專利名稱：：納米脂質(zhì)體抗人乳頭瘤病毒(HPV)及抗婦科炎癥病原體特異性復(fù)合IgY及其組合制劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及醫(yī)療衛(wèi)生
技術(shù)領(lǐng)域：
，尤其涉及到一種納米脂質(zhì)體抗人乳頭瘤病毒(HPV)及抗婦科炎癥病原體特異性復(fù)合IgY以及含這種納米脂質(zhì)體復(fù)合IgY的組合制劑。
背景技術(shù)：
：目前宮頸癌是嚴(yán)重危害婦女健康和生命的疾病，每年約有50萬新發(fā)病例，25萬人死亡，是引起婦女死亡的第二大原因，其中大部分在發(fā)展中國家，占80%左右?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)在大量試驗(yàn)研究的基礎(chǔ)上，己證實(shí)子宮頸癌源自一種人乳頭瘤病毒(HPV)，這是目前人類所有癌癥中唯一一個(gè)病因明確的癌癥。大量檢測資料顯示，HPV感染在1828歲之間的青年人中最常見?？梢哉f，所有在性生活上活躍的人，50y。以上會在其一生中的某個(gè)時(shí)刻發(fā)生生殖器HPV感染。而比例高達(dá)80%的絕大多數(shù)婦女，在50歲之前有過HPV感染。世界衛(wèi)生組織的統(tǒng)計(jì)數(shù)字表明，全球被感染總數(shù)約達(dá)到6,3億人之多，占人口總數(shù)10%，其中女性占絕大多數(shù)；這是一個(gè)令人觸目驚心的大數(shù)字。比較麻煩的是，多數(shù)HPV感染沒有體征和癥狀，但是病毒卻可以通過性生活傳染，這就增加了這種病毒廣泛傳播的危險(xiǎn)性。所以，一般說來，如16歲前過早就有性生活的人，自己或配偶有多個(gè)性伴侶的人，都是HPV的高危人群。此外，無論何種原因?qū)е旅庖吡μ幱诘拖聽顩r的人，也都屬于HPV病毒的易感者，如多孕早產(chǎn)的婦女、HIV病毒(艾滋病毒)感染者、器官移植者或化療患者，以及吸煙、吸毒和營養(yǎng)不良的婦女等。不過，迄今為止，醫(yī)藥界還沒有開發(fā)出用于治療HPV感染的抗病毒藥物，抗生素和其它殺菌藥、消毒藥對HPV病毒完全沒有作用。目前，除了美國剛剛推出進(jìn)行臨床試驗(yàn)的一種疫12苗作為預(yù)防用外，還沒有可用于治療HFV感染的藥物；對己經(jīng)發(fā)生的HPV感染更沒有任何根除方法，現(xiàn)有的治標(biāo)方法僅為去除外生的疣體；而且，各種暫時(shí)的處置手段均有復(fù)發(fā)的可能。一旦受到高危類型HPV病毒感染，最終往往會發(fā)展成為癌癥。雖然美國已經(jīng)研發(fā)出HPV疫苗，不過經(jīng)大量的臨床試驗(yàn)證明，僅僅沒有感染過HPV病毒的人，經(jīng)過3針免疫注射，預(yù)防HPV病毒感染的效果可以達(dá)到100%;但是，絕大多數(shù)婦女，在50歲之前都曾受到HPV病毒感染，另外HPV疫苗對HPV病毒感染只有預(yù)防作用，并沒有治療作用，對于己受到HPV病毒感染的人注射這種疫苗是無能為力的。更何況，要求每個(gè)女性特別是年青健康的青少年在未受到感染前都一律要強(qiáng)制注射這種疫苗也不太現(xiàn)實(shí)；而且，現(xiàn)在也還沒有足夠證據(jù)表明這種疫苗可使注射者獲得終身免疫。目前的現(xiàn)狀是l.臨床上尚無預(yù)防HPV病毒感染的措施；2.對中晚期宮頸癌的化療和手術(shù)治療效果不理想；3.宮頸癌的復(fù)發(fā)率較高，治療費(fèi)用又相當(dāng)高；4.現(xiàn)有疫苗存在許多缺陷。另外，婦科感染也是危害女士健康的一種常見病，多發(fā)病。在健康女性中檢查中，往往有將近半數(shù)的人檢查出患有輕重不同的婦科感染疾病。而且，女性一旦受到HPV病毒感染，就很容易發(fā)生各種婦科炎癥繼發(fā)感染；而婦科炎癥繼發(fā)感染又反過來加劇HPV病毒感染的病情。目前，世界各地的女士普遍采用抗生素或其它各種化學(xué)藥劑來治療這類感染性疾病?？墒牵?dāng)人們服用抗生素或者用普通洗液、殺菌泡騰片、栓劑清潔陰道時(shí)，會把女士陰道內(nèi)的乳酸桿菌等有益菌也一道殺滅；從而，破壞陰道中起天然屏障作用的菌群生態(tài)平衡，造成各種病原體乘機(jī)大量繁殖;結(jié)果，使不少女性因沒有能根治的藥物而終生受各種婦科感染和HPV病毒感染的困擾。因此，尋找一種可同時(shí)對抗HPV病毒感染和婦科炎癥，既可預(yù)防又具有治療作用的新藥，是世界各國千百萬女性的迫切需求，也是擺在國際醫(yī)學(xué)科學(xué)界面前的一項(xiàng)重要課題。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明針對上述現(xiàn)有技術(shù)的不足所要解決的技術(shù)問題是提供乳頭瘤瘤體細(xì)胞蛋白和人乳頭瘤病毒(HPV)基因表達(dá)蛋白兩種方法，分別用乳頭瘤瘤體細(xì)胞蛋白和基因工程重組HPV病毒L1、L2基因表達(dá)蛋白制作抗原，用淘汰法選擇高免疫應(yīng)答產(chǎn)蛋禽類，以免疫激活方法免疫產(chǎn)蛋禽類，制成高活性抗HPV特異性lgY，以被動免疫的方式彌補(bǔ)現(xiàn)有注射疫苗方法之不足；同時(shí)，應(yīng)用納米脂質(zhì)體技術(shù)將所制得的抗HPV特異性IgY超微囊化，增加滲透能力和延效作用，提高實(shí)際療效。另外，本發(fā)明還制備一種納米脂質(zhì)體抗婦科炎癥病原體特異性IgY，并將其與納米脂質(zhì)體抗HPV特異性IgY復(fù)合成納米脂質(zhì)體抗HPV及抗婦科炎癥病原體特異性復(fù)合IgY。這種納米脂質(zhì)體化的抗人乳頭瘤病毒(HPV)及抗婦科炎癥病原體特異性復(fù)合IgY具有很強(qiáng)的滲透能力和延效作用，會滲透陰道粘膜并進(jìn)入體內(nèi)抑滅人乳頭瘤病毒(HPV)及婦科炎癥病原體；完全可用于治療和輔助治療HPV病毒感染以及婦科多種病毒和致病菌混合感染。本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是一.制備抗人乳頭瘤病毒(HPV)特異性IgY1篩選引致女性生殖器疣和宮頸瘤的有代表性的幾種人乳頭瘤病毒。HPV病毒是一種具有種屬特異性的嗜上皮病毒，屬雙鏈死循環(huán)的小DNA病毒，包含約8000個(gè)堿基對。其中包括8個(gè)早期開放讀碼框架(El-E8)、2個(gè)晚期讀碼框架和1個(gè)非編碼長控區(qū)。在早期開放讀碼框架中，E6和E7基因?qū)?xì)胞生長刺激最為重要，E6、E7編碼的E6、E7蛋白引起宮頸上皮細(xì)胞永生化。而晚期讀碼框Ll和L2基因分別編碼HPV的主要和次要衣殼蛋白，組裝成HPV病毒的衣殼。根據(jù)流行病學(xué)調(diào)查，人乳頭瘤病毒(HPV)是一個(gè)大家族，共有100多型，約30型可以引起男女生殖器部位的持續(xù)感染。HPV6、ll為低危型，而HPV31、33、35、39、51、52和58為中危型，HPVI6、18、45和56為高危型。低危類型的HPV病毒可引起生殖器疣的形成，即在生殖器表面或周圍出現(xiàn)肉質(zhì)的非癌變的生長物，6型和11型感染造成的生殖器疣占所有病例的卯％。高危類型的HPV病毒有16、18、31和45型及其它型，感染如果長期存在，會導(dǎo)致宮頸癌和陰道癌以及外陰癌等，其中16和18型感染導(dǎo)致的宮頸癌占70%左右。因此本發(fā)明選擇6、11、16、18、31和45型六種型作為有代表性的病原體。2.制備免疫用抗原。本發(fā)明采用以下兩種方法制作免疫用抗原-2.1乳頭瘤瘤體細(xì)胞蛋白2.1.1把從患者體內(nèi)切割的乳頭瘤瘤體組織置入"組織搗碎勻漿機(jī)"中，用8000-12000rpm高速搗碎勻化，得到含乳頭瘤瘤體細(xì)胞蛋白和人乳頭瘤病毒(HPV)的蛋白懸浮漿液。乳頭瘤瘤體組織經(jīng)過"組織搗碎勻槳機(jī)"高速搗碎勻化后，其中的瘤體細(xì)胞和人乳頭瘤病毒(HPV)就都以蛋白形式存在于所制成的蛋白懸浮漿液中。根據(jù)本發(fā)明人的試驗(yàn)，以這兩種成份作為抗原免疫產(chǎn)蛋禽類，除了可得到抗人乳頭瘤病毒(HPV)的抗體外，還可獲得抗人乳頭瘤的抗體。因此，本發(fā)明沒有必要從乳頭瘤瘤體組織中分離人乳頭瘤病毒(HPV)蛋白。這也是本發(fā)明的新穎和獨(dú)創(chuàng)之處。2丄2制備免疫用抗原將所制得的含乳頭瘤瘤體細(xì)胞蛋白和人乳頭瘤病毒(HPV)的蛋白懸浮漿液以1-10:1-10的比例(通常為l:l)加入福氏佐劑，置入高速勻漿器以30,000rpm高速勻化，形成油包水乳液，即制得乳頭瘤瘤體細(xì)胞、病毒蛋白復(fù)合抗原。2.2基因工程表達(dá)蛋白根裾對HPV病毒結(jié)構(gòu)的基因分析，HPV中的Ll和L2基因分別編碼HPV的主要和次要衣殼蛋白，組裝成HPV病毒的衣殼。因此，選擇Ll和L2作為有代表性的共同抗原決定簇成份，應(yīng)用基因工程技術(shù)重組HPV病毒L1、L2基因表達(dá)蛋白，并將這種重組基因表達(dá)蛋白作為抗原成份。如果只選擇L1或者只選擇L2，都將影響所制備的抗體的功效。具體實(shí)施方法如下-2.2.1應(yīng)用基因工程技術(shù)制作抗原成份用RT-PCR方法從HPV病毒RNA克隆HPV.Ll、L2基因，去掉信號肽和穿膜區(qū)的片段。先插入pGEM-T載體。測序證明所獲得的基因序列正確后，用限制性內(nèi)切酶EcoRI和NotI雙酶消化，電泳回收目的片段，與用同樣雙酶消化的酵母表達(dá)載體pPIC9K連接。轉(zhuǎn)化大腸桿菌。15挑取陽性克隆，提質(zhì)粒，酶切鑒定正確后，電轉(zhuǎn)化畢氏酵母菌(Pichiapastoris)KM71和GS115。在不含組氨酸的培養(yǎng)基上篩選陽性克隆，然后再在含不同濃度的G418的培養(yǎng)基上篩選高拷貝轉(zhuǎn)化株。挑取單個(gè)菌落接種到培養(yǎng)基中，在28度搖床培養(yǎng)過夜。稀釋后繼續(xù)培養(yǎng)。待細(xì)菌濃度達(dá)到OD600的吸光值約為0.8時(shí)，將培養(yǎng)基換成含甲醇的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24-48小時(shí)。于培養(yǎng)的不同時(shí)間采樣，用ELISA法測定上清中HA的表達(dá)量。選表達(dá)量最高的時(shí)間收獲。離心去除細(xì)胞沉淀。上清中即含大量表達(dá)產(chǎn)物。經(jīng)50%硫酸鉸沉淀，截留分子量10kd的透析袋用蒸鎦水透析24小時(shí)，以及S印hacrylS-200和S印hacrylS-100柱層析后，即獲得純化的HPV病毒L1、L2基因表達(dá)蛋白抗原成份。2.2.2制備免疫用抗原將所制得的HPV病毒L1、L2基因表達(dá)蛋白抗原成份以1-10:1-10的比例(通常為1:1)加入福氏佐劑，置入高速勻漿器以30，000rpm高速勻化，形成油包水乳液，即制得HPV病毒Ll、L2基因表達(dá)蛋白抗原。3.制備含高活性抗體的免疫蛋本發(fā)明可選用任何產(chǎn)蛋禽類免疫制備免疫蛋，限于篇幅僅以母雞為例說明，其它禽類完全可依下文所述方法同樣進(jìn)行。首先采用淘汰法選擇產(chǎn)蛋禽類(雞、鴨、鵝、火雞、鴕鳥等)，再用所制備的抗原免疫所選擇的禽類獲得免疫蛋。現(xiàn)以產(chǎn)蛋母雞為代表說明如下3.1采用淘汰法選擇具有高免疫應(yīng)答能力的產(chǎn)蛋母雞3丄選擇正在產(chǎn)蛋的健康無特定病原體攜帶的(SPF)健康產(chǎn)蛋雞200只并一一用數(shù)字進(jìn)行編號標(biāo)記。然后用上敘制得的HPV病毒L1、L2基因表達(dá)蛋白抗原對這些產(chǎn)蛋雞進(jìn)行注射免疫。在第一次注射后間隔7天，再以同樣劑量、方法注射第二次，第二次注射后再間隔7天以相同劑量注射第3次，第一次注射后從第20天開始揀取高免疫蛋。對所檢取的免疫蛋按每只雞的編號不同進(jìn)行編碼標(biāo)記。3丄2當(dāng)每種編碼的免疫蛋數(shù)量達(dá)到300只左右時(shí)，將檢取的每批免疫蛋分別用0.5%新潔而滅溶液或0.1%KMnO4溶液或其它同類消毒液將免疫蛋浸泡15-30分鐘消毒，無菌蒸餾水沖洗、晾干，置于打蛋機(jī)中將蛋殼打碎，用蛋黃篩濾除蛋清留下蛋黃加入4-8倍蒸餾水稀釋攪拌均勻，用lmo1/1NaOH液或者lmo1/1HCL液調(diào)節(jié)PH至5.5-6.0,4-6'C下靜置過夜，稀釋液8,000-12,000r/min高速離心20分鐘，取上清液用超濾機(jī)超濾濃縮，得到200批抗HPV特異性IgY濃縮液體。3丄3分別以6、11、16、18、31和45型六種型HPV病毒作為抗原，采用酶聯(lián)免疫法(ELISA)檢測所制得的200批抗HPV特異性IgY濃縮液體中每批對6、11、16、18、31和45型六種型HPV病毒的抗體結(jié)合效價(jià)。3丄4將凡是對6、11、16、18、3和45型六種型HPV病毒的抗體結(jié)合效價(jià)達(dá)到1:102,400以上的該批抗HPV特異性IgY濃縮液體單獨(dú)挑選出來；找出其對應(yīng)的產(chǎn)蛋母雞的編號，把這些產(chǎn)蛋母雞作為選擇的"具有高免疫應(yīng)答能力的產(chǎn)蛋母雞"，其它不符合高免疫應(yīng)答能力的母雞則淘汰不用。3.2免疫高免疫應(yīng)答能力的正在產(chǎn)蛋母雞將所選擇的具有高免疫應(yīng)答能力的產(chǎn)蛋母雞，應(yīng)用免疫激活方法，分別采用乳頭瘤瘤體細(xì)胞、病毒蛋白復(fù)合抗原和HPV病毒L1、L2基因表達(dá)蛋白抗原進(jìn)行注射免疫。在第一次注射后間隔7天，再以同樣劑量、方法注射第二次，第二次注射后再間隔7天以相同劑量注射第3次，第一次注射后從第20天幵始揀取高免疫蛋。對所檢免疫蛋按不同抗原進(jìn)行編碼登記。4.抗HPV特異性IgY粗品的制備將所獲得的兩種高免疫蛋分別用0.5%新潔而滅溶液或0.1%KMnO4溶液或其它同類消毒液將免疫蛋浸泡15-30分鐘消毒，無菌蒸餾水沖洗、晾干，置于打蛋機(jī)中將蛋殼打碎，用蛋黃篩濾除蛋清留下蛋黃加入4-8倍蒸餾水稀釋攪拌均勻，用lmo/NaOH液或者lmol/1HCL液調(diào)節(jié)PH至5.5-6.0,4-6'C下靜置過夜，稀釋液8,000-12,000r/min高速離心20分鐘，取上清液用超濾機(jī)超濾濃縮。然后，采用美國PallUitrafmeFiltrationCompany制造的除病毒過濾系統(tǒng)的細(xì)菌病毒濾除裝置，徹底濾除各種細(xì)菌病毒，確保所制備的IgY絕不含任何病毒和細(xì)菌。第一道細(xì)菌濾除裝置是用0.22pm膜除菌過濾器除去沙門菌(Salmonella)等細(xì)菌；第二道支原體濾除裝置是用O.lpm膜除支原體過濾器除去支原體；第三道病毒濾除裝置是用UltiporVFTMDV50除病毒過濾器除去包括禽流感病毒、腸病毒在內(nèi)的多種病毒。最后，將所得濃縮液用冷凍干燥機(jī)干燥，即制得兩種抗HPV特異性IgY粗品。5.抗HPV特異性IgY純品制備將所制得的兩種抗HPV特異性IgY粗品分別過離子交換柱和凝膠交換柱再經(jīng)過親和層析柱進(jìn)行純化，即制得兩種高活性的抗HPV特異性純IgY。采用常規(guī)"水稀釋法"或"聚乙二醇法"等普通方法，而未經(jīng)過親和層析柱層析純化的，所得到的只是初級的IgY粗制品，并不是純化的IgY，其生物活性達(dá)不到醫(yī)療要求，根本不能用于對HPV病毒感染的預(yù)防，更不可能用于治療。將所制得的兩種抗特異性IgY純品應(yīng)用冷凍干燥機(jī)干燥，即制得兩種抗HPV特異性IgY純品干粉。應(yīng)用SDS-PAGE電泳測定法，對按以上工藝所制取的兩種抗HPV特異性IgY純品進(jìn)行檢測，測得其中IgY含量都在98%以上。6.取所制得的兩種抗HPV特異性IgY純品干粉，加入超微粉碎機(jī)中碾磨粉碎，加工成大小在l-100nm之間、粒度超過》15000目的超微粒子，制得相應(yīng)的兩種納米化抗HPV特異性IgY純品干粉。7.分別將以上所制得的兩種納米化抗HPV特異性IgY純品制成脂質(zhì)體液晶微囊。具體實(shí)施方法如下把卵磷脂和膽固醇溶于乙醚中，再分別將兩種納米化抗HPV特異性IgY純品加入4mmol/L磷酸鹽緩沖液(PBS)配成IgY溶液，超聲處理2min(每處理0.5min，間歇.0.5min),立即在水浴中減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至呈凝膠狀，漩渦振蕩使凝膠轉(zhuǎn)相，再繼續(xù)蒸發(fā)除盡乙醚，進(jìn)而超速離心(35000r/min，30min)分離除去未包入的IgY，沉淀用水洗二次，離心，得沉淀，用10mmol/LPBS稀釋，即制得兩種抗HPV特異性IgY脂質(zhì)體。8.分別以6、1、6、18、3和45型六種型HPV病毒以及未作為免疫用抗原的33、35、39、51、52和58、56型HPV病毒作為抗原，采用酶聯(lián)免疫法(ELSA)檢測以上所制得的兩種抗HPV特異性IgY脂質(zhì)體對6、U、16、18、31和45型六種型HPV病毒的抗體結(jié)合效價(jià)都高達(dá)1:102,400以上。對未作為免疫用抗原的33、35、39、51、52和58、56型HPV病毒的抗體結(jié)合效價(jià)也可達(dá)1:25,600以上；這就證實(shí)了本發(fā)明所采取的兩種特殊的抗原制作方法以及選擇高應(yīng)答能力免疫雞種的方法和免疫激活措施，對提高免疫原性和增強(qiáng)抗原交叉性是確切有效的。這是一般的常規(guī)免疫方法所做不到的，這樣高的生物活性和抗原交叉性才有可能對多種不同型的HPV病毒引致的女性生殖器感染都有確切功效，也才真正具有實(shí)際應(yīng)用的價(jià)值。二.制備脂質(zhì)體抗婦科炎癥病原體特異性IgY1.篩選引致陰道炎癥的有代表性的病毒和致病菌、原蟲。根據(jù)流行病學(xué)調(diào)查，引致陰道炎癥的病原體主要有淋球菌、白色念珠菌、毛滴蟲、金黃色葡萄球菌、陰道嗜血桿菌以及皰疹病毒。因此本發(fā)明選擇淋球菌、白色念珠菌、毛滴蟲、金黃色葡萄球菌、陰道嗜血桿菌以及皰疹病毒作為陰道炎有代表性的病原體。2.制備免疫用抗原。2.1培養(yǎng)病原體與"江西省微生物研究所合作從陰道炎患者體內(nèi)攝取淋球菌、白色念珠菌、毛滴蟲、金黃色葡萄球菌、陰道嗜血桿菌以及皰疹病毒，并采用常規(guī)方法培養(yǎng)這些病原菌、毛滴蟲和皰疹病毒。2.2制備復(fù)合抗原-先將所制得的四種致病菌和毛滴蟲按卜10:1-10:1-10:1-10:1-10的比例(通常按1:1:1:1:1)混合并用常規(guī)方法粉碎，然后以5:1的比例與皰疹病毒提純液混合，并置入"組織搗碎勻漿機(jī)"中以8000-12000rpm充分搗碎攪拌均勻。然后將這種細(xì)菌病毒蛋白混合液以卜10:1-10的比例(通常為1:1)加入福氏佐劑，置入高速勻漿器以30，000rpm高速勻化，形成油包水乳液，即制得細(xì)菌病毒蛋白復(fù)合抗原。3.制備含高活性抗體的免疫蛋首先采取與前敘相同方法選擇產(chǎn)蛋禽類(雞、鴨、鵝、火雞、鴕鳥等)，再用所制備的抗原免疫所選擇的禽類獲得免疫蛋?，F(xiàn)以產(chǎn)蛋母雞為代表說明如下3.1采用淘汰法選擇具有高免疫應(yīng)答能力的產(chǎn)蛋母雞3丄1選擇正在產(chǎn)蛋的健康無特定病原體攜帶的(SPF)健康產(chǎn)蛋雞200只，并一一用數(shù)字進(jìn)行編號標(biāo)記。然后用上敘制得的細(xì)菌病毒蛋白復(fù)合抗原對這些產(chǎn)蛋雞進(jìn)行注射免疫。在第一次注射后間隔7天，再以同樣劑量、方法注射第二次，第二次注射后再間隔7天以相同劑量注射第3次，第一次注射后從第20天開始揀取高免疫蛋。對所檢取的免疫蛋按每只雞的編號不同進(jìn)行編碼標(biāo)記。3.1.2當(dāng)每種編碼的免疫蛋數(shù)量達(dá)到300只左右時(shí)，將檢取的每批免疫蛋分別用0.5%新潔而滅溶液或0.1%KMnO4溶液或其它同類消毒液將免疫蛋浸泡15-30分鐘消毒，無菌蒸餾水沖洗、晾干，置于打蛋機(jī)中將蛋殼打碎，用蛋黃篩濾除蛋清留下蛋黃加入4-8倍蒸餾水稀釋攪拌均勻，用lmo1/1NaOH液或者lmo1/1HCL液調(diào)節(jié)PH至5.5-6.0,4-6'C下靜置過夜，稀釋液8,000-12,000r/min高速離心20分鐘，取上清液用超濾機(jī)超濾濃縮，得到200批抗婦科炎癥病原體特異性IgY濃縮液體。3丄3分別以淋球菌、白色念珠菌、毛滴蟲、金黃色葡萄球菌、陰道嗜血桿菌以及皰疹病毒作為抗原，采用酶聯(lián)免疫法(ELISA)檢測所制得的200批抗婦科炎癥病原體特異性1gY濃縮液體中每批對淋球菌、白色念珠菌、毛滴蟲、金黃色葡萄球菌、陰道嗜血桿菌以及皰疹病毒的抗體結(jié)合效價(jià)。3丄4將凡是對淋球菌、白色念珠菌、毛滴蟲、金黃色葡萄球菌、陰道嗜血桿菌以及皰疹病毒的抗體結(jié)合效價(jià)達(dá)到1:51,200以上的該批抗婦科炎癥病原體特異性IgY濃縮液體單獨(dú)挑選出來找出其對應(yīng)的產(chǎn)蛋母雞的編號，把這些產(chǎn)蛋母雞作為選擇的"具有高免疫應(yīng)答能20力的產(chǎn)蛋母雞"，其它不符合高免疫應(yīng)答能力的母雞則淘汰不用。3.2免疫高免疫應(yīng)答能力的正在產(chǎn)蛋母雞將所選擇的具有高免疫應(yīng)答能力的產(chǎn)蛋母雞，應(yīng)用免疫激活方法，采用上敘制得的細(xì)菌病毒蛋白復(fù)合抗原進(jìn)行注射免疫。在第一次注射后間隔7天，再以同樣劑量、方法注射第二次，第二次注射后再間隔7天以相同劑量注射第3次，第一次注射后從第20天開始揀取高免疫蛋。4.抗婦科炎癥病原體特異性IgY粗品的制備分別將所產(chǎn)的高免疫蛋用0.5%新潔而滅溶液或0.1%KMnO4溶液或其它同類消毒液將免疫蛋浸泡15-30分鐘消毒，無菌蒸餾水沖洗、晾干，置于打蛋機(jī)中將蛋殼打碎，用蛋黃篩濾除蛋清留下蛋黃加入4-8倍蒸餾水稀釋攪拌均勻，用lmol/lNaOH液或者lmol/lHCL液調(diào)節(jié)PH至5.5-6.0，4-6。C下靜置過夜，稀釋液8，000-12,000r/min高速離心20分鐘，取上清液用超濾機(jī)超濾濃縮。然后，采用美國PallUltrafmeFiltrationCompany制造的除病毒過濾系統(tǒng)的細(xì)菌病毒濾除裝置，徹底濾除各種細(xì)菌病毒，確保所制備的IgY絕不含任何病毒和細(xì)菌。第一道細(xì)菌濾除裝置是用0.22nm膜除菌過濾器除去沙門菌(Salmonella)等細(xì)菌；第二道支原體濾除裝置是用O.lpm膜除支原體過濾器除去支原體；第三道病毒濾除裝置是用UltiporVFTMDV50除病毒過濾器除去包括禽流感病毒、腸病毒在內(nèi)的多種病毒。最后，將所得濃縮液用冷凍干燥機(jī)干燥，即制得抗婦科炎癥病原體特異性IgY粗品。5.抗婦科炎癥多種病原體特異性IgY純品制備將所制得的抗婦科炎癥病原體特異性IgY粗品分別過離子交換柱和凝膠交換柱以及親和層析柱進(jìn)行純化，即得抗婦科炎癥病原體特異性純IgY;將所制得的抗婦科炎癥病原體特異性IgY粗品或抗婦科炎癥病原體特異性IgY純品應(yīng)用冷凍干燥機(jī)干燥，即制得抗婦科炎癥病原體特異性IgY粗制品干粉和抗婦科炎癥病原體特異性IgY純品干粉。應(yīng)用SDS-PAGE電泳測定法，對按以上工藝所制取的抗婦科炎癥病原體特異性IgY純品進(jìn)行檢測，測得其中IgY含量為98W以上。6.分別以淋球菌、白色念珠菌、毛滴蟲、金黃色葡萄球菌、陰道嗜血桿菌以及皰疹病毒作為抗原，采用酶聯(lián)免疫法(ELISA)檢測以上所制得的抗婦科炎癥病原體特異性IgY粗制品對這五種致病菌和皰疹病毒的抗體結(jié)合效價(jià)。對五種致病菌的抗體結(jié)合效價(jià)都高達(dá)1:51,200以上，對皰疹病毒的抗體結(jié)合效價(jià)更高達(dá)l:102,400以上，完全達(dá)到了醫(yī)療的要求。7.取所制得的抗婦科炎癥病原體特異性IgY干粉，加入超微粉碎機(jī)中碾磨粉碎，加工成大小在l-100nm之間、粒度超過》15000目的超微粒子，制得相應(yīng)的納米化抗婦科炎癥病原體特異性IgY干粉。8.將以上所制得的納米化抗婦科炎癥病原體特異性IgY制成脂質(zhì)體液晶微囊。具體實(shí)施方法如下把卵磷脂和膽固醇溶于乙醚中，再將納米化抗婦科炎癥病原體特異性IgY加入4mmol/L磷酸鹽緩沖液(PBS)配成IgY溶液，超聲處理2min(每處理0.5min，間歇.0.5min),立即在水浴中減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至呈凝膠狀，漩渦振蕩使凝膠轉(zhuǎn)相，再繼續(xù)蒸發(fā)除盡乙醚，進(jìn)而超速離心(35000r/min，30min)分離除去未包入的IgY,沉淀用水洗二次，離心，得沉淀，用1Ommol/LPBS稀釋，即制得抗婦科炎癥病原體特異性IgY脂質(zhì)體。三.制備抗人乳頭瘤病毒(HPV)及抗婦科炎癥病原體特異性復(fù)合IgY脂質(zhì)體分別將所制得的兩種抗HPV特異性IgY脂質(zhì)體按10-10:1-10比例(通常以l:l)與抗婦科炎癥病原體特異性IgY脂質(zhì)體混合，加入勻質(zhì)機(jī)充分混合均勻，然后再用超聲波進(jìn)一步勻化，即制得兩種抗人乳頭瘤病毒(HPV)及抗婦科炎癥病原體特異性復(fù)合IgY脂質(zhì)體。四.實(shí)際應(yīng)用上述所制得的兩種抗人乳頭瘤病毒(HPV)及抗婦科炎癥病原體特異性復(fù)合IgY脂質(zhì)體可以再加入其它化學(xué)藥品成份或中藥成份制成各種復(fù)方藥品，用于預(yù)防和治療人乳頭瘤病毒(HPV)感染以及婦科多種病毒和致病菌混合感染。將上述兩種抗人乳頭瘤病毒(HPV)及抗婦科炎癥病原體特異性復(fù)合IgY脂質(zhì)體與各種化學(xué)藥品、中藥等配成的復(fù)方成份配以蒸餾水調(diào)配成濃度0.01—20.0%的溶劑，可制成各種陰道噴霧劑、陰道洗液等劑型，也可制成男士用噴霧劑等；或者配以99.99~"80.0%的各種適宜的輔料制成各種臨床可接受的劑型，如陰道凝膠劑、陰道軟膠囊和硬膠囊、陰道栓劑、陰道膜、陰道片劑和泡騰片以及軟膏、霜劑等，也可制成男女士用含片、咀嚼片、口香糖等。含抗人乳頭瘤病毒(HPV)及抗婦科炎癥病原體特異性復(fù)合IgY脂質(zhì)體的洗液可供女士日常清潔陰部，有效消除人乳頭瘤病毒(HPV)以及各種陰道致病菌和皰疹病毒的感染；其它各種劑型可直接置入陰道內(nèi)，在陰道局部殺滅人乳頭瘤病毒(HPV)以及各種陰道致病菌和皰疹病毒。由于近年來，發(fā)現(xiàn)一些海藻蛋白具有殺滅HIV病毒和HPV病毒以及皰疹病毒的功效，特別是其中一種褐藻蛋白M對HPV病毒和皰疹病毒有相當(dāng)強(qiáng)的殺滅作用；只要達(dá)到十萬分之一的濃度就可有效殺滅HPV病毒和皰疹病毒。因此，本發(fā)明采用抗人乳頭瘤病毒(HPV)及抗婦科炎癥病原體特異性復(fù)合IgY脂質(zhì)體和褐藻蛋白M組成復(fù)合物，再與各種化學(xué)藥品、中藥等配成復(fù)方成份并配以蒸餾水調(diào)配成濃度0.01—20.0%的溶劑，可制成各種陰道噴霧劑、陰道洗液等劑型，也可制成男士用噴霧劑等；或者配以99.99一80.0%的各種適宜的輔料制成各種臨床可接受的劑型，如陰道凝膠劑、陰道軟膠囊和硬膠囊、陰道栓劑、陰道膜、陰道片劑和泡騰片以及軟膏、霜劑等，也可制成男女士用含片、咀嚼片、口香糖等。含抗人乳頭瘤病毒(HPV)及抗婦科炎癥病原體特異性復(fù)合IgY脂質(zhì)體和褐藻蛋白M的洗液可供女士日常清潔陰部，有效消除人乳頭瘤病毒(HPV)以及各種陰道致病菌和皰疹病毒的感染；其它各種含抗人乳頭瘤病毒(HPV)及抗婦科炎癥病原體特異性復(fù)合IgY脂質(zhì)體和褐藻蛋白M的劑型可直接置入陰道內(nèi)，在陰道局部殺滅人乳頭瘤病毒(HPV)以及各種陰道致病菌和皰疹病毒。本發(fā)明的有益效果是由于本發(fā)明的特異性IgY脂質(zhì)體具有更強(qiáng)的靶向性、延效性和表皮滲透性，顯著提升了治療指數(shù)，能更有效地滲透深入陰道粘膜層；因此，這種脂質(zhì)體化的特異性IgY抗體納米液晶微囊很容易通過陰道粘膜吸收，并通過陰道粘膜分布豐富的血管進(jìn)入體內(nèi)，達(dá)到局部治療作用和經(jīng)粘膜吸收發(fā)揮全身治療作用相結(jié)合的效果，這是常規(guī)方法制備的一般抗人乳頭瘤病毒(HPV)IgY所做不到的；另外，本發(fā)明不采用常規(guī)的從瘤體組織分離病毒蛋白的做法，而是直接采用經(jīng)過"組織搗碎勻漿機(jī)"加工的"人乳頭瘤瘤體細(xì)胞蛋白"制作抗原，其中既包含了瘤體細(xì)胞蛋白，又包含了人乳頭瘤病毒蛋白；用這種復(fù)合蛋白漿液作為抗原成份免疫禽類，就可制成一種含抗人乳頭瘤抗體成份的抗人乳頭瘤病毒(HPV)復(fù)合抗體。含有這種復(fù)合抗體的抗人乳頭瘤病毒(HPV)及抗婦科炎癥病原體特異性復(fù)合IgY脂質(zhì)體除了可有效抑滅人乳頭瘤病毒(HPV)以及各種陰道致病菌和皰疹病毒外，還具有抑制腫瘤細(xì)胞的功效，以下的實(shí)施方案中的實(shí)驗(yàn)例4也證明了這一點(diǎn)。這也是本發(fā)明的一個(gè)重要突破。.根據(jù)最新的研究揭示，人乳頭瘤病毒(HPV)病毒和皰疹病毒也可感染男士，是男性得口腔癌的主要原因。因此，本發(fā)明的納米脂質(zhì)體抗人乳頭瘤病毒(HPV)及抗婦科炎癥病原體特異性復(fù)合IgY也可制成一種口噴劑和外用清潔噴劑供男士使用，消除男士口腔中和下陰部可能感染的人乳頭瘤病毒(HPV)和皰疹病毒；也可杜絕通過接吻、性接觸等途徑將人乳頭瘤病毒(HPV)和皰疹病毒從男士身上傳染給女士，這也是本發(fā)明的新穎性。本發(fā)明利用脂質(zhì)體抗人乳頭瘤病毒(HPV)及抗婦科炎癥病原體特異性復(fù)合IgY保護(hù)陰道局部粘膜細(xì)胞不受人乳頭瘤病毒(HPV)以及婦科多種病毒和致病菌的侵染，這是阻斷其感染的關(guān)鍵，對人乳頭瘤病毒(HPV)和婦科多種病毒的吸附直接起到封閉作用，是本發(fā)明的抗人乳頭瘤病毒(HPV)及抗婦科炎癥病原體特異性復(fù)合IgY脂質(zhì)體具有預(yù)防和治療作用的機(jī)理之一。本發(fā)明的抗人乳頭瘤病毒(HPV)及抗婦科炎癥病原體特異性復(fù)合IgY脂質(zhì)體還可對受感染者被侵染周部新釋放的病毒迸行中和，使其喪失再行擴(kuò)散傳播的能力，因而達(dá)到既可治療又可防止人乳頭瘤病毒(HPV)以及婦科多種病毒和致病菌通過性接觸等途徑傳染的雙重目的。這是其創(chuàng)新獨(dú)到之處。由于抗人乳頭瘤病毒(HPV)及抗婦科炎癥病原體特異性復(fù)合IgY脂質(zhì)體及其各種組合制劑天然安全，無任何毒副作用，完全是從發(fā)病根源上有效杜絕人乳頭瘤病毒(HPV)感染和其它各種婦科感染。它能專一殺滅病原體，保護(hù)乳酸桿菌等有益菌，維護(hù)陰道菌群生態(tài)平衡，形成天然抗菌抗病毒屏障，產(chǎn)生特殊的長效作用。既可用于平日隨時(shí)隨地預(yù)防，特別是可用于房事前后最直接、最及時(shí)的預(yù)防，抑滅陰道內(nèi)的各種病原體；又可用于己受感染者的治療，使用又十分簡便。因此，它一方面可解決目前國際醫(yī)藥界還沒有開發(fā)出用于治療HPV感染和皰疹病毒感染的抗病毒藥物，抗生素和其它殺菌藥、消毒藥對HPV病毒和皰疹病毒完全沒有作用的問題；另一方面，它還解決了己經(jīng)發(fā)生的HPV和皰疹病毒感染沒有任何根除方法，各種暫時(shí)的處置手段均有復(fù)發(fā)的可能的難題。同時(shí)，本發(fā)明的相關(guān)組合制劑的問世，也在一定程度上克服了HPV疫苗使用不便，以及對HPV病毒感染只有遠(yuǎn)期預(yù)防作用，無法及時(shí)預(yù)防，更沒有治療作用，對疫苗靶抗原之外的其它許多型的人乳頭瘤病毒(HPV)感染也沒有保護(hù)作用的不足。具體實(shí)施方式本發(fā)明是這樣實(shí)施的10.1實(shí)驗(yàn)例1:兩種抗HPV特異性IgY和抗婦科炎癥病原體特異性IgY中的IgY含量檢測應(yīng)用SDS-PAGE(十二烷基硫酸鈉一聚丙烯凝膠)電泳測定法，分別對按以上工藝所制取的兩種抗HPV特異性IgY和抗婦科炎癥病原體特異性IgY粗提物進(jìn)行檢測，結(jié)果含IgY45-52%。將這三種IgY粗提物經(jīng)二次過柱純化后，得到純IgY。經(jīng)SDS-PAGE分析，純度達(dá)到PAGE純，如下表所示IgY純品純IgY含量抗HPV特異性IgY-1純品(人乳頭瘤細(xì)胞、病毒蛋白復(fù)合抗原)99.99%抗HPV特異性IgY-II純品(基因重組表達(dá)蛋白抗原)99.99%抗婦科炎癥病原體特異性IgY純品99.99%2510.2實(shí)驗(yàn)例2:檢測兩種抗人乳頭瘤病毒(HPV)及抗婦科炎癥病原體特異性復(fù)合IgY脂質(zhì)體對有代表性的六種HPV病毒的抗體結(jié)合效價(jià)分別以采用人乳頭瘤細(xì)胞、病毒蛋白復(fù)合抗原和HPVL1、L2基因表達(dá)蛋白抗原的兩種免疫抗原方案所制備的兩種抗HPV特異性IgY和抗HPV特異性IgY脂質(zhì)體，用6、11、16、18、31和45型六種型HPV病毒作為檢測抗原，用"ELISA"方法檢測所制得的兩種抗人乳頭瘤病毒(HPV)及抗婦科炎癥病原體特異性復(fù)合IgY脂質(zhì)體的抗體效價(jià)。結(jié)果如下表<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>從以上檢測結(jié)果可看出，無論采取乳頭瘤細(xì)胞、病毒蛋白復(fù)合抗原或者采用HPV病毒Ll、L2基因表達(dá)蛋白抗原來免疫產(chǎn)蛋禽類，所制備的兩種抗人乳頭瘤病毒(HPV)及抗婦科炎癥病原體特異性復(fù)合IgY脂質(zhì)體對直接作為抗原免疫的六種HPV病毒都有很高的抗體結(jié)合效價(jià)。其中"乳頭瘤細(xì)胞、病毒蛋白復(fù)合抗原"由于含有HPV病毒全蛋白，以其作為抗原免疫雞，所制備的脂質(zhì)體IgY效價(jià)更高。試驗(yàn)結(jié)果證明，本發(fā)明所采用的方法對提高所制備的IgY的抗體效價(jià)有十分理想的效果。10.3實(shí)驗(yàn)例3:檢測兩種抗人乳頭;l病毒(HPV)及抗婦科炎癥病原體特異性復(fù)合IgY脂質(zhì)體對未作為抗原免疫的其它型的HPV病毒的抗體結(jié)合效價(jià)。分別采用"人乳頭瘤細(xì)胞、病毒蛋白復(fù)合抗原"和HPV病毒L1、L2基因表達(dá)蛋白抗原免疫所制備的兩種抗人乳頭瘤病毒(HPV)及抗婦科炎癥病原體特異性復(fù)合IgY脂質(zhì)體，以未作為免疫用抗原的33、35、39、51、52和58、56型HPV病毒作為檢測抗原，用"ELISA"方法檢測所制得的兩種抗人乳頭瘤病毒(HPV)及抗婦科炎癥病原體特異性復(fù)合IgY脂質(zhì)體的抗體效價(jià)。結(jié)果如下表IgY抗原抗體結(jié)合效價(jià)抗人乳頭瘤病毒(HPV)及抗婦科炎癥病原體特異性復(fù)合IgY脂質(zhì)體-I(人乳頭瘤細(xì)胞、病毒蛋白復(fù)合抗原)33型HPV病毒1:512,0035型HPV病毒1:512,0039型HPV病毒1:512,0051型HPV病毒1:512,0052型HPV病毒1:512,0058型HPV病毒1:512,0056型HPV病毒1:512,00抗人乳頭瘤病毒(HPV)及抗婦科炎癥病原體特異性復(fù)合IgY脂質(zhì)體-II(基因重組表達(dá)蛋白抗原)33型HPV病毒1:25,60035型HPV病毒1:25,60039型HPV病毒1:25,60051型HPV病毒1:25,600<table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>從以上檢測結(jié)果可看出，無論采取人乳頭瘤細(xì)胞、病毒蛋白復(fù)合抗原或者采用HPV病毒L1、L2基因表達(dá)蛋白抗原來免疫產(chǎn)蛋禽類，所制備的兩種抗人乳頭瘤病毒(HPV)及抗婦科炎癥病原體特異性復(fù)合IgY脂質(zhì)體對沒有作為抗原免疫的33、35、39、51、52、58、56型HPV病毒也有理想的抗體結(jié)合效價(jià)。其中"人乳頭瘤細(xì)胞、病毒蛋白復(fù)合抗原"由于含有HPV病毒全蛋白，以其作為抗原免疫雞，所制備的脂質(zhì)體IgY效價(jià)相對更高。本試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步證明，本發(fā)明所采用的方法對提高所制備的IgY的抗體效價(jià)有十分理想的效果。10.4實(shí)驗(yàn)例4:采用經(jīng)過"組織搗碎勻漿機(jī)"加工的"人乳頭瘤瘤體細(xì)胞、病毒蛋白"作為檢測用抗原，使用"ELISA"方法檢測以"人乳頭瘤瘤體細(xì)胞、病毒蛋白復(fù)合抗原"免疫禽類所制得抗人乳頭瘤病毒(HPV)及抗婦科炎癥病原體特異性復(fù)合IgY脂質(zhì)體的抗體效價(jià)。結(jié)果如下表<table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>以上檢測結(jié)果表明，由于"人乳頭瘤細(xì)胞、病毒蛋白復(fù)合抗原"中包含有大量的腫瘤細(xì)胞蛋白成份，以其作抗原免疫母雞，所制得的抗人乳頭瘤病毒(HPV)及抗婦科炎癥病原體特異性復(fù)合IgY脂質(zhì)體將包含有抗腫瘤的抗體成份。把這種含抗腫瘤的抗體成份的IgY脂質(zhì)體用于人乳頭瘤病毒(HPV)感染的患者身上，除了可以抑滅人乳頭瘤病毒(HPV)之外，還具有抑制腫瘤細(xì)胞的作用。10.5實(shí)驗(yàn)例5:檢測抗婦科炎癥病原體特異性IgY脂質(zhì)體對有代表性的幾種婦科炎癥病原體的抗體結(jié)合效價(jià)。把抗婦科炎癥病原體特異性IgY脂質(zhì)體，分別以淋球菌、白色念珠菌、毛滴蟲、金黃色葡萄球菌、陰道嗜血桿菌以及皰疹病毒作為檢測抗原，用"ELISA"方法檢測所制得的抗婦科炎癥病原體特異性IgY的抗體結(jié)合效價(jià)。結(jié)果如下表IgY抗原抗體結(jié)合效價(jià)<table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table>ll.實(shí)施例11.1實(shí)施例1:用瘤體組織搗碎法制備納米化抗HPV特異性IgY(1)。(l)制備瘤體組織蛋白抗原成份把從患者體內(nèi)切割的乳頭瘤瘤體組織置入"組織搗碎勻漿機(jī)"中，用8000-12000rpm高速搗碎勻化，得到含人乳頭瘤瘤體細(xì)胞蛋白和人乳頭瘤病毒(HPV)的蛋白懸浮漿液。(2)制備免疫用抗原將所制得的含乳頭瘤瘤體細(xì)胞蛋白和人乳頭瘤病毒(HPV)的蛋白懸浮漿液以1-10:1-10的比例(通常為1:1)加入福氏佐劑，置入高速勻漿器以30,000rpm高速勻化，形成油包水乳液，即制得乳頭瘤瘤體細(xì)胞、病毒蛋白復(fù)合抗原。(3)制備免疫蛋A.選擇具有高免疫應(yīng)答能力的良種母雞選擇雅臣在中國福建的免疫基地600只產(chǎn)蛋母雞作為免疫試驗(yàn)用母雞。用所制得的乳頭瘤瘤體細(xì)胞、病毒蛋白復(fù)合抗原免疫這600只產(chǎn)蛋母雞，每次注射lml抗原，在第一次注射后，每隔二周再強(qiáng)化注射一次，共三次；于第一次注射后第7個(gè)月，把這些產(chǎn)蛋母雞所產(chǎn)的蛋分別標(biāo)記后，再按常規(guī)方法分別提取其中的IgY;以酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)法分別檢測所制得的IgY的效價(jià)，如果某只母雞所產(chǎn)蛋制成的IgY的效價(jià)大于1:10,240，則選出該只母雞作為選擇的高免疫應(yīng)答能力的特種母雞，其它不符合要求的母雞則淘汰不用。B.分別對選擇的特種母雞進(jìn)行強(qiáng)化免疫用所制備的乳頭瘤瘤體細(xì)胞、病毒蛋白復(fù)合抗原，采用皮下注射的強(qiáng)化免疫法，分別對選擇的特種母雞進(jìn)行免疫，每只每次注射量達(dá)到12ml抗原，每隔二周再強(qiáng)化注射一次，共免疫三次；第一次免疫20天后，檢取母雞所產(chǎn)免疫蛋。(4).制備抗HPV特異性IgY粗提物用流動水洗凈免疫雞蛋，再用酒精擦洗消毒；然后用打蛋機(jī)將免疫蛋打碎，蛋黃篩濾去蛋清，留下蛋黃并攪拌均勻；按蛋黃體積的4~6倍加入蒸餾水，進(jìn)行稀釋并混合均勻；用1.0NHCI溶液調(diào)pH至5.56.0;將調(diào)好pH值的稀釋液進(jìn)一步充分?jǐn)嚢杈鶆?，然后將其冷卻至2~6°C,靜置12小時(shí)24小時(shí)；將上述稀釋液于10000rpm條件下，離心20分鐘；取分離所得的上清再加入超濾器中進(jìn)行超濾并濃縮15倍；加入2.0%海藻酸鈉溶液，至終濃度為0.1%，攪拌至出現(xiàn)渾濁沉淀，再加入2.0%。&(:12溶液，至終濃度為0.1%，攪拌均勻，并于4。C條件下過夜；于8000rpm條件下離心20分鐘，取上清，再用0.45um膜過濾除菌；再進(jìn)行冷凍千燥，即制得備抗HPV特異性IgY粗提物干粉。(5).抗HPV特異性IgY提純將所制得的抗HPV特異性IgY粗提物溶解于pH7.0、O.OIMPB(磷酸鹽緩沖液)，再先后過離子交換柱、凝膠層析柱以及親和層析柱純化，再用美國Pall膜除菌過濾器和除病毒過濾器去除細(xì)菌和病毒，即得到純化的抗HPV特異性IgY純品。(6)取所制得的抗HPV特異性IgY干粉，加入超微粉碎機(jī)中碾磨粉碎，加工成大小在l-100nm之間、粒度超過>15000目的超微粒子，制得相應(yīng)的納米化抗HPV特異性IgY-I干粉。11.2實(shí)施例2:用基因工程法制備納米化抗HPV特異性IgY(11)。(1)制備HPV-、L1L2基因表達(dá)蛋白抗原成份，具體包括以下步驟用RT-PCR方法從HPV病毒RNA克隆HPV.Ll、L2基因，去掉信號肽和穿膜區(qū)的片段。先插入pGEM-T載體。測序證明所獲得的基因序列正確后，用限制性內(nèi)切酶EcoRI和NotI雙酶消化，電泳回收目的片段，與用同樣雙酶消化的酵母表達(dá)載體pPIC9K連接。轉(zhuǎn)化大腸桿菌。挑取陽性克隆，提質(zhì)粒，酶切鑒定正確后，電轉(zhuǎn)化畢氏酵母菌(Pichiapastoris)KM71和GS115。在不含組氨酸的培養(yǎng)基上篩選陽性克隆，然后再在含不同濃度的G418的培養(yǎng)基上篩選高拷貝轉(zhuǎn)化株。挑取單個(gè)菌落接種到培養(yǎng)基中，在28度搖床培養(yǎng)過夜。稀釋后繼續(xù)培養(yǎng)。待細(xì)菌濃度達(dá)到OD600的吸光值約為0.8時(shí)，將培養(yǎng)基換成含甲醇的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24-48小時(shí)。于培養(yǎng)的不同時(shí)間采樣，用ELISA法測定上清中HA的表達(dá)量。選表達(dá)量最高的時(shí)間收獲。離心去除細(xì)胞沉淀。上清中即含大量表達(dá)產(chǎn)物。經(jīng)50%硫酸銨沉淀，截留分子量10kd的透析袋用蒸鎦水透析24小時(shí)，以及S印hacrylS-200和S印hacrylS-100柱層析后，即獲得純化的HPV病毒L1、L2基因表達(dá)蛋白抗原成份。(2)制備基因工程表達(dá)蛋白抗原將以上所制成的基因工程所述方法而制得的純化的HPV病毒Ll、L2基因表達(dá)蛋白抗原成份以1:1加入福氏佐劑，置入高速勻漿器，采用30,000rpm高速勻化，形成油包水乳液，即制得基因工程表達(dá)蛋白抗原。(3)制備免疫蛋A.選擇具有高免疫應(yīng)答能力的良種母雞選擇雅臣在中國福建的免疫基地600只產(chǎn)蛋母雞作為免疫試驗(yàn)用母雞。用所制得的基因工程表達(dá)蛋白抗原免疫這600只產(chǎn)蛋母雞，每次注射lml抗原，在第一次注射后，每隔二周再強(qiáng)化注射一次，共三次；于第一次注射后第7個(gè)月，把這些產(chǎn)蛋母雞所產(chǎn)的蛋分別標(biāo)記后，再按常規(guī)方法分別提取其中的IgY;以酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)法分別檢測所制得的IgY的效價(jià)，如果某只母雞所產(chǎn)蛋制成的IgY的效價(jià)大于1:10,240，則選出該只母雞作為選擇的高免疫應(yīng)答能力的特種母雞，其它不符合要求的母雞則淘汰不用。B.分別對選擇的特種母雞進(jìn)行強(qiáng)化免疫用所制備的基因工程表達(dá)蛋白抗原，采用皮下注射的強(qiáng)化免疫法，分別對選擇的特種母雞進(jìn)行免疫，每只每次注射量達(dá)到l2ml抗原，每隔二周再強(qiáng)化注射一次，共免疫三次；第一次免疫20天后，檢取母雞所產(chǎn)免疫蛋。(4).制備抗HPV特異性IgY粗提物用流動水洗凈免疫雞蛋，再用酒精擦洗消毒；然后用打蛋機(jī)將免疫蛋打碎，蛋黃篩濾去蛋清，留下蛋黃并攪拌均勻；按蛋黃體積的4~6倍加入蒸餾水，進(jìn)行稀釋并混合均勻；用1.0NHCI溶液調(diào)pH至5.5~6.0;將調(diào)好pH值的稀釋液進(jìn)一步充分?jǐn)嚢杈鶆颍缓髮⑵淅鋮s至2~6°C，靜置12小時(shí)24小時(shí)；將上述稀釋液于10000rpm條件下，離心20分鐘；取分離所得的上清再加入超濾器中進(jìn)行超濾并濃縮15倍；加入2.0%海藻酸鈉溶液，至終濃度為0.1%，攪拌至出現(xiàn)渾濁沉淀，再加入2.0。/。CaC12溶液，至終濃度為0.1%，攪拌均勻，并于4。C條件下過夜；于8000rpm條件下離心20分鐘，取上清，再用0.45um膜過濾除菌；再進(jìn)行冷凍干燥，即制得備抗HPV特異性IgY粗提物干粉。(5).抗HPV特異性IgY提純將所制得的抗HPV特異性IgY粗提物溶解于pH7.0、0.01MPB(磷酸鹽緩沖液)，再先后過離子交換柱、凝膠層析柱以及親和層析柱純化，再用美國Pall膜除菌過濾器和除病毒過濾器去除細(xì)菌和病毒，即得到純化的抗HPV特異性IgY純品。(6)取所制得的抗HPV特異性IgY干粉，加入超微粉碎機(jī)中碾磨粉碎，加工成大小在l-100nm之間、粒度超過》15000目的超微粒子，制得相應(yīng)的納米化抗HPV特異性IgY-II干粉。11.3實(shí)施例3:脂質(zhì)體抗HPV特異性IgY的生產(chǎn)，提高靶向性、延效性和滲透能力。具體實(shí)施步驟如下-A.把卵磷脂和膽固醇各50%按1:5比例溶于乙醚中；B.將實(shí)施例1中所制得的兩種納米化抗HPV特異性IgY干粉中的任意一種按h100比例加入4mmol/L磷酸鹽緩沖液(PBS)配成濃度1%的IgY溶液；C.將卵磷脂和膽固醇乙醚溶液和IgY的PBS溶液按3:1比例混合均勻；D.超聲處理2min(每處理0.5min，間歇.0.5min);E.在水浴中減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至呈凝膠狀，漩渦振蕩使凝膠轉(zhuǎn)相，再繼續(xù)蒸發(fā)除盡乙醚；F.超速離心(35000r/min，30min)分離除去未包入的IgY;G.沉淀用水洗二次，置入高速離心機(jī)離心，得沉淀；H.將所得的沉淀用10mmol/LPBS稀釋，即制得兩種抗HPV特異性IgY脂質(zhì)體。11.4實(shí)施例4:制備抗婦科炎癥病原體特異性IgY并將其納米化I.選擇淋球菌、白色念珠菌、毛滴蟲、金黃色葡萄球菌、陰道嗜血桿菌以及皰疹病毒作為陰道炎有代表性的病原體。2.制備免疫用抗原。332.1培養(yǎng)病原體與"江西省微生物研究所合作從陰道炎患者體內(nèi)攝取淋球菌、白色念珠菌、毛滴蟲、金黃色葡萄球菌、陰道嗜血桿菌以及皰疹病毒，并采用常規(guī)方法培養(yǎng)這些病原菌、毛滴蟲和皰疹病毒。2.2制備復(fù)合抗原先將所制得的四種致病菌和毛滴蟲按1:1:1:1:1比例混合并用常規(guī)方法粉碎，然后以5:1的比例與皰疹病毒提純液混合，充分?jǐn)嚢杈鶆?。然后將這種細(xì)菌病毒混合液以1:1的比例加入福氏佐劑，置入高速勻漿器以30，000rpm高速勻化，形成油包水乳液，即制得細(xì)菌病毒復(fù)合抗原。3.制備含高活性抗體的免疫蛋首先采取與前敘相同方法選擇產(chǎn)蛋母雞，將所選擇的具有高免疫應(yīng)答能力的產(chǎn)蛋母雞，應(yīng)用免疫激活方法，采用上敘制得的細(xì)菌病毒復(fù)合抗原迸行注射免疫。在第一次注射后間隔7天，再以同樣劑量、方法注射第二次，第二次注射后再間隔7天以相同劑量注射第3次，第一次注射后從第20天開始揀取高免疫蛋。4.提取抗婦科炎癥病原體特異性IgY粗品分別將所產(chǎn)的高免疫蛋用0.5。/。新潔而滅溶液或0.1。/。KMnO4溶液或其它同類消毒液將免疫蛋浸泡15-30分鐘消毒，無菌蒸餾水沖洗、晾干，置于打蛋機(jī)中將蛋殼打碎，用蛋黃篩濾除蛋清留下蛋黃加入4-8倍蒸餾水稀釋攪拌均勻，用lmol/lNaOH液或者lmol/lHCL液調(diào)節(jié)PH至5.5-6.0，4-6。C下靜置過夜，稀釋液8，000-12，000r/min高速離心20分鐘，取上清液用超濾機(jī)超濾濃縮。然后，采用美國PallUltrafmeFiltrationCompany制造的除病毒過濾系統(tǒng)的細(xì)菌病毒濾除裝置，徹底濾除各種細(xì)菌病毒，確保所制備的IgY絕不含任何病毒和細(xì)菌。第一道細(xì)菌濾除裝置是用0.22pm膜除菌過濾器除去沙門菌(Salmonella)等細(xì)菌；第二道支原體濾除裝置是用O.lnm膜除支原體過濾器除去支原體；第三道病毒濾除裝置是用UltiporVFTMDV50除病毒過濾器除去包括禽流感病毒、腸病毒在內(nèi)的多種病毒。最后，將所得濃縮液用冷凍干燥機(jī)干燥，即制得抗婦科炎癥病原體特異性IgY粗品。5.制備抗婦科炎癥多種病原體特異性IgY純品將所制得的抗婦科炎癥病原體特異性IgY粗品分別過離子交換柱和凝膠交換柱以及親和層析柱純化，進(jìn)行純化，即得抗婦科炎癥病原體特異性純IgY;將所制得的抗婦科炎癥病原體特異性IgY粗品或抗婦科炎癥病原體特異性IgY純品應(yīng)用冷凍干燥機(jī)干燥，即制得抗婦科炎癥病原體特異性IgY粗制品干粉和抗婦科炎癥病原體特異性IgY純品干粉。6..取所制得的抗婦科炎癥病原體特異性IgY干粉，加入超微粉碎機(jī)中碾磨粉碎，加工成大小在l-100nm之間、粒度超過》15000目的超微粒子，制得相應(yīng)的納米化抗婦科炎癥病原體特異性IgY干粉。11.5實(shí)施例5:制備抗婦科炎癥病原體特異性IgY制成脂質(zhì)體液晶微囊。具體實(shí)施步驟如下I.把卵磷脂和膽固醇各50%按1:5比例溶于乙醚中；J.將實(shí)施例1中所制得的納米化抗婦科炎癥病原體特異性IgY干粉按1:100比例加入4mmol/L磷酸鹽緩沖液(PBS)配成濃度1%的IgY溶液；K.將卵磷脂和膽固醇乙醚溶液和IgY的PBS溶液按3:1比例混合均勻；L.超聲處理2min(每處理0.5min,間歇.0.5min);M.在水浴中減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至呈凝膠狀，漩渦振蕩使凝膠轉(zhuǎn)相，再繼續(xù)蒸發(fā)除盡乙醚；N.超速離心(35000r/min，30min)分離除去未包入的IgY;0.沉淀用水洗二次，置入高速離心機(jī)離心，得沉淀；P.將所得的沉淀用1Ommol/LPBS稀釋，即制得抗婦科炎癥病原體特異性IgY脂質(zhì)體。II.6實(shí)施例6:制備抗人乳頭瘤病毒(HPV)及抗婦科炎癥病原體特異性復(fù)合IgY脂質(zhì)體。具體步驟如下(1)分別按照實(shí)施例3的方法制備兩種抗人乳頭瘤病毒(HPV)脂質(zhì)體各100kg(2)按照實(shí)施例5的方法制備100kg抗婦科炎癥病原體特異性復(fù)合IgY脂質(zhì)體(3)應(yīng)用等量混合法，一邊攪拌一邊分別將所制得的兩種抗人乳頭瘤病毒(HPV)脂質(zhì)體中的其中一種徐徐加入抗婦科炎癥病原體特異性復(fù)合IgY脂質(zhì)體中，充分混和均勻；再采用超聲波進(jìn)一步分散處理，即制成200kg兩種抗人乳頭瘤病毒(HPV)及抗婦科炎癥病原體特異性復(fù)合IgY脂質(zhì)體。11.7實(shí)施例7:抗人乳頭瘤病毒(HPV)及抗婦科炎癥病原體特異性復(fù)合IgY脂質(zhì)體陰道凝膠劑生產(chǎn)。具體實(shí)施方案如下配方抗人乳頭瘤病毒(HPV)及抗婦科炎癥病原體特異性復(fù)合IgY脂質(zhì)體(兩種中任一種)lO.Og褐藻蛋白.O.lg卡波姆6.2g丙二醇250..0g乙二胺四醋酸鈉0.5g聚山梨醇1.6g氫氣化鈉0.6g蒸餾水加至lOOOg(配方中也可不用褐藻蛋白)工藝流程如下(l)把卡波姆溶于乙二胺四醋酸鈉及適量蒸餾水中;(2)—邊攪拌一邊加入10%氫氣化鈉溶液，制成凝膠基質(zhì)；(3)將抗人乳頭瘤病毒(HPV)及抗婦科炎癥病原體特異性復(fù)合IgY脂質(zhì)體、褐藻蛋白.、聚山梨醇加入適量蒸餾水中攪拌均勻至澄清脂質(zhì)體抗人乳頭瘤病毒(HPV)及抗婦科炎癥病原體特異性復(fù)合IgY脂質(zhì)體溶液；(4)抗人乳頭瘤病毒(HPV)及抗婦科炎癥病原體特異性復(fù)合IgY溶液加入凝膠基質(zhì)中，充分?jǐn)嚢杌靹蚴钩删|(zhì)凝膠即得。將上述制得的抗人乳頭瘤病毒(HPV)及抗婦科炎癥病原體特異性復(fù)合IgY脂質(zhì)體陰道凝膠劑裝入軟膠囊就成為抗人乳頭瘤病毒(HPV)及抗婦科炎癥病原體特異性復(fù)合IgY脂質(zhì)體陰道軟膠囊，方便擄帶和使用。將所制得的抗人乳頭瘤病毒(HPV)及抗婦科炎癥病原體特異性復(fù)合IgY脂質(zhì)體陰道凝膠劑或抗人乳頭瘤病毒(HPV)及抗婦科炎癥病原體特異性復(fù)合IgY脂質(zhì)體陰道軟膠囊置入陰道，這種液晶微囊化的凝膠劑與陰道粘膜表面分泌液接觸后膨脹，軟膠囊則先溶化后膨脹，然后與吸收處陰道粘膜局部緊密粘貼定位，可延長滯留時(shí)間；抗人乳頭瘤病毒(HPV)及抗婦科炎癥病原體特異性復(fù)合IgY脂質(zhì)體在表皮滲透劑協(xié)同下緩緩釋放滲入陰道粘膜層有效清除吸附在陰道表層和粘膜內(nèi)的人乳頭瘤病毒(HPV)和陰道炎癥病原體。并經(jīng)陰道粘膜吸收進(jìn)入體內(nèi)發(fā)揮治療作用。既可平日定期使用預(yù)防人乳頭瘤病毒(HPV)和陰道炎癥多種病原體感染，也可經(jīng)常使用防止復(fù)發(fā)。同時(shí)，由于本品可深入感染部位直接清除局部感染的病原體；因此，完全可作為對己經(jīng)發(fā)生感染的患者的一種輔助治療手段。11.8實(shí)施例8制備抗人乳頭瘤病毒(HPV)及抗婦科炎癥病原體特異性復(fù)合IgY脂質(zhì)體常壓噴霧劑采用抗人乳頭瘤病毒(HPV)及抗婦科炎癥病原體特異性復(fù)合IgY脂質(zhì)體(兩種中任一種)50g，作為主要原料制成一種預(yù)防和治療人乳頭瘤病毒感染和陰道炎癥多種病原體感染的陰道噴霧劑。配方抗人乳頭瘤病毒(HPV)及抗婦科炎癥病原體特異性復(fù)合IgY脂質(zhì)體50g褐藻蛋白..5.0g甘油1,OOOgPEG4001,250g薄荷腦50g香精15g乙醇500g蒸餾水加至50，OOOg(配方中也可不用揭藻蛋白)生產(chǎn)工藝將抗人乳頭瘤病毒(HPV)及抗婦科炎癥病原體特異性復(fù)合IgY脂質(zhì)體、揭藻蛋白.溶于蒸餾水中，加入甘油混勻。薄荷腦、香精加入乙醇溶解，再加PEG400混勻，在攪拌下加于上述溶液攪勻、過濾，補(bǔ)加蒸餾水至全量，用O.lmol、NaOH流液調(diào)pH至6.5。將藥液灌入常壓噴瓶中，每支20ml，全檢合格后包裝即得2，500支可用于預(yù)防和治療HPV感染和婦科炎癥病原體感染的IgY常壓噴霧劑。這種噴霧劑使用十分方便，既可平日定期使用預(yù)防人乳頭瘤病毒(HPV)及婦科炎癥病原體感染，特別是可用于房事前后通過簡單的局部噴霧方式進(jìn)行最直接、最及時(shí)的預(yù)防，中和新感染的以及局部新釋放的病毒，有效地阻斷人乳頭瘤病毒(HPV)及婦科炎癥病原體通過性接觸的傳播途徑；也可經(jīng)常使用防止復(fù)發(fā)。同時(shí)，由于本品可直接噴霧進(jìn)入感染部位清除局部感染的HPV病毒及抗婦科炎癥病原體；因此，完全可作為對己經(jīng)發(fā)生HPV感染或婦科炎癥病原體感染的患者的一種輔助治療手段。11.9實(shí)施例9:制備抗人乳頭瘤病毒(HPV)及抗婦科炎癥病原體特異性復(fù)合IgY脂質(zhì)體女士洗液配方抗人乳頭瘤病毒(HPV)及抗婦科炎癥病原體特異性復(fù)合IgY脂質(zhì)體(兩種中任一種)2000g褐藻蛋白..200.0g甘油40kg蘆薈精華5000g天然植物發(fā)泡劑60kg香精600g乙醇20000g蒸餾水加至2，000，OOOg(配方中也可不用褐藻蛋白)生產(chǎn)工藝將抗人乳頭瘤病毒(HPV)及抗婦科炎癥病原體特異性復(fù)合IgY脂質(zhì)體、褐藻蛋白溶于蒸餾水中，加入甘油混勻。薄荷腦、香精加入乙醇溶解，再加戸薈精華和天然植物發(fā)泡劑混勻，在攪拌下加于上述溶液攪勻、過濾，補(bǔ)加蒸餾水至全量，用O.lmol、NaOH流液調(diào)pH至6.5。將藥液灌入帶壓泵頭的塑料瓶中，每瓶400ml,全檢合格后包裝即得5000瓶可用于預(yù)防和治療HPV和婦科炎癥病原體感染的IgY女士洗液。這種洗液最適宜女士平日使用預(yù)防人乳頭瘤病毒(HPV)及婦科炎癥病原體感染，特別是可用于房事前后通過簡單的局部清潔方式進(jìn)行最直接、最及時(shí)的預(yù)防，中和新感染的以及局部新釋放的病毒，有效地阻斷人乳頭瘤病毒(HPV)和婦科炎癥病原體通過性接觸的傳播途徑；也可經(jīng)常使用防止復(fù)發(fā)。同時(shí)，由于本品可采用一種灌洗器輔助灌入感染部位清除局部感染的人乳頭瘤病毒(HPV)及婦科炎癥病原體；因此，完全可作為對己經(jīng)發(fā)生人乳頭瘤病毒(HPV)感染或及婦科炎癥病原體感染的患者的一種輔助治療手段。11.10實(shí)施例10:預(yù)防和治療抗人乳頭瘤病毒(HPV)及抗婦科炎癥病原體特異性復(fù)合IgY脂質(zhì)體陰道泡騰片生產(chǎn)[配方]抗人乳頭瘤病毒(HPV)及抗婦科炎癥病原體特異性復(fù)合IgY脂質(zhì)體(兩種中任一種)l.Og褐藻蛋白0.6g碳酸氫鈉(NaHC03)140g無水枸椽酸113g乳糖125g微晶纖維素(MCC)180g吐溫-80(TW-80)0.08g硬脂酸鎂8.0g2%羥丙甲基纖維素醇液(HPMC)適量共制成l，OOO片(每片0.6g)(配方中也可不用褐藻蛋白)[制備工藝]1.NaHCO360。C干燥2hr，加20%PEG乙醇液適量制軟材，14目尼龍篩制粒60。C干燥備用。2.枸椽酸、乳糖、MCC混勻80目粉碎，加于2。/。HPMC醇液中攪勻。3.再加入抗人乳頭瘤病毒(HPV)及抗婦科炎癥病原體特異性復(fù)合IgY脂質(zhì)體、褐藻蛋白混勻過一次14目篩，再加硬脂酸鎂混勻壓片即得。4.檢驗(yàn)合格后水泡眼包裝，外套鋁塑復(fù)合膜塑料袋密封，裝盒，裝箱入庫。這種陰道泡騰片擄帶和使用都十分方便，既可平日使用預(yù)防HPV病毒感染，特別是可用于房事前后通過簡單的給藥片方式進(jìn)行最直接、最及時(shí)的預(yù)防，有效地阻斷人乳頭瘤病毒(HPV)和婦科炎癥病原體的傳播途徑；也可經(jīng)常使用防止復(fù)發(fā)。同時(shí)，由于本品可直接深入感染部位清除局部感染的HPV病毒和婦科炎癥病原體；因此，完全可作為對己經(jīng)發(fā)生HPV抗人乳頭瘤病毒(HPV)或婦科炎癥病原體感染的患者的一種輔助治療手段。以上所述，僅是本發(fā)明納米脂質(zhì)體抗人乳頭瘤病毒(HPV)及抗婦科炎癥病原體特異性復(fù)合IgY及其組合制劑的較佳實(shí)施例而已，并非對本發(fā)明的技術(shù)范圍作任何限制，凡是依據(jù)本發(fā)明的技術(shù)實(shí)質(zhì)對上面實(shí)施例所作的任何細(xì)微修改、等同變化與修飾，均仍屬于本發(fā)明技術(shù)的范圍內(nèi)。權(quán)利要求1、一種納米脂質(zhì)體抗人乳頭瘤病毒(HPV)及抗婦科炎癥病原體特異性復(fù)合IgY的制備方法，其特征在于納米脂質(zhì)體抗人乳頭瘤病毒(HPV)及抗婦科炎癥病原體特異性復(fù)合IgY的制備方法是1)、篩選引致女性生殖器疣和宮頸瘤的有代表性的人乳頭瘤病毒以及引致陰道炎癥的有代表性的病毒和致病菌、原蟲；2)、分別用人乳頭瘤瘤體細(xì)胞、病毒蛋白和基因工程重組HPV病毒L1、L2基因表達(dá)蛋白以及引致陰道炎癥的有代表性的病毒和致病菌、原蟲制備免疫用抗原；3)、采用淘汰法選擇高免疫應(yīng)答的產(chǎn)蛋禽類，應(yīng)用免疫激活方法分別以人乳頭瘤瘤體細(xì)胞、病毒蛋白復(fù)合抗原和基因工程重組HPV病毒L1、L2基因表達(dá)蛋白抗原以及婦科炎癥病原體復(fù)合抗原免疫選擇的產(chǎn)蛋禽類，制備含高活性抗體的免疫蛋；4)、分別把三種含高活性抗體的免疫蛋制備成兩種抗人乳頭瘤病毒(HPV)特異性IgY和一種抗婦科炎癥病原體特異性IgY；5)、先后過離子交換柱、凝膠層析柱以及親和層析柱，制得兩種抗人乳頭瘤病毒(HPV)特異性純IgY和一種抗婦科炎癥病原體特異性純IgY；6)用冷凍干燥機(jī)干燥，制得兩種抗人乳頭瘤病毒(HPV)特異性純IgY干粉和一種抗婦科炎癥病原體特異性純IgY干粉；7)、將所制得的兩種抗人乳頭瘤病毒(HPV)特異性純IgY干粉和一種抗婦科炎癥病原體特異性純IgY干粉超微粉碎，得到兩種納米化抗人乳頭瘤病毒(HPV)特異性純IgY和一種納米化抗婦科炎癥病原體特異性純IgY；8)、將以上所制得的兩種納米化抗人乳頭瘤病毒(HPV)特異性純IgY和一種抗婦科炎癥病原體特異性純IgY制成納米脂質(zhì)體液晶微囊；9)、將所述兩種抗人乳頭瘤病毒特異性IgY脂質(zhì)體中任一種與抗婦科炎癥病原體特異性IgY脂質(zhì)體混合，制成納米脂質(zhì)體抗人乳頭瘤病毒(HPV)及抗婦科炎癥病原體特異性復(fù)合IgY。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的納米脂質(zhì)體抗人乳頭瘤病毒(HPV)及抗婦科炎癥病原體特異性復(fù)合IgY的制備方法，其特征在于所述的步驟2)中的制備免疫用乳頭瘤瘤體細(xì)胞、病毒蛋白復(fù)合抗原的方法是(1)把從患者體內(nèi)切割的乳頭瘤瘤體組織置入"組織搗碎勻漿機(jī)"中，用8000-12000rpm高速搗碎勻化，得到含乳頭瘤瘤體細(xì)胞蛋白和人乳頭瘤病毒(HPV)的蛋白懸浮漿液；(2)將所制得的含乳頭瘤瘤體細(xì)胞蛋白和人乳頭瘤病毒(HPV)的蛋白懸浮漿液以1-10:1-10的比例加入福氏佐劑，置入高速勻漿器以30，000rpm高速勻化，形成油包水乳液，即制得人乳頭瘤瘤體細(xì)胞、病毒蛋白復(fù)合抗原。3、根據(jù)權(quán)利要求1所述的納米脂質(zhì)體抗人乳頭瘤病毒(HPV)及抗婦科炎癥病原體特異性復(fù)合IgY的制備方法，其特征在于所述的步驟2)中的制備免疫用HPV病毒L1、L2基因表達(dá)蛋白抗原的方法是用RT-PCR方法從HPV病毒RNA克隆HPV丄1丄2基因，去掉信號肽和穿膜區(qū)的片段；先插入pGEM-T載體；測序證明所獲得的基因序列正確后，用限制性內(nèi)切酶EcoRI和NotI雙酶消化，電泳回收目的片段，與用同樣雙酶消化的酵母表達(dá)載體pPIC9K連接；轉(zhuǎn)化大腸桿菌；挑取陽性克隆，提質(zhì)粒，酶切鑒定正確后，電轉(zhuǎn)化畢氏酵母菌KM71和GS115;在不含組氨酸的培養(yǎng)基上篩選陽性克隆，然后再在含不同濃度的G418的培養(yǎng)基上篩選高拷貝轉(zhuǎn)化株；挑取單個(gè)菌落接種到培養(yǎng)基中，在28度搖床培養(yǎng)過夜；稀釋后繼續(xù)培養(yǎng)；待細(xì)菌濃度達(dá)到OD600的吸光值約為0.8時(shí)，將培養(yǎng)基換成含甲醇的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24-48小時(shí)；于培養(yǎng)的不同時(shí)間采樣，用ELISA法測定上清中HA的表達(dá)量；選表達(dá)量最高的時(shí)間收獲；離心去除細(xì)胞沉淀；上清中即含大量表達(dá)產(chǎn)物；經(jīng)50%硫酸銨沉淀，截留分子量10kd的透析袋用蒸鎦水透析24小時(shí)，以及S印hacry1S-200和S印hacry1S-100柱層析后，即獲得純化的HPV病毒L1、L2基因表達(dá)蛋白抗原成份；將所制得的HPV病毒L1、L2基因表達(dá)蛋白抗原成份以1-10:1-10的比例加入福氏佐劑，置入高速勻漿器以30,000rpm高速勻化，形成油包水乳液，即制得HPV病毒L1、L2基因表達(dá)蛋白抗原。4、根據(jù)權(quán)利要求1所述的納米脂質(zhì)體抗人乳頭瘤病毒(HPV)及抗婦科炎癥病原體特異性復(fù)合IgY的制備方法，其特征在于所述的步驟2)中制備婦科炎癥病原體復(fù)合抗原方法是1)篩選出淋球菌、白色念珠菌、毛滴蟲、金黃色葡萄球菌、陰道嗜血桿菌以及皰疹病毒作為婦科炎癥有代表性的病原體；2)采用常規(guī)方法培養(yǎng)淋球菌、白色念珠菌、金黃色葡萄球菌、陰道嗜血桿菌、毛滴蟲和皰疹病毒；3)將所培養(yǎng)的淋球菌、白色念珠菌、金黃色葡萄球菌、陰道嗜血桿菌四種致病菌和毛滴蟲按1-10:1-10:1-10:1-10:1-10的比例混合并用常規(guī)方法粉碎，然后以5:1的比例與皰疹病毒提純液混合，充分?jǐn)嚢杈鶆?；然后將這種細(xì)菌病毒混合液以1-10:1-10的比例加入福氏佐劑，置入高速勻漿器以30，000rpm高速勻化，形成油包水乳液，即制得細(xì)菌病毒復(fù)合抗原。5、根據(jù)權(quán)利要求1所述的納米脂質(zhì)體抗人乳頭瘤病毒(HPV)特異性IgY的制備方法，其特征在于所述的步驟3)中制備含高活性抗體的免疫蛋的方法是采用淘汰法選擇的高免疫應(yīng)答能力的產(chǎn)蛋禽類，應(yīng)用免疫激活方法，分別采用上述制備的人乳頭瘤瘤體細(xì)胞、病毒蛋白復(fù)合抗原和基因工程重組HPV病毒L1、L2基因表達(dá)蛋白抗原以及婦科炎癥病原體復(fù)合抗原對所選產(chǎn)蛋禽類進(jìn)行注射免疫；在第一次注射后間隔7天，再以同樣劑量和方法注射第二次，第二次注射后再間隔7天以相同劑量注射第3次，第一次注射后從第20天開始揀取高免疫蛋，并對應(yīng)不同的抗原，對所檢取的免疫蛋進(jìn)行編碼標(biāo)記。6、根據(jù)權(quán)利要求1所述的納米脂質(zhì)體抗人乳頭瘤病毒(HPV)及抗婦科炎癥病原體特異性復(fù)合IgY的制備方法，其特征在于所述的步驟4)中采用人乳頭瘤瘤體細(xì)胞、病毒蛋白復(fù)合抗原免疫時(shí)，抗HPV特異性IgY的制備方法是將用人乳頭瘤瘤體細(xì)胞、病毒蛋白復(fù)合抗原免疫的禽類所產(chǎn)高免疫蛋用0.5。/。新潔而滅溶液或0.1%KMnO4溶液或其它同類消毒液將免疫蛋浸泡15-30分鐘消毒，無菌蒸餾水沖洗、晾干，置于打蛋機(jī)中將蛋殼打碎，用蛋黃篩濾除蛋清留下蛋黃加入4-8倍蒸餾水稀釋攪拌均勻，用1mo1/1NaOH液或者1mol/lHCL液調(diào)節(jié)PH至5.5-6.0，4"6t:下靜置過夜，稀釋液8，000-12,000r/min高速離心20分鐘，取上清液用超濾機(jī)超濾濃縮；然后采用細(xì)菌病毒濾除裝置，徹底濾除各種細(xì)菌病毒，確保所制備的IgY絕不含任何病毒和細(xì)菌；細(xì)菌病毒濾除裝置包括第一道細(xì)菌濾除裝置是用0.22um膜除菌過濾器除去沙門菌等細(xì)菌；第二道支原體濾除裝置是用0.1|jm膜除支原體過濾器除去支原體；第三道病毒濾除裝置是用UltiporVFTMDV50除病毒過濾器除去包括禽流感病毒、腸病毒在內(nèi)的多種病毒。7、根據(jù)權(quán)利要求1所述的納米脂質(zhì)體抗人乳頭瘤病毒(HPV)及抗婦科炎癥病原體特異性復(fù)合lg丫的制備方法，其特征在于所述的步驟4)中采用基因表達(dá)蛋白抗原免疫時(shí)，抗HPV特異性lgY的制備方法是將HPV病毒L1、L2基因表達(dá)蛋白抗原免疫的禽類所產(chǎn)高免疫蛋用0.5%新潔而滅溶液或.0.1%KMnO4溶液或其它同類消毒液將免疫蛋浸泡15-30分鐘消毒，無菌蒸餾水沖洗、晾干，置于打蛋機(jī)中將蛋殼打碎，用蛋黃篩濾除蛋清留下蛋黃加入4-8倍蒸餾水稀釋攪拌均勻，用im0|/|NaOH液或者1mo1/1HCL液調(diào)節(jié)PH至5.5-6.0，4"6。C下靜置過夜，稀釋液8,000-12，000r/min高速離心20分鐘，取上清液用超濾機(jī)超濾濃縮；然后采用細(xì)菌病毒濾除裝置，徹底濾除各種細(xì)菌病毒，確保所制備的IgY絕不含任何病毒和細(xì)菌；細(xì)菌病毒濾除裝置包括第一道細(xì)菌濾除裝置是用.0.22|jrri膜除菌過濾器除去沙門菌等細(xì)菌；第二道支原體濾除裝置是用0.1|jm膜除支原體過濾器除去支原體；第三道病毒濾除裝置是用UltiporVFTMDV50除病毒過濾器除去包括禽流感病毒、腸病毒在內(nèi)的多種病毒。8、根據(jù)權(quán)利要求1所述的納米脂質(zhì)體抗人乳頭瘤病毒(HPV)特異性IgY的制備方法，其特征在于納米脂質(zhì)體抗人乳頭瘤病毒(HPV)特異性lgY由以下步驟制成1)、將兩種抗人乳頭瘤病毒特異性IgY制備成抗HPV特異性IgY純品干粉；2)、將兩種抗HPV特異性IgY干粉制備成納米化抗HPV特異性IgY純品干粉；3)、將以上所制得的納米化抗HPV特異性IgY純品制成納米脂質(zhì)體抗人乳頭瘤病毒(HPV)特異性lgY液晶微囊。9、根據(jù)權(quán)利要求8所述的納米脂質(zhì)體抗人乳頭瘤病毒(HPV)特異性IgY的制備方法，其特征在于所述的步驟1)中制備抗HPV特異性lgY干粉的方法是將所制得的兩種抗HPV特異性IgY粗品分別過離子交換柱和凝膠交換柱以及親和層析柱進(jìn)行純化，即得兩種抗HPV特異性IgY純品；然后將所制得的抗HPV特異性IgY粗品或抗特異性IgY純品應(yīng)用冷凍干燥機(jī)干燥，即制得抗HPV特異性lgY純品干粉。10、根據(jù)權(quán)利要求8所述的納米脂質(zhì)體抗人乳頭瘤病毒(HPV)特異性lgY的制備方法，其特征在于所述的步驟2)中的制備納米化抗HPV特異性lgY純品干粉方法是取步驟1)中所制得的兩種抗HPV特異性lgY純品干粉，分別加入超微粉碎機(jī)中碾磨粉碎，加工成大小在1-100nm之間、粒度超過^15000目的超微粒子，制得兩種納米化抗HPV特異性IgY純品干粉。11、根據(jù)權(quán)利要求8所述的納米脂質(zhì)體抗人乳頭瘤病毒(HPV)特異性lgY的制備方法，其特征在于所述的步驟3)中納米脂質(zhì)體抗人乳頭瘤病毒(HPV)特異性lgY的方法是把卵磷脂和膽固醇溶于乙醚中，再將兩種納米化抗HPV特異性IgY純品干粉中之一種加入4mmol/L磷酸鹽緩沖液配成IgY溶液，超聲處理2min，在2min內(nèi)每處理0.5min，間歇0.5min，經(jīng)超聲處理后立即在水浴中減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至呈凝膠狀，漩渦振蕩使凝膠轉(zhuǎn)相，再繼續(xù)蒸發(fā)除盡乙醚，進(jìn)而超速離心分離除去未包入的IgY，沉淀用水洗二次，離心，得沉淀，用10mmol/LPBS稀釋，即制得納米脂質(zhì)體抗人乳頭瘤病毒(HPV)特異性lgY。12、根據(jù)權(quán)利要求1所述的納米脂質(zhì)體抗人乳頭瘤病毒(HPV)及抗婦科炎癥病原體特異性復(fù)合IgY的制備方法，其特征在于所述的步驟9)中制備納米脂質(zhì)體抗人乳頭瘤病毒(HPV)及抗婦科炎癥病原體特異性復(fù)合IgY的方法是采用等量混合法將兩種納米脂質(zhì)體抗人乳頭瘤病毒(HPV)特異性lgY中之任一種按10-10:1-10比例與抗婦科炎癥病原體特異性IgY脂質(zhì)體加入勻質(zhì)機(jī)充分混合均勻，再用超聲波分散勻化而成。13、根據(jù)權(quán)利要求12所述的納米脂質(zhì)體抗人乳頭瘤病毒(HPV)及抗婦科炎癥病原體特異性復(fù)合IgY的制備方法，其特征在于采用等量混合法將所述兩種納米脂質(zhì)體抗人乳頭瘤病毒(HPV)特異性IgY中之任一種按1:1比例與抗婦科炎癥病原體特異性IgY脂質(zhì)體加入勻質(zhì)機(jī)充分混合，再用超聲波分散勻化而成。14、根據(jù)權(quán)利要求1所述的納米脂質(zhì)體抗人乳頭瘤病毒(HPV)及抗婦科炎癥病原體特異性復(fù)合IgY的制備方法，其特征在于所述抗婦科炎癥病原體特異性IgY脂質(zhì)體的制備方法如下1)、篩選引致陰道炎癥的有代表性的病毒和致病菌、原蟲；2)、制備免疫用抗原包括培養(yǎng)病原體與制備復(fù)合抗原兩步驟；3)、制備含高活性抗體的免疫蛋；4)、制備抗婦科炎癥病原體特異性lgY粗品；5)、制備抗婦科炎癥多種病原體特異性純lgY干粉；6)、制備納米化抗婦科炎癥病原體特異性lg丫干粉；7)、將以上所制得的納米化抗婦科炎癥病原體特異性IgY制成脂質(zhì)體液晶微囊。15、根據(jù)權(quán)利要求14所述的納米脂質(zhì)體抗婦科炎癥病原體特異性IgY的制備方法，其特征在于所述的步驟3)中制備含高活性抗體的免疫蛋的方法是用淘汰法選擇具有高免疫應(yīng)答能力的正在產(chǎn)蛋的健康無特定病原體攜帶的SPF健康產(chǎn)蛋禽類，應(yīng)用免疫激活方法，采用權(quán)利要求14的步驟2)制備的細(xì)菌病毒復(fù)合抗原對所選產(chǎn)蛋禽類進(jìn)行注射免疫；在第一次注射后間隔7天，再以同樣劑量和方法注射第二次，第二次注射后再間隔7天以相同劑量注射第3次，第一次注射后從第20天開始揀取高免疫蛋。16、根據(jù)權(quán)利要求14所述的納米脂質(zhì)體抗婦科炎癥病原體特異性IgY的制備方法，其特征在于所述的步驟4)中制備抗婦科炎癥病原體特異性IgY粗品的方法是分別將高免疫蛋用0.5%新潔而滅溶液或0.1%KMnO4溶液或其它同類消毒液將免疫蛋浸泡15-30分鐘消毒，無菌蒸餾水沖洗、晾干，置于打蛋機(jī)中將蛋殼打碎，用蛋黃篩濾除蛋清留下蛋黃加入4-8倍蒸餾水稀釋攪拌均勻，用1mo1/1NaOH液或者1mo1/1HCL液調(diào)節(jié)PH至5.5~6.0，4~6°。下靜置過夜，稀釋液8,000-12，000r/min高速離心20分鐘，取上清液用超濾機(jī)超濾濃縮；然后，采用除病毒過濾系統(tǒng)的細(xì)菌病毒濾除裝置，徹底濾除各種細(xì)菌病毒，確保所制備的lg丫絕不含任何病毒和細(xì)菌；細(xì)菌病毒濾除裝置包括第一道細(xì)菌濾除裝置是用0.22ijm膜除菌過濾器除去沙門菌(Salmonella)等細(xì)菌；第二道支原體濾除裝置是用0.1pm膜除支原體過濾器除去支原體；第三道病毒濾除裝置是用UltiporVFTMDV50除病毒過濾器除去包括禽流感病毒、腸病毒在內(nèi)的多種病毒；17、根據(jù)權(quán)利要求14所述的納米脂質(zhì)體抗婦科炎癥病原體特異性IgY的制備方法，其特征在于所述的步驟5)中制備抗婦科炎癥多種病原體特異性IgY純品干粉的方法是將上述所制得的抗婦科炎癥病原體特異性lg丫粗品分別過離子交換柱和凝膠交換柱以及親和層析柱進(jìn)行純化，即得抗婦科炎癥病原體特異性純IgY;將所制得的抗婦科炎癥病原體特異性IgY粗品或抗婦科炎癥病原體特異性lgY純品應(yīng)用泠涑干燥機(jī)干燥，即制得抗婦科炎癥病原體特異性IgY粗制品干粉和抗婦科炎癥病原體特異性lg丫純品干粉。18、根據(jù)權(quán)利要求14所述的納米脂質(zhì)體抗婦科炎癥病原體特異性lgY的制備方法，其特征在于所述的步驟6)中制備納米化抗婦科炎癥病原體特異性IgY干粉方法是取步驟5)中所制得的抗婦科炎癥病原體特異性純IgY干粉，加入超微粉碎機(jī)中碾磨粉碎，加工成大小在1-100nm之間、粒度超過215000目的超微粒子，制得相應(yīng)的納米化抗婦科炎癥病原體特異性純IgY干粉。19、根據(jù)權(quán)利要求14所述的納米脂質(zhì)體抗婦科炎癥病原體特異性IgY的制備方法，其特征在于所述的步驟7)中制備脂質(zhì)體抗婦科炎癥病原體特異性IgY液晶微囊的方法是把卵磷脂和膽固醇溶于乙醚中，再將納米化抗婦科炎癥病原體特異性IgY加入4mmol/L磷酸鹽緩沖液(PBS)配成lgY溶液，超聲處理2min(每處理0.5min，間歇.0.5min)，立即在水浴中減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至呈凝膠狀，漩渦振蕩使凝膠轉(zhuǎn)相，再繼續(xù)蒸發(fā)除盡乙醚，進(jìn)而超速離心(35000r/min，30min)分離除去未包入的IgY，沉淀用水洗二次，離心，得沉淀，用1Ommol/LPBS稀釋，即制得抗婦科炎癥病原體特異性IgY脂質(zhì)體液晶微囊。20、一種含納米脂質(zhì)體抗人乳頭瘤病毒(HPV)及抗婦科炎癥病原體特異性復(fù)合IgY的組合制劑，其特征在于所述該組合制劑由下述方法制成將納米脂質(zhì)體抗人乳頭瘤病毒及抗婦科炎癥病原體特異性復(fù)合IgY與各種化學(xué)藥品、中藥等配成的復(fù)方成份配以蒸餾水調(diào)配成濃度0.01—20.0%的溶劑，制成陰道噴霧劑、陰道洗液等劑型，也可制成男士用噴霧劑；或者將納米脂質(zhì)體抗人乳頭瘤病毒及抗婦科炎癥病原體特異性復(fù)合IgY與各種化學(xué)藥品、中藥等配成的復(fù)方成份配以99.99~80.0%的各種適宜的輔料制成各種臨床可接受的劑型陰道凝膠劑、陰道軟膠囊和硬膠囊、陰道栓劑、陰道膜、陰道片劑和泡騰片以及軟膏、霜劑，也可制成男女士用含片、咀嚼片、口香糖。21、一種含納米脂質(zhì)體抗人乳頭瘤病毒(HPV)及抗婦科炎癥病原體特異性復(fù)合IgY的組合制劑，其特征在于所述該組合制劑由下述方法制成將納米脂質(zhì)體抗人乳頭瘤病毒及抗婦科炎癥病原體特異性復(fù)合IgY和褐藻蛋白組成復(fù)合物，再與各種化學(xué)藥品、中藥等配成復(fù)方成份并配以蒸餾水調(diào)配成濃度o.oi一20.0%的溶劑，可制成各種陰道噴霧劑、陰道洗液等劑型，也可制成男士用噴霧劑;或者將納米脂質(zhì)體抗人乳頭瘤病毒及抗婦科炎癥病原體特異性復(fù)合ig丫和褐藻蛋白組成復(fù)合物，再與各種化學(xué)藥品、中藥等配成的復(fù)方成份并配以、99.99一80.0%的各種適宜的輔料制成各種臨床可接受的劑型，如陰道凝膠劑、陰道軟膠囊和硬膠囊、陰道栓劑、陰道膜、陰道片劑和泡騰片以及軟膏、霜劑，也可制成男女士用含片、咀嚼片、口香糖。全文摘要本發(fā)明涉及一種納米脂質(zhì)體抗人乳頭瘤病毒(HPV)及抗婦科炎癥病原體特異性復(fù)合IgY及其組合制劑。優(yōu)選產(chǎn)蛋禽類，分別制備瘤體細(xì)胞、病毒蛋白復(fù)合抗原和基因重組蛋白抗原以及細(xì)菌病毒復(fù)合抗原免疫產(chǎn)蛋禽類，親和層析純化抗人乳頭瘤病毒特異性IgY和抗婦科炎癥病原體特異性IgY，并將其納米脂質(zhì)體化，制得納米脂質(zhì)體特異性復(fù)合IgY。其有益效果是應(yīng)用納米脂質(zhì)體技術(shù)，增加滲透能力和延效作用，提高療效?？芍瞥筛鞣N陰道或其它噴霧劑、洗液、凝膠劑、膠囊、栓劑、陰道膜、片劑和泡騰片以及軟膏、霜劑等。納米脂質(zhì)體復(fù)合IgY能滲入陰道粘膜層有效清除吸附在陰道表層和粘膜內(nèi)的HPV病毒和婦科炎癥病原體，并經(jīng)陰道粘膜吸收進(jìn)入體內(nèi)發(fā)揮預(yù)防和治療作用，還可有效防止復(fù)發(fā)。文檔編號C07K1/14GK101328219SQ200810068439公開日2008年12月24日申請日期2008年7月9日優(yōu)先權(quán)日2008年7月9日發(fā)明者晟包申請人:深圳雅臣生物科技有限公司