專利名稱：C2H7的Fab片段與CD20抗原表位多肽的復(fù)合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于抗體藥物技術(shù)領(lǐng)域，具體地說，是關(guān)于一種抗人B細胞表面的CD20分子 的單克隆抗體C2H7的Fab片段與CD20抗原表位多肽的復(fù)合物，獲得所述復(fù)合物的方法， 以及所述復(fù)合物的三維晶體結(jié)構(gòu)及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
人CD20是一類表達于B細胞表面的標記分子(Stashenko， P., L. M. Nadler, etal. (1980). J. Immunol. 125(4): 1678-85)。它是一個四次跨膜的蛋白，被預(yù)測有一個大的胞外環(huán)區(qū)(從 142位賴氨酸到182位的酪氨酸)，并且可以在B細胞表面寡聚化(Bubien, J. K., L.丄Zhou, et al. (1993). J. Cell Biol. 121(5): 1121-32; Teeling, J. L， W. J. Mackus, et al. (2006). J. Immunol. 177(1): 362-71.)。盡管CD20的確切功能并不是很清楚，但是很多實驗證據(jù)顯示 CD20的功能很可能是形成或者調(diào)節(jié)電壓門控性鈣離子通道(Bubien, J. K., L. J. Zhou, et al. (1993). J. Cell Biol. 121(5): 1121-32)。由于CD20分子具有以下一些性質(zhì)CD20分子在80% 以上的B細胞淋巴瘤中有表達，但是在干細胞，原B細胞以及一般的漿細胞和其它組織 中沒有表達，而且被抗體交聯(lián)以后并不引起細胞的內(nèi)吞作用(Anderson, K.C.,M. P. Bates, et al. (1984). Blood 63(6): 1424-33; Press, 0, W,, J. Howell-Clark, et al. (1994). Blood 83(5): 1390-7),使其成為一個非常好的B細胞淋巴瘤的藥物靶標分子。
2H7是在一株鼠源的抗人CD20的IgG2b(k)單克隆抗體，而C2H7則是將2H7的可 變區(qū)與人IgGl (k)的恒定區(qū)嵌合所得到的嵌合抗體,具有潛在的應(yīng)用于淋巴瘤以及自身免 疫性疾病的治療的藥用價值(Liu, A. Y" Robinson, R. R" et al. (1987). J Immunol 139: 3521-6)。通過嵌合可以降低抗體在人免疫系統(tǒng)內(nèi)的排斥反應(yīng)，并且是抗體在人免疫系統(tǒng) 獲得介導(dǎo)補體依賴的細胞毒作用和抗體依賴的細胞毒作用。2H7它的抗原表位至今沒有明 確的報道，現(xiàn)有的一些實驗數(shù)據(jù)顯示它的抗原表位大致定位于人B細胞表面抗原CD20的 胞外區(qū)的從163位天冬酰胺到187位谷氨酰胺的區(qū)域(Polyak, M.丄and J. P. Deans (2002). Blood 99(9): 3256-62; Teeling, J. L., W. J. Mackus, et al. (2006). J Immunol 177(1): 362-71 )。 盡管己經(jīng)有多種抗CD20類抗體藥物包括Rituximab (嵌合的2B8抗體)，Zevalin (放射性 90Y標記2B8抗體)，Bexxar (放射性1311標記和未標記的Bl抗體)成功上市(Garber, K.(2003). J Natl Cancer Inst 95(3): 189)，但是因為B細胞表面的CD20表達在不同的患者之 間有著顯著的差異，對于B細胞表面CD20低表達量的患者來說，現(xiàn)有藥物并不能完全達 到預(yù)期的治療效果，因而基于己有抗體獲得高親和性和高特異性的抗體對于CD20表達水 平低的患者的治療有著重要的意義(Keating, M. and S. O'Brien (2000). Semin Oncol 27(6 Suppl 12): 86-90; McLaughlin, R， F. B. Hagemeister, et al. (2000). Semin Oncol 27(6 Suppl 12): 37-41)。
此外，這幾種以及其它的一些鼠源的針對CD20的抗體，例如1F5和AT80，被認為 識別CD20上相似的區(qū)域(從165位酪氨酸到182位酪氨酸)(Polyak, M. J. and J. P. Deans (2002). Blood 99(9): 3256-62; Teeling, J. L., W. J. Mackus, et al, (2006), J Immunol 177(1): 362-71)。然而這些抗體在功能上還是有差異。比如大部分的抗體結(jié)合會使CD20積聚到去 垢劑不溶的脂筏中，但是B1卻沒有這樣的作用。這個性質(zhì)可能與其介導(dǎo)補體依賴性的細 胞殺傷作用相關(guān)，但與其引起細胞凋亡的能力無關(guān)(Deans,丄P., S. M. Robbins, et al. (1998). J Biol Chem 273(1): 344-8; Chan, H. T., D. Hughes, et al. (2003). Cancer Res 63(17): 5480-9; Cragg， M. S., S. M. Morgan, et al. (2003). Blood 101(3): 1045-52)。
為了解CD20抗體的功能多樣性以及其潛在的機制，鑒定2H7以及其它識別CD20的 單克隆抗體的抗原表位在近幾年引起廣泛的興趣，人源化的2H7抗體Ocrelizumab (羅氏 公司)被稱譽為下一代的抗CD20類藥物。人和鼠的CD20分子的序列對比顯示盡管兩者 有73%的序列一致性，但是在胞外環(huán)區(qū)的43個氨基酸中只有16個相同(Polyak, M. J. and J. P. Deans (2002). Blood 99(9): 3256-62)。突變實驗顯示出人CD20上的170位的丙氨酸和 172位的脯氨酸是決定CD20上2H7所識別的抗原表位的關(guān)鍵(Polyak, M. J. and J. P. Deans (2002). Blood 99(9): 3256-62)。肽段相互作用實驗顯示CD20上從165位酪氨酸到182位 酪氨酸是潛在的2H7抗體結(jié)合的表位(Teeling, J. L., W. J. Maekus, et al. (2006). J Immunol 177(1): 362-71)。
因此，構(gòu)建C2H7的Fab片段與CD20抗原表位多肽的復(fù)合物可以給開發(fā)C2H7的藥 用價值提供理論依據(jù)，對于在已有C2H7抗體的基礎(chǔ)上進行進一步的改造以獲取更高親和 力的抗體藥物，并且對于CD20胞外區(qū)的抗原空間表位信息的揭示和依據(jù)此空間表位的藥 物設(shè)計有著重要的提示意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的在于，提供一種單克隆抗體C2H7的Fab片段與CD20抗原表位多 肽的復(fù)合物。本發(fā)明的另一個目的在于，提供一種C2H7的Fab片段與CD20抗原表位多肽的復(fù)合 物的制備方法。
本發(fā)明的又一個目的在于，提供一種C2H7的Fab片段與CD20抗原表位多肽形成的 復(fù)合物的三維晶體結(jié)構(gòu)。
本發(fā)明的還有一個目的在于，提供一種C2H7的Fab片段與CD20抗原表位多肽形成 的復(fù)合物的三維晶體結(jié)構(gòu)的用途。
為實現(xiàn)上述目的，發(fā)明人設(shè)計并合成了 CD20從163位天冬酰胺到187位谷氨酰胺的 肽段，并且，在肽鏈中、對應(yīng)于人CD20胞外區(qū)的167位和183位的這2個半胱氨酸之間 人工合成引入了一個鏈內(nèi)的二硫鍵，以模擬CD20自然的狀態(tài)。
隨后，發(fā)明人將純化的C2H7的Fab和抗原表位肽混合并進行共結(jié)晶，獲得C2H7的 Fab和抗原表位肽的復(fù)合物。
發(fā)明人還測定了所述C2H7的Fab片段與抗原表位肽的共結(jié)晶復(fù)合物的三維晶體結(jié) 構(gòu)，并對所述的復(fù)合物的結(jié)構(gòu)進行了分析。
所述的復(fù)合物的結(jié)構(gòu)的分析結(jié)果顯示了 C2H7和抗原表位肽相互作用的關(guān)鍵殘基。同 時，分析結(jié)果還很好的解釋了以往文獻(Polyak, M. J. and J. P. Deans (2002). Blood 99(9): 3256-62)中提及的生化數(shù)據(jù)，即人CD20上的170位的丙氨酸和172位的脯氨酸是決定 CD20上C2H7所識別的抗原表位的關(guān)鍵；并且，為設(shè)計和改造C2H7及其它由2H7衍生 的抗體以得到具有更高親和力和更高特異性的抗體提供了理論基礎(chǔ)。根據(jù)本發(fā)明，在所述 的復(fù)合物中，CD20抗原表位肽段呈現(xiàn)獨特的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，可用于篩選針對該表位的新的抗 體。


圖1顯示了電泳檢測C2H7Fab的純度和均一性的結(jié)果。 圖2顯示了抗原表位肽的分析型反相色譜層析結(jié)果。 圖3顯示了抗原表位肽的質(zhì)譜分析結(jié)果。
圖4是C2H7 Fab片段與抗原表位肽的復(fù)合物的結(jié)構(gòu)的立體圖。 圖5是C2H7 Fab片段與抗原表位肽的相互作用的細節(jié)立體圖。
具體實施例方式
以下結(jié)合附圖，以具體實施例對本發(fā)明作進一步詳細說明，應(yīng)理解，以下實施例僅用 于說明本發(fā)明而非用于限定本發(fā)明的范圍。以下實施例中，未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)實驗條件，如《分子克隆
實驗室手冊》(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)等中所述的條件進行。
本發(fā)明中使用的木瓜蛋白酶購自Sigma-Aldrich公司，本發(fā)明中使用的層析柱SP-S印harose FF和Phenyl-Sepharose HP均購自GE Healthcare 。
實施例1、抗體的制備
參考Liu， A. Y., Robinson, R. R.等發(fā)表于〈Uournal oflmmunology》第139期3521 — 3526頁的方法制備抗體，將得到的抗體以木瓜蛋白酶酶切C2H7，酶切條件為10mg/ml的C2H7中加入木瓜蛋白酶(Sigma-Aldrich)至終濃度為O.lmg/ml;然后于37。C,酶切18小時，緩沖液為0.1MTris-HCl+2mMEDTA + l mM 二硫蘇糖醇，pH 8.0。將酶切產(chǎn)物先通過層析柱SP-S印harose FF進行陽離子交換層析，再通過層析柱Phenyl-Sepharose HP進行疏水相互作用層析，獲得C2H7的Fab片段。
采用SDS-PAGE對Fab片段的純度和均一性進行驗證，結(jié)果如圖1所示，根據(jù)圖1的結(jié)果，純化得到的C2H7的Fab片段，其純度大于95%，并且均一性良好。
將純化的Fab片段濃縮至7mg/ml，同時將緩沖液置換為100 mM的NaCl+10 mMTris-HCl， pH8.0。
實施例2、 CD20抗原表位肽的制備 .
對應(yīng)于人CD20胞外區(qū)163位到187位殘基的肽段，設(shè)計并合成了一段含有25個氨基酸的抗原表位肽片段，該片段序列如下NIYNCEPANPSEKNSPSTQYCYSIQ 。
同時，在該片段中對應(yīng)于人CD20胞外區(qū)的167位和183位殘基的2個半胱氨酸(已在序列中用下劃線標識)之間引入了一個鏈內(nèi)二硫鍵，從而模擬出CD20的自然狀態(tài)。
參考操作手冊所述方法，通過分析型反相色譜層析(圖2)和質(zhì)譜分析(圖3)，確定所制備的氨基酸片段的純度大于95%。
實施例3-5、抗體與抗原表位肽的共結(jié)晶
分別按照l: 1、 1: 5禾fU: 10的摩爾比，將純化好的C2H7 Fab和CD20抗原表位肽，在4'C混合12小時，獲得蛋白-肽的混合溶液。采用懸滴擴散法，將混合所獲得的蛋白-肽的混合溶液與結(jié)晶池液(0.2 M磷酸氫二 銨，20%聚乙二醇3350)各1微升混合形成懸滴后，置于含有500微升結(jié)晶池液的結(jié)晶 槽中進行晶體生長。
在4'C下生長兩月左右，即收獲方形的共結(jié)晶復(fù)合物晶體。
將晶體冷凍保存在加入18%聚乙二醇500的結(jié)晶池液中，然后迅速降溫至-170。C。 在BL6A射線源(日本光子工廠)上，進行共結(jié)晶復(fù)合物的衍射實驗，并收集共結(jié)晶
復(fù)合物的2.6埃分辨率的衍射數(shù)據(jù)，并用軟件HKL2000 (光子工廠提供)處理收集的數(shù)據(jù)，
結(jié)果如表1所示。
由表1的結(jié)果可知，C2H7 Fab和在CD20上被它識別的表位肽的復(fù)合物晶體衍射數(shù) 據(jù)，有較高的質(zhì)量和完整度，這套數(shù)據(jù)可以很好的反映出復(fù)合物的結(jié)構(gòu)。從結(jié)構(gòu)的修正統(tǒng) 計來看，整體結(jié)構(gòu)模型的誤差低于一般公認的可接受的結(jié)構(gòu)模型誤差標準(R因子低于等 于25%， Free R因子低于等于30X)，可以有效地反映出C2H7 Fab與其在CD20上的表 位肽的復(fù)合物的真實結(jié)構(gòu)。
7表l、衍射數(shù)據(jù)和結(jié)構(gòu)修正統(tǒng)計表
衍射數(shù)據(jù)統(tǒng)計表
衍射光源波長(A)1.0000
空間群
晶胞參數(shù)
a, 6軸(A)96.5
c軸(A)107.6
衍射分辨率(A)a20.0-2.60 (2.69-2.60)
觀察到的衍射點178,866
實際獨立的衍射點(信噪比>0)15,644
平均冗余度11.4(10.9)
平均信噪比21.7(4.5)
完整度(°/p)97.6 (98.7)
R瞎ge值(％) &10.0(48.8)
結(jié)構(gòu)修正模型的數(shù)據(jù)統(tǒng)計
衍射點數(shù)量(F。>(te(F。))
修正組14,828
, 檢測組781
R因子(e/p) C23.4
FreeR因子(％)30.1
氨基酸殘基數(shù)456
水分子的數(shù)目117
所有原子的平均B因子(A2)46.1
鍵長的均方差(A)0.012
鍵角的均方差co1.22
Ramachandr肌點分布(％)
最可幾區(qū)84.7
可幾區(qū)13.0
基本上可幾區(qū)2.0
不可幾區(qū)0.3
其中，a括號中的數(shù)據(jù)代表最高衍射層的統(tǒng)計數(shù)據(jù)。
cr因子-Mf。I-IkII/If。1。
8實施例6、共結(jié)晶復(fù)合物的結(jié)構(gòu)測定，優(yōu)化和分析
C2H7 Fab與其在CD20上的表位肽的共結(jié)晶復(fù)合物的結(jié)構(gòu)在軟件MOLREP (http:〃www.ccp4.ac.uk/html/molrep.htmi)中用分子置換的方法進行解析以本單位所解
單克隆抗體Rituximab的Fab片段的結(jié)構(gòu)(Du, J., Wang, H., et al. (2007) . J Biol Chem 282 (20 ) : 15073-15080 )作為分子置換的模型；結(jié)構(gòu)的修正在REFMAC5 (http:〃www.ccp4.ac.uk/html/refmac5.html)中用標準的流程進行。Free R值用5X隨機選
擇的數(shù)據(jù)來計算。
在軟件O (http:〃www.imsb.au.dk/~mok/o/o—man/manual.html)中經(jīng)過模型構(gòu)建之后， 電子密度圖中可以清晰地發(fā)現(xiàn)對應(yīng)于肽的電子密度。結(jié)構(gòu)的立體化學(xué)分析采用了軟件 Procheck (http:〃www.biochem.ucl.ac.uk/ roman/procheck/procheck.html)， 該結(jié)豐勾{彥正的統(tǒng) 計結(jié)果見表1。 CD20表位肽與C2H7的Fab片段的復(fù)合物的結(jié)構(gòu)被修正到R值23.4%和 free R值到30.1%。
Fab的肘角用Stanfield等人表述的方法來計算(StanfieW, R. L., A. Zemla， et al.(2006).丄 Mol Biol 357(5): 1566 — 74),結(jié)果為141度。
復(fù)合物的整體結(jié)構(gòu)利用用軟件Pymol (http://pymol.sourceforge.net/)制作，結(jié)果見圖 4。如圖4所示，晶體結(jié)構(gòu)的一個不對稱單元中包含一個抗原抗體復(fù)合物分子。其中，抗 體的結(jié)構(gòu)是經(jīng)典的由四個卩桶形結(jié)構(gòu)域所組成的規(guī)范的免疫球蛋白折疊輕鏈折疊為VL 和CL結(jié)構(gòu)域，重鏈折疊為VH和CHl結(jié)構(gòu)域，每個結(jié)構(gòu)域中包含一個鏈內(nèi)二硫鍵穩(wěn)定其 結(jié)構(gòu)，重鏈和輕鏈的碳末端通過一個鏈間二硫鍵連接起來?？贵w的六個互補決定區(qū)中，輕 鏈L1和L2沒有參與與抗原的相互作用，輕鏈L3和重鏈H1、 H2、 H3四個互補決定區(qū)形 成一個口袋與抗原發(fā)生相互作用。如圖4和圖5顯示，復(fù)合物的結(jié)構(gòu)中的肽段形成一個特 殊的環(huán)狀構(gòu)象。肽段的N端的環(huán)盡管沒有二級結(jié)構(gòu)但是其結(jié)構(gòu)卻由于與Fab的相互作用而 得到穩(wěn)定，中間的ANPS區(qū)和環(huán)通過豐富的氫鍵與肽上其它部分相互作用形成穩(wěn)定的結(jié) 構(gòu)。C末端是一小段疏水的螺旋區(qū)，預(yù)測其為CD20跨膜區(qū)的延伸的解旋狀態(tài)。
Fab與抗原表位肽之間有441平方埃的面積被包埋在相互作用的界面內(nèi)，并且具有一 定的形狀互補值(0.69)，略高于一般的抗原抗體之間0.64—0.68的形狀互補值(Lawrence, M. C. and P. M. Colman (1993). J Mol Biol 234(4): 946-50)。
C2H7的Fab的互補決定區(qū)L3， HI, H2和H3參與了與肽段的相互作用，并且形成
一個深的口袋將肽段中的幾個關(guān)鍵氨基酸，ANP'^包埋在口袋的內(nèi)部。它們之間有一些
極性相互作用見圖5，肽上168位的谷氨酸通過其主鏈的羰基與Fab上輕鏈93位天冬酰胺的側(cè)鏈氨基形成氫鍵；肽上170位的丙氨酸通過其主鏈羰基與Fab上重鏈59位的絲氨 酸側(cè)鏈羥基形成氫鍵；肽上175位的賴氨酸與Fab上重鏈57位的天冬氨酸形成潛在的鹽 堿相互作用。除去氫鍵以外肽段和Fab之間還有豐富的范德華力接觸，尤其是在關(guān)鍵的 ，ANPS173與Fab之間有45個范德華力接觸，而整體的肽段與Fab之間一共有57個范德 華力接觸。
根據(jù)以上對復(fù)合物的結(jié)構(gòu)的分析，可將所獲得的信息用于基于所述復(fù)合物的結(jié)構(gòu)的藥 物的虛擬改造；還可用于篩選針對CD20抗原表位肽段呈現(xiàn)獨特的環(huán)狀結(jié)構(gòu)的新的抗體。
權(quán)利要求
1、一種抗體與抗原的復(fù)合物，其特征在于，所述抗體為C2H7的Fab片段，所述抗原為CD20抗原表位多肽。
2、 如權(quán)利要求l所述的復(fù)合物，其特征在于，所述復(fù)合物為共結(jié)晶復(fù)合物。
3、 如權(quán)利要求1所述的復(fù)合物，其特征在于，所述的CD20抗原表位肽的氨基酸序 列為NIYNCEPANPSEKNSPSTQYCYSIQ 。
4、 如權(quán)利要求3所述的復(fù)合物，其特征在于，所述的CD20抗原表位肽的2個半胱 氨酸之間有一個鏈內(nèi)二硫鍵。
5、 如權(quán)利要求1一4中任一項所述復(fù)合物的制備方法，其特征在于，所述復(fù)合物通過 共結(jié)晶方法獲得。
6、 如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，該方法包括以下步驟A、 C2H7的Fab和CD20抗原表位肽混合；B、 共結(jié)晶。
7、 如權(quán)利要求5或6所述的方法，其特征在于，所述的CD20抗原表位肽的氨基酸 序列為NIYNCEPANPSEKNSPSTQYCYSIQ 。
8、 如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述的CD20抗原表位肽的2個半胱氨 酸之間有一個鏈內(nèi)二硫鍵。
9、 如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，C2H7的Fab和CD20抗原表位肽混合的 摩爾比為h 1 h 10。
10、 如權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，所述的摩爾比為l: 5。
11、 如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，共結(jié)晶步驟中，含有蛋白-肽的混合懸 滴與結(jié)晶池液的體積比為1: 1。
12、 如權(quán)利要求1_4中任一項所述復(fù)合物的三維晶體結(jié)構(gòu)。
13、 如權(quán)利要求12所述的復(fù)合物三維晶體結(jié)構(gòu)的應(yīng)用，其特征在于，用于基于所述 復(fù)合物的結(jié)構(gòu)的藥物的虛擬改造。
14、 如權(quán)利要求12所述的復(fù)合物三維晶體結(jié)構(gòu)的應(yīng)用，其特征在于，用于篩選針對 CD20抗原表位肽段的抗體。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種抗人B細胞表面CD20分子的單克隆抗體C2H7的Fab片段與CD20抗原表位多肽的復(fù)合物，獲得所述復(fù)合物的方法，以及所述復(fù)合物的三維晶體結(jié)構(gòu)及其應(yīng)用。本發(fā)明提供的復(fù)合物的三維晶體結(jié)構(gòu)的分析結(jié)果不僅揭示了C2H7和抗原表位肽相互作用的關(guān)鍵殘基，并且，為設(shè)計和改造C2H7以及其它由2H7衍生的抗體以得到更高親和力和更高特異性的抗體提供了理論基礎(chǔ)，可用于基于所述復(fù)合物的結(jié)構(gòu)的藥物的虛擬改造。另外，本發(fā)明提供復(fù)合物中，CD20抗原表位肽段呈現(xiàn)獨特的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，可用于篩選針對該表位的新的抗體。
文檔編號C07K16/28GK101492507SQ20081003285
公開日2009年7月29日 申請日期2008年1月22日 優(yōu)先權(quán)日2008年1月22日
發(fā)明者丁建平, 杜嘉木, 琛 鐘 申請人:中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院