專利名稱：：調(diào)節(jié)lrrk2的方法調(diào)節(jié)LRRK2的方法方法近期的發(fā)現(xiàn)己經(jīng)引起很大的興趣在編碼富含亮氨酸重復(fù)的蛋白激酶-2(LRRK2)的基因中的不同常染色體顯性點突變使人類傾向于發(fā)生晚發(fā)的帕金森病(PD,OMIM登記號碼609007)，其具有與原發(fā)性PD不能區(qū)分的臨床征候[l-4]。截至目前進行的遺傳分析顯示，LRRK2中的突變是相對頻繁的，不只占家族型PD的5-10%，還被發(fā)現(xiàn)占偶發(fā)PD病例的重要比例[5，6]。很少知道LRRK2是如何在細胞中被調(diào)節(jié)的，什么是其生理性底物，LRRK2中的突變是如何造成或增加PD風(fēng)險。在哺乳動物中有2種LRRK蛋白激酶的亞型LRRK1(2038殘基)和LRRK2(2527殘基)。它們屬于也被稱作Roco的蛋白家族[7]。迄今，LRRK2中的突變，而不是LRRK1中的突變，已經(jīng)與PD聯(lián)系上。'蛋白激酶的LRRK/Roco類最初在黏菌網(wǎng)柱菌W/weotomW"z'c/^wfe//"cfoco/cfeww中被鑒定為稱作GbpC(cGMP結(jié)合蛋白C)的蛋白，其含有Ras/GTPase超家族的罕見成員，與其它小GTPase結(jié)構(gòu)域不同，因為其具有包括蛋白激酶的其它結(jié)構(gòu)域[7,8]。隨后的研究提示，在網(wǎng)柱菌屬中，GbpC調(diào)節(jié)趨化性(chemotaxis)和細胞極性[9]，但是該酶的生理性底物還未被闡明。LRRK/Roco-蛋白的定義(defining)特征是其具有富含亮氨酸重復(fù)(LRR)的基序、Ras-樣小GTPase、高氨基酸保守區(qū)(被稱為復(fù)合物的Ras的C-末端(COR)結(jié)構(gòu)域(C-terminalOfRasofcomplex(COR)domain)和蛋白激酶催化結(jié)構(gòu)域[7,10]。LRRK2的蛋白激酶結(jié)構(gòu)域?qū)儆诶野彼針咏z氨酸/蘇氨酸蛋白激酶并且與Rho-相互作用蛋白激酶(RIPK)最相似，RIPK在先天的免疫信號通路中扮演重要角色[ll]。在LRRK激酶的特異成員中還發(fā)現(xiàn)其它結(jié)構(gòu)域。例如，GbpC具有另一個DEP、環(huán)GMP-結(jié)合和Ras-GEF結(jié)構(gòu)域，其沒有在哺乳動物L(fēng)RRK1和LRRK2中發(fā)現(xiàn)。人類LRRK1具有在其N-末端的3個錨蛋白重復(fù)，而LRRK2缺少這些結(jié)構(gòu)域，但是具有未在LRRK1中發(fā)現(xiàn)的定位于其C-末端的一個WD40重復(fù)[7]。人類LRRK2包含富含亮氨酸重復(fù)(殘基1010-1287)、小GTPase結(jié)構(gòu)域(殘基1335-1504)、COR結(jié)構(gòu)域(殘基1517-1843)、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶結(jié)構(gòu)域(殘基1875-2132)和與WD40重復(fù)有低相似性的基序(2231-2276)。迄今，~20單氨基酸置換性突變已經(jīng)與常染色體顯性PD聯(lián)系起來，且已經(jīng)發(fā)現(xiàn)這些突變是在小GTPase、COR、蛋白激酶和WD40結(jié)構(gòu)域的保守殘基當中或與它們很接近[3,4]。占歐洲家族型PD的~6%和偶發(fā)性PD病例的3%的LRRK2最流行的突變形式包括在激酶結(jié)構(gòu)域的亞結(jié)構(gòu)域-V^中保守的DYG-Mg2+-結(jié)合基序內(nèi)的Gly2019至絲氨酸殘基的氨基酸置換[3]。近期的報告提示，該突變適中地增加了LRRK2的自磷酸化以及其磷酸化髓磷脂堿牲蛋白的能力~2-3倍[12，13]。這些發(fā)現(xiàn)提示，LRRK2的過度活化使人類易發(fā)生PD，這意味著抑制LRRK2的藥物可以用于延緩某些形式PD的發(fā)生或甚至治療某些形式的PD。難以表達活性重組酶和缺少有力的定量分析阻礙了LRRK2的研究。在本說明書中對在前公開的文件的列出或討論不應(yīng)必然地被認為是承認該文獻是本領(lǐng)域的一部分或是公知常識。我們已經(jīng)研制了表達活性重組LRRK2的方法，并且將其用于激酶底物示蹤和闡明(KinasESubstrateTRackingandELucidation(KESTREL))篩選，所述篩選是近期開發(fā)出來的，用于幫助尋找蛋白激酶的生理性底物(在[14]中有綜述)。這導(dǎo)致將膜突蛋白鑒定為潛在的生理性底物，其在被變性時在Thr558上被LRRK2有效地磷酸化，所述Thr558是以前鑒定的生理性相關(guān)磷酸化位點。我們已經(jīng)應(yīng)用這些發(fā)現(xiàn)開發(fā)LRRK2有力的和定量的分析(assay)。通過使用該方法，我們證明在PD患者中鑒定的幾個LRRK2突變，或者不影響或者實際上抑制而不是活化LRRK2。本發(fā)明的第一方面提供一種鑒定化合物的方法，該化合物預(yù)期在調(diào)節(jié)LRRK2蛋白激酶活性中有用，該方法包括下列步驟(1)測定測試化合物是否調(diào)節(jié)LRRK2多肽在底物埃茲蛋白/根蛋白/膜突蛋白(Ezrin/Radixin/Moesin(ERM))家族多肽上的蛋白激酶活性，和(2)選擇調(diào)節(jié)所述LRRK2多肽蛋白激酶活性的化合物。在篩選方法中被調(diào)節(jié)/評估的LRRK2多肽的蛋白激酶活性是ERM家族多肽的磷酸化。ERM家族多肽的磷酸化可以用檢測ERM家族多肽的磷酸化或調(diào)節(jié)而評估，如在下面和在實施例中進一步討論的。例如，如本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的，對例如膜突蛋白的磷酸化(或非磷酸化)的磷酸化位點特異的抗體可以用于評估那個磷酸化位點的磷酸化。其他方法在本教導(dǎo)和評估蛋白磷酸化的許多已知方法的基礎(chǔ)上對技術(shù)人員是明顯的。ERM家族多肽的磷酸化也可以通過評估ERM家族多肽結(jié)合肌動蛋白或結(jié)合細胞膜或膜成分例如PtdIns4,5P2或膜相關(guān)(membrane-associated)多肽如L-選擇蛋白、ICAM123或CD44的能力來評估。例如已經(jīng)報道膜突蛋白的FERM結(jié)構(gòu)域與幾個原生質(zhì)膜蛋白[18,19]以及Ptdlns4，5P2相互作用。例如膜突蛋白的后30個殘基被認為形成F-肌動蛋白(F-actin)結(jié)合位點[20，22]。評估這種結(jié)合的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的并且本文所引用的參考文獻中也給出了范例，例如文獻18、19、20、21、22、24和25。ERM家族多肽的磷酸化或調(diào)節(jié)還可以在細胞中評估，例如通過評估細胞骨架參數(shù)評估。在一個實施例中，可以使用如在Nakamum等人(1995)J歷o/C&w270(52),31377-31385"PhosphorylationofThreonine558intheCarboxyl-terminalActin-bindingDomainofMoesinbyThrombinActivationofHumanPlatelets，，中公開的基于血小板的測定(assay)。已報道血小板含有膜突蛋白但不含其它家族成員根蛋白和埃茲蛋白。發(fā)現(xiàn)絲氨酸/蘇氨酸激酶的非特異抑制劑(十字孢堿(staurosporine))和磷酸酶抑制劑對膜突蛋白磷酸化具有相反效果，但是發(fā)現(xiàn)它們都使血小板形成極長的絲狀偽足并且不在玻璃上伸展。發(fā)現(xiàn)磷酸化的膜突蛋白在細胞中心與F-肌動蛋白集中在一起。因此，或者細胞的行為(例如細胞形狀)或者膜突蛋白和/或肌動蛋白的定位可以用于(用合適的對照，如本領(lǐng)域的技術(shù)人員所公知的)評估(或進一步評估)測試化合物對LRRK2多肽蛋白激酶活性的效果。本發(fā)明的另一個方面提供一種鑒定化合物的方法，該化合物預(yù)期在調(diào)節(jié)如抑制細胞中ERM家族多肽的磷酸化中有用，該方法包括下列步驟(1)測定測試化合物是否調(diào)節(jié)，例如抑制，LRRK2多肽蛋白激酶活性，和(2)選擇調(diào)節(jié)，例如抑制，LRRK2多肽蛋白激酶活性的化合物。本發(fā)明的另一個方面提供一種鑒定化合物的方法，該化合物預(yù)期在治療或預(yù)防帕金森病(PD)或帕金森綜合癥(或其它神經(jīng)變性狀況)中有用，該方法包括下列步驟(1)測定測試化合物是否調(diào)節(jié)，例如抑制，ERM家族(例如膜突蛋白)多肽的磷酸化，和(2)選擇調(diào)節(jié)，例如抑制，ERM家族(例如膜突蛋白)多肽的磷酸化的化合物。該方法可包括下列步驟(1)測定測試化合物是否通過LRRK2多肽調(diào)節(jié)，例如抑制，ERM家族(例如膜突蛋白)多肽的磷酸化，和(2)選擇通過LRRK2多肽調(diào)節(jié)，例如抑制，ERM家族(例如膜突蛋白)多肽的磷酸化的化合物。評估ERM家族多肽磷酸化的方法的范例在上面進行了討論并包括使用如上所述的磷酸化特異抗體的方法。在存在合適的如上所述的ERM家族多肽的磷酸供體時，LRRK2多肽的活性可以通過檢測通過LRRK2多肽進行的磷酸化檢測。上面指出了評估ERM家族多肽磷酸化的方法的范例。蛋白激酶活性可以通過改變LRRK2多肽針對特定底物的V皿或Km(或兩者)而增加或減少。例如，活性可以通過增加Vmax或降低Km而增加。應(yīng)理解的是，為了測定LRRK2多肽是否已經(jīng)被活化或去活化，可不必測量Vn^或Km的值?；钚钥蓽y量為給定時間中被磷酸化的底物的量；因此，活性的變化可測量為給定時間中被磷酸化的底物量的變化(例如，在單一濃度下)。優(yōu)選地，活性被適當?shù)卦黾踊蚪档椭辽?倍，優(yōu)選地是5、10、15、20、25、30或50倍。應(yīng)理解的是，可能需要測定化合物對底物性質(zhì)的影響，例如通過測量當暴露于化合物(1)在將底物暴露給LRRK2多肽之后，(2)在將底物暴露給LRRK2多肽之前和/或(3)沒有將其暴露給LRRK2多肽時，底物的性質(zhì)。術(shù)語蛋白激酶活性的調(diào)節(jié)包括抑制或增加蛋白激酶的活性。應(yīng)理解的是，在本發(fā)明的方法中，其中多肽的磷酸化發(fā)生可能需要如本發(fā)明上述方面所述的合適的磷酸供體存在。合適的磷酸供體是本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的并且包括ATP，例如如實施例中所述的ATP鎂鹽(MgATP)。評估測試化合物對LRRK2多肽和ERM家族多肽結(jié)合的影響是有用的。評估多肽多肽相互作用的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。LRRK2和/或ERM家族多肽可以，例如自LRRK2和/或ERM家族多肽被天然表達的細胞中純化，但是至少一個LRRK2和ERM家族的多肽被重組將是更便易的。如上所述，術(shù)語ERM家族多B太是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。如上所述，ERM家族成員包括膜突蛋白、埃茲蛋白和根蛋白。Merlin是另一個ERM家族成員。在分析中使用的ERM家族多肽可以是重組體或非重組體。ERM家族多肽可以是，例如，細菌表達的或哺乳動物細胞表達的ERM家族多肽(例如實施例中所述的)。ERM家族多肽可以具有天然存在的ERM家族成員的氨基酸序列，例如天然存在的膜突蛋白、埃茲蛋白、根蛋白或merlin多肽的氨基酸序列，或可以是或含有融合多肽(例如實施例1中所述的)，或可以是天然存在的ERM家族成員的片段或變體，所述片段或變體保留了被LRRK2多肽，例如如實施例1中所述的LRRK2[1326-2527]或LRRK2[1326-2527,G2019S]磷酸化或活化的能力。因此，優(yōu)選地，ERM家族多肽是在對應(yīng)于全長的野生型人類膜突蛋白的蘇氨酸558位置上保留蘇氨酸(或絲氨酸)殘基的ERM家族多肽。優(yōu)選地，ERM家族多肽不是其中對應(yīng)于Thr558的殘基被非蘇氮酸或絲氨酸的殘基替代的突變體，例如Thr558由丙氨酸替代。ERM家族多肽可以是在對應(yīng)于全長野生型人類膜突蛋白的蘇氨酸526位置上保留了蘇氨酸(或絲氨酸)殘基的ERM家族多肽。ERM家族多肽不應(yīng)是其中Thr526由非蘇氨酸或絲氨酸的殘基替代的突變體，例如Thr526由丙氨酸替代。可源自ERM家族多肽，例如膜矣蛋白、根蛋白或埃茲蛋白的片段是用于篩選方法的合適底物，所述片段包括對應(yīng)于膜突蛋白的Thr558殘基的殘基和包括該殘基的周圍序列的至少一部分，例如該殘基C-末端和N-末端的至少2、3、4、5、6或7個殘基?？稍醋訣RM家族多肽，例如膜突蛋白、根蛋白或埃茲蛋白的片段可以是用于篩選方法的合適底物，所述片段包括對應(yīng)于膜突蛋白的Thr526殘基的殘基和包括該殘基的序列的至少一部分，例如該殘基C-末端和/或N-末端的至少2、3、4、5、6或7個殘基。多肽可以具有，例如包括該殘基的至少8或9個殘基，例如具有該殘基N-末端的5至6個殘基和該殘基C-末端的2或3個殘基。如實施例和附圖中顯示的，LRRK2磷酸化在埃茲蛋白、根蛋白、膜突蛋白和merlin上等同的殘基并且例如在篩選分析中，這些中的任一個可以用作LRRK2的底物。所有的都被相似地磷酸化并且據(jù)認為，不論使用哪個，都不會有顯著的差別。可源自膜突蛋白、根蛋白或埃茲蛋白并且包括對應(yīng)于膜突蛋白Thr558殘基的合適底物是RLGRDKYKILRQIRQ或RLGRDKYKILRQIRQGNTKQR。對應(yīng)于膜突蛋白Thr558的殘基加了下劃線。.ERM家族多肽可以是包含氨基酸序列RLGRDKYK(T/S)LRQIRQ或RLGRDKYK(T/S)LRQIRQGNTKQR的在100、80、60、50、40、30、25、20、19、18、17或16個氨基酸殘基以下的多肽，每個可沒有或具有除了T/S殘基的高達1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10個保守或非保守殘基的置換。ERM家族多肽還可以是含有來自這一序列的至少7、8、9、或10個氨基酸的在16個氨基酸殘基以下的多肽，該序列包括可沒有或具有除了T/S殘基的高達1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個保守或非保守的殘基的置換。該多肽序列一般源自天然存在的ERM家族多肽的序列，例如膜突蛋白、根蛋白或埃茲蛋白，例如人類模突蛋白、根蛋白或埃茲蛋白，可選擇地具有保守或非保守殘基置換(例如多達10、20、30、40、50或60%的殘基)。圖19和20中展示的數(shù)據(jù)也顯示了在等同于Thr558的Thr殘基周圍的個體殘基的相對重要性。最重要的殘基似乎是Tyr556(-2位置)并且還注意到在+2位置上的堿性殘基的顯著偏好。因此，在一個具體實施方式中，在相對于T/S殘基-2的位置上，多肽具有蘇氨酸氨基和/或在相對于T/S殘基的+2位置上具有堿性殘基(例如精氨酸或賴氨酸)。較長序列RLGRDKYK(T/S)LRQIRQGNTKQR(稱作長-LRRKtide)被認為允許使用相對于較短序列RLGRDKYK(T/S)LRQIRQ(短LRRKtide)低5-10倍的肽量。但是在較短和較長肽序列中的核心識別基序是同樣的?？赡苄枰獙RM多肽變性(例如如果其含有FERM結(jié)構(gòu)域(例如人類膜突蛋白的殘基1-298)和C-末端尾區(qū)(C-ERMAD結(jié)構(gòu)域，例如人類膜突蛋白的殘基489-575))以便其被LRRK2多肽在體外磷酸化，如在實施例1中所述。因此，可能渴望的是ERM多肽不包掊功能性FERM結(jié)構(gòu)域。在NCBI數(shù)據(jù)庫中ERM家族多肽的登錄號的范例包括AAB02864,M86450(豬膜突蛋白)AAA39728，M86390.1,NP_034963,NM0腦3.2像鼠膜突蛋白)NP_002435，NM002444.2(人類膜突蛋白)NP—110490，NM030863.1(挪威大鼠膜突蛋白)NP001039942,NM001046477.1(牛膜突蛋白)NP—062230,NM019357.1(挪威大鼠埃茲蛋白)CAA43086,X60671.1(家鼠埃茲蛋白)P15311(人類埃茲蛋白)NP_002897，NM002906.3(人類根蛋白)NP一033067,NM—009041(家鼠根蛋白)NP001005889,NM001005889.2(挪威大鼠根蛋白)NP_001009576，NM001009576.1(豬根蛋白)P35240(人類merlin)P46662(家鼠merlin)Q63648(挪威大鼠merlin)如本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的，哺乳動物和非哺乳動物ERM家族多肽序列的大量買TDiYBiy!jKj^A《土ki/ANUBiMeaiine""/Jtx分卞近/、tfj;予;yij實義:i7山7牛卞3大l守。如上所述，術(shù)語LRRK2是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。用于分析的LRRK2多肽可以是重組體或非重組體。LRRK2多肽可以是，例如，細菌表達或哺乳動物細胞表達的LRRK2多肽(例如實施例中所述的)。與底物多肽例如ERM家族多肽并排表達LRRK2多肽可是恰當?shù)?。LRRK2多肽可以具有天然存在LRRK2的氨基酸序列，或可以是或包含融合多:肽(例如實施例l中所述的)，或可以是保留了磷酸化ERM家族多肽或髓磷脂堿性蛋白能力的天然存在LRRK2的片段或變體，如在實施例1中所述，例如保留了在對應(yīng)于全長人類膜突蛋白Thr558(或Thr526)的殘基的位置上磷酸化(變性的，如實施例1中所述的)膜突蛋白或其片段的能力的。因此LRRK2多肽是保留了活性激酶結(jié)構(gòu)域的LRRK2多肽。還認為，為了是催化活性的，LRRK2多肽保留了對應(yīng)于GTPase結(jié)構(gòu)域、COR結(jié)構(gòu)域、WD40樣基序和C-末端尾的區(qū)域，如實施例1中所述。LRRK2多肽可不含有在全長LRRK2中存在的富含亮氨酸重復(fù).—(LRR)基序。如實施例1中所述，LRRK2多肽可以含有或由野生型人類LRRK2的殘基1326-2527，或這樣片段的GST融合體組成。含有完整激酶結(jié)構(gòu)域和上述其它結(jié)構(gòu)域，但不包含其他LRRK2區(qū)域(例如富含亮氨酸重復(fù)(LRR)基序)的LRRK2的片段可以是有用的；LRRK2的這個區(qū)域足以保留蛋白激酶活性，但是比全長LRRK2短并且更易于以活性形式表達。用于分析的LRRK2多肽不是激酶-死亡突變體，如實施例中所述的(例如LRRK2，其中等同于全長人類LRRK2殘基D2017的殘基被突變至，例如丙氨酸)。因此，LRRK2多肽可以是野生型人類LRRK2或其片段，或其二者之一的融合體。該片段可以至少含有野生型人類LRRK2的殘基1326-2527。據(jù)認為，C-末端的截短可以不利地影響截短的LRRK2多肽的蛋白激酶活性，同時在片段N-末端的截短可被更好的忍受。因此截短的LRRK2多肽的N-末端可以選擇性地在殘基1326之后，例如在殘基1326和大約殘基1336之間。LRRK2多肽可以是具有野生型人類LRRK2的天然存在突變的人類LRRK2，或其片段，或其二者之一的融合體。該片段可以至少含有具有天然存在的突變的人類LRRK2的殘基1326-2527。人類LRRK2的天然存在的突變可以是與帕金森病(PD)相關(guān)的突變。通過使用野生型人類LRRK2編號，該突變可以是G2019S。認為該突變增強LRRK2蛋白激酶活性，如實施例1中進一步所述的。該突變通過使用野生型人類LRRK2的編號而言，可以選擇性地是R1441C、R1441G、Y1699C、R1914H、I2012T、I2020T或G2385R。認為具有突變R144〗C、R1441G、Y1699C或T2356I的LRRK2與野生型LRRK2具有相似的蛋白激酶活性。認為具有突變R1914H或I2012T的LRRK2是幾乎無活性的。認為具有突變I2020T的LRRK2具有在野生型LRRK2和具有突變R1914H或I2012T的LRRK2中間的活性。還認為具有突變G2385R的LRRK2是幾乎無活性的。其他突變體的活性在圖17中顯示。測試對抗(against)多于一個LRRK2多肽的化合物是有幫助的；例如對抗多于一個的突變LRRK2多肽。這有助于決定需要設(shè)計和測試的其他化合物。如實施例1中所述，LRRK2多肽可以是GST融合多肽。例如，LRRK2多肽可以是GST-LRRK2[1326-2527,G2019S]。或者如本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的，還可以使用其他融合部分。'特別優(yōu)選地，盡管不必要，就在全長人類膜突蛋白殘基Thr558或Thr526上的磷酸化；或含有這樣殘基的肽底物(例如上述的；例如RLGRDKYKTLRQIRQ或RLGRDKYKTLRQIRQGNTKQR)的磷酸化而言，LRRK2多肽具有全長人類LRRK2至少30%的酶活性。如上所述，就在全長人類膜突蛋白殘基Thr558或Thr526上的磷酸化；或含有這樣殘基的肽底物的磷酸化而言，如果LRRK2多肽具有全長人類LRRK2的至少50%，優(yōu)選地至少70%和更優(yōu)選地至少90%的酶活性是更優(yōu)選的。在NCBI數(shù)據(jù)庫中哺乳動物L(fēng)RRK2序列的登錄號包括AAV63975.1人類XP_001168494:1黑猩猩屬(Pantroglodytes),(黑猩猩(chimpanzee))XP—615760.3牛(BosTaurus)(家牛(domesticcow))XP—543734.2家犬(Canisfamiliaris)(犬)NP—080006.2小鼠(Musmusculus)(小鼠(mouse))XP—235581.4大鼠(Rattusnorvegicus)(大鼠(rat))如本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的，哺乳動物和非哺乳動物L(fēng)RRK2多肽序列的大量其他范例可以在從NCBIMedlineTM服務(wù)可獲得的序列數(shù)據(jù)庫中獲得。術(shù)語多肽的"變體"包括保守性或非保守性的插入、刪除和置換。特別地，其包括多肽的變體，其中，如適當?shù)脑?asappropriate),這樣的改變本質(zhì)上不改變蛋白激酶活性或被磷酸化的能力?；诶?，比較每個多肽(例如來自不同物種的)的范例的序列，技術(shù)人員能容易地設(shè)計和測試合適的變體。技術(shù)人員能容易地測定哪里可以產(chǎn)生插入或刪除；或哪個殘基可以恰當?shù)乇３植蛔儯槐槐Ｊ刂脫Q所替代，或被非保守置換所替代。例如在實施例1中所述地，可以容易地測試變體多肽，。術(shù)語"保守性置換"是指組合如Gly、Ala;Val、Ile、Leu;Asp、Glu;Asn、Gln;Ser、Thr;Lys、Arg;禾QPhe、Tyr。除了上述定義的符號Zaa，本文使用了IUPAC-IUB生物化學(xué)命名委員會的3字母或單字母氨基酸代碼。特別地，Xaa代表任何氨基酸。優(yōu)選地，至少對應(yīng)于本文中定義的共有序列(consensussequence)的氨基酸是L-氨基酸。特別優(yōu)選地，多肽變體具有與相關(guān)人類多肽氨基酸序列至少65%同一性的氨基酸序列，更優(yōu)選地，與相關(guān)人類多肽的氨基酸序列具有至少70%、71%、72%、73%或74%，更優(yōu)選地，至少75%，更優(yōu)選地，至少80%，更優(yōu)選地，至少85%，更優(yōu)選地，至少90%，并且最優(yōu)選地，至少95%或97%同一性的氨基酸序列。更優(yōu)選地，蛋白激酶變體具有與人類多肽的催化結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列至少65%同一性的氨基酸序列，更優(yōu)選地，與相關(guān)人類氨基酸序列具有至少70%、71%、72%、73%或74%，更優(yōu)選地，至少75%，更優(yōu)選地至少80%，更優(yōu)選地，至少83%或85%，更優(yōu)選地，至少90%，并且最優(yōu)選地，至少95%或97%同一性的氨基酸序列。應(yīng)理解的是，例如通過使用如下述的序列比較，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易地鑒定蛋白激酶-相關(guān)多肽的催化結(jié)構(gòu)域。蛋白激酶顯示保守的催化核心，如Johnson等人(1996)Ce〃，85,149-158和Taylor和Radzio-Andzelm(1994)5^w"we2,345-355中綜述的。該核心折疊成大多含有反向平行的P-折疊片的小N-末端裂片(lobe)和大多是oc-螺旋的C-末端裂片。兩個多肽之間的百分比序列同一性可以用適當?shù)挠嬎銠C程序確定，例如威斯康星大學(xué)遺傳計算組的GAP程序，并且應(yīng)理解的是，百分比同一性是關(guān)于多肽計算的，該多肽的序列已經(jīng)被優(yōu)化地比對。比對可以選擇性地使用ClustalW程序進行(Thompson等人.，1994)。使用的參數(shù)可以如下快速配對比對參數(shù)K-元組(tuple)(字)大??；1，窗口大??；5,空位罰分；3，頂端對角線的數(shù)量；5。得分方法X百分比。多重比對參數(shù)空位開放罰分；10，空位延伸罰分；0.05。得分陣距BLOSUM。如在實施例1中所述，比對可以選擇性地使用程序T-Coffee[19]或EMBOSS[20]進行。-對應(yīng)(等同)于例如全長人類膜突蛋白Thr558的殘基可以通過比對多肽序列和全長人類膜突蛋白的序列，以使序列間最大化匹配的方式鑒定?？梢酝ㄟ^目測和/或通過使用適當?shù)挠嬎銠C程序?qū)崿F(xiàn)比對，例如使用威斯康星大學(xué)遺傳計算組的GAP程序，該程序還允許計算多肽的百分比同一性。比對程序(Pearson(1994)in:MethodsinMolecularBiology,ComputerAnalysisofSequenceData,PartII(Griffin,AMandGriffin,HGeds)pp365-389,HumanaPress,Clifton)。因此，以該方式鑒定的殘基也是"對應(yīng)殘基"。.應(yīng)理解的是，在(例如)膜突蛋白的截短形式的情況下或在發(fā)生簡單的氨基酸殘基替換的形式下，鑒定"對應(yīng)殘基"是容易的。優(yōu)選地，篩選中使用的多肽是哺乳動物的，優(yōu)選地，人類的(或在農(nóng)業(yè)中有用的物種或作為家養(yǎng)或伴侶動物的物種，例如犬、貓、馬、牛)，包括天然存在的等位基因變體(包括剪接變體)。篩選中使用的多肽可以包括GST部分或可以是生物素化的或其他標記的，例如具有6ffis、HA、myc或其他表位標記，如本領(lǐng)域技術(shù)人員知道的，或如實施例1中所述的。這可以在純化和/或檢測多肽中是有用的。在不同濃度的化合物存在下，例如在缺少和存在該化合物下，例如在約100nM、30pM、lOpM、3pM、lpM、O.lpM、O.OlpM禾口/或O.OOl(aM的濃度下，化合物的效果可以通過比較底物多肽被LRRK2多肽磷酸化的速率或程度測定。通過本發(fā)明的方法鑒定的化合物可以調(diào)節(jié)LRRK2多肽磷酸化不同底物，例如膜突蛋白、根蛋白或埃茲蛋白或肽底物RLGRDKYKTLRQIRQ或RLGRDKYKTLRQIRQGNTKQR至不同程度的能力。因此，優(yōu)選地，但不是必要的，當篩選用于調(diào)節(jié)膜突蛋白活性的化合物時，該膜突蛋白或其片段用作底物。相似地，優(yōu)選地，但不是必要地，當篩選用于調(diào)節(jié)根蛋白活性的化合物時，該根蛋白或其片段用作底物。肽底物RLGRDKYKTLRQIRQ存在于每個膜突蛋白、根蛋白和埃茲蛋白中。該方法在鑒定化合物中有用，該化合物例如通過LRRK2調(diào)節(jié)，例如抑制，LRRK2的蛋白激酶活性，或ERM家族多肽的磷酸化。通過LRRK2調(diào)節(jié)，例如抑制LRRK2蛋白激酶活性或ERM家族多肽磷酸化的化合物可用于治療帕金森病(例如原發(fā)性帕金森病或遲發(fā)性帕金森病)或帕金森綜合癥。調(diào)節(jié)，例如抑制ERM家族多肽，例如膜突蛋白磷酸化的化合物，可以用于其它神經(jīng)變性狀況?；衔锟梢允墙Y(jié)合在LRRK2多肽和ERM家族多肽之間接觸區(qū)域或結(jié)合靠近該接觸區(qū)域的一種化合物，或可以是結(jié)合到其它區(qū)域并且例如誘導(dǎo)穩(wěn)定(或去穩(wěn)定)復(fù)合物構(gòu)象或變構(gòu)變化的一種化合物，或促進(或抑制)復(fù)合物形成的一種化合物。化合物可以結(jié)合到LRRK2多肽或ERM多肽，以通過變構(gòu)效應(yīng)增加LRRK2多肽蛋白激酶的活性。變構(gòu)效應(yīng)可以是涉及LRRK2多肽活性天然調(diào)節(jié)的變構(gòu)效應(yīng)。方法中鑒定的化合物本身可用作藥物或其可以代表用于設(shè)計和合成更有效化合物的前導(dǎo)化合物。化合物可以是藥物樣化合物或為每個上述鑒定化合物的方法開發(fā)藥物樣化合物的前導(dǎo)化合物。應(yīng)理解的是，所述方法在開發(fā)藥物化合物或藥物中可作為篩選分析方法，如本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。術(shù)語"藥物樣化合物"在本領(lǐng)域技術(shù)人員中是熟知的，并且可以包括具有使其適用于藥物中，例如作為藥劑的活性成分的特征的化合物的意思。因此，例如，藥物樣化合物可以是通過有機化學(xué)技術(shù)，不太優(yōu)選的是通過分子生物或生物化學(xué)技術(shù)合成的分子，并且優(yōu)選的是小分子，其可以在5000道爾頓以下。藥物樣化合物另外可以顯示與特定蛋白或蛋白選擇性相互作用的特征并且是生物可利用的和/或能夠穿透細胞膜，但是應(yīng)理解的是，這些特征不是必要的。相似地，術(shù)語"前導(dǎo)化合物"是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的，且可以包括的意思是化合物，而其本身不適合作為藥物(例如因為其對其預(yù)期的目標只有弱的效力，其作用是非選擇性的，不穩(wěn)定，難以合成或具有不良的生物利用率)可以提供設(shè)計有更多所需特征的其它化合物的起始點。應(yīng)理解的是，想要的是鑒定在體內(nèi)可以調(diào)節(jié)蛋白激酶活性的化合物。因此，應(yīng)理解的是，可以選擇用于方法的試劑和條件，以使得在例如LRRK2多肽和ERM家族多肽，例如膜突蛋白、根蛋白或埃茲蛋白多肽之間的相互作用基本上與人類LRRK2和人類ERM家族多肽，例如膜突蛋白、根蛋白或埃茲蛋白多肽之間的相互作用相同。應(yīng)理解的是，化合物可以結(jié)合到LRRK2多肽，或可以結(jié)合到ERM家族多肽。在所述分析或其它分析中的篩選方法中測試的化合物，可以是(但不必必須是)使用分子建模(modelling)技術(shù)，例如使用計算機技術(shù)選擇的和/或設(shè)計(包括修飾)的化合物，在所述其它分析中，可以檢測化合物調(diào)節(jié)蛋白激酶例如LRRK2多肽的蛋白激酶活性的能力?？梢院铣?如果尚未被合成)所選或設(shè)計的化合物并測試所選或設(shè)計的化合物對LRRK2多肽的效果，例如其對蛋白激酶活性的效果?？梢栽诒景l(fā)明的篩選方法中測試該化合物。測試的化合物可以是已經(jīng)被認為可能能夠調(diào)節(jié)蛋白激酶活性的化合物；或可以是基于可能調(diào)節(jié)蛋白激酶活性而尚未被選出的化合物。因此，測試的化合物可以是形成至少部分總的、未選擇的化合物庫的化合物；或可以選擇性地是形成至少部分預(yù)選擇的化合物庫的化合物，所述預(yù)選擇的化合物庫是例如基于被認為可能調(diào)節(jié)蛋白激酶活性而預(yù)選擇的化合物庫。應(yīng)理解的是，能夠高通量操作的篩選分析將是特別優(yōu)選的。例如，通過使用基于一個膜突蛋白磷酸化位點的底物多肽，例如提供使用結(jié)合到肽的磷酸化形式但不是非磷酸化形式(或反之亦然)的抗體的分析可以是適合的。范例可以包括基于細胞的分析和蛋白-蛋白結(jié)合分析。另一個范例是如本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的基于SPA(閃爍親近分析(ScintillationProximityAssay);AmershamInternational)的系統(tǒng)。例如，可以制備含有閃爍體和底物多肽，例如上述的ERM家族肽底物的珠子。珠子可以與含有"P-或"P-Y-標記的ATP、LRRK2多肽的樣品混合，以及與測試化合物混合。方便地，這在96孔板中完成。然后使用合適的閃爍計數(shù)器，使用已知的32P或33PSPA分析的參數(shù)計數(shù)該板子。只檢測與閃爍體接近的32P或33P，即只有那些結(jié)合到與珠子結(jié)合的底物的32P或33P。也可以使用這種分析的變體，例如其中通過結(jié)合抗體或抗體片段將底物多肽固定在閃爍體珠子上的變體。高通量蛋白激酶活性分析是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的，并且考慮到本文提供的通過LRRK2多肽磷酸化ERM多肽的信息，能被容易地改造。篩選方法可以進一步包括評估在整個細胞、組織或有機體中，化合物是否調(diào)節(jié)ERM家族多肽，例如膜突蛋白，磷酸化(或其它參數(shù)，例如肌動蛋白結(jié)合或膜成分結(jié)合或細胞特征，如上所述)的步驟；和選擇調(diào)節(jié)磷酸化(或其它參數(shù))的化合物的步驟。如上所討論的，化合物可以在整個細胞、組織或具有與帕金森病關(guān)聯(lián)的LRRK2突變的；或過表達LRRK2的有機體中測試?；衔锟梢岳缭谏窠?jīng)元細胞系中測試。因此，在神經(jīng)元細胞系中可以評估化合物對ERM家族多肽，例如膜突蛋白磷酸化的效果。如本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的，可能需要的是評估化合物對于其他蛋白激酶有什么效果。例如，可能需要的是評估化合物對于其他蛋白激酶底物，例如RockII底物的磷酸化的效果，以便區(qū)分LRRK2和ROCK抑制劑。例如，在例如圖20和22所顯示和其中圖例所述的，LRRK2和RocklI的底物偏好性是不同的。作為一個例子，LRRK2不磷酸化MYPT，而RockII磷酸化MYPT。表1.rho相關(guān)激酶(Rock)的已知底物。根據(jù)Kang等人(Biochimie89.p.39-472007)改編的表顯示了已知Rock底物的磷酸化位點。Meriin是埃茲蛋白、根蛋白、膜突蛋白(ERM)相關(guān)蛋白，其具有與膜突蛋白T558相似的但是退化(degenerate)的位點。<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>篩選方法仍可以進一步包括評估化合物是否在整個細胞、組織或有機體中調(diào)節(jié)LRRK2活性的步驟，和選擇調(diào)節(jié)所選活性的化合物的步驟。可在例如在下列鏈接中找到PD模型、生物標記和評估技術(shù)的信息，其中/以其為背景(againstwhich),通過使用本文所述的篩選方法，可進一步測試鑒定的化合物是適當?shù)?，且其中該鏈接是本領(lǐng)域技術(shù)人員可得到的信息代表。http:〃www.ninds.nih.gov/aboutninds/plans/nihparkinsonsagenda.htm#Modelshttp:〃www.sciencedailv.com/releases/2006/07/060729134653.htm(具有線粒體失調(diào)的小鼠模型)http:〃www.sciencedailv.com/releases/2004/10/041005074846.htm(胚胎干細胞模型)http:〃en.wikipedia.org/wiki/Parkinson'sdiseasePD動物模型包括6-羥多巴胺處理的嚙齒動物和MPTP處理的靈長動物。兩者都基于多巴胺能腦細胞的毒性破壞(和某些其它類型)，并且經(jīng)常使用年輕的不然則是健康的動物。因為這些模型再現(xiàn)了帕金森病的某些關(guān)鍵特征，認為其對于測試新出現(xiàn)的新型治療是有用的。，還可以將化合物用于其它測試，例如毒理或代謝測試，如本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。本發(fā)明的篩選方法可以包括合成、純化和/或配制所選化合物的步驟。本發(fā)明還提供制備化合物的方法，該化合物調(diào)節(jié)LRRK2活性或ERM家族多肽的磷酸化，該方法包括1)進行本發(fā)明適當?shù)暮Y選方法，2)合成、純化和/或配制所選化合物。可以配制化合物用于藥學(xué)應(yīng)用，例如用于在動物或人類中的體內(nèi)試驗。本發(fā)明的另一個方面是通過本發(fā)明的篩選方法鑒定的化合物或可M定的化合物。本發(fā)明的另一個方面是用于藥物的本發(fā)明的化合物。本發(fā)明的另一個方面是用于治療帕金森病(例如原發(fā)性帕金森病或遲發(fā)性帕金森病)或帕金森綜合癥的本發(fā)明的化合物?；衔锟梢匀魏魏线m的方式給藥，通常是胃腸外，例如由靜脈、向腹膜內(nèi)、皮下或肌內(nèi)或膀胱內(nèi)，在標準無菌無熱原的稀釋劑和載體配方中使用?；衔镆部删植拷o藥。化合物還可以局限性的方式給藥，例如通過注射。治療可以由一段時間內(nèi)的單一劑量,多劑量組成?；衔锟梢栽谥委熁加信两鹕』蚺两鹕C合癥或有罹患帕金森^或帕金森綜合癥風(fēng)險的患者中有用。同時可能的是本發(fā)明的化合物是單獨給藥，優(yōu)選的是將其作為藥學(xué)配方，與一個或更多的可接受載體一起給出。該載體必須是"可接受的"，意思是與本發(fā)明的化合物是可以配伍的并且對其接受者不是有害的。通常，載體是無菌的和無熱原的水或鹽水。17因此，本發(fā)明還提供含有通過本發(fā)明的篩選方法鑒定的或可鑒定的化合物和藥學(xué)上可接受的載體的藥物組合物。該組合物還可以包括其他化合物或與其他化合物一起給藥，如果適當?shù)脑挘龌衔镌谥委熍两鹕』蚺两鹕C合癥或其它祌經(jīng)變性狀況中有用。本發(fā)明的另一個方面提供純化的制備物或部分的試劑盒，其包括LRRK2多肽(例如如上所述)或多核苷酸(即編碼LRRK2多肽的多核苷酸)和ERM家族多肽(例如如上所述)或多核苷酸(即編碼ERM家族多肽的多核苷酸)。該制備物或試劑盒可以，例如包括重組LRRK2多核苷酸和重組ERM家族多核苷酸。作為另一個例子，該制備物或試劑盒可以選擇性地包括LRRK2和可源自ERM家族多肽，例如膜突蛋白、根蛋白或埃茲蛋白的片段，其含有對應(yīng)于膜突蛋白Thr558殘基的殘基和含有該殘基的至少部分周圍序列，例如該殘基的C-末端和N-末端的至少2、3、4、5、6或7個殘基；例如多肽RLGRDKYKTLRQIRQ或RLGRDKYKTLRQIRQGNTKQR;或在100、80、60、50、40、30、25、20、19、18、17或16個氨基酸以下的多肽，所述多肽含有氨基酸序列RLGRDKYK(T/S)LRQIRQ或RLGRDKYK(T/S)LRQIRQGNTKQR，每個沒有或具有除了如上所述的T/S殘基的多達1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個保守性或非保守性殘基置換。該制備物或試劑盒可以用在本發(fā)明的第一、第二或第三方面的分析中。該試劑盒可以進一步包括特異性結(jié)合配偶體，通常是抗體，其以磷酸化狀態(tài)敏感的方式結(jié)合到含有膜突蛋白(例如人類膜突蛋白)Thr558或Thr526的表位或另一種ERM多肽，例如根蛋白或埃茲蛋白的對應(yīng)部分。術(shù)語"以磷酸化狀態(tài)敏感的方式結(jié)合"是指，當在可磷酸化的部分上被磷酸化時，特異性結(jié)合配偶體能夠結(jié)合到表位(或含有該表位的ERM家族多肽)，但是當其在該表位的可磷酸化部分上未被磷酸化時，不能結(jié)合到表位(或含有該表位的ERM家族多肽)。因此，優(yōu)選地，特異性結(jié)合配偶體在對磷酸化和非磷酸化ERM家族多妖的親和力具有至少5倍，優(yōu)選地IO、20、50、100、200、500、1000、2000或5000倍的差別。在實踐中，使用本領(lǐng)域中的已知方法(見例如，WO03/087400;例如使用磷酸化肽親和柱和非磷酸化肽親和柱親和純化的)制備和純化的/所選的特異性結(jié)合配偶體預(yù)期具有所需的親和力和結(jié)合特異性。術(shù)語"抗體"包括合成抗體和保留了抗原結(jié)合位點的整個抗體的片段和變體(例如如上所述的)?？贵w可以是單克隆抗體，但還可以是多克隆抗體制備物、其部分(例如Fab片段或F(ab')2)或合成抗體或其部分。Fab、Fv、ScFv和dAb抗體片段都可以在大腸桿菌中表達和從大腸桿菌中分泌，因此允許容易地產(chǎn)生大量的所述片段。術(shù)語"ScFv分子"指其中Vh和Vi^配偶體結(jié)構(gòu)域通過易彎曲的寡肽連接的分子。IgG類抗體是優(yōu)選的?？顾x抗原的合適單克隆抗體可以通過己知技術(shù)，例如如上所述修改的那些在"MonoclonalAntibodies:Amanualoftechniques",H.Zola(CRCPress,1988)禾口在"MonoclonalHybridomaAntibodies:techniquesandApplications",JGRHurrell(CRCPress,1982)中揭示的技術(shù)進行制備。雙特異性抗體可以通過細胞融合、通過重新組合單價片段或通過完整抗體的化學(xué)交聯(lián)制備。制備雙特異性抗體的方法在Corvalen等人，(1987)Cawcer/mmww/./wwramA^:24,127-132禾口133-137禾口138-143中揭示。在Winter&Milstein(1991)A^we349，293-299中可發(fā)現(xiàn)上述技術(shù)的總的綜述，所述技術(shù)涉及合成保留其特異性結(jié)合位點的抗體片段。術(shù)語"純化的"指制備物己經(jīng)從其形成時存在的其他成分，例如重組細胞的其他成分中至少部分地分離。可以使用的純化方法的例子在實施例中有描述。制備物可以基本上是純的。術(shù)語"基本上純"的意思是所述多肽基本上沒有其它蛋白。因此，我們包括含有至少2、3、4、5、10、15、20或30重量％的蛋白含量的任何組合物作為所述多肽，優(yōu)選的是至少50%，更優(yōu)選的是至少70%，更優(yōu)選的是至少90%和最優(yōu)選的至少95%的蛋白含量是所述多肽。因此，本發(fā)明還包括含有所述多肽和污染物的組合物，其中污染物占組合物96、95、94、90、85、80或70重量％以下，優(yōu)選的是在組合物的50%以下，更優(yōu)選的是在組合物的30%以下，更優(yōu)選的是在組合物的10%以下和最優(yōu)選的是在組合物的5%以下。當與離體的其它成分結(jié)合時，本發(fā)明還包括基本上純的所述多肽，所述其它成分不是在發(fā)現(xiàn)所述多肽的細胞中發(fā)現(xiàn)的所有成分。本發(fā)明的另一個方面提供能夠表達LRRK2多肽和ERM家族多肽的重組細胞。該細胞可以含有重組LRRK2多核苷酸和重組ERM家族多核苷酸。該細胞可以能夠從編碼所述多肽的內(nèi)源序列過表達LRRK2多肽和/或ERM家族多肽，例如通過使用轉(zhuǎn)錄活化劑的序列特異性靶向技術(shù)。因此，可以以一種方式修飾該細胞，該方式預(yù)期導(dǎo)致相對于未被如此修飾的細胞而言增加的至少一個LRRK2多肽和ERM家族多肽的表達。該細胞可以是原核或真核細胞。例如，其可以是真核細胞，例如昆蟲、酵母或哺乳動物細胞，例如人類細胞。適合的細胞的例子公開在例如實施例中。重組核酸優(yōu)選地適于表達編碼的多肽。重組核酸可以是表達載體的形式。適于表達給定多肽的重組多核苷酸是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的，例子在實施例1中有描述'o本發(fā)明的另一個方面提供含有LRRK2多肽和ERM家族多肽的重組細胞。該細胞可以含有重組LRRK2多肽和重組ERM家族多肽。該細胞可以是根據(jù)本發(fā)明在前方面的細胞。該細胞可以含有比等同細胞至少多1.1、1.2、1.5、2、3、5、10或20倍的LRRK2多肽(和/或ERM家族多肽)，所述等同細胞沒有為了過表達LRRK2多肽或表達重組LRRK2多肽而被修飾。術(shù)語"適于表達"的意思是多核苷酸是可以被翻譯以形成多肽的多核苷酸，例如RNA，或是編碼本發(fā)明多肽的多核苷酸(優(yōu)選的是DNA)以合適的方向和正確的表達閱讀框被插入表達載體，如質(zhì)粒。該多核苷酸可以連接到被任何所需宿主所識別的恰當?shù)霓D(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)節(jié)控制核苷酸序列；這樣的控制序列可以并入表達載體。適于在哺乳動物/真核細胞中復(fù)制的載體的特征是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的，并且在下面給出實施例。應(yīng)理解的是，載體可以同時適于在原核和真核細胞中復(fù)制。已經(jīng)研制出各種方法以可操作地連接多核苷酸，特別是DNA至載體，例如通過互補粘末端。合適的方法在Sambrook等人(1989)Mo/ecw/wC7cm/wg，j丄a6or加o^yA/"wwa/,ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,NY中有描述。修飾編碼本發(fā)明多肽的DNA的所需方式是使用如Saiki等人(1988)Sciew"239,487-491所述的聚合酶鏈反應(yīng)。該方法可以用于將DNA引入合適載體中，例如通過在合適的限制性位點工程化，或其可以以本領(lǐng)域中已知的其它有用方式用于修飾DNA。在該方法中，將被酶法擴增的DNA的旁側(cè)有兩個特異引物，所述引物本身可以并入擴增的DNA。所述特異引物可以含有限制性內(nèi)切酶識別位點，通過使用本領(lǐng)域已知的方法，所述位點可以用于克隆進入表達載體。然后在合適的宿主中表達DNA(或在逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的情況下，RNA)以產(chǎn)生含有本發(fā)明化合物的多肽。因此，根據(jù)己知的并考慮本文含有的教導(dǎo)而適當修飾的技術(shù)，可以使用編碼構(gòu)成本發(fā)明化合物的多肽的DNA來構(gòu)建表達載體，所述載體然后用于轉(zhuǎn)化用于表達和產(chǎn)生本發(fā)明多肽的合適的宿主細胞。這樣的技術(shù)包括那些在1984年4月3日授予Rutter等人的美國專利No.4,440,859，1985年7月23日授予Weissman的4,530,901,1986年4月15日授予Crowl的4,582,800，1987年6月30日授予Mark等人的4,677,063，1987年7月7日授予Goeddel的4,678,751，1987年11月3日授予Itakura等人的4,704,362，1987年12月1日授予Murray的4,710,463，1988年7月12日授予TooleJr.等人的4,757,006，1988年8月23日授予Goeddel等人的4,766,075和1989年3月7日授予Stalker的4,810,648中揭示的技術(shù)，其全部通過引用并入本文。為了引入合適的宿主，編碼多肽的DNA(或在逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的情況下，RNA)可以與廣泛種類的其它DNA序列結(jié)合。伴侶DNA將依靠于宿主的性質(zhì)、將DNA引入宿主的方式和是否需要附加型維持或整合。通常，以合適的方向和正確的表達閱讀框，將DNA插入表達載體，例如質(zhì)粒。如果需要，DNA可以與所需宿主識別的合適的轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)節(jié)控制核苷酸序列連接，雖然這樣的控制通常是在表達載體中可獲得的。然后通過標準技術(shù)將載體引入宿主。通常，不是所有的宿主都能被載體轉(zhuǎn)化。因此，有必要選擇轉(zhuǎn)化的宿主細胞。一種選擇技術(shù)涉及將DNA序列與具有編碼轉(zhuǎn)化細胞中的可選擇特性的任何必需的控制元件，如抗生素抗性的任何對照元件一起并入表達載體。或者，負責這樣的可選擇特性的基因可以在另一個載體上，所述另一個載體用于共轉(zhuǎn)化所需宿主細胞。然后將已經(jīng)轉(zhuǎn)化了本發(fā)明重組DNA的宿主細胞以足夠的時間并在考慮到本文公開的技術(shù)的本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的合適的條件下培養(yǎng)細胞，以便允許表達其然后可以被回收的多肽。許多表達系統(tǒng)是已知的，包括細菌(例如大腸桿菌Eco//和枯草芽孢桿菌Sac/〃^raZ^'fo)、酵母(例如釀酒酵母Sacc;araw少c^cweWw'ae、絲狀真菌(例如曲霉^^erg///^)、植物細胞、動物細胞和昆蟲細胞。載體包括原核復(fù)制子，如ColElon'，用于在原核細胞中繁殖，即使該載體將用于在其它非原核細胞類型中表達。該載體還可以包括合適的啟動子如原核啟動子，所述啟動子能夠在細菌宿主，例如用其轉(zhuǎn)化的大腸桿菌中指導(dǎo)表達(轉(zhuǎn)錄和翻譯)基因。啟動子是由DNA序列形成的表達控制元件，其允許RNA聚合酶結(jié)合和轉(zhuǎn)錄發(fā)生。與范例細菌宿主相容的啟動子序列通常是在質(zhì)粒載體中提供的，所述載體含有方便的用于插入本發(fā)明DNA片段的限制性位點。典型的原核載體質(zhì)粒是可從BiomdLaboratories,(Richmond,CA,美國)獲得的pUC18、pUC19、pBR322和pBR329和可從Pharmacia,Piscataway,NJ,美國獲得的P7>r99A和pKK223-3。典型的哺乳動物細胞載體質(zhì)粒是可從Pharmacia,Piscataway,NJ,美國獲得的pSVL。該載體使用SV40晚期啟動子以驅(qū)動克隆基因的表達，最高水平的表達在T抗原-產(chǎn)生細胞，如COS-l細胞中發(fā)現(xiàn)?？烧T導(dǎo)的哺乳動物表達載體的例子是pMSG，也可從Pharmacia獲得。該載體使用小鼠乳房腫瘤病毒長末端重復(fù)的糖皮質(zhì)激素-誘導(dǎo)的啟動子以驅(qū)動克隆基因的表達。有用的酵母質(zhì)粒載體是pRS403-406禾BpRS413-416,其通常從StratageneCloningSystems,LaJolla,CA92037，美國獲得。質(zhì)粒pRS403、pRS404、pRS405和pRS406是酵母整合質(zhì)粒(YeastIntegratingplasmids(YIp))并且整合酵母選擇性標記Z/d7T尸7、Z五t/2和WL^。質(zhì)粒pRS413-416是酵母著絲粒質(zhì)粒(YCp)。宿主細胞可以是原核或真核的。細菌細胞是優(yōu)選的原核宿主細胞并且通常是大腸桿菌的菌株，如，例如可從B6thesdaResearchLaboratoriesInc.,Bethesda,MD,美國獲得的大腸桿菌菌株DH5，和可從Rockville,MD美國的AmericanTypeCultureCollection(ATCC)獲得的RR1(NoATCC31343)。優(yōu)選的真核宿主細胞包括酵母、昆蟲和哺乳動物細胞，優(yōu)選的是脊椎動物細胞如那些來自小鼠、大鼠、猴或人類成纖維細胞系的細胞。酵母宿主細胞包括通?？蓮腟tratageneCloningSystems,LaJolla，CA92037美國獲得的YPH499、YPH500和YPH501。優(yōu)選的哺乳動物宿主細胞包括人胚腎293細胞(見實施例1)，可從ATCC作為CCL61獲得的中國倉鼠卵巢(CHO)細胞，可從ATCC作為CRL1658獲得的NIH瑞士小鼠胚胎細胞NIH/3T3，和可從ATCC作為CRL1650獲得的猴腎-來源的COS-l細胞。優(yōu)選的昆蟲細胞是可以用桿狀病毒表達載體轉(zhuǎn)化的Sf9細胞。用DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)化合適的細胞宿主是通過通常依賴使用的載體類型的熟知方法完成的。關(guān)于轉(zhuǎn)化原核宿主細胞，見例如Cohen等人(1972)—/Voc.—Ato/.—^c。d69,2110禾口Sambrook等人(1989)Afo/ecw/arC7om'"g，爿Za6orato/jAfowwa/，ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,NY。轉(zhuǎn)化酵母細胞在Sherman等人(1986)7l^osfGewWos,爿丄a6oratoryMawwa/,ColdSpringHarbor,NY中有描述。Beggs(1978)AWww275，104-109的方法也是有用的。關(guān)于在轉(zhuǎn)染這樣的細胞中有用的脊椎動物細胞、試劑，例如磷酸鈣和二乙氨(基)乙基葡聚糖(DEAE-dextran)或脂質(zhì)體配方，可從StratageneCloningSystems或LifeTechnologiesInc.,Gaithersburg，MD20877美國獲得。電穿孔也對轉(zhuǎn)化和/或轉(zhuǎn)染細胞是有用的并且在轉(zhuǎn)化酵母細胞、細菌細胞、昆蟲細胞和脊椎動物細胞的領(lǐng)域中是熟知的。例如，許多細菌物種可以通過Luchansky等人(1988)Mo/.M/craWo/.2，637-646中所述的方法轉(zhuǎn)化，該文獻通過引用并入本文。在25:FD使用每cm6250V,將懸浮于2.5XPEB的DNA-細胞混合物電穿孔之后一致性地回收最大數(shù)量的轉(zhuǎn)化體。通過電穿孔轉(zhuǎn)化酵母的方法在Becker&Guarente(1990)Afe^zoA￡"^wo/.194,182中公開?！?成功轉(zhuǎn)化的細胞，即含有本發(fā)明DNA構(gòu)建體的細胞，可以通過熟知技術(shù)鑒定。例如，從導(dǎo)入本發(fā)明的表達構(gòu)建體獲得的細胞可以被培養(yǎng)而產(chǎn)生本發(fā)明的多肽。可以收集和裂解細胞并且通過使用如Southern(1975)Mo/.說o/.98,503或Berent等人(1985)說ofcc/z.3,208所述的方法可以檢查其DNA含量而確定DNA的存在。除了直接分析重組DNA的存在，當重組DNA能夠指導(dǎo)蛋白表達時，成功的轉(zhuǎn)化可以通過熟知的免疫方法證實。例如，成功地用表達載體轉(zhuǎn)化的細胞產(chǎn)生顯示適當抗原性的蛋白。收集懷疑被轉(zhuǎn)化的細胞樣品并且使用合適抗體分析蛋白。因此，除了轉(zhuǎn)化的宿主細胞本身，本發(fā)明還考慮那些細胞的培養(yǎng)物，優(yōu)選的是單克隆(克隆同質(zhì)的)培養(yǎng)物，或在營養(yǎng)培養(yǎng)基中的源自單克隆培養(yǎng)物的培養(yǎng)物。'用于產(chǎn)生本發(fā)明制備物的本發(fā)明的另一個方面包括從根據(jù)本發(fā)明的細胞純化制備物的步驟。培養(yǎng)宿主細胞和分離重組蛋白的方法在本領(lǐng)域中是熟知的。合適的純化技術(shù)的例子在實施例中有描述。例如，制備物的一個或更多成分可以被標記以通過使用親和試劑幫助純化，如本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的和實施例中所述的。22還可以使用色譜技術(shù)，例如在實施例中所述的。本發(fā)明另一個方面提供通過本發(fā)明在前方面的方法獲得的或可獲得的制備物。制備物可以包括，例如標記的LRRK2多肽和ERM家族多肽。本發(fā)明的第一、第二或第三方面的方法可以用本發(fā)明制備物形式的LRRK2多肽和ERM家族多肽進行;或通過上述方法獲得的或可獲得的制備物或復(fù)合物進行;或在本發(fā)明的細胞中進行。上面的多肽可以通過本領(lǐng)域熟知的方法和下面描述的方法和在實施例1中的方法制備，例如通過使用分子生物學(xué)方法或自動化學(xué)肽合成方法。應(yīng)理解的是，素擬肽(peptidomimetic)化合物也可以有用。因此，術(shù)語"多肽"或"肽"不僅包括其中氨基酸殘基通過肽(-CO-NH-)鍵結(jié)合的分子，還包括其中肽鍵是反向的分子。這種向后相反(retro-inverso)的素擬肽可以通過使用本領(lǐng)域已知的方法制備，例如那些在M9zinre等人(1997)J！/附附柳o/.159,3230-3237(并入本文作為參考)中描述的。這一方法涉及制備含有涉及骨架，而不是側(cè)鏈方向變化的假肽(pseudopeptides)。Meziere等人(1997)顯示，至少對于MHCII類和T輔助細胞反應(yīng)，這些假肽是有用的。含有NH-CO鍵而不是CO-NH肽鍵的向后相反的肽對蛋白水解更加有抗性。相似地，假如使用保留氨基酸殘基的CI原子之間間距的合適連接部分(moiety)，可以完全省掉肽鍵；特別優(yōu)選的是，該連接部分具有與肽鍵基本上相同的電荷分布和基本上相同的平面性。應(yīng)理解的是，可以方便地在N-或C-末端封閉肽，以便幫助減少對外切蛋白酶消化的易感性。因此，應(yīng)理解的是，LRRK2或更優(yōu)選地，ERM家族多肽可以是素擬肽化合物。包括編碼LRRK2多肽的重組多核苷酸和編碼ERM家族多肽的重組多核苷酸的本發(fā)明部分的試劑盒可以用于形成制備物或復(fù)合物，該制備物或復(fù)合物可以用于例如本發(fā)明的第一、第二或第三方面的篩選方法。重組多核苷酸可以在表達載體中(例如如上所述)或(較不希望)用于體外表達。如上所述，ERM家族多肽可以是包含人類膜突蛋白殘基Thr558的肽。本發(fā)明的另一個方面提供在2000氨基酸以下的截短的LRRK2多肽，其在底物ERM家族多肽(例如包括如上述的人類膜突蛋白殘基Thr558的肽)上具有蛋白激酶活性，包含至少GTPase結(jié)構(gòu)域、COR結(jié)構(gòu)域、激酶結(jié)構(gòu)域、WD40-樣基序和野生型人類LRRK2或其變體或天然存在突變體的C-末端尾殘基。截短的LRRK2多肽可以不含有富含亮氨酸重復(fù)(LRR)的基序。截短的LRRK2多肽可以含有或由至少野生型人類LRRK2或其變體或天然存在突變體的1326-2527殘基組成。如上所述，據(jù)認為，在C-末端截短可以不利地影響截短的LRRK2多肽的蛋白激酶活性，同時，可以較好地容忍在片段N-末端的截短。因此，截短的LRRK2多肽的N-末端可以可選地位于殘基1326之后，例如在殘基1326和約殘基1336之間。因此，本發(fā)明的多肽的例子是LRRK2多肽GST-LRRK2[1326-2527,G2019S]或GST-LRRK2[1326-2527]。本發(fā)明的另一個方面提供一種底物多肽，其是可源自ERM家族多肽，例如膜突蛋白、根蛋白或埃茲蛋白的片段，其包含對應(yīng)于膜突蛋白Thr558殘基的殘基和至少部分包括該殘基的周圍序列，例如該殘基C-末端和N-末端的至少2、3、4、5、6或7個殘基；例如多肽RLGRDKYKTLRQTRQ或RLGRDKYKTLRQIRQGNTKQR;或含有氨基酸序列RLGRDKYK(T/S)LRQIRQ或RLGRDKYK(T/S)LRQIRQGNTKQR的在100、80、60、50、40、30、25、20、19、18、17或16個氨基酸以下的多肽，每個均沒有或具有達l、2、3、4、5、6、7、8、9或10個保守或非保守的不是如上所述的T/S殘基的殘基替代物。底物多肽可以包含氨基酸序列RLGRDKYK(T/S)LRQIRQ或RLGRDKYK(T/S)LRQIRQGNTKQR，每個均沒有或具有達l、2、3、4、5、6、7、8、9或10個保守或非保守的不是T/S殘基的殘基替代物。本發(fā)明的另，個方面提供編碼本發(fā)明的截短的LRRK2多肽的多核苷酸。本發(fā)明的另一個方面提供編碼本發(fā)明底物多肽的多核苷酸。多核苷酸可以是適于在哺乳動物/真核細胞中復(fù)制和/或表達多肽的載體。本發(fā)明的另一個方面是適合于表達本發(fā)明多肽的重組多核苷酸。多核苷酸或重組多核苷酸可以是DNA或RNA，優(yōu)選是DNA。多核苷酸在編碼序列中可以含有或不含有內(nèi)含子，優(yōu)選地，多核苷酸是或含有cDNA。本發(fā)明的另一個方面提供磷酸化ERM家族多肽的方法，其中ERM家族多肽被LRRK2多肽磷酸化。通過該方法磷酸化的ERM家族多肽可以是部分或完全去磷酸化的ERM家族多肽。本發(fā)明的另一個方面提供LRRK2多肽在磷酸化ERM家族多肽的方法中的用途。ERM家族多肽可以優(yōu)選地在對應(yīng)于全長人類膜突蛋白Thr558的蘇氨酸殘基上被磷酸化，但還可以或可選地在對應(yīng)于全長人類膜突蛋白Thr526的蘇氨酸殘基上被磷酸化。應(yīng)理解的是，如果ERM家族多肽已經(jīng)被磷酸化，進一步的磷酸化是不可能的。應(yīng)進一步理解的是，從細胞中分離的ERM家族多肽(或者作為內(nèi)源的或重組的多肽)就其磷酸化狀態(tài)可以是異質(zhì)的。例如，完全磷酸化的、完全去磷酸化的和/或部分磷酸化的ERM家族多肽的分子可以存在于單細胞或細胞的集合/培養(yǎng)物中。本發(fā)明的另一個方面提供鑒定LRRK2突變體，例如在患有帕金森病的患者中發(fā)現(xiàn)的LRRK2突變體的方法，該方法包括評估LRRK2突變體磷酸化底物ERM家族多肽的能力的步驟。該方法可以包括測定LRRK2突變體對于ERM家族多肽的Km和/或Vmax的步驟。這樣的鑒定可以用于研究潛在的帕金森病或帕金森綜合癥的機理。本文提及的所有文獻并入本文作為參考。.現(xiàn)在通過參考下列非限制性的附圖和實施例更詳細地描述本發(fā)明。圖例圖1.產(chǎn)生用于KESTREL篩選的活性LRRK2片段。(上面的圖)LRRK2結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)的圖解表述顯示預(yù)測的功能性結(jié)構(gòu)域、對應(yīng)于人類LRRK2(登錄號AAV63975)殘基的編號?？s寫LRR(富含亮氨酸的重復(fù))、COR(Ras保守基序的C-末端)、KD(絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶結(jié)構(gòu)域)。以編碼GST-LRRK2的指明形式的構(gòu)建體轉(zhuǎn)染293細胞。轉(zhuǎn)染后36小時，親和純化LRRK2激酶并且用聚丙烯酰胺凝膠電泳分析并且用膠體藍(colloidalblue)染色以定量相對的蛋白水平。通過在聚丙烯酰胺凝膠上電泳和隨后對應(yīng)于MBP或LRRK2的膠體藍染色的條帶的放射自顯影測定MBP的磷酸化和LRRK2的自磷酸化而分析GST-LRRK2。*指示污染GSf-LRRK2制備物的蛋白。在3個單獨的實驗中獲f尋了相似的結(jié)果。圖2.LRRK2[G2019S]KESTREL篩選。(A至D)從大鼠大腦中抽提的不結(jié)合肝素瓊脂糖的蛋白(圖9)連續(xù)地在指明的柱上色譜分離。特定的組分在存在(+)或無(-)GST-LRRK2[1326-2527,G2019S]和在材料和方法中所述的[,P]-ATP時被磷酸化。在樣品的聚丙烯酰胺電泳和放射自顯影后分析底物的磷酸化。將膜突蛋白和肌酸激酶鑒定為磷酸化的底物在圖3中確立。圖3.將膜突蛋白鑒定為LRRK2底物。將在至Superdex之前進一步在Source-Q中純化的含有與肝素-瓊脂糖相互作用的62kDa底物(CRMP2)的Superdex200柱的組分10-15(圖10)、含有68kDa底物(膜突蛋白)的Superdex200柱的組分12-15(圖2)和含有43kDa底物(肌酸激酶)的Q-柱的組分11用VivaScience旋轉(zhuǎn)濾器濃縮。在無(-)或有(+)GST-LRRK2[1326-2527，G2019S]和在材料和方法中所述的[,P]-ATP時磷酸化樣品。在樣品的聚丙烯酰胺凝膠電泳和放射自顯影之后分析底物的磷酸化。在相同的凝膠上跑所有的樣品，但是將顯示的條帶切割并且貼在一起以便簡化數(shù)據(jù)。黑色線指示凝膠在那里被切割。被LRRK2磷酸化的膠體藍染色的條帶(用*標記)從凝膠上切下，用胰蛋白酶在凝膠中消化，通過胰蛋白酶肽質(zhì)譜指紋圖譜確定其身份。Mascot得分是其中>63的值被認為是顯著的(P<0.05)的地方。圖4.鑒定膜突蛋白上被LRRK2磷酸化的殘基。(A)將大腸桿菌表達的膜突蛋白在65'C孵育15分鐘，然后以GST-LRRK2[1326-2527，G2019S]和[,P]-ATP以所述的次數(shù)磷酸化。在聚丙烯酰胺凝膠電泳和隨后的膠體藍染色的對應(yīng)于膜突蛋白的條帶的放射自顯影之后測定膜突蛋白的磷酸化。在3個單獨的實驗中獲得相似的結(jié)果。(B)將以GST-LRRK2[1326-2527,G2019S]磷酸化40分鐘后的32P-標記的膜突蛋白用胰蛋白酶消化并且在C18柱上色譜分離。顯示了含有主要的32P-標記的胰蛋白酶肽(Pl)、肽(P2)和肽(P3)的組分并且在色譜的其它組分中未觀察到其它主要的"P-標記的肽。(c)將所述的肽進行固相測序并且測定在每個Edman降解循環(huán)后釋放的3￥-放射性。(D)還通過MALDI-TOF-TOF質(zhì)譜分析了肽并且指示出推斷的氨基酸序列和用(p)表示的磷酸化位點，以及每條肽觀察到的和理論的質(zhì)量。(E)如在(A)中一樣，除了所述的野生型和突變體形式的膜突蛋白用GST-LRRK2[1326-2527，G2019S]磷酸化30分鐘。在2個單獨的實驗中獲得相似的結(jié)果。圖5.以LRRK2分析膜突蛋白磷酸化(A)大腸桿菌表達的GST-膜突蛋白(1nM)在標明的溫度孵育15分鐘，然后以GST-LRRK2[1326-2527，G2019S](上面圖)或ROCK-II(下面圖)在30°C磷酸化。在聚丙烯酰胺凝膠電泳和隨后的對應(yīng)于膜突蛋白的膠體藍染色條帶的放射自顯影后測定膜突蛋白的磷酸化。(B和C)如在(A)中一樣，除了通過在以活性GST-LRRK2[1326-2527,G2019S]或激酶非活性的(KI)GST-LRRK2[1326-2527，D2017A]或ROCKII磷酸化之前在7(TC孵育15分鐘將所述野生型和截短形式的膜突蛋白(濃度都為1pM)"熱變性"。在2個單獨的實驗中獲得相似的結(jié)果。在凝膠條帶上的數(shù)字表示與MBP(B)或膜突蛋白[500-577]相比相對的磷酸化(C)未經(jīng)熱變性的。(D)如上述一樣，除了分析了以GST-LRRK2[1326-2527,G2019S]磷酸化大腸桿菌表達的GST-埃茲蛋白和GST-根蛋白的全長野生型和所述突變體。圖6.產(chǎn)生LRRK2的肽底物。(A)以編碼所述活性形式和激酶非活性形式(KI,D2017A)的GST-LRRK2的構(gòu)建體轉(zhuǎn)染293細胞。轉(zhuǎn)染后36小時，親和純化LRRK2激酶并且用聚丙烯酰胺凝膠電泳分析并且用膠體藍染色而定量相對的蛋白水平。通過測定300的LRRKtide肽(RLGRDKYKTLRQIRQ)的磷酸化分析GST-LRRK2，如材料和方法中所述。將激酶催化分析的結(jié)果以3次重復(fù)進行的分析的平均催化活性±S.D.的形式顯示。顯示的結(jié)果是2-3個獨立實驗的代表。(B)如在(A)中一樣，除了LRRKtide的濃度有變化以便能夠計算Vm^和Km的酶的參數(shù)。圖7.PD疾病LRRK2突變體的分析。圖解表述顯示在我們分析的LRRK2上的9個造成PD的突變的位置(縮寫同圖l中一樣)。(B)非突變的和所述突變形式的GST-LRRK2[1326-2527]在293細胞中表達并且在谷胱甘肽-瓊脂糖上親和純化。通過聚丙烯酰胺凝膠電泳分析2.0嗎的每個制備物，凝膠用膠體藍染色以便定量相對的蛋白水平。通過測定MBP、膜突蛋白[500-577]和LRRKtide肽的自磷酸化以及磷酸化分析每個制備物。將LRRKtide磷酸化的數(shù)據(jù)作為在3次重復(fù)中進行的分析的平均特異性活性(在純化的GST-LRRK2制備物中的每mg總蛋白的單位)土S.D.展示。顯示的結(jié)果是2-3個獨立實驗的代表?？s寫WT:野生型；KI:激酶非活性(D2017A)LRRK2。圖8.非激酶結(jié)構(gòu)域在調(diào)節(jié)LRRK2活性中的作用。(A)(上面圖)LRRK2的結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)的圖解表述顯示預(yù)測的功能性結(jié)構(gòu)域和對應(yīng)于人類LRRK2殘基(登錄號AAV63975)的殘基的編號?？s寫同圖1中一樣。GST-LRRK2的野生型和所述片段在293細胞中表達并在谷胱甘肽-瓊脂糖上親和純化。通過聚丙烯酰胺凝膠電泳分析1.0嗎每個制備物，其以聚丙烯酰胺凝膠電泳分析并且用抗-GST抗體免疫印跡以便定量相對的蛋白水平。還通過測定MBP、膜突蛋白[500-577]和LRRKtide的自磷酸化以及磷酸化分析每個制備物。將LRRKtide分析的數(shù)據(jù)作為在3次重復(fù)中進行的分析的平均特異性活性(在純化的GST-LRRK2制備物中的每mg總蛋白的單位)土S.D.顯示。(B)如(A)中一樣，除了通過使用LRRKtide底物分析GST-LRRK2[1327-2527,G2019S]的所述C-末端點突變體和小C-末端截短物的效果。顯示的結(jié)果是2-3個獨立實驗的代表?？s寫WT:野生型；KI:激酶非活性(D2017A)LRRK2。圖9.在293細胞中各種形式的GSTLRRK2的表達。(上面圖)LRRK2結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)的圖解表述顯示預(yù)測的功能性結(jié)構(gòu)域和對應(yīng)于人類LRRK2殘基(登錄號AAV63975)的殘基的編號?？s寫LRR(富含亮氨酸重復(fù))、COR(Ras保守基序的C-末端)、KD(絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶結(jié)構(gòu)域)。用編碼所述形式的GST-LRRK2的構(gòu)建體轉(zhuǎn)染293細胞。轉(zhuǎn)染后36小時，親和純化LRRK2激酶并且通過聚丙烯酰胺凝膠電泳分析并用膠體藍染色以便定量相對的蛋白水平。在聚丙烯酰胺凝膠電泳后，通過測定LRRK2的自磷酸化分析GST-LRRK2。圖10.LRRK2[G2019S]KESTREL篩選。將從大鼠大腦中提取的蛋白用60%硫酸銨沉淀、脫鹽并且在肝素-瓊脂糖柱上色譜分離。將所述組分的等份變性然后將其在有(+)或無(-)GST-LRRK2[1326-2527,G2019S〗和在材料和方法中所述的iMn-[,P]-ATP時磷酸化。在樣品聚丙烯酰胺凝膠電泳和放射自顯影后分析底物的磷酸化。在圖3中確立了作為磷酸化底物的CRMP2和肌酸激酶的身份。圖ll.通過LRRK2進行的MBP的磷酸化的分析。(A)在與用于磷酸化膜突蛋白(圖4B)相同的條件下以GST-LRRK2[1326-2527,G2019S]磷酸化40分鐘后的32P-標記的MBP。每摩爾MBP只磷酸化0.01摩爾的32P。用胰蛋白酶消化磷酸化的MBP并且在C18柱上色譜純化。顯示了含有主要的"P-標記的胰蛋白酶肽的組分(Pl-P5)。在色譜的其它組分中未觀察到其它主要的^P-標記的肽。(B)將所述肽進行固相測序并且測定在每個Edman降解后釋放的34-放射性。(C)還通過MALDI-TOF-TOF質(zhì)譜分析了肽并且指出推斷的氨基酸序列和通過(p)表示的磷酸化位點以及每個肽的觀察到的和理論的質(zhì)量。一圖12.在LRRK2上的自磷酸化位點的分析。(A)將GST-LRRK2[1326-2527]的所述活性形式和激酶非活性(KI)形式在存在100^MATP時孵育40分鐘。將樣品進行聚丙烯酰胺電泳并且將對應(yīng)于GST-LRRK2[1326-2527]的考馬斯染色條帶切下并用胰蛋白酶消化。通過LC-MS和MS/MS的聯(lián)合分析鑒定磷酸肽。圖顯示27源自GST-LRRK2[1326-2527](藍)、KI-GST-LRRK2[1326-2527,D2017A](綠)、GST-LRRK2[1326-2527,G2019S](紅)的磷酸肽的信號強度(cps,每秒檢測到的離子的計數(shù))對離子分布(m/z)。我們能夠通過質(zhì)譜鑒定的磷酸化的肽用Pa至Pf標記。當肽中磷酸化的確切位點不能確定時，其在表中以一個指出。圖13.LRRK2上的自磷酸化位點的突變不影響活性。非突變的GST-LRRK2[1326-2527]和GST-LRRK2[1326-2527]的所述自磷酸化位點突變體在293細胞中表達并在谷胱甘肽-瓊脂糖上親和純化。通過聚丙烯酰胺凝膠電泳分析它們并且用膠體藍染色以便定量相對的蛋白水平。通過測定對LRRKtide肽的活性分析每個制備物。數(shù)據(jù)作為在3次重復(fù)中進行的分析的平均催化活性±S.D.顯示。圖14.人類ERM家族多肽的序列比對。圖15.通過LRRK2進行的膜突蛋白磷酸化的分析。(A)埃茲蛋白、根蛋白和Merlin的C-末端區(qū)域的序列比對。星號指示了等同于膜突蛋白Thr555的殘基。黑色和灰色陰影的殘基分別代表相同和同源的殘基。(B)大腸桿菌表達的全長GST-膜突蛋白、GST-埃茲蛋白、GST-根蛋白或GST-膜突蛋白[500-577]、C-末端片段(C'膜突蛋白)或者置于冰上(-)或者在7(TC孵育15分鐘(+)，然后以GST-LRRK2[1326-2527，G2019S]磷酸化。在聚丙烯酰胺凝膠電泳和隨后對應(yīng)于膜突蛋白的膠體藍染色條帶(右圖)的放射自顯影后(左圖)測定ERM家族蛋白的磷酸化。圖16.在膜突蛋白上主要的LRRK2磷酸化肽的MALDI-ToF-ToF分析。通過使用在50%乙腈、0.1%三氟乙酸中的5mg/ml的a-氰基-4-羥基肉桂酸作為基質(zhì)在反射模式的AppliedBiosystems4700蛋白質(zhì)組分析儀上分析在源自圖4A中顯示的實驗的肽P2。通過y7(-98)+離子的存在顯示從該肽中H3P04的丟失。在分析圖4A中顯示的Pl和P3肽時觀察到相似的98Da的特征性丟失。圖17.在LRRK2激酶活性上的PD相關(guān)突變的分析。在292細胞中表達Flag表位標記的LRRK2全長野生型(WT)、激酶死亡(KD)和突變cDNA等位基因并且通過使用單克隆M2抗FLAG瓊脂糖樹脂通過免疫親和色譜法純化它們。當[Y~32P]ATP存在時分析抗LRRKtide的免疫復(fù)合物。特異性活性是對于LRRK2的量校正的摻入LRRKtide的32P的cpm，其通過LICOR通過免疫印跡定量測定。G2019S突變引起約2倍活性的增加，而A1442P、R194lH、I2012T、I2020T和G2385R引起活性的降低。圖18.膜突蛋白、根蛋白、埃茲蛋白和meriin作為LRRK2的底物的評估。ERM蛋白和merlin的羧基末端作為GST融合體在細菌中生產(chǎn)。產(chǎn)生的片段和突變?nèi)缦履ね坏鞍装被?00末端、野生型和T558A;埃茲蛋白氨基酸505末端、野生型和T567A;根蛋白氨基酸503末端、野生型和T664A;和merlin514末端野生型和T567A。通過在["P]ATP存在時的體外激酶反應(yīng)測定LRRK2和Rock修飾這些蛋白的能力。重組GST-LRRK1326末端如所述方法(Jaleel等人BiochemJ2007，405(2):307-17)制備。Rock是從昆蟲細胞中純化的組成性活性片段2-543氨基酸。通過SDS-PAGE和考馬斯藍染色(CB)，然后通過放射自顯影("P)評估反應(yīng)產(chǎn)物。LRRK2容易地修飾在所有ERM蛋白，尤其是merlin上的相似的T558位點，這表明其是LRRK2的新型的體外底物。Rock還在T558位點和相似的ERM殘基上修飾ERM蛋白，但是其不在T567上磷酸化merlin，這表明其顯示與LRRK2不同的底物決定因素。圖19.在重組蛋白中LRRK2磷酸化位點決定因素的闡明。A.顯示在左圖中，將膜突蛋白500末端T526A進行定點突變，其中將磷酸化位點的-8至+8位置的氨基酸變成丙氨酸。在右圖中，將膜突蛋白500末端T526A進行定點突變，其中將膜突蛋白的指明的殘基用指明的殘基替代。將這些蛋白用LRRK2和Rock進行體外激酶反應(yīng)并且通過SDS-PAGE和考馬斯藍染色(CB)然后通過放射自顯影("P)評估反應(yīng)產(chǎn)物。B.用編號和指明的殘基位置顯示在膜突蛋白(moesing)T558磷酸化位點周圍的殘基的序列。圖20.在肽中的LRRK2磷酸化位點決定因素的闡明。為了進一步研究與Rock相比指導(dǎo)LRRK2識別LRRKtide的氨基酸決定因素，合成了單獨的肽，其中LRRKtide的殘基-6至+5以Ala、3A和C替代。另外，合成了其中殘基也變成圖19B和D中指明的殘基的肽。具有Thr558位點+7至+12殘基的較長的LRRKtide(長)與LRRKtide比較。檢測LRRK2(A和B)和Rock(C和D)的濃度依賴的肽磷酸化。4泣f將Gly552置換至Ala對LRRK2和Rock識別重組蛋白底物具有中度的效果。這與LRRK2以552A改變而修飾肽相似，但是對于Rock負面效果更加明顯，因為其更多地降低反應(yīng)速率。-5泣f將Arg553置換成Ala減少重組蛋白以及LRRK2和Rock的肽的修飾。4位f重組蛋白數(shù)據(jù)顯示，LRRK2和Rock不喜歡在-4位置的酸性殘基，其通過當該殘基變成Ala時信號的增加而證實。對于LRRK2，當通過肽磷酸化分析時，在該位置上去除負電荷的正面效果較不明顯；但是，對于通過增加肽的反應(yīng)速率顯示的Rock是明確顯著的。-重組蛋白數(shù)據(jù)顯示，在LRRK2的-3位置上堿性殘基(K555〉是較為不利的，這通過當該殘基變成Ala時信號的增加而證明。但是對于Rock，在該位置上的堿性殘基似乎是有利的，因為至Ala或Glu酸的突變阻礙磷酸化。對于LRRK2和Rock，在該位置上Pro殘基是非常易于接受的。在LRRK2中未見到增強的K555A肽的修飾并且通過反應(yīng)速率的減少，Rock對于在555上的堿性殘基的偏愛是明顯的。-2泣g.將Tyr556置換成Ala將LRRK2磷酸化重組蛋白降低至近背景水平并且顯著地減少通過Rock的磷酸化。另夕卜，Tyr556至Pro、Glu或Arg也對于LRRK2識別底物具有不利的效果。當在LRRKtide的背景下評估置換，將概述所有這些觀察。有趣的是對于Rock，Rock微弱修飾Tyr556Pro突變體并且Tyr556Glu置換的負電荷完全阻礙了通過Rock的磷酸化。這些結(jié)果也用肽磷酸化概述。在-2位置上的堿性電荷Tyr556Arg導(dǎo)致通過Rock的磷酸化的大量增加。盡管556R肽被磷酸化至與野生型相似的水平。這些結(jié)果標明，在-2位置上的疏水殘基對于LRRK2是必需的并且堿性電荷是Rock最優(yōu)選的。-7泣f將Lys557置換成Ala導(dǎo)致減少通過LRRK2的修飾和完全阻礙通過Rock的磷酸化。當在肽中Lys557被改變時這一效果更顯著并且反應(yīng)速率值在野生型的一半以下。+7泣#,在重組蛋白中，將Leu559置換成Ala、Phe、Gly、Lys、Pro或Tyr對于通過LRRK2的磷酸化有很少的效果至無效果，但是Leu559至Glu的改變是不利的。當在LRRKtide的背景下分析Leu559Ala時，反應(yīng)速率減少至約野生型的一半。但是，在+l位置上的Leu似乎對于通過Rock的底物識別是關(guān)鍵的，因為在重組蛋白或LRRKtide中分析的在該位置上的任何突變均阻礙磷酸化。對于LRRK2和Rock，在該位置上堿性殘基是優(yōu)選的^將Arg560置換成Ala、Pro或Glu阻礙通過這2種激酶的磷酸化。當在LRRKtide的背景下分析Arg560至Ala、Pro或Glu時，LRRK2不能磷酸化該肽。對于Rock，將Arg560置換成Ala或Pro降低反應(yīng)速率但不完全，Pro置換顯示輕微降低的親和力。將Gln561改變至Ala對于LRRK2或Rock修飾重組底物的能力顯示可忽略不計的效果。對于LRRK2，當通過肽磷酸化分析時，該效果也是最小的，反應(yīng)速率只有輕微的降低。但是對于Rock，當在LRRKtide中用Ala置換Gln561時，可見反應(yīng)速率的明顯改變。將Ile562置換成Ala減少LRRK2對重組底物以及肽底物的磷酸化。這一置換增加Rock對重組底物的修飾但是輕微減少對肽底物的磷酸化。將Arg563改變?yōu)锳la、Pro或Glu對于重組蛋白底物識別LRRK2具有中度的效果；但是，Rock更易接受在重組蛋白中的Ala和Glu的置換但不是Pro的置換。在LRRKtide中Ala的置換引起對于Rock反應(yīng)速率的中度效果，但是在LRRK2中可見速率的嚴重減少。Pro和Glu的置換563阻礙通過LRRK2的磷酸化，可見有這些改變的Rock的反應(yīng)速率的降低。將Gln564置換成Ala減少LRRK2和Rock對重組底物的修飾。+7體將Gly564置換成Ala輕度減少LRRK2和Rock對重組底物的修飾。十S體將Asn564置換成Ala輕微增加LRRK2對重組底物的修飾并且輕微減少Rock對重組底物的磷酸化。圖21.LRRK2顯示對于具有羧基末端延伸的較長LRRKtide的較高親和力。具有Thr558位點+7至+12殘基的較長的LRRKtide與用LRRK2磷酸化的LRRKtide比較。分析在重組膜突蛋白中遠端+位置殘基的Ala置換的分析顯示了通過LRRK2的磷酸化的輕微差別。LRRK2對于長LRRKtide的親和力是LRRKtide的10倍以上。圖22.LRRK2不磷酸化MYPT。重組GST-MYPT和熱變性的GST全長埃茲蛋白在[Y-"P]ATP存在時與增加量的Rock或LRRK2進行體外激酶反應(yīng)。用SDS-PAGE，然后通過考馬斯藍染色和放射自顯影或免疫印跡分析反應(yīng)產(chǎn)物，免疫印跡用用于MYPT激酶反應(yīng)的總的MYPT和磷酸-MYPTThr850或用于埃茲蛋白激酶反應(yīng)的總的ERM和磷酸-ERM進行。已知的MYPTRock磷酸化含有在-2位置的Arg和在+2位置的Gly(表1)。如果LRRK2優(yōu)選在-2位置上的疏水殘基和在+2位置上的堿性殘基，那么MYPT應(yīng)該作為LRRK2的不良底物。MYPT是Rock而不是LRRK2的更好的底物，這支持了突變的數(shù)據(jù)。實施例l:LRRK2在Thr558上磷酸化膜突蛋白；鑒定帕金森病突變體如何影響激酶活性。縮寫GST，谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶；KESTREL，激酶底物追蹤和闡明；LRRK2，富含亮氨酸重復(fù)的激酶2;LDS，十二垸基硫酸鋰；MBP，髓磷脂堿性蛋白；CRMP2，腦衰蛋白反應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白2;COR，Ras復(fù)合物C-末端；PD，帕金森病；GbpC，cGMP結(jié)合蛋白C;RIPK,p-相互作用蛋白激酶和ROCK-II，p相關(guān)激酶2。摘要。在人類富含亮氨酸重復(fù)的激酶2(LRRK2)基因中的常染色體顯性突變導(dǎo)致遲發(fā)的帕金森病(PD)。LRRK2是一個大的280kDa的酶，除了蛋白激酶結(jié)構(gòu)域，其還含有富含亮氨酸的重復(fù)、GTPase結(jié)構(gòu)域、COR結(jié)構(gòu)域和WD40基序。在每個這些結(jié)構(gòu)域中的突變都與PD相關(guān)。鮮知LRRK2是如何被調(diào)控的，什么是其生理性底物或突變是如何影響LRRK2的功能。至今只通過自磷酸化和磷酸化髓31磷脂堿性蛋白(MBP)而評估了LRRK2的活性，其被催化得相當緩慢。我們在大鼠大腦提取物中進行了KESTREL篩選以便鑒定被活化的PDLRRK2突變體(G2019S)磷酸化的蛋白。這導(dǎo)致一個發(fā)現(xiàn)，即將肌動蛋白-細胞骨架錨定至質(zhì)膜的稱作膜突蛋白的蛋白被LRRK2在Thr558上有效地磷酸化，Thr558是在先鑒定的調(diào)節(jié)膜突蛋白結(jié)合肌動蛋白能力的體內(nèi)磷酸化位點。LRRK2還磷酸化含有Thr558的稱作LRRKtide的肽。我們利用這些發(fā)現(xiàn)確定了9個在先報道的PDLRRK2的突變體如何影響激酶活性。只有一個被分析的突變體，即G2019S，促進激酶活性。4個突變體(R1941H、I2012T、I2020T和G2385R)抑制LRRK2激酶活性，而剩余的突變體(R1441C、R1441G、Y1699C和T2356I)不影響活性。因此，其中LRRK2突變誘導(dǎo)PD的方式有可能比原先想象的更復(fù)雜，并且不只是通過LRRK2激酶活性的增加造成。我們還顯示，LRRK2的最小催化活性片段需要完整的GTPase、COR和激酶結(jié)構(gòu)域以及WD40基序和C-末端尾(含有殘基1326-2527)。在該研究中提出的發(fā)現(xiàn)將用于定量測定LRRK2激酶活性并且還可以用于篩選為了治療PD的抑制LRRK2的藥物。我們還討論了通過突變的LRRK2對膜突蛋白磷酸化的解除調(diào)控如何能夠?qū)е屡两鹕≈械脑缙诙喟桶纺茌S突末端的丟失。材料和方法。材料。蛋白酶抑制劑混合物片來自Roche;P81磷酸纖維素紙來自Whatman;[Y32P]-ATP和所有的蛋白色譜介質(zhì)購自AmershamBiosciences。髓磷脂堿性蛋白(MBP)來自Invitrogen;預(yù)凝的SDS聚丙烯酰胺Bis-Tris凝膠來自Invitrogen;組織培養(yǎng)試齊U來自LifeTechnologies;MilliporeImmobilon-P來自FisherScientific?；钚源笫驲OCKII[殘基2-543]被信號轉(zhuǎn)導(dǎo)治療單位分部(DivisionofSignalTransductionTherapyUnit)(Dundee大學(xué))在桿狀病毒中表達。LRRKtide肽(RLGRDKYKTLRQIRQ)通過Bristol大學(xué)的GrahamBloomberg博士合成。抗體?？笹ST是針對谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶蛋白在羊中產(chǎn)生的。用于免疫印跡的偶聯(lián)至辣根過氧化物酶的第二抗體獲自Pierce。一般方法。使用標準的規(guī)程進行組織培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染、免疫印跡、限制性酶消化、DNA連接和其它重組DNA過程。使用快改變(Quick-Change)定點突變方法(Stratagene)進行所有的突變。使用Qiagen質(zhì)粒Mega或Maxi試劑盒根據(jù)生產(chǎn)者的規(guī)程從大腸桿菌DH5oc中純化用于轉(zhuǎn)染的DNA構(gòu)建體。通過DNA測序證實所有的DNA構(gòu)建體，其通過英國蘇格蘭Dundee大學(xué)生命科學(xué)院的測序服務(wù)中心使用DYEnamicET終止化學(xué)(AmershamBiosciences)在AppliedBiosystems的自動DNA測序儀上進行。緩沖液。裂解緩沖液含有50mMTris/HClpH7.5、1mMEGTA、1mMEDTA、1%(w/v)Triton-X100、lmM正釩酸鈉、10mMp-甘油磷酸鈉、50mM氟化鈉、5mM焦磷酸鈉、0.27M蔗糖、0.1%(v/v)2-巰基乙醇和完全蛋白酶抑制劑混合物(一片/50ml,Boehringer)。緩沖液A含有50mMTris/HClpH7.5、0.1mMEGTA和0.1%(v/v)2-巰基乙醇。抽提緩沖液含有50mMTris/HClpH7.5、5%(v/v)甘油、10mM2-巰基乙醇、lmMEDTA、1mMEGTA、0.03%(v/v)Brij-35、完全蛋白酶抑制劑混合物(一片/50ml)。樣品緩沖液是含有1%(以體積計)2-巰基乙醇的IXNuPAGELDS樣品緩沖液(Invitrogen)。質(zhì)粒。編碼對應(yīng)于NCBIAcc.AAV63975的LRRK2全長cDNA克隆是來自MichelGoedert博士(LMBCambridge)的慷慨禮物。用于本研究的全長LRRK2基因和其片段根據(jù)標準的PCP方法，使用KOD聚合酶(Novagen)從LRRK2cDNA片段中擴增而來。獲得的PCR產(chǎn)物作為Bamhl-Notl片段被亞克隆進入哺乳動物pEBG2T和pCMV5表達載體。通過從購自Geneservice(IMAGE克隆4908580)的ESTPCR擴增編碼人類膜突蛋白(NCBI登錄號NP一002435)的全長以及C-末端片段的cDNA。將PCR產(chǎn)物作為Notl-Notl片段連接進入不同的表達載體。GST-LRRK2的表達和純化。通常培養(yǎng)10至100個10cm直徑碟的HEK293細胞，并且使用多聚乙酰亞胺(polyethylenimine)方法[15]用5pg編碼野生型或不同突變形式的LRRK2的pEBG-2T構(gòu)建體轉(zhuǎn)染每碟。進一步培養(yǎng)細胞36小時并且在0.5ml冰冷的裂解緩沖液中裂解細胞，將裂解液合并并且在4°C以26,000xg離心10分鐘。通過在谷胱甘肽-瓊脂糖(每碟293細胞10)Ld)上的親和色譜法純化GST-融合蛋白并且在含有20mM谷胱甘肽和0.27M蔗糖的緩沖液A中洗脫GST-融合蛋白。以小等份急速冷凍酶并且將其儲存于-80°<3。LRRK2KESTREL篩選。切碎來自50個大鼠的大腦并且用4倍體積的抽提緩沖液勻漿。通過在4°C以28,000xg離心20分鐘沉淀不溶的物質(zhì)，通過用60%(w/v)的硫酸銨攪拌沉淀在上清液中的蛋白2小時。通過以28,000xg離心20分鐘收集沉淀的蛋白，將蛋白重懸于抽提緩沖液，通過在葡聚糖凝膠-G25上的色譜法脫鹽精制到30mMMOPSpH6.9、10%(v/v)甘油、10mM2-巰基乙醇、0.03%(v/v)Brij-35，并且在肝素-瓊脂糖上在后一緩沖液中色譜分離。將肝素柱的流出物(flow-through)用1MNaOH滴定至pH7.5并且置于8mlSource15Q柱上，Source15Q柱在30mMTris/HClpH7.5、10。/。(v/v)甘油、10mM2-巰基乙醇、0.03%(v/v)Brij-35中用136ml梯度洗脫(developedin)至1MNaCl。將所有組分的等份在50mMTris/HClpH7.5、10mM2-巰基乙醇、lOpg/ml亮肽素(leupeptin)、1mMPefabloc中稀釋10倍，在65°C孵育15分鐘，然后用3mMMnC12、1MBq/ml[2P]-ATP在無或有2ngGST-LRRK2[1326-2527，G2019S](估計的LRRK2酶的純度是總蛋白的2-5%)時孵育5分鐘。'通過加入SDS-樣品緩沖液終止反應(yīng)，進行聚丙烯酰胺凝膠電泳并且電轉(zhuǎn)至ImmobilonP。將膜干燥和放射自顯影。在-80。C冷凍所有的組分和測試等份。將含有Q-組分5和6的底物在30mMTris/HClpH8.2、10%(v/v)甘油、10mM2-巰基乙醇、0.03%(v/v)Brij-35中稀釋5倍并且置于1mlSource15Q柱上。該柱在30mMTris/HClpH7.5、10%(v/v)甘油、10mM2-巰基乙醇、0.03%(v/v)Brij-35中用10ml梯度洗脫至1M的NaCl，收集0.5ml的組分，如上所述用LRRK2篩選等份。將含有Q-組分6和7的底物置于120mlSuperdex-200柱上，收集1.2ml等份并且篩選。將含有Superdex-組分12-15的底物合并，濃縮并且通過在2mlVivaScience系統(tǒng)中過濾而脫鹽。將4|ag等份變性或保持天然并且通過在有或無LRRK2時磷酸化檢測底物的存在。樣品在聚丙烯酰胺凝膠上電泳，用膠體藍染色并且通過放射自顯影分析。將對應(yīng)于底物信號的蛋白條帶切下，用胰蛋白酶消化并且通過質(zhì)譜指紋圖譜進行蛋白鑒定。在大腸桿菌中人類膜突蛋白的表達和純化。將編碼野生型和突變形式的人類膜突蛋白的pGEX表達構(gòu)建體轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21細胞，在37°C在含有100|iig/ml氨芐青霉素的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中培養(yǎng)1L培養(yǎng)物直到在600nm的吸收為0.8。通過加入100異丙基-p-D-半乳糖苷進行蛋白表達的誘導(dǎo)，進一步在26°C培養(yǎng)細胞16小時。離心分離細胞，將其重懸于15ml冰冷的裂解緩沖液中并且在一輪冷凍/融解中裂解，然后用超聲波處理至片段DNA。將裂解液在4°C以26,000xg離心30分鐘，重組蛋白在0.2ml谷胱甘肽-瓊脂糖上親和純化并且在0.4ml含有20mM谷胱甘肽和0.27M蔗糖的緩沖液A中洗脫。定位在膜突蛋白上通過G2019SLRRK2磷酸化的位點。在65°C處理膜突蛋白(4嗎)15分鐘，然后在30°C用在緩沖液A中的1.5嗎GST-LRRK2[1326-2527,G2019S]孵育，緩沖液A含有在50pl總反應(yīng)體積中的10mMMgCb和100pM[,P]-ATP(10000cpm/pmol)。在40分鐘后通過加入樣品緩沖液至1%(w/v)LDS-10mM二硫蘇糖醇(DTT)的終濃度終止反應(yīng)，并且在100。C加熱樣品1分鐘并且在冰上冷卻樣品。將4-乙烯吡啶加至50mM的濃度，將樣品在室溫留在搖動平臺上30分鐘以烷基化半胱氨酸殘基。將樣品在BisTris4-12%聚丙烯酰胺凝膠上進行電泳，凝膠用膠體藍染色然后放射自顯影。將磷酸化的膜突蛋白條帶切下，切成較小的片，隨后用1ml下列成分在震動平臺上洗滌15分鐘水、水和乙腈的1:1混合物、0.1M碳酸氫銨、0.2M碳酸氫銨和乙腈的1:1混合物和最后的乙腈。用speedi-vac干燥凝膠片并且在0.1ml的50mM碳酸氫銨、含有1pg質(zhì)譜級胰蛋白酶(Promega)的0.1%(w/v)n-辛基葡萄糖苷中孵育。16小時之后，加入0.1ml乙腈并且將混合物在搖動平臺上孵育10分鐘。去除上清液，進一步在0.3ml的50mM碳酸氫銨和0.1%v/v三氟乙酸中洗滌凝膠片10分鐘。將含有>90%32P-放射性的合并的上清液在用水中的0.1%v/v三氟乙酸中平衡的Vydac218TP5215C18柱(SeparationsGroup,Hesperia,CA)上進行色譜分離。該柱用線性乙腈梯度(對角線)在0.2ml/min的流速下進行分離(developed),收集0.1ml的組分。通過在Phospho-Select樹脂(Sigma)上的固定的金屬螯合親和色譜法(IMAC)進一步純化磷酸肽。磷酸肽序列分析。在AppliedBiosystems4700蛋白質(zhì)組分析儀(MALDI-TOF-TOF)上使用5pg/ml的a氰基肉桂酸作為基質(zhì)分析分離的磷酸肽。獲得在反射器和線性模式中的光譜，通過在所選質(zhì)量上進行MALDI-MS/MS證實磷酸肽的序列。使用從親代磷酸肽中特征性丟失磷酸(M-98Da)以及從磷酸絲氨酸中中性地丟失脫氫丙氨酸(M-69kDa)或從磷酸蘇氨酸中中性地丟失脫氫氨丁酸(-83)分配磷酸化位點的位置。通過在肽的AppliedBiosystems494C序列分析儀上的固相Edman降解確定所有32P-標記的肽的磷酸化位點，所述肽結(jié)合至如前所述的Sequelon-AA膜上(Milligen)[16]。使用膜突蛋白或MBP作為底物的LRRK2的分析。在含有0.5-0.7pg野生型或突變形式的LRRK2、1nM膜突蛋白(已經(jīng)置于冰上或在分析前在65°C孵育15分鐘的全長或指明的突變體)或1^M髓磷脂堿性蛋白、10mMMgC12和0.1mM[Y32P]-ATP(300cpm/pmol)的總體積25jal的緩沖液A中建立分析。在30。C孵育30分鐘后，通過加入LDS-樣品緩沖液終止反應(yīng)。在4-12%聚丙烯酰胺凝膠電泳樣品和放射自顯影干燥的考馬斯藍染色凝膠后測定至膜突蛋白或MBP底物的磷酸的摻入以及LRRK2的自磷酸化。還將磷酸化底物從凝膠上切下，并且用Cherenkov計數(shù)定量32P的摻入。使用LRRKtide作為底物分析LRRK2。在存在300pM或指明濃度的LRRKtide(RLGRDKYKTLRQIRQ)肽底物時，在含有0.5-0.7嗎野生型或突變形式的LRRK2、10mMMgCl2和0.1mM[y32P]-ATP(300cpm/pmol)的總體積50pl的緩沖液A中建立分析。在30。C孵育30分鐘后，通過將40)nl的反應(yīng)化合物加至P81磷酸纖維素紙上終止反應(yīng)，在50mM磷酸中洗滌P81磷酸纖維素和Cherenkov計數(shù)后定量LRRKtide的磷酸化。一個單位(u)的LRRK2活性定義為催化1nmol32P摻入LRRKtide的酶的量。通過使用不同濃度的LRRKtide進行上述分析測定Km和Vmax參數(shù)。使用Graph-Padprism程序計算Km和Vmax參數(shù)。免疫印跡。將樣品在樣品緩沖液中在70。C加熱5分鐘，進行聚丙烯酰胺凝膠電泳并且轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上。在50mMTris/HClpH7.5、0.15MNaCl、含有10%(w/v)脫脂奶的0.2%(v/v)Tween(TBST緩沖液)中封閉膜30分鐘。在4°C在含有5%(w/v)脫脂奶的TBST緩沖液中用1pg/ml的抗-GST抗體用探針雜交膜16小時。用辣根過氧化物酶偶聯(lián)的第二抗體和增強性化學(xué)發(fā)光試劑進行檢測。LRRK2自磷酸化位點的鑒定。在含有10mMMgCh和0.1mMATP的總體積為50nl的緩沖液A中孵育10|iig指明形式的純化的GST-LRRK2[1326-2527]60分鐘。通過加入樣品緩沖液終止反應(yīng)和在4-12%的聚丙烯酰胺凝膠上進行電泳，凝膠用膠體藍考馬斯染色。將GST-LRRK2條帶從凝膠上切下并且用0.1MNH4HC03和50%乙腈/50mMNH4HC03洗滌凝膠。然后在65°C將蛋白用在0.1MNH4HC03中的10mMDTT還原45分鐘并且通過在室溫加入50mM碘乙酰胺垸基化30分鐘。在0.1MNH4HC03和50%(v/v)乙腈/50mMNH4HC03中洗滌凝膠片，干燥，用含有5pg/ml胰蛋白酶的25mM碳酸氫三乙胺在30。C孵育16小時。為了鑒定磷酸化位點，通過在AppliedBiosystems4000Q-TRAP上的LC-MS分析肽。使用Mascot搜索算法(www.matrixscience.com)搜索包括CeleraDiscoverySystem(AppliedBiosystems)人類數(shù)據(jù)庫的幾個數(shù)據(jù)庫。結(jié)果。-用于KESTREL的LRRK2活性片段的表達。作為用于KESTREL篩選的蛋白激酶的來源，我們在293細胞中表達了GST-融合體。在谷胱甘肽-瓊脂糖上的親和純化后，全長LRRK2的表達水平低，但是含有殘基1326-2527、缺少富含亮氨酸重復(fù)但仍含有GTPase、COR、激酶、WD40和C-末端尾的LRRK2片段的表達水平顯著地較高(圖9)。當與鎂和[t^P]-ATP和磷酸化的髓磷脂堿性蛋白(MBP)孵育時，盡管弱，LRRK2[1326-2527]片段還是被自磷酸化了(圖1)。其中結(jié)合Mg/的Asp殘基被突變的催化非活性突變體LRRK2[1326-2527,D2017A]不能在平行反應(yīng)中自磷酸化或磷酸化MBP(圖1)。我們還發(fā)現(xiàn)，在序言中提到的共同的PD突變體LRRK2[1326-2527,G2019S]與非突變的LRRK2[1326-2527]相比顯示3倍高的自磷酸化和MBP磷酸化水平，這與以前的工作是一致的，顯示該突變促進LRRK2的活性[12,13]。LRRK2KESTREL篩選。為了搜索在大腦中被LRRK2磷酸化的蛋白，將來自50個大鼠大腦的提取物用60%(w/v)硫酸銨沉淀，脫鹽，在肝素-瓊脂糖上色譜分離(圖10)，然后用在pH7.5的Source-Q(圖2A)和在pH8.2的So,-Q(圖2B)，最后在Superdex200凝膠上過濾(圖2C)。將每個柱組分的等份在反應(yīng)緩沖液中稀釋并且在65ec孵育15分鐘以便滅活可以磷酸化蛋白的內(nèi)源性蛋白激酶，因此減少了不然可以干擾KESTREL分析的背景磷酸化水平[17]。然后在存在或不存在GST-LRRK2[1326-2527]或GST-LRRK2[1326-2527，G2019S]和如材料和方法中所述的[y32P]-ATP的情況下孵育每個組分。使用純化的非突變的GST-LRRK2[1326-2527]，未檢測到任何大鼠大腦蛋白的顯著磷酸化(數(shù)據(jù)未顯示)。運用更多的^g性GST-LRRK2[1326-2527,G2019S]突變體，觀察到3個蛋白被磷酸化(圖2和圖10)。將這些蛋白純化，在聚丙烯酰胺凝膠上進行電泳并且通過胰蛋白酶肽的質(zhì)譜指紋圖譜方法建立在每個制備物中的被LRRK2磷酸化的考馬斯藍染色條帶的身份(圖3)。這顯示，被LRRK2磷酸化的蛋白是腦衰蛋白反應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白2(CRMP2)、肌酸激酶和膜突蛋白。觀察到CRMP2和肌酸激酶在大腦提取物中比膜突蛋白豐富50-100倍(AK數(shù)據(jù)未顯示)。為了檢査這些蛋白被LRRK2的相對磷酸化，用GST-LRRK2[1326-2527，G2019S]磷酸化相似量的純化的CRMP2、肌酸激酶和膜突蛋白，并且在這些條件下，膜突蛋白比CRMP2或肌酸激酶被磷酸化至顯著更高的程度(圖3)。因為CRMP2和肌酸激酶是高豐度蛋白并且比膜突蛋白被LRRK2以低的多的效率磷酸化，我們集中研究了通過LRRK2的膜突蛋白的磷酸化。定位在被LRRK2磷酸化的膜突蛋白中的磷酸化殘基。我們發(fā)現(xiàn)，在大腸桿菌中表達的重組人類GST-膜突蛋白被LRRK2以時間相關(guān)的方式磷酸化至每摩爾膜36突蛋白~0.1摩爾的磷酸的最大化學(xué)計量(圖4A)，如在KESTREL篩選中進行的在650C孵育上述重組人類GST-膜突蛋白15分鐘。我們不能將膜突蛋白磷酸化至更高的化學(xué)計量，這表示重組酶的重要部分可能是不能被磷酸化的構(gòu)象。用胰蛋白酶消化被LRRK2磷酸化的"P-膜突蛋白并且在C18柱上色譜分離以分離32P標記的磷酸肽。這顯示了兩個主要的峰(Pl和P2)和一個次要的峰(P3)(圖4B)。Pl和P2的固相Edman測序(圖4C)和質(zhì)譜(圖4D)將其身份確定為在Thr558上被磷酸化的肽和P3作為在Thr526上被磷酸化的肽。我們接著評估了在膜突蛋白中的Thr526和Thr558的突變是如何影響通過GST-LRRK2[1326-2527,G2019S]的磷酸化。Thr526的突變中度降低通過LRRK2的膜突蛋白的磷酸化，而Thr558的突變事實上去除了膜突蛋白的磷酸化(圖4E)，這顯示其是主要的磷酸化位點。當突變Thr526和Thr558時，未觀察到膜突蛋白的磷酸化。進一步分析通過LRRK2的膜突蛋白的磷酸化。膜突蛋白是蛋白埃茲蛋白/根蛋白/膜突蛋白(ERM)家族的成員，其功能是將肌動蛋白細胞骨架錨定至細胞膜，并在調(diào)節(jié)膜結(jié)構(gòu)和組構(gòu)中扮演重要角色[18，19]。膜突蛋白包含與幾個質(zhì)膜蛋白相互作用的條帶四-點-一/埃茲蛋白/根蛋白/膜突蛋白(FERM)結(jié)構(gòu)域(殘基1至298)[18，19]以及磷酸肌醇4，5二磷酸鹽(Ptdlns4,5P2)。在膜突蛋白上的FERM結(jié)構(gòu)域的后面是a-螺旋結(jié)構(gòu)域(殘基298至460)、易彎曲的連接區(qū)(殘基460至489)和保守的C-末端尾(也稱C-ERMAD結(jié)構(gòu)域，殘基489至575)。包含Thr558的膜突蛋白的后30個氨基酸形成F-肌動蛋白結(jié)合位點[20-22]。膜突蛋白和其它ERM蛋白存在至少兩個構(gòu)象狀態(tài)，即能夠結(jié)合膜和F-肌動蛋白的活性"開放"形式和因為肌動蛋白結(jié)合位點被遮蔽而不能將肌動蛋白細胞骨架連接至質(zhì)膜的非活性或休眠"關(guān)閉"形式。膜突蛋白關(guān)閉狀態(tài)的結(jié)構(gòu)顯示，膜突蛋白的FERM結(jié)構(gòu)域和C-末端尾彼此相互作用，而在開放形式中，F(xiàn)ERM和C-末端結(jié)構(gòu)域是分離的[23]。在Thr558上磷酸化膜突蛋白，結(jié)合FERM結(jié)構(gòu)域結(jié)合膜蛋白，或許結(jié)合PtdIns(4,5)P2，促進C-末端尾從FERM結(jié)構(gòu)域分離，這使得膜突蛋白結(jié)合F-肌動蛋白[24，25]。還沒有肯定地建立在Thr558上磷酸化膜突蛋白的激酶，雖然一些候選激酶包括在體外和當在細胞中過表達時磷酸化ERM蛋白C-末端尾的p相關(guān)激酶(ROCK)[26-28]。以前的報道發(fā)現(xiàn)，細菌表達的膜突蛋白的C-末端尾與全長膜突蛋白相比通過ROCK被磷酸化至大得多的程度[26,28]。這是推測的，因為當在大腸桿菌中表達膜突蛋白時，其是在關(guān)閉的構(gòu)象中，其中Thr558對于磷酸化是不可進入的。我們推測，在KESTREL篩選中，在磷酸化之前在65。C孵育膜突蛋白可能已經(jīng)誘導(dǎo)暴露Thr558的構(gòu)象變化。為了研究這一點，我們在平行反應(yīng)中研究了加熱在大腸桿菌中表達的膜突蛋白是如何通過LRRK2(圖5A)以及ROCK-II(圖5B)影響其磷酸化。醒目的是，我們發(fā)現(xiàn)LRRK2和ROCK-n都不能磷酸化未在至少60OC溫度下預(yù)孵育的膜突蛋白(圖5A)。與此相反，缺失FERM結(jié)構(gòu)域的膜突蛋白的片段可以在磷酸化前無熱處理的情況下被LRRK2(圖5C)或ROCK-II(圖5D)磷酸化。在采用的條件下，膜突蛋白[400-577]C-末端片段與全長GST-膜突蛋白相比被磷酸化至高2倍的程度(圖5B)。LRRK2的基于肽的底物分析的鑒定。我們接著研究了LRRK2是否可以磷酸化包含膜突蛋白Thr558的短肽底物(RLGRDKYKTLRQIRQ)，其中劃了下劃線的不能磷酸化肽的條件下，GST-LRRK2[1326-2527,G2019S]以比非突變GST-LRRK2[1326-2527]高~3倍的起始速率磷酸化該肽(圖6A)。該肽被稱作LRRKtide并且以相似的200pM的Km被非突變GST-LRRK2[1326-2527]和GST隱LRRK2[1326-2527,G2019S]磷酸化(圖6B)。通過GST-LRRK2[1326-2527,G2019S]的LRRKtide的磷酸化的Vmax比通過非突變GST-LRRK2[1326-2527]的高~2.5倍(圖6B)。GST-LRRK2[1326-2527，G2019S]具有10U/mg的Vmax并且估計在這一制備物中酶的純度為~5%，這提示LRRK2[G2019S]酶的純制備物可以以200U/mg的特異性活性磷酸化LRRKtide，對于相對活性的激酶磷酸化合適的底物；這個活性是一個不小的速率。LRRK2的PD突變形式的并排分析。通過應(yīng)用本研究中詳盡的分析，我們接著比較了己經(jīng)在患有PD的人類中報道的9種LRRK2突變形式的活性(在[3]中綜述)。發(fā)現(xiàn)研究的突變是在GTPase結(jié)構(gòu)域(R1441C，R1441G)、COR區(qū)(Y1699C)、激酶結(jié)構(gòu)域(R1914H，I2012T,G2019S,12020T)和在位于WD40重復(fù)之外的C-末端尾的區(qū)域(T23561，G2385R)中(圖7A)。我們發(fā)現(xiàn)，只有通常觀察到的G2019S突變顯著地促進LRRK2自磷酸化以及膜突蛋白、LRRKtide和MBP的磷酸化(圖7B)。4個突變(R1441C、R1441G、Y1699C和T2356I)和非突變LRRK2在所有的分析中具有相似的活性(圖7B)。激酶結(jié)構(gòu)域中4個突變中的2個(R1914H,I2012T)是近乎非活性的，這顯示比作為對照的激酶非活性LRRK2[D2017A]略高的活性。第3個激酶結(jié)構(gòu)域突變(I2020T)具有比非突變LRRK2顯著低的活性，但是具有比R1914H和I2012T突變高的活性。有趣的是，2個C-末端尾LRRK2突變中的一個(G2385R)還在所有的分析中具有非常低的催化活性(圖7B)。定義保留蛋白激酶活性的LRRK2的最小片段。我們比較了全長和缺失特異性結(jié)構(gòu)域的突變形式的LRRK2的活性。野生型全長LRRK2對于膜突蛋白、LRRKtide和MBP底物具有相似的活性，在本研究的其余部分中使用的LRRK2[1326-2527]片段也一樣。缺失GTPase結(jié)構(gòu)域(.LRRK2[1541-2527])或GTPase和COR結(jié)構(gòu)域(LRRK2[1856-2527])兩者的突變體未顯示自磷酸化并且不磷酸化任何底物。另外，缺失C-末端WD40結(jié)構(gòu)域(LRRK2[1326-2149])或只是7個C-末端氨基酸([LRRK2[1326-2520])的LRRK2突變體也是非活性的。與其活性需要LRRK2的GTPase、COR、WD40和C-末端區(qū)的概念相一致，只包含激酶結(jié)構(gòu)域的LRRK2的片段(LRRK2[1856-2145])無任何激酶活性圖8)。在圖6至8中顯示的研究中，將相同量的GST純化的蛋白加載到每個凝膠中，在每個分析中使用相同量的總蛋白。所有使用的LRRK2的制備物有相似的純度。用1nMMBP和300nMLRRKtide進行圖7和圖8中的激酶分析。在使用的條件下，我們獲得摻入MBP的約300-1000cpm和慘入LRRKtide的通常為10-20倍高的計數(shù)。由于用于這些分析中的MBP和LRRKtide濃度的300倍的差別，難I、I"T±rII，"V入TT八r~l~"±rII,、；ti"vi~.i[J_Lr"^rdJUit>ZJXl一M4J.-rl、ITT7mIf*W且:T女/A込'r頭3互^r且伎「L儀込S/te'伊J。LKKJVtiaeJWUfc'秒Jtf、JVLS、定井KlbA術(shù)州〔LMBP高的多的濃度并且較不可能被可能的污染性蛋白激酶所磷酸化。MBP也以低水平在至少10個不同的位點被LRRK2磷酸化，如圖11中顯示。定位在被LRRK2磷酸化的MBP中的磷酸化殘基。我們還研究了在被LRRK2磷酸化的MBP上的殘基。我們發(fā)現(xiàn)，MBP不被GST-LRRK2[1326-2527,G2019S]很好地磷酸化，只達到只有每摩爾蛋白0.01摩爾磷酸鹽的化學(xué)計量。在這些條件下磷酸化的32P-MBP的胰蛋白酶消化顯示IO個以上不同的32P標記的肽(圖11)，這提示與膜突蛋白相比，LRRK2磷酸化MBP的許多位點，并且都以非常低的化學(xué)計量。通過使用質(zhì)譜和固相測序，我們?nèi)匀荒軌蚨ㄎ贿@些磷酸化位點中的6個為Ser7、Thrl8、Thr64、Thr94、Thr97、Thrl48(圖11)。定位LRRK2的自磷酸化位點。我們還進行了定位在GST-LRRK2[1326-2527]、GST-LRRK2[1326-2527,G2019S]以及催化非活性的GST-LRRK2[1326-2527,D2017A]的自磷酸化位點的質(zhì)譜，其在將這些酶與Mg-ATP孵育后被觀察到。在催化非活性的LRRK2上未觀察到磷酸肽，但是在許多位點上觀察到自磷酸化的LRRK2的非突變和G2019S形式(圖12)。通過質(zhì)譜分析，我們能夠鑒定皆定位于GTPase結(jié)構(gòu)域(在殘基1335-1504之間，圖12)之中的5個磷酸化的肽。在非突變的GST-LRRK2[1326-2527]上的主要自磷酸化位點是Thrl503。該殘基在GST-LRRK2[1326-2527，G2019S]上以2-3倍高的水平被磷酸化。包括Thrl410的其它殘基在更有活性的GST-LRRK2[1326-2527，G2019S]突變體上被磷酸化至更高的化學(xué)計量(圖12)。我們將Thrl410和Thr1503突變成Ala，但是發(fā)現(xiàn)這不影響LRRK2的催化活性(圖13)。討論。在本研究中，我們采用了包含殘基1326-2527的最有活性的LRRK2G2019S突變形式用于大腦中激酶底物的篩選并且鑒定膜突蛋白作為該酶的最已知的蛋白底物。包含Thr558磷酸化位點的肽也在體外底物中有用。通過使用這一方法，我們能夠通過比較一套點突變和刪除分析LRRK2的催化性激酶活性的需求，并且確立在PD患者中發(fā)現(xiàn)的LRRK2突變?nèi)绾斡绊懨傅幕钚浴＿@個研究是使用KESTREL方法發(fā)現(xiàn)未被很好地鑒定的蛋白激酶的底物的另一個例子。需要進一步的工作來評估膜突蛋白是否含有LRRK2的生理性底物。為了嚴格地做到這一點，關(guān)鍵的是評價在LRRK2敲除/降低的小鼠或細胞中在膜突蛋白Thr558上的磷酸化。還有必要敲除/降低也具有磷酸化膜突蛋白潛力的LRRK1的表達。由于在膜突蛋白上Thr558位點周圍的序列在埃茲蛋白和根蛋白中是相同的，有可能的是LRRK2至少在體外也能夠磷酸化這些蛋白。假如發(fā)現(xiàn)的ERM蛋白含有LRRK2的生理性底物，需要進一歩研究其可以在神經(jīng)變性和PD發(fā)展中的扮演的角色。就這一點而言，膜突蛋白和根蛋白涉及在調(diào)節(jié)神經(jīng)突自然發(fā)展結(jié)果中扮演關(guān)鍵的角色，因為缺少這些蛋白的神經(jīng)元顯示出生I,i/t"_t_丄AAi1=1^!i!r、,r41.1iiX、l上A>A>VA"tUtl-17A"、口Ttn,=1、tL>I,.、trTA"TXt氏人々、tTJ亞有tW/J、、"乂牙J4A求議tfj穴、土"PCTSW、JIB到白々U1艾/V土ts:T田卞t、|Atfj肌動蛋白絲的顯著的結(jié)構(gòu)破壞[29]。近來的研究還證明，過度表達活化的G2019SLRRK2突變體誘導(dǎo)神經(jīng)突長度的進行性減少以及在原代神經(jīng)細胞和大鼠黑質(zhì)紋狀體通路中的分枝，而缺少LRRK2導(dǎo)致神經(jīng)突長度的增加和分枝[30]。通盤考慮，這些數(shù)據(jù)提示，通過突變的LRRK2的膜突蛋白磷酸化的解除調(diào)控可能導(dǎo)致在帕金森病中的早期多巴胺能軸突末端的丟失。在人類中，編碼膜突蛋白相關(guān)的蛋白(稱為meriin)的基因的失活性突變造成2型神經(jīng)纖維瘤病，其是主要影響神經(jīng)系統(tǒng)的癌癥的一種形式[31]。很少知道關(guān)于磷酸化等同于merlinC-末端尾中的Thr558的殘基的激酶的身份并且研究LRRK2是否可以在該殘基上磷酸化merlin將是目的。我們的結(jié)果證實，最普通的G2019SLRRK2PD突變增加激酶活性，這個結(jié)論與2個近期的研究相一致，在這2個研究中，LRRK2活性是通過自磷酸化和磷酸化MBP評估的[12，13]。我們用LRRKtide進行的動力學(xué)分析還顯示，G2019S突變通過增加催化Vmax常數(shù)而不是通過增加底物結(jié)合的Km親和力而促進LRRK2的活性。有趣的是將LRRK2催化結(jié)構(gòu)域結(jié)晶并且確定靠近激酶催化結(jié)構(gòu)域的亞結(jié)構(gòu)域VII中的Mg2+Asp殘基的保守Gly殘基的置換如何可以促進磷酸化的催化效率。對518個人類激酶的分析顯示，2個蛋白激酶(TSSK1,BUBR1)以及7個預(yù)測的非活性假激酶(KSR2，STLK6,RSKL1，SgK071,結(jié)構(gòu)域2—GCN2，SgK269,SgK196)在它們的催化結(jié)構(gòu)域的亞結(jié)構(gòu)域VII中具有Gly至Ser置換基序[ll，32]。有趣的是建立TSSK1和BUBR1亞結(jié)構(gòu)域VIISer殘基至Gly的突變?nèi)绾斡绊戇@些激酶的活性?？赡艿氖沁@樣的氨基酸置換被用作進化機制以增加這些酶的基礎(chǔ)活性。還有趣的是研究在其它蛋白激酶中Gly至Ser突變的效果。我們的數(shù)據(jù)顯示，不是所有的PD突變都促進LRRK2的活性。我們發(fā)現(xiàn)，4個PD突變R1441C、R1441G(位于GTPase結(jié)構(gòu)域)、Y1699C(位于COR結(jié)構(gòu)域)和T2356I(位于C-末端尾)不顯著影響LRRK2的激酶活性。另外，3個突變R1941H、I2012T(位于激酶結(jié)構(gòu)域)和G2385R(位于C-末端尾)顯著抑制LRRK2的激酶活性。另一個PD突變I2020T(在位于Gly2019下一個的殘基中)減少MBP和膜突蛋白的LRRK2自磷酸化和磷酸化，但是到了比R1941H、I2012T和G2385R突變低的程度。近期的報道指出，Y1699C突變與野生型蛋白相比具有~50%增加的自磷酸化[33]。雖然我們的數(shù)據(jù)可能顯示該突變與野生型蛋白相比具有略高的活性(圖7)，其比G2019S突變體也僅有顯著少的活性。另一個報道認為I2020TLRRK2突變體自磷酸化的能力為比野生型高~40%的水平[34]，這與我們發(fā)現(xiàn)的該突變具有40更低的活性是相反的。其原因不清楚，但是自磷酸化的測定有可能不可靠，尤其是因為難以保證這些分析是線性的，另外蛋白激酶的自磷酸化不總是與該酶的內(nèi)在活性成比例。我們在評估LRRK2的PD突變體形式中獲得的這些結(jié)果顯示，不是所有的突變都以與G2019S突變相同的方式施加其影響，其增加蛋白激酶活性?？赡艿氖且籭H*^i^"rfn"、3、斗mJm~f4^.w_八an/m/J-下4JiTm^T,^a"Ama/",丄nt~mtiij++m~il￡5:大文巡《1州匸周lJ'l土5日百曰U內(nèi)'KKri7LLKKJ^ZtfJ;HUJEi^r日iLTP川漢:r牛共TF/tl^J/現(xiàn)以變LRRK2細胞穩(wěn)定性或定位。一些突變降低激酶活性的發(fā)現(xiàn)表明，LRRK2的抑制還具有導(dǎo)致多巴胺能神經(jīng)元的退化和PD發(fā)展的可能性。如果是這樣的話，這將提示LRRK2抑制劑的治療效果可能限于治療具有活化的G2019SLRRK2突變的患者，并且需要使用不將引起疾病的LRRK2[G2019S]酶的活性降低至基礎(chǔ)水平以下的這樣藥物的劑量。重要的是測試近期產(chǎn)生的LRRK2敲除小鼠[35]是否當其年老時發(fā)生神經(jīng)變性的征兆。我們的工作也證明，完整的LRRK2C-末端尾是活性需要的，因為只截去該區(qū)域的7個C-末端殘基去除了LRRK2活性。我們還發(fā)現(xiàn)，位于朝向WD40基序的C-末端的G2385RPD突變滅活了LRRK2激酶活性。近期的工作顯示，該突變，其特別是在中華民族的臺灣人群中盛行，可能代表增加發(fā)生PD危險而不是PD造成的突變的多態(tài)性[36]。與WD40基序分開的LRRK2的C-末端區(qū)與任何其它已知蛋白或其它功能性結(jié)構(gòu)域不具有同源性。通盤考慮，這些觀察顯示，完整的LRRK2C-末端區(qū)在調(diào)節(jié)激酶活性中扮演重要的角色。需要進一步的分析來研究該結(jié)構(gòu)域可以調(diào)節(jié)LRRK2的機制，和該結(jié)構(gòu)域是否可以與其它因子和/或LRRK2的其它區(qū)域相互作用以調(diào)節(jié)激酶活性?？傊?，本研究中的結(jié)果定義了保留蛋白激酶活性的最小LRRK2片段并且還證明，在體外，LRRK2有效地在Thr558上磷酸化膜突蛋白。雖然需要進一步的工作來確定膜突蛋白是否含有LRRK2的生理性底物，我們的發(fā)現(xiàn)將通過提供更定量的和有力的方法來評估LRRK2蛋白激酶活性而有助于LRRK2的功能性分析。其還將能使更好地鑒定不同的PD突變?nèi)绾斡绊慙RRK2活性成為可能并且?guī)椭幬锇l(fā)現(xiàn)程序來篩選用于治療PD的LRRK2抑制劑。實施例2:埃茲蛋白和根蛋白在等同于膜突蛋白Thr558的殘基上被LRRK2磷酸化。在膜突蛋白中在磷酸化Thr558位點周圍的氨基酸序列在埃茲蛋白和根蛋白中是一樣的；這提示這些蛋白也將被LRRK2磷酸化。為了研究這一點，我們研究了LRRK2是否磷酸化在大腸桿菌中表達的全長埃茲蛋白和根蛋掃。與全長膜突蛋白相似，埃茲蛋白和根蛋白只在其在70°C加熱之后被LRRK2[1326-2527,G2019S]磷酸化(圖5D和圖15)。等同于Thr558的埃茲蛋白中的殘基(Thr567)和根蛋白中的殘基(Thr564)至Ala的突變強烈地降低通過LRRK2的這些蛋白的磷酸化，這顯示這些是主要的磷酸化位點。在使用的條件下，GST-埃茲蛋白以比GST-膜突蛋白和GST-根蛋白高2倍的程度被LRRK2[1326-2527，G2019S]磷酸化，這提示其可能代表評估LRRK2酶活性的最好的體外底物。實施例2:適合化合物篩選的分析模式可以使用本領(lǐng)域已知的蛋白激酶篩選分析模式，并考慮到將ESM家族多肽鑒定為LRRK2多肽的底物而作了修改。/C"+n+"Mr/"Cil1r+iPaAAi+"HTTT|、|TO"T-始」Af"/|,人；WnTTTI、I/士BO堪/|、I~T-:017,卜k17Uyn，1工為乂旭I7畫J1T'l丈ffl口、J:T又/l、K)fcA/flJJ/(P處'K/曰-"K;。WIX/tl大'lkA—J—力P3在WO03/087400中所述的分析。可以使用能夠高通量操作的篩選分析。例如，使用基于ERM家族多肽磷酸化位點中一個的底物肽的分析，例如使用結(jié)合至肽的磷酸化形式而不是非磷酸化形式(或反之亦然)的抗體可以是適合的。例如當評估化合物對細胞體積反應(yīng)的效果時，可以使用基于細胞的分析?？梢允褂玫鞍?蛋白結(jié)合分析，例如使用基于表面等離子體共振的技術(shù)或基于芯片的結(jié)合技術(shù)，如本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。如本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的，可以使用基于SPA(閃爍迫近分析(ScintillationProximityAssay),AmershamInternational)的分析。例如，可以制備含有閃爍體和底物多肽，例如上述的膜突蛋白肽底物的珠子?？梢詫⒅樽优c含有"P-或"P-y-標記的ATP、LRRK2多肽的樣品混合并且與測試化合物混合。方便地，這在96孔板中進行。然后使用合適的閃爍計數(shù)器計數(shù)該板，將已知的參數(shù)用于32P或33PSPA分析。只有與閃爍體接近的^P或"P，即只有結(jié)合到結(jié)合至珠子的底物的被檢測?？梢允褂眠@種分析的變體，例如其中底物多肽通過結(jié)合抗體或抗體片段被固定在閃爍體珠子上。也可使用適合于篩選小藥物樣化合物文庫的ELISA模式的非放射性分析抗磷酸膜突蛋白558和抗磷酸膜突蛋白526的抗磷酸肽抗體可以在羊中產(chǎn)生，例如用于western印跡的。評估其用于ELISA模式。膜突蛋白或膜突蛋白片段至微滴度板的固定，例如通過吸附或經(jīng)由GST標簽的俘獲，未被預(yù)期影響LRRK2多肽磷酸化其的能力。分析可以在maxisorp(Nunc)384透明板中進行。在4°C在pH7.4的Tris緩沖液鹽(TBS)中包埋30ng/孔的膜突蛋白片段過夜。多余的結(jié)合位點用在含有0.2%Tween的TBS(TBST)中的5%BSA在室溫封閉1小時，然后用TBST洗滌3次。將在反應(yīng)緩沖液(50mMTrispH7.5、0.01%BSA、O.lmMEGTA、ImMDTT)中的15^ilLRRK2(l-1000ng)加入孔中并且加入溶于11%DMSO的2^1化合物并且孵育30分鐘。通過加入5|aLATP(l-1000nM)/10mMMgCl2開始反應(yīng)并且在室溫孵育25分鐘。通過加入20nL0.5MEDTA停止反應(yīng)。在加入22nL抗磷酸膜突蛋白558抗體(在含有20ng/ml封閉肽的TBST中稀釋1:3700倍)前，用TBST洗板3次。l小時后，用TBST洗板3次，然后在每孔中加入22pL抗羊過氧化物酶偶聯(lián)物(在1%BSA/TBST中1:5000稀釋)并且進一步孵育1小時。在加入在50mM乙酸、50mM乙酸鈉、0.0009%H202中的22nl過氧化物酶底物3，3，，5，5，四甲基聯(lián)苯胺TMB之前，進行最后4次TBST洗滌。顯色進行15分鐘，通過加入5|aL1MHC1而停止。在吸收度讀出器上在450nm讀板?；蛘呖梢允褂蒙虡I(yè)上可獲得的過氧化物酶底物，其允許不同的顏色檢測。例如，在492nm讀數(shù)的鄰苯二胺(OPD)或在405nm讀數(shù)的二胺2,2，-疊氮-二(3-乙基-苯噻唑啉-6-磺酸鹽)(Diammonium2，2，-azino-bis(3-ethyl-benzothiazoline,ir*,、\^rP"^y—、"T""zrrI、Im/士m、1/ri="(tArt丄^i八一z;n:ri"fczH"~■:tf7rt八nrr~~P*tr3-o-suiionaie"。現(xiàn)a比K)^;^州'i丈w火兀;t^'寸"3^11-。耽整-丄/-一于:￡整叨-游噪現(xiàn)川于發(fā)光的基于發(fā)光底物的檢測技術(shù)。認為分析可以適用于廣泛的ATP濃度(1-1000^M)和P/。DMSO(化合物儲存溶劑)。認為源自自發(fā)熒光、淬滅或吸收的化合物干擾被最小化，因為其是涉及異質(zhì)的幾次洗滌步驟。參考文獻1Paisan-Ruiz,C.，Jain，S.，Evans,E.W.，Gilks,W.P.,Simon,J.,vanderBrug,M.,LopezdeMunain,A.，Aparicio,S.,Gil,A.M.，Khan，N.,Johnson,J.,Martinez,J.R.,Nicholl,D.,Carrera，I.M.,Pena,A.S.,deSilva,R.',Lees,A.，Marti-Masso,J.F"Perez-Tur,J.,Wood,N.W.andSingleton,A.B.(2004)CloningofthegenecontainingmutationsthatcausePARK8-linkedParkinson'sdisease.Neuron44,595-6002Zimprich,A.，Biskup，S.，Leitner,P"Lichtner,P.，'Farrer，M.，Lincoln,S.,Kachergus,J"Hulihan,M.,Uitti，R.J"Calne,D.B.,Stoessl，A.J"Pfeiffer,R.F"Patenge，N.,Carbajal,I.C.，Vieregge,P.,Asmus,F"Muller-Myhsok,B.,Dickson,D.W"Meitinger,T.，Strom,T.M.,Wszolek,Z.K.andGass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