專(zhuān)利名稱(chēng)：：一種異土木香內(nèi)酯的提純制備方法和其在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種化合物的提純制備方法和其醫(yī)藥用途，具體地說(shuō)是一種異土木香內(nèi)酯的提純制備方法和其在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：土木香為菊科土木香(InulaheleniumL)的干燥根。土木香根中含有1-3%的揮發(fā)油，油中的主要成分為十木香內(nèi)酯、異土木香內(nèi)酯、二氫土木香內(nèi)酯等。在傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中，土木香的功能主要為健脾和胃，行氣解郁，止痛安胎。臨床上主要用于治療胸腹脹滿(mǎn)疼痛，嘔吐泄瀉，痢疾，胎動(dòng)不安。現(xiàn)代藥理學(xué)研究已確認(rèn)土木香揮發(fā)油具有抗菌，驅(qū)蟲(chóng)，鎮(zhèn)痛，影響平滑肌、心血管的作用。在傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)應(yīng)用中，土木香的提取物通常為混合物，故其療效不確切，毒副作用大。例如，土木香揮發(fā)油所含的土木香內(nèi)酯及其衍生物均易溶于醇，故其提取物不純且副作用多(詳見(jiàn)中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所等.中藥志(第一冊(cè))〔M)北京人民衛(wèi)生出版杜，1979，86)。因此，長(zhǎng)期以來(lái)人們一直都在致力于尋找更好的土木香有效成分的提純制備方法，同時(shí)也在積極探索土木香有效成分的新醫(yī)藥用途。.
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的就是耍提供一種異土木香內(nèi)酯的提純制備方法，同時(shí)提供一種異土木香內(nèi)酯的新的醫(yī)藥用途。本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的本發(fā)明所提供的異土木香內(nèi)酯的提純制備方法，包括以下步驟(a)以菊科旋覆花屬植物土木香為原料，用90-99%的乙醇冷浸提取，過(guò)濾，濾液減壓濃縮得浸膏；(b)將浸膏懸浮在飽和的鹽水中，使其濃度達(dá)到0.8—1.2g/ml，在609(TC條件下，用石油醚萃取3次，萃取溶劑體積分別為相當(dāng)于水溶液體積的2/3，1/2，1/3，合并石油醚萃取液，并用無(wú)水Na2S04脫水后減壓濃縮至近干，分別得石油醚提取物；(c)采用硅膠柱色譜進(jìn)行分離，石油醚-乙酸乙酯溶劑系統(tǒng)進(jìn)行梯度洗脫，洗脫液配比為10:1，8:2，6:4，5:5，最后依次用乙酸乙酯、甲醇沖柱至洗脫完全，洗脫液按體積接收，每份500mL，減壓濃縮各流份，采用薄層色譜進(jìn)行檢測(cè)，按照薄層色譜結(jié)果將相同流份進(jìn)行合并；在8-19流份得化合物異土木香內(nèi)酯。本發(fā)明方法中所用的倍半萜化合物異土木香內(nèi)酯，其化學(xué)結(jié)構(gòu)如下其波譜數(shù)據(jù)為'H-NMR5ppm:6.13(1H,br.s,H-13a)，5.59(1H,br.s，H-13b),4.77(1H,br.s,H陽(yáng)15a)，4.44(1H,br.s，H陽(yáng)15b),4.50(1H，br.S，H-8),2.99(1H,m,H-7),2.34(1H,d，■/=12.0Hz,H-3b),2.20(1H，d,J=16.0Hz，H-9a),2.01(1H,m,H-3a)，1.85(1H,J=12.5Hz,H-5)，1.75(1H,o.m,H-6a),1.71(1H,o.m,H-9b),1.60(2H,o.m,H-2)，L54(1H,o.m，H-la),1.40(1H，m,H-6b),1.25(1H，m,H-lb),0.83(3H,s，14-CH3)。13C-NMR5ppm:41.33(C-l),22.68(C陽(yáng)2),36.79(C-3)，148.97(C-4),46.18(C-5),27.45(C-6),40.51(C-7),76.82(C-8)，42.16(C-9),34.26(C-10),142.16(C-ll)，170.67(C-12),120.18(C-13),17.65(C-14)，106.61(C-15)。本發(fā)明方法制備的異土木香內(nèi)酯其純度高、晶型好、產(chǎn)量大。試驗(yàn)表明，采用本發(fā)明方法提純制備異土木香內(nèi)酯，其純度可達(dá)80-97%,產(chǎn)品收率與一般的醇提法相比可提高2-3倍。本發(fā)明人經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期大量的研究還發(fā)現(xiàn)丫異土木香內(nèi)酯的新的藥理活性，從而完成了異土木香內(nèi)酯在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用的發(fā)明目的。本發(fā)明所述異土木香內(nèi)酯尤其適于在制各抗消化道腫瘤藥物中應(yīng)用。特別是在制備抑制消化道腫瘤細(xì)胞增殖藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明所述異土木香內(nèi)酯的新的藥理活性通過(guò)以下試驗(yàn)得到了驗(yàn)證。試驗(yàn)用細(xì)胞株HeLa:人子宮頸癌細(xì)胞株;HEC-1:人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞株；SHIN-3和HOC-21:人卵巢透明癌細(xì)胞株；HAC-2:人卵巢囊腺癌細(xì)胞株；T-98和U251-SP:人腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞株；HLE:人肝癌細(xì)胞株；MM1-CB和HMV-1:人黑色素瘤細(xì)胞株；KT:腦轉(zhuǎn)移細(xì)胞株。(一)異土木香內(nèi)酯抑制腫瘤細(xì)胞增殖活性試驗(yàn)實(shí)驗(yàn)方法細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)法。在含有20%胎牛血清的D-MEM/hams培養(yǎng)基中，將被試細(xì)胞調(diào)成密度為2Xl()S細(xì)胞/mL。將上述腫瘤細(xì)胞株懸液接種于96孔培養(yǎng)板，每孔50|il，分別加入空白對(duì)照磷酸鹽緩沖液(PBS)、溶劑對(duì)照0.1%二甲基亞砜、陽(yáng)性對(duì)照順鉑(DDP)以及不同濃度單體化合物各5(^1，每組均設(shè)3個(gè)復(fù)孔。置于飽和濕度、37。C和5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小時(shí)，于培養(yǎng)結(jié)束前4小時(shí)，各培養(yǎng)孔加入5mg/ml四氮唑鹽(MTT)lO!il，培養(yǎng)結(jié)束后，棄去培養(yǎng)上清，懸浮細(xì)胞需離心后棄去上清，每孔加入反應(yīng)停止液150^1，靜置1小時(shí)，用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀檢測(cè)各孔吸光度(OD)值，測(cè)定波長(zhǎng)A:570nm，參考波長(zhǎng)入630nm，并計(jì)算腫瘤細(xì)胞生存率。本發(fā)明化合物溶解于DMSO，添加后的最終濃度在0.1%以下。以只添加DMSO的培養(yǎng)基作為對(duì)照。試驗(yàn)結(jié)果本發(fā)明化合物的抑制腫瘤細(xì)胞增殖活性以相對(duì)于對(duì)照(添加DMSO)的結(jié)果在下表l、表2中表示。表1異土木香內(nèi)酯抗婦科腫瘤細(xì)胞增殖活性<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>表2異土木香內(nèi)酯抗其它腫瘤細(xì)胞增殖活性異土木香內(nèi)酯抑制細(xì)胞增殖活性(％)濃度((iM)T-98U25卜SPHLEMM1-CBHMV-1KT100567164788563104229142720122601224(二)異土木香內(nèi)酯抑制體內(nèi)移植腫瘤細(xì)胞增殖活性試驗(yàn)實(shí)驗(yàn)方法體內(nèi)移植腫瘤細(xì)胞實(shí)驗(yàn)法。取冷凍保存的腹水型肉瘤S180和腹水型肝癌H22細(xì)胞，2000r/min離心5min，棄上清液，用無(wú)菌生理鹽水稀釋?zhuān){(diào)整瘤細(xì)胞至2X106細(xì)胞/mL;取5只健康昆明種小鼠，每只用上述細(xì)胞懸液0.4mL，腹腔注射，710天后接種小鼠腹部明顯增大，凸出。將其麻醉處死，無(wú)菌抽取乳白色腹水液，以生理鹽水h1稀釋后計(jì)算活細(xì)胞數(shù)>95%，調(diào)整瘤細(xì)胞密度為2X106細(xì)胞/mL，待用。將腹腔傳代的肝癌細(xì)胞(H22)及肉瘤細(xì)胞(S，)接種部位于小鼠右前肢腋下，接種量為2><106細(xì)胞/只，分別灌胃給予自來(lái)水，腹腔給予環(huán)磷酰胺(30mg/kg)，灌胃給予各濃度的異土木香內(nèi)酯(100mg/kg，10mg/kg和lmg/kg)，各處理組的給藥溶劑為0.2mL/10g體重，連續(xù)給藥10天。.于給藥的第IO天，脫頸椎處死小鼠，立即剝?nèi)∧[瘤，摘取荷瘤小鼠的胸腺和脾臟，分別稱(chēng)重，計(jì)算抑瘤率、胸腺指數(shù)和脾指數(shù)。異土木香內(nèi)酯在體內(nèi)抑制腫瘤細(xì)胞增殖活性的結(jié)果見(jiàn)表3:表3異土木香內(nèi)酯體內(nèi)移植腫瘤細(xì)胞增殖活性異土木香內(nèi)酯抑制細(xì)胞增殖活性(％)胸腺指數(shù)(mg/10g)脾指數(shù)(mg/10g)給藥量(mg/kg)S180H22S180H22S180H2210069665343102411052425349931051422354'4092106以上試驗(yàn)表明，異土木香內(nèi)酯具有良好的腫瘤細(xì)胞增殖活性抑制作用。其可在制備抗癌藥物中得到應(yīng)用。腫瘤是一種常見(jiàn)病、多發(fā)病，其中惡性腫瘤是目前危害人類(lèi)健康最嚴(yán)重的一類(lèi)疾病。目前臨床上用于治療食道癌、胃癌和婦科等惡性腫瘤的藥物，因其在抑制癌細(xì)胞增殖的同時(shí)，無(wú)選擇地也抑制骨髓等細(xì)胞的增殖，因而普遍存在毒副作用大的問(wèn)題。目前臨床急切期待研究人員能夠研發(fā)出毒副作用低、選擇性高的抗惡性腫瘤藥物。本發(fā)明為人們制備抗癌藥物提供了一種新的選擇。本發(fā)明所述異土木香內(nèi)酯在制備抗腫瘤藥物時(shí)，可按照常規(guī)的制劑方法以異土木香內(nèi)酯為藥物活性成分，添加適宜的藥物載體，制成各種藥物劑型，如片劑、滴丸、膠囊劑、散劑、注射劑、緩控釋劑等等。在用于治療腫瘤疾病時(shí)，口服制劑的用量一般可控制在每日服用異土木香內(nèi)酯300-600mg。其他劑型的用量可參考該用量。本發(fā)明的藥物用法用量，也不完全限于此，臨床醫(yī)師也可以根據(jù)病人的具體情況決定藥物的用法用量。具體實(shí)施例方式下面的實(shí)施例可更詳細(xì)地說(shuō)明本發(fā)明，但不以任何形式限制本發(fā)明。實(shí)施例1異土木香內(nèi)酯的提純制備'a)以河北菊科旋覆花屬植物土木香為原料，用99%的乙醇冷浸提取，過(guò)濾，濾液減壓濃縮得浸膏；b)將浸膏懸浮在飽和鹽水中，使其濃度達(dá)到約lg/ml，在75t:條件下，用石油醚萃取3次，萃取溶劑體積分別為相當(dāng)于水溶液體積的2/3，1/2，1/3，合并石油醚萃取液，并用無(wú)水Na2S04脫水后減壓濃縮至接近無(wú)水分，分別得石油醚提取物；c)采用硅膠柱色譜進(jìn)行分離，石油醚-乙酸乙酯溶劑系統(tǒng)進(jìn)行梯度洗脫，洗脫液配比為10:1，8:2，6:4，5:5，最后依次用乙酸乙酯、甲醇沖柱至洗脫完全，洗脫液按體積接收，每份500mL，減壓濃縮各流份，采用薄層色譜進(jìn)行檢測(cè)按照薄層色譜結(jié)果將相同流份進(jìn)行合并；在8-19流份得化合物異土木香內(nèi)酯。其含量為87.6%。實(shí)施例2本發(fā)明藥物顆粒劑將實(shí)施例l所制異土木香內(nèi)酯干燥物粉碎成粉，加入乙醇作黏合劑，加入淀粉作填充劑，壓制成顆粒。實(shí)施例3:本發(fā)明藥物口服液將實(shí)施例l所制異土木香內(nèi)酯溶于1000ml水中，制成2.5%濃度的水溶液，加入適量的混懸劑，混合均勻，裝入20ml藥瓶中，封口、消毒。實(shí)施例4:本發(fā)明藥物片劑將實(shí)施例1所制異土木香內(nèi)酯10公斤，按常規(guī)片劑制備方法，加入淀粉，糊精、硬酯酸鎂等，混合制成濕粒，機(jī)器沖壓成片，每片含本發(fā)明藥物干浸膏200mg。本發(fā)明的藥物劑型不完全限于此，它可以制備成更多的劑型，如滴丸、膠囊劑、軟膠囊劑、緩控釋制劑、注射劑等等。權(quán)利要求1、一種異土木香內(nèi)酯的提純制備方法，其特征在于它包括以下步驟(a)以菊科旋覆花屬植物土木香為原料，用90--99％的乙醇冷浸提取，過(guò)濾，濾液減壓濃縮得浸膏；(b)將浸膏懸浮在飽和的鹽水中，使其濃度達(dá)到約0.8-1.2g/ml，在60～90℃條件下，用石油醚萃取3次，萃取溶劑體積分別為相當(dāng)于水溶液體積的2/3，1/2，1/3，合并石油醚萃取液，并用無(wú)水Na2SO4脫水后減壓濃縮至近干，分別得石油醚提取物；(c)采用硅膠柱色譜進(jìn)行分離，石油醚-乙酸乙酯溶劑系統(tǒng)進(jìn)行梯度洗脫，洗脫液配比為10∶1，8∶2，6∶4，5∶5，最后依次用乙酸乙酯、甲醇沖柱至洗脫完全，洗脫液按體積接收，每份500mL，減壓濃縮各流份，采用薄層色譜進(jìn)行檢測(cè)按照薄層色譜結(jié)果將相同流份進(jìn)行合并；在8-19流份得化合物異土木香內(nèi)酯。2、異土木香內(nèi)酯在制備抗癌藥物中的應(yīng)fl。3、異土木香內(nèi)酯在制備抗消化道腫瘤藥物中的應(yīng)用。4、異土木香內(nèi)酯在制備抑制消化道腫瘤細(xì)胞增殖藥物中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明公開(kāi)了一種異土木香內(nèi)酯的提純制備方法及其在制備抗癌藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明方法包括以下步驟土木香為原料，用90-99％的乙醇冷浸提取，濾液減壓濃縮得浸膏；將浸膏懸浮在飽和的鹽水中，在60～90℃條件下，用石油醚萃取3次，合并石油醚萃取液，并用無(wú)水Na₂SO₄脫水后減壓濃縮至近干，分別得石油醚提取物；采用硅膠柱色譜進(jìn)行分離，石油醚-乙酸乙酯溶劑系統(tǒng)進(jìn)行梯度洗脫，依次用乙酸乙酯、甲醇沖柱至洗脫完全，洗脫液按體積接收，每份500mL，減壓濃縮各流份將相同流份，進(jìn)行合并；在8-19流份得化合物異土木香內(nèi)酯。本發(fā)明方法制備的異土木香內(nèi)酯其純度高、晶型好、產(chǎn)量大。文檔編號(hào)C07D307/92GK101624387SQ20081005537公開(kāi)日2010年1月13日申請(qǐng)日期2008年7月10日優(yōu)先權(quán)日2008年7月10日發(fā)明者斌叢,史清文,玫董申請(qǐng)人:河北醫(yī)科大學(xué)