(méi)有將本發(fā)明限于所述特定方法的前提下，從藻類、酵母或細(xì)菌中(在塞中或在溶液中)制備的DNA樣品通過(guò)脈沖場(chǎng)凝膠電泳(PFGE)進(jìn)行分析，或者用合適的限制酶(如SmaI)進(jìn)行消化并且通過(guò)PFGE——常規(guī)的瓊脂凝膠電泳——和/或DNA印跡法進(jìn)行分析。用于這些目的的標(biāo)準(zhǔn)程序被充分描述在Gemmill等(在由RamS.Verma編輯的"AdvancesinGenomeBiology",Vol.1,"UnfoldingTheGenome,“第217-251頁(yè))。技術(shù)人員將了解，本領(lǐng)域已知的許多其它方法可取代本文具體描述或參考的方法。實(shí)施例2轉(zhuǎn)化方法大腸桿菌菌株DHlOB或Genehog通過(guò)下列步驟制備成電感受態(tài)細(xì)胞使細(xì)胞生長(zhǎng)至0.7的0D_，然后收集并用冰冷的10%甘油洗滌兩次，在干冰乙醇浴中被速凍并且保持在-80°C。所有的酵母或藻類DNA在Bio-RadGenePulsarElectroporator中通過(guò)使用例如1，800V、200歐姆和25mF下的0.Icm比色杯制備并電穿孔到大腸桿菌中?；厥占?xì)胞，并且在包含一種或多種抗生素的瓊脂生長(zhǎng)培養(yǎng)基中選擇克隆，抗生素諸如卡那霉素(50ug/mL)、氨比西林(100ug/mL)、慶大霉素(50ug/mL)、四環(huán)素(51ug/mL)或氯霉素(34ug/mL)。酵母菌株YPH857、YPH858或AB1380可通過(guò)下列方法進(jìn)行轉(zhuǎn)化如Sheistl&Geitz(Curr.Genet.16339346,1989)禾口Sherman等，“LaboratoryCourseManualMethodsinYeastGenetics"(ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,1986)中描述的醋酸鋰方法，或原生質(zhì)球法諸如Sipiczki等，Curr.Microbiol.,12(3)169-173(1985)所述的方法。酵母轉(zhuǎn)化體在缺少氨基酸和/或核酸如色氨酸、亮氨酸或尿嘧啶的瓊脂培養(yǎng)基上進(jìn)行選擇和篩選。如Sherman等，同上所述，采用酵母生長(zhǎng)和表型測(cè)試的標(biāo)準(zhǔn)方法。藻類菌株cscl37c(mt+)，Wl.1或Wl-I可通過(guò)顆粒轟擊法進(jìn)行轉(zhuǎn)化。細(xì)胞在IOOrpm下旋轉(zhuǎn)振蕩器裝置上在450LuX的恒定照明下于23°C下在0.5mM5-氟脫氧尿苷(Gorman和Levine,Proc.Natl.Acad.Sci.，USA541665-1669，1965，其在本文中通過(guò)引用并入)的存在或不存在下于TAP培養(yǎng)基中生長(zhǎng)至后對(duì)數(shù)期(大約7天)。通過(guò)在4，OOOXg于23°C下離心過(guò)濾5min收獲50ml細(xì)胞。上清液被輕輕倒出并且細(xì)胞被再懸浮在4mlTAP培養(yǎng)基中，以隨后通過(guò)顆粒轟擊法進(jìn)行葉綠體轉(zhuǎn)化(Cohen等，同上，1998)。技術(shù)人員將了解，本領(lǐng)域已知的許多其它轉(zhuǎn)化方法可取代本文具體描述或參考的方法。^mm3-Mmmm^mmm^^mmmM在該實(shí)施例中，利用捕獲葉綠體DNA的雜合空位填補(bǔ)載體建立系統(tǒng)(圖1)。雜合空位填補(bǔ)載體骨架包含允許其作為酵母人工質(zhì)粒(YAP)起作用的酵母元件以及允許其作為質(zhì)粒人工染色體(PAC)起作用的細(xì)菌元件。酵母元件包括酵母選擇標(biāo)記序列(如TRPl或LEU2)、酵母著絲粒序列(CEN)和酵母自主復(fù)制核苷酸序列(ARS)。細(xì)菌元件包括Pl或細(xì)菌復(fù)制起點(diǎn)序列以及細(xì)菌選擇標(biāo)記序列(如Kanr)。為了操作雜合空位填補(bǔ)載體，產(chǎn)生了載體pDOCI(SEQIDNO.1)。pTRP_AU的部分(圖2)利用PCR引物對(duì)進(jìn)行擴(kuò)增，所述PCR引物對(duì)與包含TEL、ADE2和URA3的區(qū)域周圍的位點(diǎn)退火。一對(duì)擴(kuò)增位于酵母元件內(nèi)的區(qū)域(SEQIDNOs.21和22)并且另一對(duì)擴(kuò)增位于細(xì)菌元件內(nèi)的區(qū)域(SEQIDNOs.23和24)。PCR產(chǎn)物利用單一引物對(duì)通過(guò)PCR裝配被裝配成單一DNA片段(SEQIDNOs.21和24)。裝配的產(chǎn)物用NotI消化并被連接到NotI消化的pUC-SE(SEQIDNO.2)以形成pDOCI(SEQIDNO.1)。為了使雜合空位填補(bǔ)載體適于捕獲葉綠體DNA，產(chǎn)生載體pD0CI_10(SEQIDNO.3)。萊茵衣藻葉綠體基因組的部分利用對(duì)靠近psbD基因座(圖3;由方框所包圍的數(shù)字10指示)的兩個(gè)鄰近區(qū)域(SEQIDNOs.25和26以及SEQIDNOs.27和28)特異性的兩個(gè)引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。各個(gè)PCR產(chǎn)物用NotI和I-SceI消化并被連接到pDOCI(SEQIDNO.1)——其用I-SceI消化，以形成pDOCI-lO(SEQIDNO.3)。為了使pDOCI-lO在藻類中賦予抗生素抗性，選擇標(biāo)記被克隆。pSE-3HB-Kan(SEQIDNO.4)——其包含來(lái)自細(xì)菌的卡那霉素抗性編碼基因，其由來(lái)自萊茵衣藻的atpA基因的5，UTR和啟動(dòng)子序列以及來(lái)自萊茵衣藻的rbcL基因的3，UTR序列進(jìn)行調(diào)控——用SnaBI消化，其釋放卡那霉素抗性表達(dá)盒。該表達(dá)盒被連接到SnaBI消化的pD0CI-10以形成pD0CI-10-Kan(SEQIDΝ0·5)。用于捕獲葉綠體DNA的雜合空位填補(bǔ)載體——pTRP-IO-Kan(SEQIDN0.6)利用酵母中的重組進(jìn)行構(gòu)建(圖2)。簡(jiǎn)而言之，pD0CI-10-Kan用PacI和AscI消化以釋放將葉綠體基因組特異性元件引入雜合空位填補(bǔ)載體的表達(dá)盒。該表達(dá)盒與pTRP-AU—起利用醋酸鋰法轉(zhuǎn)化到酵母菌株YPH858中。同源重組在轉(zhuǎn)化的酵母細(xì)胞中體內(nèi)發(fā)生。與表達(dá)盒正確整合的轉(zhuǎn)化體基于在包含5-氟乳清酸(5-F0A)的CSM-Trp瓊脂培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)和通過(guò)紅色進(jìn)行分離。5-F0A選擇這樣的克隆，該克隆缺少功能性URA3基因，并且當(dāng)ADE2基因消除時(shí)紅色產(chǎn)生。質(zhì)粒DNA與酵母克隆分離，酵母克隆在CSM-Trp液體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)并且被轉(zhuǎn)化到大腸桿菌(DHlOB)。為了產(chǎn)生大量pTRP-10-Kan，包埋pTRP-10-Kan的DHlOB細(xì)胞在LB+Kan(50ug/mL)中37°C下生長(zhǎng)至飽和，然后在LB+Kan+IPTG中以120進(jìn)行稀釋并且在37°C下生長(zhǎng)4小時(shí)。DNA利用PlasmidMaxikit(QIAGEN)從細(xì)菌培養(yǎng)基中制備。載體的組成通過(guò)對(duì)整個(gè)質(zhì)粒進(jìn)行DNA測(cè)序被證實(shí)。實(shí)施例4在外源宿主中穩(wěn)定和/或修飾葉綠體基因組DNA的載體通常，異源DNA的大片段在宿主生物體如酵母或細(xì)菌中是不穩(wěn)定的。這可能由于多種因素，其包括但不限于毒性基因產(chǎn)物或密碼子偏好的存在和/或缺少選擇壓力。因此，穿梭載體內(nèi)的靶DNA可在酵母或細(xì)菌中進(jìn)行改變。例如，靶DNA序列的某些部分(如編碼區(qū)或啟動(dòng)子)可被刪除或者通過(guò)宿主生物體內(nèi)的重組而被移動(dòng)。在類似的方面，當(dāng)攜帶靶DNA的穿梭載體被轉(zhuǎn)移回提供靶DNA的生物體(或關(guān)系接近的物種)時(shí)，靶DNA可能變得不穩(wěn)定。這種不穩(wěn)定和易感序列的位點(diǎn)通過(guò)測(cè)定哪些基因組DNA的片段逃避捕獲或消失一段時(shí)間而容易發(fā)現(xiàn)。這些位點(diǎn)可通過(guò)將初始分離的空位填補(bǔ)靶DNA質(zhì)粒與從轉(zhuǎn)化菌株——其已經(jīng)在選擇質(zhì)粒編碼選擇標(biāo)記(如TRP1)存在的條件下在實(shí)驗(yàn)室中被順序傳代——中分離的質(zhì)粒比較或者通過(guò)與陰性靶DNA(如萊茵衣藻葉綠體DNA)比較進(jìn)行檢測(cè)。這樣的比較可通過(guò)例如限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(RFLP)分析或直接測(cè)序而進(jìn)行。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到，存在許多種其它測(cè)定這種差別的方案和方法。鑒別后，這些位點(diǎn)和序列可被迫在標(biāo)記的選擇中維持。圖4顯示選擇標(biāo)記在載體的多個(gè)克隆位點(diǎn)中的排列的實(shí)例。為了產(chǎn)生包含酵母和藻類穩(wěn)定元件的穩(wěn)定載體，在包含ADE2和URA3基因的PTrp-AU中的DNA區(qū)域通過(guò)用SfiI消化而釋放出來(lái)，接著凝膠提純期望的片段。該片段用Klenow片段進(jìn)行處理以產(chǎn)生鈍化末端并且被連接到PmlI消化的pSE-3HB_Str印(SEQIDNO.7)，產(chǎn)生pSE-3HB-Str印-AU(圖4B)。pSE-3HB-Strep是將來(lái)自細(xì)菌的鏈霉素抗性編碼基因——其由由來(lái)自萊茵衣藻的atpA基因的5’UTR和啟動(dòng)子序列以及來(lái)自萊茵衣藻的rbcL基因的3’UTR序列進(jìn)行調(diào)控一一靴向萊茵衣藻葉綠體基因組的3HB基因座的載體。為了產(chǎn)生靶向葉綠體基因組的其它區(qū)域的載體，SOO-IOOObp區(qū)域利用與圖3中編號(hào)圓圈所示位點(diǎn)兩翼的5’和3’區(qū)域退火的PCR引物對(duì)進(jìn)行擴(kuò)增(位點(diǎn)1-5’，SEQIDNOs.29和30；位點(diǎn)1-3，，SEQIDNOs.31和32；位點(diǎn)3-5，，SEQIDNOs.33和34；位點(diǎn)3-3，，SEQIDNOs.35和36；位點(diǎn)4-5，，SEQIDNOs.37和38；位點(diǎn)4-3，，SEQIDNOs.39和40；位點(diǎn)5-5',SEQIDNOs.41和42；位點(diǎn)5_3，，SEQIDNOs.43和44；以及位點(diǎn)7-5，，SEQIDNOs.45和46；位點(diǎn)7-3，，SEQIDNOs.47和48)。每對(duì)PCR產(chǎn)物用NotI和I-SceI消化，混合并連接到NotI消化的pUC-SE(SEQIDNO.2)；產(chǎn)生質(zhì)粒pUCl、pUC3、pUC4、pUC5和pUC7(以其整合位置命名)。構(gòu)建多個(gè)酵母選擇標(biāo)記對(duì)以便可同時(shí)利用多個(gè)穩(wěn)定位點(diǎn)(圖4B)。各個(gè)標(biāo)記對(duì)包含URA3基因(SEQIDNO.8)，其從pRS416進(jìn)行PCR擴(kuò)增。各個(gè)標(biāo)記對(duì)還包含從pRS415擴(kuò)增的LEU2基因(SEQIDNO.9)、從pRS413擴(kuò)增的HIS3基因(SEQIDNO.10)、從pTrp-AU擴(kuò)增的ADE2基因(SEQIDN0.11)、從釀酒酵母基因組DNA擴(kuò)增的LYS2基因(SEQIDN0.12)或者來(lái)自pFA6a-kanMX6的kanMX6基因(SEQIDN0.13)，其具賦予抗真菌劑G418抗性。URA3基因所用的引物將XmaI限制性位點(diǎn)添加到5’末端(SEQIDN0.49)以及將SalI和SacII添加到3，末端(SEQIDN0.50)。LEU2、HIS3、ADE2、LYS2和G418r基因所用引物將XmaI限制性位點(diǎn)添加至IJ5，末端(對(duì)于LEU2,SEQIDN0.51；對(duì)于HIS3,SEQIDN0.52；對(duì)于ADE2,SEQIDN0.53；對(duì)于LYS2，SEQIDNO.54；以及對(duì)于G418r，SEQIDNO.55)以及將SalI、FseI禾口SpeI位點(diǎn)添加到3，末端(對(duì)于LEU2，SEQIDNO.56；對(duì)于HIS3，SEQIDN0.57；對(duì)于ADE2，SEQIDN0.58；對(duì)于LYS2，SEQIDN0.59；以及對(duì)于G418r，SEQIDNO.60)。各個(gè)PCR產(chǎn)物用XmaI和SalI消化，成對(duì)地混合，并且被連接到期望的整合載體，產(chǎn)生pUCl_URA3/ADE2、pUC3-URA3/LEU2、pUC4-URA3/HIS3、pUC5-URA3/ADE2和pUC7_URA3/LYS2。URA3被用于各個(gè)情況中，因?yàn)樗试S陽(yáng)性和陰性選擇。標(biāo)記對(duì)可基于任一基因的選擇(在單個(gè)修飾的情況中)而引入，而在兩個(gè)或更多的修飾的情況中是非-URA3基因。然后標(biāo)記可通過(guò)引入具有與標(biāo)記對(duì)周圍的那些序列同源的末端序列的DNA以及選擇在包含5-F0A的基本培養(yǎng)基上生長(zhǎng)而被去除。為了提升細(xì)菌中的序列穩(wěn)定性，抗生素抗性標(biāo)記被克隆入酵母選擇標(biāo)記對(duì)。細(xì)菌穩(wěn)定性標(biāo)記包括但不限于從pET-21a擴(kuò)增的氨比西林抗性基因(Amp1^SEQIDN0.14)，從PBR322擴(kuò)增的四環(huán)素抗性基因(Tetlr,SEQIDN0.15)，從pETcoco-Ι擴(kuò)增的綠霉素抗性基因(Camr，SEQIDN0.16)，和從pJQ200擴(kuò)增的慶大霉素抗性基因(Gentr,SEQIDN0.17)。對(duì)于各個(gè)基因，將XmaI位點(diǎn)添加到5’和3’末端的引物對(duì)(對(duì)于Amp、SEQIDNOs.61和62；對(duì)于Tetr,SEQIDNOs.63和64；對(duì)于Camr,SEQIDNOs.65和66；以及對(duì)于Gentr,SEQIDNOs.67和68)被用于PCR擴(kuò)增抗生素抗性片段。各個(gè)PCR產(chǎn)物用XmaI消化并被連接成XmaI-消化的pUCl-URA3/ADE2、pUC3_URA3/LEU2、pUC4_URA3/HIS3、pUC5_URA3/ADE2和PUC7-URA3/LYS2。圖4C顯示酵母和細(xì)菌穩(wěn)定性標(biāo)記的排列。棚列5細(xì)錄·_帥弓丨入齡穩(wěn)、鴻體為了產(chǎn)生包含帶有或不帶有穩(wěn)定載體的雜合載體的萊茵衣藻葉綠體基因組，pTRP-IO-Kan和pSE-3HB_Str印-AU被轉(zhuǎn)化到藻類細(xì)胞。pTRP-10-Kan用NotI消化以使載體線性化，從而葉綠體靶向元件在各個(gè)末端(圖5)。pSE-3HB-Str印-AU作為環(huán)狀DNA被轉(zhuǎn)化。對(duì)于這些實(shí)驗(yàn)，所有的轉(zhuǎn)化都是在萊茵衣藻菌株137c(mt+)上進(jìn)行的。細(xì)胞在IOOrpm下旋轉(zhuǎn)振蕩器裝置上在450Lux的恒定照明下于23°C下在TAP培養(yǎng)基(Gorman和Levine,Proc.Natl.Acad.Sci.，USA54:1665_1669，1965，其在本文中通過(guò)引用并入)中在0.5mM5-氟脫氧尿苷存在下生長(zhǎng)至后對(duì)數(shù)期(大約7天)。通過(guò)在4，OOOXg于23°C下離心5min收獲50ml細(xì)胞。上清液被輕輕倒出并且細(xì)胞被再懸浮在4mlTAP培養(yǎng)基中，以隨后通過(guò)顆粒轟擊法進(jìn)行葉綠體轉(zhuǎn)化(Cohen等，同上，1998)。所有的轉(zhuǎn)化在卡那霉素選擇(100yg/ml)之下進(jìn)行，其中抗性由圖5中標(biāo)記為“Kan”的片段所編碼的基因賦予(ChlamydomonasStockCenter，DukeUniversity)0PCR被用于鑒別轉(zhuǎn)化的菌株。對(duì)于PCR分析，IO6個(gè)藻類細(xì)胞(來(lái)自瓊脂板或液體培養(yǎng)基)被懸浮在IOmMEDTA并且加熱至95°C10分鐘，然后冷卻至接近23°C。制備了PCR混合物，其由反應(yīng)緩沖液、MgCl2,dNTPs、PCR引物對(duì)(多對(duì))、DNA聚合酶和水組成。加入EDTA中的藻類裂解物以提供反應(yīng)模板。鎂濃度進(jìn)行改變以均衡所加入的藻類裂解物和EDTA的量和濃度。采用退火溫度梯度以測(cè)定特定引物對(duì)的最佳退火溫度。圖6顯示包含帶有或不帶pSE-3HB-Str印-AU的pTrp-10-Kan的分離藻類菌株的實(shí)例。整合pTRP-10-Kan的菌株利用擴(kuò)增載體骨架中不同區(qū)域的引物對(duì)(泳道1，SEQIDNOs.69和70；泳道2，SEQIDNOs.71和72；泳道3，SEQIDNOs.73和74；泳道4，SEQIDNOs.75和76；泳道5，SEQIDNOs.77和78；泳道6，SEQIDNOs.79和80；泳道7，SEQIDNOs.81和82；泳道8，SEQIDNOs.83和84；和泳道9，SEQIDNOs.85和86)或者橫跨PTrp-IO-KanDNA和葉綠體基因組DNA之間的連接的引物對(duì)(泳道10，SEQIDNOs.87和88；泳道11，SEQIDNOs.89和90)的任一一組進(jìn)行鑒定。為了鑒別具有整合的pSE-3HB-Str印-AU的菌株，使用引物對(duì)(SEQIDNOs.91and92)，其擴(kuò)增ADE2基因內(nèi)的區(qū)域。期望的克隆是產(chǎn)生期望大小的PCR產(chǎn)物的那些。實(shí)施例6將葉綠體基因組捕獲入外源宿主在該實(shí)施例中，萊茵衣藻葉綠體DNA采用上述標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)進(jìn)行分離。包含帶有或不帶pSE-3HB-Str印-AU的pTRP-10-Kan載體的萊茵衣藻葉綠體DNA被用于轉(zhuǎn)化細(xì)菌。電泳感受態(tài)大腸桿菌菌株DH10B或Genehog在帶有卡那霉素(50mg/l)的LB瓊脂生長(zhǎng)培養(yǎng)基上進(jìn)行轉(zhuǎn)化和選擇。來(lái)自單個(gè)克隆的DNA通過(guò)在帶有卡那霉素(50mg/l)的LB液體生長(zhǎng)培養(yǎng)基上37°C下使細(xì)胞生長(zhǎng)至飽和而進(jìn)行分離。標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞培養(yǎng)基在LB+Kan+IPTG中以120進(jìn)行稀釋并且在37°C下生長(zhǎng)4小時(shí)。PlasmidMaxikit(QIAGEN)被用于從分離的克隆中制備質(zhì)粒DNA。圖7A顯示與親本雜合載體(克隆C)相比較從細(xì)菌轉(zhuǎn)化得到的兩種克隆(克隆1和克隆2)的限制分析?？寺?和2由>IOOkb的DNA組成，而親本雜合載體由僅僅23kb的DNA組成，這證明大部分的DNA的確被雜合載體所捕獲。限制繪圖表明克隆1包括大約一半的線粒體基因組(圖8A)。雜合載體兩側(cè)區(qū)域的DNA測(cè)序表明，重組事件發(fā)生在萊茵衣藻卡那霉素抗性表達(dá)盒的3’UTR(其是來(lái)自萊茵衣藻中的rbcL基因的3’UTR)與萊茵衣藻鏈霉素抗性表達(dá)盒的3’UTR(其是來(lái)自萊茵衣藻中的rbcL基因的3’UTR)之間?？寺?保留了萊茵衣藻卡那霉素抗性表達(dá)盒，但丟失了萊茵衣藻鏈霉素抗性表達(dá)盒。限制繪圖表明，克隆2也包括大約一半的葉綠體基因組(圖8B)。然而，雜合載體兩側(cè)區(qū)域的DNA測(cè)序表明，不同的重組事件發(fā)生從而產(chǎn)生克隆2。萊茵衣藻卡那霉素抗性表達(dá)盒的5’UTR(其是來(lái)自萊茵衣藻中的atpA基因的5’UTR)與萊茵衣藻葉綠體基因組中atpA基因的5’UTR進(jìn)行重組，并且反向重復(fù)B(圖8中的IR-B)與反向重復(fù)A(圖8中的IR-A)進(jìn)行重組?？寺?丟失了萊茵衣藻卡那霉素抗性表達(dá)盒和萊茵衣藻鏈霉素抗性表達(dá)盒。為了證實(shí)雜合載體將支持酵母中穩(wěn)定的復(fù)制，克隆1通過(guò)醋酸鋰法被轉(zhuǎn)化到酵母菌株AB1380中，并且轉(zhuǎn)化體在CSM-Trp瓊脂培養(yǎng)基上進(jìn)行選擇。轉(zhuǎn)化體利用擴(kuò)增帶有克隆1的葉綠體基因組DNA的區(qū)域的引物對(duì)(SEQIDNOs97和98)進(jìn)行PCR篩選。期望克隆是產(chǎn)生期望大小的PCR產(chǎn)物的那些。單個(gè)PCR陽(yáng)性克隆被劃線以使每個(gè)分離物產(chǎn)生多個(gè)克隆。DNA從分離的酵母克隆制備并且被轉(zhuǎn)化到細(xì)菌。細(xì)菌利用擴(kuò)增在克隆1的葉綠體基因組DNA內(nèi)的區(qū)域的引物對(duì)(SEQIDNOs97和98)進(jìn)行PCR篩選。期望克隆是產(chǎn)生期望大小的PCR產(chǎn)物的那些。DNA從分離的細(xì)菌克隆中進(jìn)行制備并且通過(guò)用EcoRI限制消化進(jìn)行分析。圖7B顯示，所有分離的克隆具有與原始分離的克隆1相同的限制圖譜。因此，雜合載體支持酵母中穩(wěn)定的復(fù)制。為了測(cè)定捕獲的DNA是否的確是葉綠體基因組DNA。進(jìn)行DNA印跡。從細(xì)菌制備的克隆1和2用EcoRI進(jìn)行消化，通過(guò)凝膠電泳進(jìn)行分離，轉(zhuǎn)移到膜，并且用來(lái)自萊茵衣藻的放射性HindIII消化的總DNA進(jìn)行探測(cè)。圖7C顯示，克隆1和2中的DNA產(chǎn)生信號(hào)，因此表明捕獲的DNA是葉綠體基因組DNA。實(shí)施例7將葉綠體基因組DNA重新引入藻類對(duì)于這些實(shí)驗(yàn)，所有的轉(zhuǎn)化都是在任一萊茵衣藻菌株上進(jìn)行的W1.1，其表達(dá)來(lái)自內(nèi)源psbA基因座的SAA；或Wl-I，其表達(dá)來(lái)自內(nèi)源psbA基因座的LuxAB。Wl.1和Wl-I都對(duì)奇放線菌素具有抗性，這是由于P228的轉(zhuǎn)化，其在16SrRNA引入突變。細(xì)胞在IOOrpm下旋轉(zhuǎn)振蕩器裝置上在450Lux的恒定照明下于23°C下在TAP培養(yǎng)基(GormanandLevine,Proc.Natl.Acad.Sci.，USA541665-1669，1965，其在本文中通過(guò)引用并入)中生長(zhǎng)至后對(duì)數(shù)期(大約7天)。通過(guò)在4，OOOXg于23°C下離心5min收獲50ml細(xì)胞。上清液被輕輕倒出并且細(xì)胞被再懸浮在4mlHSM培養(yǎng)基中，以隨后通過(guò)顆粒轟擊法進(jìn)行葉綠體轉(zhuǎn)化(Cohen等，同上，1998)。所有的轉(zhuǎn)化都是在HSM瓊脂上進(jìn)行的。轉(zhuǎn)化體通過(guò)在HSM上生長(zhǎng)進(jìn)行選擇，其表明psbA基因基因座的功能被恢復(fù)。克隆也隨后在TAP、具有奇放線菌素的TAP(150μg/ml)、具有卡那霉素的TAP(100μg/ml)、HSM以及具有卡那霉素的HSM(100μg/ml)上進(jìn)行檢查其生長(zhǎng)。圖9表明，用克隆1轉(zhuǎn)化的Wl-I在所有的培養(yǎng)基類型上生長(zhǎng)。圖9也表明，用克隆2轉(zhuǎn)化的Wl-I不能在包含卡那霉素的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，其已被預(yù)料到，因?yàn)榭寺?不含Kan抗性標(biāo)記。實(shí)施例8葉綠體的修飾，用于產(chǎn)生生物質(zhì)降解酶為了修飾捕獲的葉綠體基因組DNA以產(chǎn)生木聚糖酶，藻類表達(dá)盒被克隆到實(shí)施例384中描述的酵母標(biāo)記載體。簡(jiǎn)而言之，萊茵衣藻葉綠體表達(dá)載體用SpeI進(jìn)行消化，以釋放來(lái)自里氏木霉(T.reesei)的具有木聚糖酶的DNA片段(SEQIDNO.18)，其由來(lái)自萊茵衣藻的PsbD基因的5’UTR和來(lái)自萊茵衣藻的psbA基因的3’UTR進(jìn)行調(diào)控。該片段用Klenow片段進(jìn)行處理以產(chǎn)生鈍化末端并且被克隆到pUCl-URA3/ADE2、pUC3_URA3/LEU2和pUC4_URA3/HIS3中酵母標(biāo)記之間的SmaI(XmaI)位點(diǎn)。圖IOA顯示新載體中不同元件的排列。葉綠體基因組DNA通過(guò)將修飾載體轉(zhuǎn)化到包埋捕獲的DNA的酵母而進(jìn)行修飾。對(duì)于轉(zhuǎn)化，所有修飾載體通過(guò)用NotI消化而線性化。包埋克隆1(來(lái)自實(shí)施例6)的酵母于30°C下在CSM-Trp培養(yǎng)基中生長(zhǎng)至飽和，然后在YPAD中以120進(jìn)行稀釋，并且在30°C下生長(zhǎng)4小時(shí)。酵母采用醋酸鋰法進(jìn)行轉(zhuǎn)化，并且通過(guò)在CSM-Ura培養(yǎng)基上生長(zhǎng)而對(duì)轉(zhuǎn)化體進(jìn)行選擇。轉(zhuǎn)化體在CSM-Trp-Ura培養(yǎng)基上進(jìn)行繁殖，然后利用對(duì)木聚糖酶表達(dá)盒(SEQIDNOs95和96)和葉綠體基因組DNA內(nèi)的區(qū)域(SEQIDNOs97和98)具有特異性的引物進(jìn)行PCR篩選。期望的克隆是對(duì)于兩個(gè)反應(yīng)給出期望大小的PCR產(chǎn)物的那些克隆。DNA從分離的酵母克隆中進(jìn)行制備并且被轉(zhuǎn)化到細(xì)菌。細(xì)菌利用對(duì)木聚糖酶表達(dá)盒(SEQIDNOs95和96)和葉綠體基因組DNA內(nèi)的區(qū)域(SEQIDNOs97和98)具有特異性的引物進(jìn)行PCR篩選。期望的克隆是對(duì)于兩個(gè)反應(yīng)給出期望大小的PCR產(chǎn)物的那些克隆。DNA從分離的細(xì)菌克隆中進(jìn)行制備并且通過(guò)用EcoRI限制消化而進(jìn)行分析。圖IOB顯示分離的是這樣的克隆，其具有與期望位置中木聚糖酶表達(dá)盒的整合相一致的限制圖譜。對(duì)于這些實(shí)驗(yàn)，所有的轉(zhuǎn)化都是在任一萊茵衣藻菌株上進(jìn)行的W1.1，其表達(dá)來(lái)自內(nèi)源psbA基因座的SAA；或W1-1，其表達(dá)來(lái)自內(nèi)源psbA基因座的LuxAB。Wl.1和W1-1都對(duì)奇放線菌素具有抗性，這是由于P228的轉(zhuǎn)化所致，其在16SrRNA中引入突變。細(xì)胞在IOOrpm下旋轉(zhuǎn)振蕩器裝置上在450Lux的恒定照明下于23°C下在TAP培養(yǎng)基(GormanandLevine,Proc.Natl.Acad.Sci.，USA54:1665_1669，1965，其在本文中通過(guò)引用并入)中生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期晚期(大約7天)。通過(guò)在4，OOOXg于23°C下離心5min收獲50ml細(xì)胞。上清液被輕輕倒出并且細(xì)胞被再懸浮在4mlHSM培養(yǎng)基中，以隨后通過(guò)顆粒轟擊法進(jìn)行葉綠體轉(zhuǎn)化(Cohen等，同上，1998)。所有的轉(zhuǎn)化都是在HSM瓊脂上進(jìn)行的。轉(zhuǎn)化體通過(guò)在HSM上生長(zhǎng)進(jìn)行選擇，其表明psbA基因基因座的功能被恢復(fù)。PCR被用于鑒別也包含內(nèi)切木聚糖酶表達(dá)盒的轉(zhuǎn)化體。對(duì)于PCR分析，IO6個(gè)藻類細(xì)胞(來(lái)自瓊脂板或液體培養(yǎng)基)被懸浮在IOmMEDTA并且加熱至95°C10分鐘，然后冷卻至接近23°C。制備了PCR混合物，其由反應(yīng)緩沖液、MgCl2、dNTPs、PCR引物對(duì)(多個(gè))(表2)、DNA聚合酶和水組成。加入EDTA中的藻類裂解物以提供反應(yīng)模板。改變鎂濃度以均衡所加入的藻類裂解物和EDTA的量和濃度。采用退火溫度梯度以測(cè)定特定引物對(duì)的最佳退火溫度。為了鑒別具有內(nèi)切木聚糖酶表達(dá)盒的菌株，利用了擴(kuò)增內(nèi)切木聚糖酶表達(dá)盒內(nèi)區(qū)域的引物對(duì)(SEQIDNOs95和96)。期望的克隆是產(chǎn)生期望大小的PCR產(chǎn)物的那些克隆。圖IlA顯示獲得了這樣的多種藻類菌株，其包含內(nèi)切木聚糖酶表達(dá)盒(PCR產(chǎn)物用星號(hào)表示)°為了測(cè)定功能木聚糖酶是否被表達(dá)，測(cè)定酶活性。來(lái)自包含卡那霉素的TAP瓊脂板(100ug/mL)的細(xì)胞塊(每塊大約2mg)被再懸浮在圓底96孔板(Corning)中的50ulpH4.8IOOmM醋酸鈉中。再懸浮細(xì)胞通過(guò)加入20ulBugBuster蛋白萃取劑(Novagen)進(jìn)行裂解并且在室溫下?lián)u動(dòng)5分鐘。細(xì)胞裂解物(50ul)被轉(zhuǎn)移到黑色96孔板上，并且所得細(xì)胞的葉綠體熒光在SpectraMaxM2微板閱讀器(分子裝置)上測(cè)量，其中激發(fā)波長(zhǎng)440nm和發(fā)射波長(zhǎng)740nm以及695nm截止過(guò)濾器。以RFUs(相對(duì)熒光單位)表示的測(cè)量的葉綠體信號(hào)被用于使木聚糖酶活性信號(hào)相對(duì)于向反應(yīng)中加入的生物質(zhì)的量規(guī)格化。葉綠體熒光測(cè)量后，加入木聚糖酶底物。EnzCheckUltra木聚糖酶底物(Invitrogen)以50ug/ml的濃度溶解在pH4.8的IOOmM醋酸鈉中，向微板中的每個(gè)孔中加入50ul底物。熒光信號(hào)在SpectraMaxM2微板閱讀器(分子裝置)上測(cè)量的，其中激發(fā)波長(zhǎng)360nm和發(fā)射波長(zhǎng)460nm，沒(méi)有截止過(guò)濾器并且該板室設(shè)置成42°C。熒光信號(hào)被測(cè)量15分鐘，并且酶流速用SoftmaxProv5.2(分子裝置)進(jìn)行計(jì)算。酶流速被記錄為RFU/分鐘。酶比活性被計(jì)算為毫RFU/分鐘/RFU葉綠體熒光。圖IlB顯示獲得了在位點(diǎn)1、3和4包含木聚糖酶表達(dá)盒的多個(gè)藻類菌株(參見(jiàn)圖3和10)，其產(chǎn)生功能木聚糖酶。實(shí)施例9修飾葉綠體基因組以產(chǎn)牛萜為了修飾用于產(chǎn)生FPP合酶的捕獲的葉綠體基因組DNA，藻類表達(dá)盒被克隆到實(shí)施例4中描述的酵母標(biāo)記載體。簡(jiǎn)單地，萊茵衣藻葉綠體表達(dá)載體用SpeI消化，以從原雞(G.galIus)釋放具有FPP合酶的DNA片段(SEQIDNO.19)，其由來(lái)自萊茵衣藻的psbD基因的5’UTR以及來(lái)自萊茵衣藻的psbA基因的3’UTR進(jìn)行調(diào)控。該片段用Klenow片段進(jìn)行處理以產(chǎn)生鈍化末端并且被克隆到pUCl-URA3/ADE2、pUC3_URA3/LEU2和pUC4_URA3/HIS3中酵母標(biāo)記之間的SmaI(XmaI)位點(diǎn)。圖IOA顯示新載體中不同元件的排列。葉綠體基因組DNA通過(guò)將修飾載體轉(zhuǎn)化到包埋捕獲的DNA的酵母而進(jìn)行修飾。對(duì)于轉(zhuǎn)化，所有修飾載體通過(guò)用NotI消化而線性化。包埋克隆1(來(lái)自實(shí)施例6)的酵母于30°C下在CSM-Trp培養(yǎng)基中生長(zhǎng)至飽和，然后在YPAD中以120進(jìn)行稀釋，并且在30°C下生長(zhǎng)4小時(shí)。酵母采用醋酸鋰法進(jìn)行轉(zhuǎn)化，并且通過(guò)在CSM-Ura培養(yǎng)基上生長(zhǎng)而對(duì)轉(zhuǎn)化體進(jìn)行選擇。轉(zhuǎn)化體在CSM-Trp-Ura培養(yǎng)基上進(jìn)行繁殖，然后利用對(duì)FPP合酶表達(dá)盒(SEQIDNOs95和99)和葉綠體基因組DNA內(nèi)的區(qū)域(SEQIDNOs97和98)具有特異性的引物進(jìn)行PCR篩選。期望的克隆是對(duì)于兩個(gè)反應(yīng)給出期望大小的PCR產(chǎn)物的那些克隆。DNA從分離的酵母克隆中進(jìn)行制備并且被轉(zhuǎn)化到細(xì)菌。細(xì)菌利用對(duì)FPP合酶表達(dá)盒(SEQIDNOs95和99)和葉綠體基因組DNA內(nèi)的區(qū)域(SEQIDNOs97和98)具有特異性的引物進(jìn)行PCR篩選。期望的克隆是對(duì)于兩個(gè)反應(yīng)給出期望大小的PCR產(chǎn)物的那些克隆。DNA從分離的細(xì)菌克隆中進(jìn)行制備并且通過(guò)限制消化而進(jìn)行分析。圖IOC顯示分離的是這樣的克隆，其具有與期望位置中FPP合酶表達(dá)盒的整合相一致的限制圖。對(duì)于這些實(shí)驗(yàn)，所有的轉(zhuǎn)化都是在任一萊茵衣藻菌株上進(jìn)行的W1.1，其表達(dá)來(lái)自內(nèi)源psbA基因座的SAA；或Wl-I，其表達(dá)來(lái)自內(nèi)源psbA基因座的LuxAB。Wl.1和Wl-I都對(duì)奇放線菌素具有抗性，這是由于P228的轉(zhuǎn)化所致，其在16SrRNA引入突變。細(xì)胞在IOOrpm下旋轉(zhuǎn)振蕩器裝置上在450Lux的恒定照明下于23°C下在TAP培養(yǎng)基(GormanandLevine,Proc.Natl.Acad.Sci.,USA54:1665_1669，1965，其在本文中通過(guò)引用并入)中生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期晚期(大約7天)。通過(guò)在4，OOOXg于23°C下離心5min收獲50ml細(xì)胞。上清液被輕輕倒出并且細(xì)胞被再懸浮在4mlHSM培養(yǎng)基中，以隨后通過(guò)顆粒轟擊法進(jìn)行葉綠體轉(zhuǎn)化(Cohen等，同上，1998)。所有的轉(zhuǎn)化都是在HSM瓊脂上進(jìn)行的。轉(zhuǎn)化體通過(guò)在HSM上生長(zhǎng)進(jìn)行鑒定，其表明psbA基因基因座的功能被恢復(fù)。PCR被用于鑒別也包含F(xiàn)PP合酶表達(dá)盒的轉(zhuǎn)化體。對(duì)于PCR分析，IO6個(gè)藻類細(xì)胞(來(lái)自瓊脂40板或液體培養(yǎng)基)被懸浮在IOmMEDTA中并且加熱至95°C10分鐘，然后冷卻至接近23°C。制備了PCR混合物，其由反應(yīng)緩沖液、MgCl2、dNTPs、PCR引物對(duì)(多個(gè)),DNA聚合酶和水組成。加入EDTA中的藻類裂解物以提供反應(yīng)模板。改變鎂濃度以均衡所加入的藻類裂解物和EDTA的量和濃度。采用退火溫度梯度以測(cè)定特定引物對(duì)的最佳退火溫度。為了鑒別具有FPP合酶表達(dá)盒的菌株，利用擴(kuò)增內(nèi)切木聚糖酶表達(dá)盒內(nèi)區(qū)域的引物對(duì)(SEQIDNOs95和96)。理想的克隆是產(chǎn)生期望大小的PCR產(chǎn)物的那些克隆。圖IlA顯示獲得了這樣的多種藻類菌株，其包含F(xiàn)PP合酶表達(dá)盒(圖12，PCR產(chǎn)物用星號(hào)表示)。實(shí)施例11空位填補(bǔ)部分葉綠體基因組在該實(shí)施例中，利用捕獲葉綠體DNA的雜合空位填補(bǔ)載體在酵母中通過(guò)重組建立系統(tǒng)(圖13)。為了使雜合空位填補(bǔ)載體適于捕獲葉綠體DNA，產(chǎn)生載體pD0CI-B5A10(SEQIDN0.20)。萊茵衣藻葉綠體基因組的部分利用對(duì)靠近psbD基因的區(qū)域(A10，SEQIDNOs.27和28)以及靠近psbH基因的區(qū)域(B5，SEQIDNOs.787和788)具有特異性的兩個(gè)引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。各個(gè)PCR產(chǎn)物用NotI和I-SceI消化并被連接到pDOCI(SEQIDNO.1)，其用I-SceI消化以形成pD0CI-B5A10(SEQIDN0.20)。用于捕獲葉綠體DNA的雜合空位填補(bǔ)載體PTRP-B5A10利用酵母中的重組進(jìn)行構(gòu)建。簡(jiǎn)而言之，pD0CI-B5A10(SEQIDNO.20)用PacI和AscI消化以釋放將葉綠體基因組特異性元件引入雜合空位填補(bǔ)載體的表達(dá)盒。該表達(dá)盒與pTRP-AU—起利用醋酸鋰法轉(zhuǎn)化到酵母菌株YPH858中。同源重組在轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞中體內(nèi)發(fā)生。與表達(dá)盒正確整合的轉(zhuǎn)化體基于在包含5-氟乳清酸(5-F0A)的CSM-Trp瓊脂培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)和通過(guò)紅色進(jìn)行分離。5-F0A選擇缺少功能URA3基因并且當(dāng)ADE2基因消除時(shí)紅色產(chǎn)生的克隆。質(zhì)粒DNA與酵母克隆進(jìn)行分離，酵母克隆在CSM-Trp液體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)并且被轉(zhuǎn)化到大腸桿菌(DHlOB)。為了產(chǎn)生大量pTRP-10-Kan，包埋在pTRP-10-Kan的DHlOB細(xì)胞在LB+Kan(50ug/mL)中37°C下生長(zhǎng)至飽和，然后在LB+Kan+IPTG中以120進(jìn)行稀釋并且在37°C下生長(zhǎng)4小時(shí)。DNA利用PlasmidMaxikit(QIAGEN)從細(xì)菌培養(yǎng)基中制備。期望基因組DNA通過(guò)利用空位填補(bǔ)載體中與靶基因組DNA的區(qū)域具有高度同源性的位點(diǎn)(圖13中由AlO和B5表示)進(jìn)行捕獲。線性化空位填補(bǔ)載體DNA和葉綠體基因組DNA被用于采用實(shí)施例2中所述的醋酸鋰法或原生質(zhì)球法來(lái)轉(zhuǎn)化釀酒酵母。同源重組在轉(zhuǎn)化的酵母細(xì)胞中體內(nèi)發(fā)生。一旦靶DNA通過(guò)同源重組被載體捕獲后，DNA可在酵母和細(xì)菌系統(tǒng)中被穩(wěn)定地復(fù)制。如圖1所示，空位填補(bǔ)載體包含選擇標(biāo)記TRP1。因此，酵母細(xì)胞在無(wú)色氨酸的培養(yǎng)基上鋪板以篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化體。對(duì)在無(wú)色氨酸培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)化菌株篩選出在空位填補(bǔ)質(zhì)粒中存在靶DNA插入物的菌株。這樣的篩選可通過(guò)本領(lǐng)域任何已知的方法，例如限制酶消化、PCR和/或凝膠電泳。酵母轉(zhuǎn)化體利用對(duì)葉綠體基因組DNA具有特異性的引物(SEQIDNOs97和98)通過(guò)PCR進(jìn)行篩選。期望克隆是產(chǎn)生期望大小的PCR產(chǎn)物的那些。DNA從分離的酵母克隆中進(jìn)行制備并且被轉(zhuǎn)化到細(xì)菌。細(xì)菌轉(zhuǎn)化體利用對(duì)葉綠體基因組DNA具有特異性的引物(SEQIDNOs97和98)進(jìn)行PCR篩選。期望克隆是產(chǎn)生期望大小的PCR產(chǎn)物的那些。DNA從分離的細(xì)菌克隆中進(jìn)行制備并且通過(guò)用EcoRI限制消化進(jìn)行分析。實(shí)施例12空位填補(bǔ)全葉綠體基因組在該實(shí)施例中，通過(guò)在酵母中重組利用捕獲葉綠體DNA的雜合空位填補(bǔ)載體建立41系統(tǒng)(圖14)。用于捕獲葉綠體DNA的雜合空位填補(bǔ)載體pTRP-10利用酵母中的重組進(jìn)行構(gòu)建。簡(jiǎn)而言之，PTRP-IO(在實(shí)施例3中描述，SEQIDNO.3)用PacI和AscI消化以釋放將葉綠體基因組特異性元件引入雜合空位填補(bǔ)載體的表達(dá)盒。該表達(dá)盒與pTRP-AU—起利用醋酸鋰法轉(zhuǎn)化到酵母菌株YPH858中。同源重組在轉(zhuǎn)化的酵母細(xì)胞中體內(nèi)發(fā)生。與表達(dá)盒正確整合的轉(zhuǎn)化體基于在包含5-氟乳清酸(5-F0A)的CSM-Trp瓊脂培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)和通過(guò)紅色進(jìn)行分離。5-F0A選擇缺少功能URA3基因并且當(dāng)ADE2基因消除時(shí)紅色產(chǎn)生的克隆。質(zhì)粒DNA從酵母克隆中分離，該酵母克隆在CSM-Trp液體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)并且被轉(zhuǎn)化到大腸桿菌(DHlOB)。為了產(chǎn)生大量pTRP-10-Kan，包埋pTRP-10-Kan的DHlOB細(xì)胞在LB+Kan(50ug/mL)中37°C下生長(zhǎng)至飽和，然后在LB+Kan+IPTG中以120進(jìn)行稀釋并且在37°C下生長(zhǎng)4小時(shí)。DNA利用PlasmidMaxikit(QIAGEN)從細(xì)菌培養(yǎng)基中制備。期望基因組DNA通過(guò)利用空位填補(bǔ)載體中與靶基因組DNA的區(qū)域具有高度同源性的位點(diǎn)(圖14中由AlO和BlO表示)進(jìn)行捕獲。線性化的空位填補(bǔ)載體DNA和葉綠體基因組DNA被用于采用實(shí)施例2中所述的醋酸鋰法或原生質(zhì)球法轉(zhuǎn)化釀酒酵母。同源重組在轉(zhuǎn)化的酵母細(xì)胞中體內(nèi)發(fā)生。一旦靶DNA通過(guò)同源重組被載體捕獲后，DNA可在酵母和細(xì)菌系統(tǒng)中被穩(wěn)定地復(fù)制。如圖1所示，空位填補(bǔ)載體包含選擇標(biāo)記TRP1。因此，酵母細(xì)胞在無(wú)色氨酸的培養(yǎng)基上鋪板以篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化體。對(duì)在無(wú)色氨酸培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)化菌株篩選出在空位填補(bǔ)質(zhì)粒中存在靶DNA插入物的菌株。這樣的篩選可通過(guò)本領(lǐng)域任何已知的方法，例如限制酶消化、PCR和/或凝膠電泳。酵母轉(zhuǎn)化體利用對(duì)葉綠體基因組DNA具有特異性的引物(SEQIDNOs89和90)通過(guò)PCR進(jìn)行篩選。期望克隆是產(chǎn)生期望大小的PCR產(chǎn)物的那些。DNA從分離的酵母克隆中進(jìn)行制備并且被轉(zhuǎn)化到細(xì)菌。細(xì)菌轉(zhuǎn)化體利用對(duì)葉綠體基因組DNA具有特異性的引物(SEQIDNOs89和90)進(jìn)行PCR篩選。期望克隆是產(chǎn)生期望大小的PCR產(chǎn)物的那些。DNA從分離的細(xì)菌克隆中進(jìn)行制備并且通過(guò)用EcoRI限制消化進(jìn)行分析。實(shí)施例13全部葉綠體基因組上的重裝配在一些情況下，葉綠體基因組可被分成不同的質(zhì)粒，其整體上包括基因組的全部(圖15)。在這種情況中，較小部分的捕獲可促進(jìn)基因組內(nèi)多個(gè)位置快速且復(fù)雜的修飾。葉綠體基因組片段然后進(jìn)行組合以重形成全部(以及也許修飾的)葉綠體基因組。在該實(shí)施例中，葉綠體被分在兩個(gè)載體之間。一個(gè)載體分別地由B5至AlO的葉綠體基因組DNA或者核苷酸76，400至176，500(根據(jù)從NCBI可得的序列，NC_005353)組成。該載體可通過(guò)實(shí)施例11中所述的方法獲得。另一載體分別地由BlO至A5的葉綠體基因組DNA或者核苷酸176，500至76，400(根據(jù)從NCBI可得的序列，NC_005353)組成。該載體與所述的克隆1相同，可通過(guò)實(shí)施例6中所述的方法獲得。兩個(gè)載體共享雜合載體序列并且可將其用作重組同源性區(qū)域。在該實(shí)施例中，重組事件將雜合載體序列插入在區(qū)域AlO和BlO之間(圖5)。然而，沒(méi)有足夠的同源性以促進(jìn)將區(qū)域AlO和BlO連接起來(lái)的重組(圖5)。因此，加入在與A5和B5同源的序列之間具有選擇標(biāo)記的第三載體。葉綠體基因組通過(guò)將所有的三種載體組合并且采用實(shí)施例2中所述的醋酸鋰法或原生質(zhì)球法轉(zhuǎn)化釀酒酵母進(jìn)行重裝配。同源重組發(fā)生在轉(zhuǎn)化的酵母細(xì)胞體內(nèi)。一旦靶DNA通過(guò)同源重組產(chǎn)生后，DNA可在酵母和細(xì)菌系統(tǒng)中被穩(wěn)定地復(fù)制。如圖15所示，第三載體包含選擇標(biāo)記URA3和ADE2。因此，酵母細(xì)胞在無(wú)色氨酸的培養(yǎng)基上鋪板以篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化體。對(duì)在無(wú)尿嘧啶和/或腺嘌呤培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)化菌株篩選出在空位填補(bǔ)質(zhì)粒中存在靶DNA插入物的菌株。這樣的篩選可通過(guò)本領(lǐng)域任何已知的方法，例如限制酶消化、PCR和/或凝膠電泳。酵母轉(zhuǎn)化體利用對(duì)葉綠體基因組DNA具有特異性的引物(SEQIDNOs89和90)通過(guò)PCR進(jìn)行篩選。期望克隆是產(chǎn)生期望大小的PCR產(chǎn)物的那些。DNA從分離的酵母克隆中進(jìn)行制備并且被轉(zhuǎn)化到細(xì)菌。細(xì)菌轉(zhuǎn)化體利用對(duì)葉綠體基因組DNA具有特異性的引物(SEQIDNOs89和90)進(jìn)行PCR篩選。期望克隆是產(chǎn)生期望大小的PCR產(chǎn)物的那些。DNA從分離的細(xì)菌克隆中進(jìn)行制備并且通過(guò)用EcoRI限制消化進(jìn)行分析。t施例14去除外源宿t中Π十綠體某因會(huì)目DNAK域的HH本和方法為了產(chǎn)生去除葉綠體基因組DNA區(qū)域的載體，800_1000bp的葉綠體DNA區(qū)域利用與圖4中所示位點(diǎn)兩翼的5’和3’區(qū)域退火的PCR引物對(duì)進(jìn)行擴(kuò)增(位點(diǎn)1-5’，SEQIDNOs.1079禾口1080；位點(diǎn)1-3，，SEQIDNOs.1125禾口1126；位點(diǎn)3-5，，SEQIDNOs.1083和1084；位點(diǎn)3-3，，SEQIDNOs.1129和1130；位點(diǎn)4-5，，SEQIDNOs.1087和1088；位點(diǎn)4-3，，SEQIDNOs.1133和1134；位點(diǎn)5-5，，SEQIDNOs.789和790；位點(diǎn)5-3，，SEQIDNOs.787和788；以及位點(diǎn)7-5，，SEQIDNOs.1091和1092；位點(diǎn)7-3，，SEQIDNOs.1089和1090)。來(lái)自不同位點(diǎn)的5’和3’區(qū)域的多對(duì)PCR產(chǎn)物用NotI和I-SceI消化，混合，并連接到NotI消化的pUC-SE(SEQIDNO.2)。多對(duì)酵母選擇標(biāo)記(實(shí)施例4中所述)利用SalI被克隆在5’和3’片段之間。葉綠體基因組DNA區(qū)域通過(guò)將缺失載體轉(zhuǎn)化到包埋捕獲的DNA的酵母中而去除。對(duì)于轉(zhuǎn)化，所有修飾載體通過(guò)用NotI消化而線性化。包埋期望克隆的酵母于30°C下在CSM-Trp培養(yǎng)基中生長(zhǎng)至飽和，然后在YPAD中以120進(jìn)行稀釋，并且在30°C下生長(zhǎng)4小時(shí)。酵母采用醋酸鋰法進(jìn)行轉(zhuǎn)化，并且通過(guò)在CSM-Ura培養(yǎng)基上生長(zhǎng)而對(duì)轉(zhuǎn)化體進(jìn)行選擇。轉(zhuǎn)化體在CSM-Trp-Ura培養(yǎng)基上進(jìn)行繁殖，然后利用對(duì)靶區(qū)域和沒(méi)有被缺失載體靶向的葉綠體基因組DNA區(qū)域具有特異性的引物進(jìn)行PCR篩選。期望的克隆是對(duì)于靶向區(qū)域沒(méi)有給出產(chǎn)物但對(duì)于未靶向區(qū)域給出期望大小的PCR產(chǎn)物的那些克隆。DNA從分離的酵母克隆中進(jìn)行制備并且被轉(zhuǎn)化到細(xì)菌。細(xì)菌利用對(duì)靶區(qū)域和沒(méi)有被缺失載體靶向的葉綠體基因組DNA區(qū)域具有特異性的引物進(jìn)行PCR篩選。期望的克隆是對(duì)于靶向區(qū)域沒(méi)有給出產(chǎn)物但對(duì)于未靶向區(qū)域給出期望大小的PCR產(chǎn)物的那些克隆。DNA從分離的細(xì)菌克隆中進(jìn)行制備并且通過(guò)限制消化而進(jìn)行分析。本文可應(yīng)用的各種修飾、方法以及許多結(jié)構(gòu)將是明顯的。盡管應(yīng)當(dāng)理解任何特定的理解、看法、理論、潛在的假設(shè)和/或工作或預(yù)期實(shí)施例不是限制性的，但是各個(gè)方面、特征或?qū)嵤┓绞娇赡芤呀?jīng)就理解、看法、理論、潛在的假設(shè)和/或工作或預(yù)期實(shí)施例進(jìn)行了解釋或描述。盡管各個(gè)方面和特征已經(jīng)就本文的各個(gè)實(shí)施方式和具體實(shí)施例進(jìn)行了描述，但是應(yīng)當(dāng)理解其任何一個(gè)對(duì)所附權(quán)利要求或可與本申請(qǐng)相關(guān)的其它權(quán)利要求的全部范圍沒(méi)有限制性。權(quán)利要求分離的載體，其包括(a)酵母元件；(b)細(xì)菌復(fù)制起點(diǎn)；和(c)至少20kb來(lái)自光合生物體的基因組DNA。2.權(quán)利要求1的載體，其中所述酵母元件是酵母著絲粒、酵母自主復(fù)制序列或其組合。3.權(quán)利要求1的載體，其中所述生物體是非維管光合生物體。4.權(quán)利要求3的載體，其中所述生物體選自宏觀藻類、微觀藻類、小球藻(Ch.vulgaris)、萊茵衣藻(C.reinhardtii)、杜氏鹽藻(D.salina)、四尾柵藻(S.quadricanda)或雨生紅球藻(H.pluvalis)。5.權(quán)利要求1的載體，其中所述基因組DNA被修飾。6.權(quán)利要求5的載體，其中所述修飾是異源或同源多核苷酸的插入、一個(gè)或多個(gè)核酸堿基的缺失、一個(gè)或多個(gè)核酸堿基的突變、一個(gè)或多個(gè)多核苷酸的重排或其組合。7.權(quán)利要求5的載體，其中所述修飾是合成的。8.權(quán)利要求4的載體，其中所述載體在宿主細(xì)胞中的表達(dá)產(chǎn)生所述宿主細(xì)胞不自然產(chǎn)生的產(chǎn)物。9.權(quán)利要求7的載體，其中所述產(chǎn)物是生物質(zhì)降解酶、脂肪酸、萜或類萜。10.權(quán)利要求5的載體，其中所述載體的表達(dá)導(dǎo)致由所述宿主細(xì)胞自然產(chǎn)生的產(chǎn)物產(chǎn)量增加。11.權(quán)利要求10的載體，其中所述產(chǎn)物是生物質(zhì)降解酶、脂肪酸、萜或類萜。12.權(quán)利要求1的載體，其進(jìn)一步包括一個(gè)或多個(gè)選擇標(biāo)記。13.權(quán)利要求12的載體，其中所述選擇標(biāo)記選自酵母營(yíng)養(yǎng)缺陷型標(biāo)記、酵母抗生素抗性標(biāo)記、細(xì)菌營(yíng)養(yǎng)缺陷型標(biāo)記、細(xì)菌抗生素抗性標(biāo)記、藻類營(yíng)養(yǎng)缺陷型標(biāo)記、藻類抗生素抗性標(biāo)記或其組合。14.權(quán)利要求1的載體，其中所述葉綠體基因組DNA包括10-200個(gè)基因。15.權(quán)利要求1的載體，其中所述葉綠體基因組DNA包括所有必需葉綠體基因。16.權(quán)利要求1的載體，其中所述葉綠體基因組DNA包括30-400kb。17.宿主細(xì)胞，其包括權(quán)利要求1的載體。18.權(quán)利要求17的宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞是自然非光合的。19.權(quán)利要求17的宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞是自然光合的。20.權(quán)利要求17的宿主細(xì)胞，其中所述細(xì)胞來(lái)自選自下列的生物體釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、大腸桿菌(Escherichiacoli)、宏觀藻類、微觀藻類、小球藻(Ch.vulgaris)、萊茵衣藻(C.reinhardtii)、杜氏鹽藻(D.salina)、四尾柵藻(S.quadricanda)S^M^fetESjc^(H·ρIuveiIis)。21.產(chǎn)生載體的方法，其包括(a)將包含靶向DNA的多核苷酸插入載體中，其中所述載體包括酵母著絲粒、酵母自主復(fù)制序列和細(xì)菌復(fù)制起點(diǎn)；(b)用所述載體轉(zhuǎn)化生物體；和(c)捕獲一部分葉綠體基因組，由此產(chǎn)生具有一部分葉綠體基因組的載體。22.權(quán)利要求21的方法，其中所述靶向DNA是葉綠體基因組DNA。23.權(quán)利要求21的方法，其中所述部分長(zhǎng)度為10-400kb。24.權(quán)利要求21的方法，其中所述捕獲步驟通過(guò)重組發(fā)生。225.權(quán)利要求24的方法，其中所述部分的葉綠體基因組與所述載體共同轉(zhuǎn)化入所述生物體。26.權(quán)利要求24的方法，其中所述重組發(fā)生在體內(nèi)。27.權(quán)利要求21的方法，其中所述生物體是真核生物體。28.權(quán)利要求21的方法，其中所述生物體是光合生物體。29.權(quán)利要求21的方法，其中所述生物體是非維管光合生物體。30.權(quán)利要求29的方法，其中所述生物體選自宏觀藻類、微觀藻類、小球藻、萊茵衣藻、杜氏鹽藻、四尾柵藻或雨生紅球藻。31.權(quán)利要求21的方法，其中所述生物體是非光合的。32.權(quán)利要求31的方法，其中所述生物體是酵母。33.權(quán)利要求32的方法，其中所述酵母包含外源葉綠體DNA。34.權(quán)利要求21的方法，其進(jìn)一步包含修飾所述部分的葉綠體基因組。35.權(quán)利要求34的方法，其中所述修飾步驟包括同源重組。36.權(quán)利要求34的方法，其中所述重組發(fā)生在生物體中。37.權(quán)利要求36的方法，其中所述生物體是真核生物體。38.權(quán)利要求37的方法，其中所述生物體是光合生物體。39.權(quán)利要求38的方法，其中所述生物體是非維管光合生物體。40.權(quán)利要求39的方法，其中所述生物體選自宏觀藻類、微觀藻類、小球藻、萊茵衣藻、杜氏鹽藻、四尾柵藻或雨生紅球藻。41.權(quán)利要求36的方法，其中所述生物體是非光合生物體。42.權(quán)利要求41的方法，其中所述生物體是酵母。43.權(quán)利要求34的方法，其中所述修飾步驟包括多核苷酸的插入、一個(gè)或多個(gè)核酸堿基的缺失、一個(gè)或多個(gè)核酸堿基的突變、多核苷酸的重排或其組合。44.分離的載體，其包括必需葉綠體基因、選擇標(biāo)記以及所述載體中一個(gè)或多個(gè)核酸中的操作。45.權(quán)利要求44的載體，其中所述必需葉綠體基因克隆自非維管光合生物體。46.權(quán)利要求45的載體，其中所述生物體選自宏觀藻類、微觀藻類、小球藻、萊茵衣藻、杜氏鹽藻、四尾柵藻或雨生紅球藻。47.權(quán)利要求44的載體，其中所述必需葉綠體基因是合成的。48.權(quán)利要求44的載體，其進(jìn)一步包括表達(dá)盒。49.權(quán)利要求48的載體，其中所述表達(dá)盒進(jìn)一步包括整合入靶DNA的區(qū)域。50.權(quán)利要求49的載體，其中所述靶DNA是細(xì)胞器DNA51.權(quán)利要求44的載體，其進(jìn)一步包括一個(gè)或多個(gè)選擇標(biāo)記。52.權(quán)利要求51的載體，其中所述選擇標(biāo)記選自營(yíng)養(yǎng)缺陷型標(biāo)記、抗生素抗性標(biāo)記、葉綠體標(biāo)記或其組合。53.權(quán)利要求44的載體，其中所述必需葉綠體基因是葉綠體功能、光合作用、碳固定、產(chǎn)生一種或多種烴或其組合所必需的那些。54.權(quán)利要求44的載體，其中所述必需葉綠體基因包括高達(dá)200個(gè)基因。55.權(quán)利要求44的載體，其中所述必需葉綠體基因由高達(dá)400kb組成。56.權(quán)利要求44的載體，其中所述操作包括添加、缺失、突變或重排。57.權(quán)利要求44的載體，其中所述載體在宿主細(xì)胞中的表達(dá)產(chǎn)生所述宿主細(xì)胞不自然產(chǎn)生的產(chǎn)物。58.權(quán)利要求44的載體，其中所述載體的表達(dá)導(dǎo)致由所述宿主細(xì)胞自然產(chǎn)生的產(chǎn)物產(chǎn)量增加。59.權(quán)利要求57或58的載體，其中所述產(chǎn)物是生物質(zhì)降解酶、脂肪酸、萜或類萜。60.分離的葉綠體，其包括權(quán)利要求44的載體。61.宿主細(xì)胞，其包括權(quán)利要求44的載體。62.權(quán)利要求61的宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞是自然非光合的。63.權(quán)利要求61的宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞是自然光合的。64.權(quán)利要求61的宿主細(xì)胞，其中所述細(xì)胞來(lái)自選自下列的生物體釀酒酵母、大腸桿菌、宏觀藻類、微觀藻類、小球藻、萊茵衣藻、杜氏鹽藻、四尾柵藻或雨生紅球藻。65.轉(zhuǎn)化細(xì)胞或生物體的方法，其包括將載體插入所述細(xì)胞或生物體，所述載體包括所有必需葉綠體基因和任選地在所述細(xì)胞或生物體中非自然存在的一個(gè)或多個(gè)基因。66.權(quán)利要求65的方法，其進(jìn)一步包括消除所述細(xì)胞或生物體中基本所有的葉綠體基因組的步驟。67.權(quán)利要求65的方法，其中所述細(xì)胞或生物體是自然非光合的。68.權(quán)利要求65的方法，其中所述細(xì)胞或生物體是自然光合的。69.權(quán)利要求65的方法，其中所述細(xì)胞或生物體是真核的。70.權(quán)利要求65的方法，其中所述生物體是非維管的。71.權(quán)利要求65的方法，其中所述載體進(jìn)一步包括表達(dá)盒。72.權(quán)利要求71的方法，其中所述表達(dá)盒整合入非核DNA。73.權(quán)利要求65的方法，其中所述在所述細(xì)胞或生物體中非自然存在的一個(gè)或多個(gè)基因是類異戊二烯途徑、MVA途徑或MEP途徑中的基因。74.權(quán)利要求65的方法，其中所述必需葉綠體基因是葉綠體功能、光合作用、碳固定、產(chǎn)生一種或多種烴或其組合所必需的那些。75.修飾生物體的方法，其包括用包括足以進(jìn)行葉綠體功能的一個(gè)或多個(gè)多核苷酸的載體轉(zhuǎn)化所述生物體。76.權(quán)利要求75的方法，其中所述載體進(jìn)一步包括用于從所述生物體生產(chǎn)或分泌化合物的序列。77.權(quán)利要求76的方法，其中所述化合物是類異戊二烯。78.權(quán)利要求75的方法，其中所述載體包括所有必需葉綠體基因。79.權(quán)利要求78的方法，其中所述必需葉綠體基因被重排或突變。80.權(quán)利要求75的方法，其中所述生物體在轉(zhuǎn)化前基本上不包含葉綠體基因組。81.從生物體制備產(chǎn)物的方法，其包括用載體轉(zhuǎn)化所述生物體，所述載體包括至少20kb的基因組DNA和下列中一個(gè)或多個(gè)(i)所述生物體中非自然存在的基因；(ii)所述生物體中自然存在的基因中的缺失；(iii)所述生物體中自然存在的基因的重排；和(iv)所述生物體中自然存在的基因中的突變。82.權(quán)利要求81的方法，其中所述生物體是自然光合的。83.權(quán)利要求81的方法，其中所述另外的基因在類異戊二烯途徑、MVA途徑或MEP途徑中。84.轉(zhuǎn)化細(xì)胞或生物體的方法，其包括向所述細(xì)胞或生物體插入葉綠體以及包括所有必需葉綠體基因的載體。85.生產(chǎn)人工葉綠體基因組的方法，其包括下列步驟(a)提供包含一個(gè)或多個(gè)必需葉綠體基因的載體；(b)向所述載體添加DNA片段；(c)用步驟(b)所產(chǎn)生的載體轉(zhuǎn)化細(xì)胞或生物體；和(d)測(cè)定在所述添加的DNA片段存在下葉綠體功能是否存在。86.權(quán)利要求85的方法，其中所述添加的DNA片段包括類異戊二烯、MVA或MEP途徑中的酶的一個(gè)或多個(gè)編碼區(qū)域。87.穿梭載體，其包括葉綠體基因組。88.權(quán)利要求87的穿梭載體，其中所述葉綠體基因組被修飾。89.載體，其包括分離的功能葉綠體基因組。90.權(quán)利要求89的載體，其中所述葉綠體基因組被修飾。91.生產(chǎn)人工葉綠體基因組的方法，其包括下列步驟(a)提供包括所有必需葉綠體基因的載體；和(b)去除、添加、突變或重排所述葉綠體基因組中的DNA。92.權(quán)利要求91的方法，其可進(jìn)一步包括下列步驟(c)將編輯的基因組轉(zhuǎn)化入宿主生物體；和(d)在所述宿主生物體中測(cè)定葉綠體功能。93.權(quán)利要求92的方法，其中步驟(b)、(c)和(d)被重復(fù)。94.權(quán)利要求91的方法，其中所述葉綠體基因組來(lái)自選自下列的生物體宏觀藻類、微觀藻類、小球藻、萊茵衣藻、杜氏鹽藻、四尾柵藻或雨生紅球藻。95.權(quán)利要求92的方法，其中所述宿主生物體選自宏觀藻類、微觀藻類、小球藻、萊茵衣藻、杜氏鹽藻、四尾柵藻或雨生紅球藻。96.權(quán)利要求91的方法，其進(jìn)一步包括從所述葉綠體基因組去除多余DNA的步驟。97.權(quán)利要求91的方法，其中所述載體包括所有或基本上所有的葉綠體基因組。98.權(quán)利要求91的方法，其中所述葉綠體基因組克隆自光合生物體。99.權(quán)利要求91的方法，其中所述葉綠體基因組是合成的葉綠體基因組。100.權(quán)利要求91的方法，其中所述載體進(jìn)一步包括所述宿主生物體中非自然存在的基因。101.權(quán)利要求100的方法，其中所述基因是來(lái)自類異戊二烯途徑、MVA途徑或MEP途徑的基因。102.生產(chǎn)人工葉綠體基因組的方法，其包括下列步驟(a)提供包括全部葉綠體基因組的載體；(b)刪除所述全部葉綠體基因組的一部分；和(c)測(cè)定在沒(méi)有所述刪除的部分的情況下葉綠體功能是否存在。103.組合物，其包括分離的功能葉綠體基因組。104.權(quán)利要求103的組合物，其進(jìn)一步包括對(duì)所述葉綠體基因組的修飾。105.離體載體，其包括(a)核酸，所述核酸包括至少大約10%的葉綠體基因組；以及(b)對(duì)所述載體中一個(gè)或多個(gè)核酸的操作。106.權(quán)利要求105的載體，其中所述核酸克隆自非維管光合生物體。107.權(quán)利要求106的載體，其中所述生物體選自宏觀藻類、微觀藻類、小球藻、萊茵衣藻、杜氏鹽藻、四尾柵藻或雨生紅球藻。108.權(quán)利要求105的載體，其中所述核酸是合成的。109.權(quán)利要求105的載體，其進(jìn)一步包括表達(dá)盒。110.權(quán)利要求109的載體，其中所述表達(dá)盒進(jìn)一步包括整合入靶DNA的區(qū)域。111.權(quán)利要求110的載體，其中所述靶DNA是細(xì)胞器DNA。112.權(quán)利要求105的載體，其進(jìn)一步包括一種或多種選擇標(biāo)記。113.權(quán)利要求112的載體，其中所述選擇標(biāo)記選自營(yíng)養(yǎng)缺陷型標(biāo)記、抗生素抗性標(biāo)記、葉綠體標(biāo)記或其組合。114.權(quán)利要求105的載體，其中所述操作包括添加、缺失、突變或重排。115.權(quán)利要求105的載體，其中所述載體的表達(dá)產(chǎn)生所述宿主細(xì)胞不自然產(chǎn)生的產(chǎn)物。116.權(quán)利要求105的載體，其中所述載體的表達(dá)導(dǎo)致由所述宿主細(xì)胞自然產(chǎn)生的產(chǎn)物產(chǎn)量增加。117.權(quán)利要求115或116的載體，其中所述產(chǎn)物是萜、類萜、脂肪酸或生物質(zhì)降解酶。118.離體載體，其包括(a)核酸，所述核酸包括至少大約20千對(duì)堿基的葉綠體基因組；以及(b)對(duì)所述載體中一個(gè)或多個(gè)核酸的操作。119.權(quán)利要求118的載體，其中所述核酸克隆自非維管光合生物體。120.權(quán)利要求119的載體，其中所述生物體選自宏觀藻類、微觀藻類、小球藻、萊茵衣藻、杜氏鹽藻、四尾柵藻或雨生紅球藻。121.權(quán)利要求118的載體，其中所述核酸是合成的。122.權(quán)利要求118的載體，其進(jìn)一步包括表達(dá)盒。123.權(quán)利要求122的載體，其中所述表達(dá)盒進(jìn)一步包括整合入靶DNA的區(qū)域。124.權(quán)利要求123的載體，其中所述靶DNA是細(xì)胞器DNA。125.權(quán)利要求118的載體，其進(jìn)一步包括一種或多種選擇標(biāo)記。126.權(quán)利要求125的載體，其中所述選擇標(biāo)記選自營(yíng)養(yǎng)缺陷型標(biāo)記、抗生素抗性標(biāo)記、葉綠體標(biāo)記或其組合。127.權(quán)利要求118的載體，其中所述操作包括添加、缺失、突變或重排。128.權(quán)利要求118的載體，其中所述載體的表達(dá)產(chǎn)生所述宿主細(xì)胞不自然產(chǎn)生的產(chǎn)物。129.權(quán)利要求118的載體，其中所述載體的表達(dá)導(dǎo)致由所述宿主細(xì)胞自然產(chǎn)生的產(chǎn)物產(chǎn)量增加。130.權(quán)利要求128或129的載體，其中所述產(chǎn)物是萜、類萜、脂肪酸或生物質(zhì)降解酶。131.產(chǎn)生包括重構(gòu)基因組的載體的方法，其包括(a)將兩個(gè)或多個(gè)載體引入到宿主細(xì)胞，其中所述載體包括基因組的片段；(b)將所述載體重組到包括至少大約90%基因組的單個(gè)載體，由此產(chǎn)生包括重構(gòu)基因組的載體。132.權(quán)利要求145的方法，其中所述宿主細(xì)胞是真核的。133.權(quán)利要求145的方法，其中所述宿主細(xì)胞是釀酒酵母。134.權(quán)利要求145的方法，其中所述基因組是細(xì)胞器基因組。135.權(quán)利要求148的方法，其中所述細(xì)胞器是葉綠體。136.權(quán)利要求145的方法，其中所述葉綠體是藻類葉綠體。137.權(quán)利要求150的方法，其中所述藻類是微藻類。138.權(quán)利要求151的方法，其中所述微藻類是小球藻、萊茵衣藻、杜氏鹽藻、四尾柵藻或雨生紅球藻。139.權(quán)利要求145的方法，其中至少一個(gè)所述載體包括選擇標(biāo)記。140.權(quán)利要求145的方法，其中至少一個(gè)所述片段是合成的。141.權(quán)利要求145的方法，其進(jìn)一步包括修飾所述基因組的一部分。142.權(quán)利要求145的方法，其中所述修飾包括添加、缺失、突變或重排。143.權(quán)利要求145的方法，其中所述修飾是外源核酸的添加，其導(dǎo)致萜、類萜、脂肪酸或生物質(zhì)降解酶的產(chǎn)生或產(chǎn)量增加。全文摘要基因的功能分析經(jīng)常需要操作大基因組區(qū)域。描述了酵母-細(xì)菌穿梭載體，其可被用于通過(guò)同源重組克隆DNA的大區(qū)域。還描述了分離包括葉綠體基因組在內(nèi)的整個(gè)基因組或其大部分的方法及其操作方法。還描述了確定最小基因組、最小途徑需求和最小細(xì)胞器基因組的方法。文檔編號(hào)C07H21/04GK101939423SQ200880109773公開(kāi)日2011年1月5日申請(qǐng)日期2008年10月6日優(yōu)先權(quán)日2007年10月5日發(fā)明者B·奧奈爾,K·米克爾森,M·門德斯申請(qǐng)人:藍(lán)寶石能源公司