專利名稱：炎性腸病的診斷、分期和監(jiān)測(cè)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及炎性腸病的診斷、分期和監(jiān)測(cè)。
背景技術(shù)：
炎性腸病(IBD)包括克羅恩病(CD)和潰瘍性結(jié)腸炎(UC)，二者均導(dǎo)致腸道長期損傷。最近將微觀結(jié)腸炎、膠原性結(jié)腸炎和淋巴細(xì)胞性結(jié)腸炎也包括在IBD中。外部抗原、免 疫反應(yīng)受損和遺傳因素的組合看來是IBD致病因素，但引起腸道炎癥的機(jī)制尚不清楚(1)。 迄今為止，業(yè)已提出了許多潛在的抗原，例如源自腸道CMV感染(2)和持久麻疹病毒感染的抗原。引流腸道內(nèi)含物的腸系膜淋巴結(jié)最有可能是IBD中引發(fā)和維持炎癥的關(guān)鍵病灶。 觸發(fā)炎癥的抗原從腸壁主動(dòng)輸送到淋巴結(jié)從而呈遞到免疫系統(tǒng)(1，4)?，F(xiàn)已開發(fā)了技術(shù)鑒 定引流腸道病理學(xué)區(qū)域的第一淋巴結(jié)并在手術(shù)期間收集這些淋巴結(jié)(5)。本發(fā)明公開的構(gòu) 建試驗(yàn)?zāi)芨鶕?jù)細(xì)胞表面標(biāo)記表達(dá)和mRNA表達(dá)陣列狀況測(cè)定來描述不同的IBD診斷和分期。 這些模式與腸道炎癥的類型和活動(dòng)有關(guān)，因此可用于對(duì)疾病活動(dòng)(包括對(duì)治療的反應(yīng))進(jìn) 行診斷、分期和監(jiān)測(cè)。在瑞典，每年診斷到1400例新IBD病人。新診斷的病人數(shù)量最近數(shù)年有所增加。 IBD發(fā)病率峰值出現(xiàn)在20歲(6，7)。腸道是復(fù)雜的微環(huán)境，免疫活性細(xì)胞在其間遭遇各種 內(nèi)源性和外源性因子。這些相互作用產(chǎn)生了由固有層中T細(xì)胞豐度反映的持續(xù)、低級(jí)炎癥 (8)。T細(xì)胞不停準(zhǔn)備抵御有害病原體，但它們忽視無害的飲食抗原或正常寄居細(xì)菌群落的 成員。當(dāng)腸道免疫系統(tǒng)中耐受性和反應(yīng)之間的平衡被打破時(shí)，即可導(dǎo)致IBD。⑶和UC是IBD的兩種主要形式。在⑶中，腸的任何部分可受影響，但最常見的是 影響回腸盲腸區(qū)域(50% )和結(jié)腸(30% )。約三分之一的患者還伴有肛周疾病。小腸的 幾個(gè)短區(qū)段可能受影響，常稱為跳躍病損。在組織病理學(xué)上，炎癥是透壁的；在最多約60% 的患者中觀察到淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的密集浸潤以及肉芽腫。UC通常涉及直腸，并向近端 延伸，所述延伸在各患者之間有所不同；然而，該疾病常局限于結(jié)腸。當(dāng)炎癥還涉及結(jié)腸右 曲(right colonic flexure)時(shí)，利用術(shù)語“總結(jié)腸”。在微觀上，粘膜炎癥是淺表的，并富 含淋巴細(xì)胞和粒細(xì)胞。潰瘍和隱窩膿腫是常見的(1)。除了長期炎癥的癥狀，例如腹瀉(常 含血)、營養(yǎng)不良、發(fā)熱和疼痛外，患者還長期具有產(chǎn)生上皮異常增殖和最終發(fā)展成腸道癌 癥的風(fēng)險(xiǎn)(9)。約15%的IBD患者的結(jié)腸炎不確定，因此，不能作出⑶或UC的確切診斷。 更重要的是，對(duì)患有爆發(fā)性結(jié)腸炎(fulminant colitis)的患者的診斷常不確定。當(dāng)要決 定是否立即醫(yī)學(xué)治療和需要長期前瞻，決定最佳外科手術(shù)治療時(shí)，正確的診斷至關(guān)重要。⑶ 中的外科手術(shù)治療包括切除發(fā)炎區(qū)段，通過結(jié)構(gòu)成形術(shù)(strictureplasties)治療狹窄， 受影響區(qū)段的結(jié)腸切除或者嚴(yán)重結(jié)腸炎情況中的全結(jié)腸切除術(shù)和回腸造口術(shù)。CD的重建外 科手術(shù)常是回腸直腸吻合術(shù)以恢復(fù)腸道連續(xù)性。較少選擇骨盆袋(pelvic pouch)，因?yàn)樵?回腸直腸吻合術(shù)區(qū)域中瘺管形成相關(guān)的并發(fā)癥風(fēng)險(xiǎn)高。一些患者最終要進(jìn)行永久性回腸造 口術(shù)。常通過結(jié)腸切除術(shù)和回腸造口術(shù)作為急診手術(shù)來治療UC導(dǎo)致嚴(yán)重結(jié)腸炎的患者。6 個(gè)月后，可選擇回腸直腸吻合術(shù)或骨盆袋作為確定的外科手術(shù)治療，但在一些病例中，永久性回腸造口術(shù)可能是唯一的可行方案。幾種證據(jù)暗示⑶是正常腸道菌群耐受性破壞所致。在人中，業(yè)已證明患者固有層 中單核的細(xì)胞對(duì)自體糞便提取物起反應(yīng)，而在正常對(duì)照中不是這樣(10)。在⑶患者淋巴細(xì) 胞對(duì)自體腸道細(xì)菌超聲波處理物的體外增殖的觀察中明顯看出T細(xì)胞刺激對(duì)抗原的依賴 性，其中抗-MHCII類抗體抑制了所述增殖(11)。對(duì)于UC，微環(huán)境的作用不大清楚，考慮到 對(duì)免疫球蛋白(IgG)的依賴性、與自身免疫疾病，例如硬化性膽管炎的相關(guān)性、自身抗體的 頻率和結(jié)腸粘膜特異性，炎癥看來是基于自身免疫-樣發(fā)病機(jī)理(12)。據(jù)假設(shè)，針對(duì)腸的免 疫反應(yīng)可能是調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的抑制作用不足所致(1，4，10)。
活性UC的特征在于活化粒細(xì)胞和單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞浸潤入結(jié)腸粘膜。這些浸 潤性細(xì)胞是促炎細(xì)胞因子的主要來源。IBD患者可能對(duì)醫(yī)學(xué)治療產(chǎn)生耐受性。原因可能是 粒細(xì)胞、細(xì)胞因子的分布或免疫細(xì)胞的功能特征，包括類固醇受體表達(dá)的改變。目前，IBD的診斷和分期是基于臨床參數(shù)(白蛋白、SR、CRP、發(fā)熱、排便量)的組合 以及內(nèi)窺鏡檢查標(biāo)準(zhǔn)和組織病理學(xué)變化。通過顯微術(shù)評(píng)估炎癥活性，但只考慮活檢中存在 的細(xì)胞的總體類型和數(shù)量。活動(dòng)特征未作測(cè)定。發(fā)明目的本發(fā)明的目的是提供能區(qū)分活動(dòng)性和非活動(dòng)性炎性腸病(IBD)的方法。本發(fā)明的另一目的是提供能區(qū)分IBD患者的克羅恩病(CD)和潰瘍性結(jié)腸炎(UC) 的診斷方法。本發(fā)明還有一目的是提供能區(qū)分不確定結(jié)腸炎患者的克羅恩病和潰瘍性結(jié)腸炎 的方法。通過研究發(fā)明概述、附圖中顯示的其優(yōu)選實(shí)施方式和隨附的權(quán)利要求書可以明白 本發(fā)明的其它目的。發(fā)明概述本發(fā)明是基于觀察到腸抗原通過粘膜樹突細(xì)胞連續(xù)轉(zhuǎn)運(yùn)至區(qū)域性腸系膜淋巴結(jié)。 在該過程中，調(diào)節(jié)性T細(xì)胞可在調(diào)節(jié)效應(yīng)T細(xì)胞中起到關(guān)鍵作用，從而能防止對(duì)正?？乖?反應(yīng)。在動(dòng)物模型中，可區(qū)分效應(yīng)T細(xì)胞反應(yīng)的兩種不同途徑。第一類免疫啟動(dòng)是由 活化的1型T輔助細(xì)胞(Thl)驅(qū)動(dòng)，其特征在于產(chǎn)生了細(xì)胞因子，例如IL-12、IFN-Y和 TNF-α。炎性部位主要是巨噬細(xì)胞和細(xì)胞毒性效應(yīng)T細(xì)胞(⑶8+)的細(xì)胞介導(dǎo)浸潤。該類 炎癥類似于CD中的病損。在2型T輔助細(xì)胞(Th2)免疫活化中，體液免疫防御系統(tǒng)(免疫 球蛋白)與炎性部位所見的細(xì)胞毒性T細(xì)胞和細(xì)胞因子，例如IL-4和IL-5以及IgGl聯(lián)合 起重要作用。在動(dòng)物模型中，Th 2型炎癥與人UC具有共同的特征。本發(fā)明公開了通過對(duì)發(fā)炎組織的活檢樣品的分離單細(xì)胞進(jìn)行多色流式細(xì)胞術(shù)來 區(qū)分IBD患者中的克羅恩病和潰瘍性結(jié)腸炎的方法。測(cè)定活化標(biāo)記和細(xì)胞因子產(chǎn)生能高精 確地測(cè)定局部免疫反應(yīng)的狀態(tài)。本發(fā)明方法還可用于對(duì)IBD-患者進(jìn)行分期并評(píng)估治療。本發(fā)明的第一優(yōu)選方面提供了測(cè)定人中是否存在的IBD的方法，所述方法包括提 供懷疑患病的遠(yuǎn)端回腸或結(jié)腸粘膜或引流所述遠(yuǎn)端回腸或結(jié)腸粘膜的警戒淋巴結(jié)的活檢 樣品，測(cè)定表達(dá)⑶69活化標(biāo)記的⑶4T細(xì)胞數(shù)量，和比較所述⑶4T細(xì)胞的數(shù)量與從健康人 和具有活動(dòng)性或非活動(dòng)性狀態(tài)IBD的人獲得的相應(yīng)T細(xì)胞的數(shù)量。
本發(fā)明的第二優(yōu)選方面提供區(qū)分IBD患者的潰瘍性結(jié)腸炎和克羅恩病的方法。該方法包括提供患病腸粘膜或引流這種粘膜的警戒淋巴結(jié)的活檢樣品，測(cè)定由活化的1型T 輔助細(xì)胞(Thl)驅(qū)動(dòng)，在免疫活化中產(chǎn)生的一種或多種細(xì)胞因子(表示CD)和由活化的2型 T輔助細(xì)胞(Th2)驅(qū)動(dòng)，在免疫活化中產(chǎn)生的一種或多種細(xì)胞因子(表示UC)，并比較Thl 和Th2細(xì)胞因子的數(shù)量與通常在患有明確CD和/或UC的患者中發(fā)現(xiàn)的數(shù)量。優(yōu)選的Thl 細(xì)胞因子包括IL-12、IFN-γ和TNF-α，特別是IFN-γ。優(yōu)選的Th2細(xì)胞因子包括IL-4和 IL-5，特別是IL-4。在該方法中，還優(yōu)選獨(dú)立或額外測(cè)定IgGl作為克羅恩病的標(biāo)記。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選方面，采用來自IBD活檢的免疫細(xì)胞的mRNA表達(dá)狀況測(cè)定(13) 對(duì)IBD進(jìn)行診斷、分期、治療并監(jiān)測(cè)IBD的治療。本發(fā)明進(jìn)一步的優(yōu)選方面公開了測(cè)定IBD患者對(duì)類固醇治療敏感性的方法，包括 測(cè)定從所述患者獲得的CD4+T輔助細(xì)胞中的糖皮質(zhì)激素受體表達(dá)。在本申請(qǐng)中，“分期”涉及測(cè)定IBD中的活動(dòng)期、炎癥嚴(yán)重程度、炎癥類型等，而“監(jiān) 測(cè)”涉及監(jiān)測(cè)患者中IBD的發(fā)展。在附圖(包括多幅圖)所示優(yōu)選實(shí)施方式的以下描述和隨附權(quán)利要求書中公開了 本發(fā)明進(jìn)一步優(yōu)選的方面。附圖簡(jiǎn)述下文將參考在附圖中顯示的多個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式更詳細(xì)地解釋本發(fā)明，在附圖中

圖1顯示了采用流式細(xì)胞術(shù)和抗⑶4以及活化標(biāo)記⑶69的抗體研究活動(dòng)或非活 動(dòng)性UC患者和健康對(duì)照的活檢的單細(xì)胞懸液，⑶4+細(xì)胞上的平均熒光強(qiáng)度見y_軸。圖2涉及在流式細(xì)胞術(shù)(FACS)研究的健康對(duì)照，活動(dòng)性和非活動(dòng)性UC患者和非 活動(dòng)性⑶患者的活檢中觀察到的活化⑶69+⑶4+T細(xì)胞百分比。圖3是將疾病不同期患者的IBD評(píng)分與FACS研究活檢中活化⑶69+⑶4+T細(xì)胞百 分比相關(guān)性的圖。圖4顯示引流⑶患者的炎性區(qū)域的非警戒淋巴結(jié)、警戒淋巴結(jié)1和警戒淋巴結(jié)2 的培養(yǎng)上清液中IFN-Y的產(chǎn)量。圖5顯示引流UC患者的炎性區(qū)域的非警戒淋巴結(jié)(NSLN)和警戒淋巴結(jié)(SLN)的 培養(yǎng)上清液中IL-4的產(chǎn)量。圖6顯示了對(duì)糖皮質(zhì)激素治療無反應(yīng)IBD患者的CD4+T輔助細(xì)胞中糖皮質(zhì)激素受 體胞內(nèi)水平的表達(dá)降低。圖7顯示活動(dòng)性⑶患者腸道的⑶4+T輔助細(xì)胞中Tbet表達(dá)增加，而非活動(dòng)期Tbet 表達(dá)較低。圖8顯示活動(dòng)性⑶患者腸道的⑶4+T輔助細(xì)胞中Tbet表達(dá)增加，而非活動(dòng)期Tbet 表達(dá)較低。此外，與活動(dòng)性⑶中觀察到的Tbet表達(dá)相比，UC患者的⑶4+T輔助細(xì)胞中Tbet 表達(dá)較低。圖9顯示活動(dòng)性UC患者腸道的⑶4+T輔助細(xì)胞中GATA-3表達(dá)增加，而非活動(dòng)期 GATA-3表達(dá)較低。發(fā)明詳述材料與方法從新鮮活檢材料制備單細(xì)胞懸液。聯(lián)用FITC、PE、PerCp, APC偶聯(lián)物與用作對(duì)照的4種同種型抗體，利用直接標(biāo)記的熒光抗體⑶4、⑶8、⑶69、⑶25、⑶14、⑶9、⑶66b、⑶19 實(shí)施流式細(xì)胞術(shù)(FACS)。在CD和UC中，利用注射在炎癥區(qū)域周圍的示蹤物質(zhì)佩德特藍(lán) (Patent Blue)進(jìn)行比較分析來鑒定引流發(fā)炎腸道和未受影響正常腸道的警戒淋巴結(jié)。還 收集各患者的靜脈血液樣品。采用夾心ELISA(研發(fā)系統(tǒng)公司(R&D systems))分析活檢或警戒淋巴結(jié)的單細(xì)胞 培養(yǎng)上清液的細(xì)胞因子IL-4和IFN- γ。依次利用小鼠抗人糖皮質(zhì)激素受體抗體和抗_小鼠IgG FITC偶連的檢測(cè)抗體分析皂苷透化處理單細(xì)胞的糖皮質(zhì)激素受體表達(dá)。利用英杰公司的TRIZOL試劑(Invitrogen，目錄號(hào)15596-026)從單細(xì)胞懸液分 離RNA0按照生產(chǎn)商的方案利用iScript cDNA合成試劑盒，反轉(zhuǎn)錄酶反應(yīng)中包含每份樣品 IOOng RNA。利用 2X IQTMSYBR 綠色超混合物(Green Supermix)，以 iCyclerlQ進(jìn)行定量 PCR0利用生物輻射公司(BIO-RAD) WiCycler IQ 光學(xué)系統(tǒng)軟件，3. 1版本(iCyclerlQ Optical System SoftwareVersion 3. 1，BIO-RAD)獲得周期閾值。采用方法按照 RPII標(biāo)準(zhǔn)化表達(dá)水平?；蛘撸瑢?duì)分離的RNA進(jìn)行cDNA合成、FAM標(biāo)記，隨后利用埃飛基質(zhì)人 陣列芯片(Affymetrix human array chip)進(jìn)行分析。引物序列QT-PCR IFNy QT 正向GCAGGTCATTCAGATGTAGCGGIFNy QT 反向TGTCTTCCTTGATGGTCTCCACACIL-4 QT 正向CACAACTGAGAAGGGAAACCTTCTGIL-4 QT 反向 CTCTCTCATGATCGTCTTTAGCCTTTCτ-bet QT 正向 CACTACAGGATGTTTGTGGACGTGτ-bet QT 反向 CCCCTTGTTGTTTGTGAGCTTTAGGATA3 QT 正向 AACTGTCAGACCACCACAACCACACGATA3 QT 反向 GGATGCCTTCCTTCTTCATAGTCAGG實(shí)施例1粘膜或引流IBD影響區(qū)域的警戒淋巴結(jié)中免疫細(xì)胞的研究.通過流式細(xì)胞術(shù)研 究粘膜或引流IBD影響區(qū)域的警戒淋巴結(jié)中的免疫細(xì)胞證明與健康對(duì)照相比，活動(dòng)性IBD 患者中⑶4+T輔助細(xì)胞(圖1)和⑶8+細(xì)胞毒性T細(xì)胞的活化標(biāo)記⑶69表達(dá)明顯增加(ρ < 0. 009)。然而，非活動(dòng)性IBD患者(適格病理學(xué)家的判斷)顯示除活化標(biāo)記⑶69的表達(dá) 增加外，⑶4+T細(xì)胞活化顯著增加(ρ < 0. 03)(圖1)。與健康對(duì)照和報(bào)道的非活動(dòng)性IBD 患者相比，在潰瘍性結(jié)腸炎和克羅恩病中，活動(dòng)性IBD患者中⑶4+⑶69+T細(xì)胞數(shù)量也增加。實(shí)施例2患者的IBD評(píng)分與流式細(xì)胞術(shù)狀況的相關(guān)性.圖3顯示了患者的IBD評(píng)分，包括 S-白蛋白、CRP和含血糞便數(shù)量/天以及流式細(xì)胞術(shù)狀況。表達(dá)⑶69活化標(biāo)記的⑶4+T細(xì) 胞數(shù)量與IBD評(píng)分相關(guān)(SE0指數(shù))。利用SEO-指數(shù)將結(jié)果與疾病活動(dòng)性相關(guān)聯(lián)。該指數(shù)利用臨床(排便頻率和便 血)和實(shí)驗(yàn)室參數(shù)(Hb、白蛋白和紅細(xì)胞沉降率)。在我們的材料中，紅細(xì)胞沉降率替換成 CRP(C-反應(yīng)活性蛋白)。實(shí)施例3
⑶和UC中引流腸道病損區(qū)域的警戒淋巴結(jié)中和引流未受影響區(qū)段的淋巴結(jié)中的 免疫反應(yīng).目前將CD中的免疫反應(yīng)視作Thl反應(yīng)，而UC可能類似于非典型的Th2活化。該 觀點(diǎn)看來主要依據(jù)通過人工手段刺激結(jié)腸炎的動(dòng)物模型。在人中，IBD炎性途徑的表征受 限；結(jié)腸的灌注研究以及外周血細(xì)胞分析支持動(dòng)物模型的一些觀察結(jié)果，但對(duì)病理生理學(xué) 特性的總體描述不完全。按照本發(fā)明測(cè)定CD和UC中引流腸道病損區(qū)域的警戒淋巴結(jié)中和 引流未受影響區(qū)段的淋巴結(jié)中的免疫反應(yīng)和細(xì)胞因子模式提示細(xì)胞因子的釋放可用于CD 和UC診斷。采用流行的標(biāo)準(zhǔn)，認(rèn)為15%的IBD患者具有不確定的結(jié)腸炎，即不能作出明確診 斷。然而，正確診斷對(duì)于決定進(jìn)一步的治療至關(guān)重要。在爆發(fā)性結(jié)腸炎中，還經(jīng)常不能區(qū)分 CD和UC，從而可能延誤充分的醫(yī)學(xué)治療而必須采用結(jié)腸切除術(shù)進(jìn)行早期外科手術(shù)干預(yù)?，F(xiàn) 已在⑶患者的胃腸炎性部位鑒定到大量IFN- Y (圖4)。相反，現(xiàn)已在UC患者的胃腸炎性 部位發(fā)現(xiàn)大量Th2細(xì)胞因子IL-4(圖5)。這些發(fā)現(xiàn)能將胃腸活檢樣品中IFN-Y的高含量 與CD相關(guān)聯(lián)，將IL-4的高產(chǎn)量與UC相關(guān)聯(lián)。這些標(biāo)記還能在常難以作出正確診斷的爆發(fā) 性結(jié)腸炎中區(qū)分CD和UC。可利用從腸道活檢獲得的信息提供早期正確診斷，從而能更精確 地改進(jìn)醫(yī)學(xué)治療并防止在一些患者中采用完全結(jié)腸切除術(shù)和回腸造口術(shù)進(jìn)行外科手術(shù)干 預(yù)。其它免疫細(xì)胞，例如嗜中性粒細(xì)胞、嗜曙紅細(xì)胞、NK細(xì)胞、NKT細(xì)胞、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞 和B細(xì)胞的活化標(biāo)記的多色流式細(xì)胞術(shù)分析可通過類似方式用于IBD的診斷、分期和監(jiān)測(cè)。實(shí)施例4
測(cè)定類固醇受體表達(dá)狀況.一些IBD患者可能對(duì)類固醇治療變得耐受是熟知的問 題。本發(fā)明公開了對(duì)活檢單細(xì)胞采用蛋白質(zhì)印跡或胞內(nèi)流式細(xì)胞術(shù)以測(cè)定這些細(xì)胞是否對(duì) 類固醇治療敏感來研究IBD-患者中類固醇受體的表達(dá)狀況。通過胞內(nèi)流式細(xì)胞術(shù)研究具 有類固醇敏感反應(yīng)的患者或?qū)︻惞檀贾委煕]反應(yīng)的患者的腸活檢或單細(xì)胞懸液的類固醇 受體表達(dá)程度?；加蓄惞檀茧y治IBD的所有患者表達(dá)較低水平的糖皮質(zhì)激素受體，而在類 固醇治療后反應(yīng)為腸道愈合和較低SEO指數(shù)的患者表達(dá)水平較高(圖6)。因此，腸道淋巴 細(xì)胞中類固醇受體的表達(dá)水平與對(duì)治療的敏感性相關(guān)。實(shí)施例5細(xì)胞因子表達(dá)陣列狀況測(cè)定.根據(jù)本發(fā)明，通過表達(dá)陣列狀況測(cè)定更詳細(xì)地描述 IBD患者活檢中免疫細(xì)胞的細(xì)胞因子表達(dá)模式。利用20k埃飛基質(zhì)芯片進(jìn)行該類狀況測(cè)定。 ⑶患者中發(fā)現(xiàn)的Thl活化模式看來是⑶69和Tbet、IFN- γ和ΤΙΜ-3的mRNA上調(diào)所致。相 反，在UC患者中見到Th2表達(dá)模式，其中除CD69外，還注意到GATA-3和IL_4、IL-5的上 調(diào)。通過實(shí)時(shí)定量PCR(QT-PCR)驗(yàn)證陣列的結(jié)果。因此，⑶患者的細(xì)胞顯示Tbet轉(zhuǎn)錄物 的表達(dá)水平較高(圖8)，而在UC患者的細(xì)胞中GATA-3轉(zhuǎn)錄物升高(圖9)。此外，在活動(dòng) 期⑶的患者中發(fā)現(xiàn)Tbet表達(dá)實(shí)質(zhì)性增加(圖7)。因此，根據(jù)一組表達(dá)狀況，可通過Tbet、 IFN- γ和TIM-3表達(dá)的增加來預(yù)測(cè)CD中Thl占優(yōu)(Thl dominance)。因此，可通過GATA-3 和IL-4、IL-5轉(zhuǎn)錄物表達(dá)的增加來預(yù)測(cè)Th2占優(yōu)和UC。參考文獻(xiàn)1. Bouma G,Strober W. The immunological and genetic basis of inflammatory bowel disease (炎性腸病的免疫學(xué)禾口遺傳學(xué)基石出)· NatureReviews Immunology 2003 ；3 521-533.2. Rahbar A, BostrOm L, Lagerstedt U, Magnusson I, Soderberg -NauclerC, Sundqvist VA. Evidence of active cytomegalovirus infection and increasedproduction of IL—6 in tissue specimens obtained from patients withinflammatory bowel diseases (從炎性腸病患者中獲得的組織樣本中活動(dòng)性巨細(xì)胞 病毒感染和IL-6產(chǎn)生增加的證據(jù)).Inflamm Bowel Dis 2003 ；3 154-61.3. Wakefield Ε, AJ, Ekblom A, Dhillon AP, Pittilo RM, Pounder RE. Crohn' s disease !pathogenesis and persistent measles virus infection(克羅J§、病發(fā)病機(jī)3S 和持久的麻疫病毒感染).Gastroenterology 108 :911_916，1995.
4. Toms C, Powrie F. Control of intestinal inflammation by regulatory Tcells (通過調(diào)節(jié)劑 T 細(xì)胞控制腸道炎癥).Microbes and infection. 2001 ；3 :929_935.5. Thorn Μ. Lymphatic mapping and sentinel node biopsy i s the methodapp 1 icab 1 e to patients with colorectal and gastric cancer ？(淋巴繪圖禾口警 戒淋巴結(jié)活檢該方法是否適于結(jié)腸直腸和胃癌患者？)Eur J Surg. 2000 ； 166 :755_758.6. Lapidus A, Bernell 0, Hellers G, Persson PG, Lofberg R. Incidence ofCrohn ' s disease in Stockholm County (斯德哥爾摩縣克羅恩病的發(fā)病 率)1955-1989. Gut. 1997 ；41 480-486.7. Tysk C, Jarnerot G. Ulcerative proctocolitis in Orebro, Sweden(瑞典奧 萊伯的潰瘍性直腸結(jié)腸炎).A retrospective epidemiologic study(追溯性流行病學(xué)研 究)，1963-1987. Scand J Gastroenterol. 1992 ；27 945-50.8. Wittig BM, Zeitz M.The gut as an organ of immunology (作為免疫學(xué)器官的 腸道).International Journal of Colorectal Disease (國際結(jié)腸直腸疾病雜志)· 2002 : 電子雜志.9. Ekbom A, Helmick C, Zack M, Adami HO. Ulcerative colitis andcolorectal cancer (潰瘍性結(jié)腸炎和結(jié)腸直腸癌).A population-based study (群體研究).N Engl J Med 1990 ；323 1228-33.10. Strober W, Kelsall, B. To be responsive or not to be responsive, that isthe mucosal question(起反應(yīng)還是沒反應(yīng)是粘膜問題)· Gastroenterology 1998 ；114 214-217.11.Duchmann R,Kaiser I,Hermann Ε,Mayet W,Ewe K,Meyer-zum-Buschenfelde KH.Tolerance exists towards resident intestinal flora but isbroken in active inflammatory bowel disease (對(duì)寄居腸道菌群的耐受性但在活動(dòng)性炎性腸病中被打 破).Clin Exp Immunol 1995;102:448-455.12. Macdonald TT, Monteleone G, Pender SLF. Recent developments inthe immunology of inflammatory bowel disease (炎性腸病免疫學(xué)的最新進(jìn)展)· Scan J Immunol. 2000 ；51 :2_9·13. DeRisi J, Penland L, Brown P0, Bittner ML, Meltzer PS, Ray M, Chen Y, Su YA, Trent JM. Use of a cDNA microarray to analyse geneexpression patterns in human cancer (利用cDNA微陣列分析人癌癥的基因表達(dá)模式).Nat Genet. 199614(4)457-60..
權(quán)利要求
一種區(qū)分患者中活動(dòng)性和非活動(dòng)性IBD的方法，所述方法包括提供懷疑患病的胃腸粘膜，特別是遠(yuǎn)端回腸或結(jié)腸粘膜或引流所述胃腸粘膜的警戒淋巴結(jié)的活檢樣品；制備該樣品的單細(xì)胞懸液；利用直接標(biāo)記的熒光CD69抗體分析該單細(xì)胞懸液中CD4+T輔助細(xì)胞上炎癥活化標(biāo)記CD69的表達(dá)情況；比較如此測(cè)定的表達(dá)CD 69的T輔助細(xì)胞數(shù)量與從健康人的腸組織獲得的相應(yīng)單細(xì)胞懸液中測(cè)定的表達(dá)CD69的T輔助細(xì)胞數(shù)量；其中表達(dá)CD69的T輔助細(xì)胞水平顯著增加表示存在活動(dòng)性IBD，而T輔助細(xì)胞水平增加不顯著表示存在非活動(dòng)性IBD。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，通過流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行分析。
3.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述抗體是直接標(biāo)記的抗體。
4.如權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述抗體是熒光抗體。
5.如權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述水平顯著增加的特征在于ρ < 0. 009。
6.如權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述水平增加不顯著的特征在 于 0. 03 < ρ > 0. 009。
7.—種區(qū)分IBD患者中潰瘍性結(jié)腸炎和克羅恩病的方法，所述方法包括提供從患病腸 粘膜或引流這種粘膜的警戒淋巴結(jié)獲得的患者活檢樣品，制備該樣品的單細(xì)胞懸液；測(cè)定 該懸液或其上清液中由活化的1型T輔助細(xì)胞(Thl)驅(qū)動(dòng)的，在免疫活化中產(chǎn)生的表示克 羅恩病的一種或多種細(xì)胞因子，和由活化的2型T輔助細(xì)胞(Th2)驅(qū)動(dòng)的，在免疫活化中產(chǎn) 生的表示潰瘍性結(jié)腸炎的一種或多種細(xì)胞因子，比較Thl和Th2細(xì)胞因子的測(cè)定量與患有 明確克羅恩病和/或潰瘍性結(jié)腸炎的患者中發(fā)現(xiàn)的相應(yīng)量。
8.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，由活化的1型T輔助細(xì)胞驅(qū)動(dòng)的，在免疫活 化中產(chǎn)生的細(xì)胞因子選自:IL-12, IFN-y和TNF-α。
9.如權(quán)利要求7或8所述的方法，其特征在于，由活化的2型T輔助細(xì)胞驅(qū)動(dòng)的，在免 疫活化中產(chǎn)生的細(xì)胞因子選自IL-4和IL-5。
10.如權(quán)利要求7-9中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，還包括測(cè)定樣品中的IgGl作為 克羅恩病的標(biāo)記。
11.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，測(cè)定所述上清液中IL-12、IFN-Y和 TNF-α中的任一種。
12.如權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，測(cè)定所述上清液中IL-4和IL-5中的任一種。
13.一種測(cè)定患者中是否存在克羅恩病的方法，所述方法包括提供懷疑患病的胃腸粘 膜，特別是遠(yuǎn)端回腸或結(jié)腸粘膜或引流所述胃腸粘膜的警戒淋巴結(jié)的活檢樣品；制備該樣 品的單細(xì)胞懸液；從該細(xì)胞懸液分離mRNA ；分析該分離的mRNA中CD69、Tbet, IFN-y和 TIM-3的兩種或更多種的mRNA ；比較該結(jié)果與從健康人相應(yīng)獲得的mRNA中⑶69、Tbet, IFN- γ和TIM-3的兩種或更多種相應(yīng)mRNA的分析結(jié)果，患者mRNA樣品中CD69、Tbet、 IFN- γ和TIM-3的兩種或更多種mRNA上調(diào)表示克羅恩病。
14.如權(quán)利要求13所述的方法在對(duì)克羅恩病分期或在監(jiān)測(cè)克羅恩病治療中的應(yīng)用。
15.一種測(cè)定患者中是否存在潰瘍性結(jié)腸炎的方法，所述方法包括提供懷疑患病的胃 腸粘膜，特別是遠(yuǎn)端回腸或結(jié)腸粘膜或引流所述胃腸粘膜的警戒淋巴結(jié)的活檢樣品；制備該樣品的單細(xì)胞懸液；從該細(xì)胞懸液分離mRNA ；分析該分離的mRNA中⑶69、GATA-3、IL-4 和IL-5的兩種或更多種的mRNA ；比較該結(jié)果與從健康人相應(yīng)獲得的mRNA中⑶69、GATA_3、 IL-4和IL-5的兩種或更多種相應(yīng)mRNA的分析結(jié)果，患者mRNA樣品中⑶69、GATA-3、IL-4 和IL-5的兩種或更多種mRNA上調(diào)表示潰瘍性結(jié)腸炎。
16.如權(quán)利要求15所述的方法在對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎分期或在監(jiān)測(cè)潰瘍性結(jié)腸炎治療中 的應(yīng)用。
17.活檢樣品中的Tbet表達(dá)作為取得該樣品的患者中克羅恩病分期標(biāo)記的應(yīng)用。
18.活檢樣品中的Tbet表達(dá)作為區(qū)分取得該樣品的患者的克羅恩病的活動(dòng)期和非活 動(dòng)期的標(biāo)記的應(yīng)用。
19.活檢樣品中的GATA-3表達(dá)作為區(qū)分取得該樣品的患者的潰瘍性結(jié)腸炎的活動(dòng)期 和非活動(dòng)期的標(biāo)記的應(yīng)用。
20.一種測(cè)定IBD患者對(duì)類固醇治療的敏感性的方法，所述方法包括測(cè)定從所述患者 獲得的CD4+T細(xì)胞中的糖皮質(zhì)激素受體表達(dá)。
21.如權(quán)利要求20所述的方法，其特征在于，將所述測(cè)定的表達(dá)與對(duì)類固醇治療有反 應(yīng)的IBD患者或一組IBD患者中和/或?qū)︻惞檀贾委煕]反應(yīng)的IBD患者或一組IBD患者中 的相應(yīng)表達(dá)作比較。
22.如權(quán)利要求21所述的方法，其特征在于，對(duì)于無反應(yīng)IBD患者組中的平均表達(dá)，所 述IBD患者中的所述測(cè)定表達(dá)增加50%表明80%或更多所述患者對(duì)類固醇治療敏感。
23.如權(quán)利要求22所述的方法，其特征在于，選擇所述無反應(yīng)IBD患者組的唯一標(biāo)準(zhǔn)是 它們對(duì)類固醇治療無反應(yīng)。
全文摘要
一種區(qū)分胃腸粘膜樣品或引流胃腸粘膜的警戒淋巴結(jié)的樣品中的活動(dòng)性和非活動(dòng)性IBD的方法，所述方法包括制備該樣品的單細(xì)胞懸液，利用直接標(biāo)記的熒光CD69抗體分析該懸液中CD4+T輔助細(xì)胞上炎癥活化標(biāo)記CD69的表達(dá)；比較樣品中表達(dá)CD 69的T輔助細(xì)胞數(shù)量與從健康人的相應(yīng)樣品獲得的數(shù)量；表達(dá)CD69的T輔助細(xì)胞水平顯著增加表示存在活性IBD，而T輔助細(xì)胞水平增加不顯著表示存在非活動(dòng)性IBD。還公開了區(qū)分潰瘍性結(jié)腸炎(UC)和克羅恩病(CD)，檢測(cè)UC和CD以及測(cè)定IBD患者對(duì)類固醇治療敏感性的方法。
文檔編號(hào)C07K14/57GK101815945SQ200880109384
公開日2010年8月25日 申請(qǐng)日期2008年7月29日 優(yōu)先權(quán)日2007年8月2日
發(fā)明者M·瑟恩, O·溫維斯特 申請(qǐng)人:Iss免疫系統(tǒng)刺激股份公司