專利名稱：牛肝金屬硫蛋白的提取方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種金屬硫蛋白的制取方法，尤指一種牛肝金屬 硫蛋白的提取方法。
背景技術：
金屬硫蛋白是一種重要的生物活性物質(zhì)，具有廣泛的生理學 和生物學功能，尤以清除體內(nèi)自由基、重金屬解毒、抗氧化和抗 應激的作用甚大，因而作為食品以及美容化妝品的添加劑和某些 疾病的治療藥物在醫(yī)學、食品加工、營養(yǎng)學等各個領域業(yè)已廣泛 應用，并且可望在促進動物健康、提高畜產(chǎn)品產(chǎn)量、營養(yǎng)價值和 質(zhì)量安全等方面發(fā)揮重要作用。
含有鋅的金屬硫蛋白(Zn-MT)是一種正四面體金屬巰基螯合 族，結晶構相相當穩(wěn)定，但它仍可通過提供Zn而激活許多以Zn 為輔基的酶。因此開展鋅誘導金屬硫蛋白合成的研究有著重要的 理論價值和廣闊的應用前景。
市場上已有的產(chǎn)品多是從菌、蝸牛及兔肝內(nèi)提取含有鋅的的 金屬硫蛋白，由于供體有限，且成本也高，不能滿足國民經(jīng)濟發(fā) 展的需要。
由此可見，選擇其它供體誘導合成金屬硫蛋白，提高金屬硫 蛋白產(chǎn)量，并降低其成本，顯得十分必要和緊迫。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術問題是針對上述現(xiàn)有技術的不足， 提供一種牛肝金屬硫蛋白的提取方法， 一種新金屬硫蛋白的提取 途徑，來提高金屬硫蛋白的產(chǎn)量，降低成本。
為了解決上述技術問題，本發(fā)明所采用的技術方案是 一種 牛肝金屬硫蛋白的提取方法，包括下列步驟
①誘導合成
選用健康的犢牛，用頸部肌肉注射ZnS04溶液進行5-7次劑量
4逐級遞增的誘導合成金屬硫蛋白，每次劑量為5-150mg/kg體重， 每隔ld誘導1次；
采用鋅劑量逐漸遞增的溶液對牛進行頸部肌肉注射誘導，開 始用低劑量的鋅誘導只增強牛對鋅的耐受性和適應性，當鋅濃度 大幅度增加時，牛不會發(fā)生瘁死現(xiàn)象，從而激發(fā)了牛對金屬硫蛋 白誘導合成的潛能，又保證了有充足的時間誘導金屬硫蛋白的大 量合成。
② 定量檢測
誘導完后的第1-3d將犢牛屠宰，取肝臟，將所取新鮮樣品用 去離子水沖洗兩次，洗凈殘血，直接用巰基顯色法或間接競爭型 ELISA法對金屬硫蛋白的含量進行檢測，或用定量濾紙吸干后于 -20°。下冷凍保存待領"要求每lg牛肝中金屬硫蛋白的含量^7mg。
③ 預處理與粗提
將檢測合格的上述牛肝臟搗碎，用pH為8. 6的Tris-HCl溶液攪 拌勻漿，再加入500mLTris-HCl溶液和250mL體積比為1: 0.08的乙 醇-氯仿混合溶液，攪拌10min，冷凍離心，取上清液放入8(TC的 水浴鍋內(nèi)水浴5min，取出后迅速冷卻至室溫，再冷凍離心，離心 后的上清液即為金屬硫蛋白粗提液，放置于4'C備用；離心溫度為 4°C，轉(zhuǎn)速為10000r/min，時間為20min。
④ 分離與純化
按體積比為l: 3于金屬硫蛋白粗提液中加入無水乙醇，4t:放 置過夜后離心，去上清液取沉淀物，再用O. lmol/L的NHJiC03溶液 完全溶解，之后濾紙過濾；用Sephedex G-100層析柱對濾液進行 層析，再用O. lmol/L NH4HC03進行洗脫，流速為20mL/min ，每5min 收集l管；收集完成后，分別于各試管中取5u l樣品，各樣品加入 10u 11. 2mol/L的鹽酸后，再加入395 u l的巰基試劑，進行顯色定 位；取顯色最深的樣品，在-8(TC下冷凍20 30h，得凍干粉即為 金屬硫蛋白純品；離心溫度為4'C，轉(zhuǎn)速為10000r/min，時間為 20min。 分裝
將凍干粉分裝待用。
本發(fā)明采用初生奶牛公犢作為供體，經(jīng)微量元素鋅頸部肌肉
注射誘導，5次誘導后宰殺，從牛的肝臟中分離提取一種具有穩(wěn)定 性好，純度高的金屬硫蛋白。經(jīng)鋅誘導牛肝合成金屬硫蛋白可達 到成本低、效果好、產(chǎn)量高、誘導劑來源廣、無副作用等特點。 且牛是一種飼養(yǎng)非常普遍的動物，來源廣，經(jīng)誘導提取金屬硫蛋 白后，牛肉可照常供食用，皮及其他副產(chǎn)品的價值也不受影響。 特別是奶牛公犢長大后不能產(chǎn)奶，且在育犢階段要消耗大量牛奶， 所以一般奶牛場對奶牛公犢不進行飼喂，出生后即淘汰或以低價 處理。所以用剛出生的奶牛公犢誘導、合成和提取金屬硫蛋白， 既充分利用了奶牛公犢資源，提高了奶牛業(yè)的經(jīng)濟效益，又為擴 大金屬硫蛋白這一重要的生物活性物質(zhì)的來源、促進金屬硫蛋白 的研究和應用開辟了新的途徑。用此法提取的金屬硫蛋白可廣泛 用于畜禽飼料抗氧化及畜禽抗應激中。
因此，本發(fā)明具有以下優(yōu)點和積極效果
1、 現(xiàn)有技術中沒有從牛肝中提取金屬硫蛋白的報道，市場上 已有的產(chǎn)品是從兔肝和豬肝內(nèi)提取的金屬硫蛋白，而從牛肝中提 取金屬硫蛋白的產(chǎn)量分別是從兔肝和豬肝提取金屬硫蛋白產(chǎn)量的 2-3倍和1.5-2倍。而且牛的詞養(yǎng)量大，特別是奶牛公犢棄之不用， 成本很低，用剛出生的奶牛公犢誘導、合成和提取金屬 既充分利用了奶牛公犢資源，提高了奶牛業(yè)的經(jīng)濟效益 大金屬硫蛋白這一重要的生物活性物質(zhì)的來源、促進金 的研究和應用開辟了新的途徑。
2、 一般誘導方法為皮下注射或腹腔注射，本方法為 注射，頸部肌肉注射安全，不會產(chǎn)生皮下注射時誘導液擴散不暢、 堆滯的現(xiàn)象和腹腔注射時引起的腹腔感染問題。采用鋅劑量逐漸 遞增的溶液進行頸部肌肉注射誘導，開始用低劑量的鋅誘導增強 牛只對鋅的耐受性和適應性，當鋅濃度大幅度增加時牛不會發(fā)生
硫蛋白， ，又為擴 屬硫蛋白
頸部肌肉瘁死現(xiàn)象，從而激發(fā)了對金屬硫蛋白誘導合成的潛能，又保證了 有充足的時間誘導金屬硫蛋白的大量合成。并且本方法誘導劑用 量小，誘導合成時間短，操作簡便，成本低。
3、 得率高，每克牛肝含8.60-9.49mg金屬硫蛋白。
4、 穩(wěn)定性好，在低溫條件下儲藏時間較長。
5、 本發(fā)明所提取的產(chǎn)品廣泛適用于畜禽飼料抗氧化及畜禽抗 應激效應中。
具體實施例方式
下面結合具體實施例進一步詳細說明
實施例1:
① 誘導合成
選用健康的初生奶牛公犢，用配制好的ZnS04 7H20溶液采用 頸部肌肉注射法進行誘導，每隔ld誘導l次，共誘導5次。每次劑 量分另'J為5， 10， 20, 50， 100mg/kg，累計185mg/kg。
用牛為供體，通過5次誘導后牛肝內(nèi)產(chǎn)生的金屬硫蛋白量為 8.60 mg/g，顯著高于平常的通過3次誘導產(chǎn)生的金屬硫蛋白量 (2.62mg/g)和通過4次誘導產(chǎn)生的金屬硫蛋白量(4.77mg/g); 而與經(jīng)7次誘導產(chǎn)生的金屬硫蛋白的量(9. 49mg/g))和經(jīng)9次誘導 產(chǎn)生的金屬硫蛋白的量(9.61mg/g)差異不顯著，并且節(jié)省誘導時 間和成本。
② 定量檢測
根據(jù)條件，任選下述一種方法
A. 巰基顯色法
取30u l金屬硫蛋白粗提液，加入1. 2mol/L的鹽酸10u L和 0. lmol /L的EDTA200 u 1，反應10min，再力口入200 u L巰基試齊!j ， 用PH7. 2的0. lmol/L的磷酸緩沖溶液定容至4mL,反應3min,在波 長420nm處測定吸光度?？瞻坠芗尤?0 u l蒸餾水，同樣處理。用 金屬硫蛋白純品制作標準曲線，根據(jù)A值可在標準曲線上讀出金屬 硫蛋白的濃度。
B. 間接競爭型ELISA法
7采用TECANA-5082型酶聯(lián)免疫分析儀測定金屬硫蛋白含量。反 應條件為抗原包被濃度為6.25Pg/ml; —抗(鼠抗牛)適宜濃度 為50Pg/ml;酶標抗體(山羊抗小鼠)的使用濃度為l/8000倍；反 應時間為3hr。
③ 預處理與粗提
取250g牛肝樣用pH為8. 6的0. 01mol/L的Tris-HC1100mL搗碎 攪拌勻漿，倒入燒杯，再加入500mLTris-HCl和250mL乙醇-氯仿(按 1: 0.08的比例配制)混合溶液，攪拌10min，冷凍離心(10000r/min， 4°C， 20min)。取上清液于另一離心管，放入80°C的水浴鍋內(nèi)水浴 5min，取出后迅速冷卻至室溫，冷凍離心(10000r/min ， 4°C ， 20min)，離心后的上清液即為金屬硫蛋白粗提液，放置于4。C備用。
④ 分離與純化
金屬硫蛋白粗提液經(jīng)3倍體積的無水乙醇沉淀，4'C放置過夜 后離心(10000r/min， 4°C ， 20min)，去上清液取沉淀物，用0. lmol/L 的NH4HC03溶液完全溶解，之后濾紙過濾。對濾液用Sephedex G-100 層析柱進行層析，用0. lmol/L NH4HC0s進行洗脫，流速控制 20mL/min，每5min收集l管。收集完成后，分別從各試管中取5ul 樣品，于各樣品中先后加入lOii 11. 2mol/L的鹽酸和395 u l的巰基 試劑，進行顯色定位。取顯色最深的樣品，在-8(TC下冷凍25h， 所得凍干樣即為金屬硫蛋白純品，含量為96%以上。每lg牛肝中可 提取7mg-9 mg的金屬硫蛋白。
⑤ 分裝
按每支安瓿20mg分裝。 實施例2:
基本步驟與實施例l相同，不同的是共誘導7次，每次劑量分 另lj為5， 10， 20， 50， 100， 150， 200 mg/kg，累計535mg/kg;而 分離純化步驟中在-8(TC下冷凍25 30h，所得凍干樣即為金屬硫蛋 白純品，含量為96%以上。每lg牛肝中可提取8mg-10mg的金屬硫蛋 白。
權利要求
1、一種牛肝金屬硫蛋白的提取方法，其特征在于包括下列步驟①誘導合成選用健康的犢牛，用頸部肌肉注射ZnSO4溶液進行5-7次劑量逐級遞增的誘導合成金屬硫蛋白，每次劑量為5-150mg/kg體重，每隔1d誘導1次；②定量檢測誘導完后的第1-3d將犢牛屠宰，取肝臟，將所取新鮮樣品用去離子水沖洗兩次，洗凈殘血，直接用巰基顯色法或間接競爭型ELISA法對金屬硫蛋白的含量進行檢測，或用定量濾紙吸干后于-20℃下冷凍保存待測；要求每1g牛肝中金屬硫蛋白的含量≥7mg；③預處理與粗提將檢測合格的上述牛肝臟搗碎，用pH為8.6的Tris-HCl溶液攪拌勻漿，再加入500mLTris-HCl溶液和250mL體積比為1∶0.08的乙醇-氯仿的混合溶液，攪拌10min，冷凍離心，取上清液放入80℃的水浴鍋內(nèi)水浴5min，取出后迅速冷卻至室溫，再冷凍離心，離心后的上清液即為金屬硫蛋白粗提液，放置于4℃?zhèn)溆茫黄渲?，離心溫度為4℃，轉(zhuǎn)速為10000r/min，時間為20min；④分離與純化按體積比為1∶3于金屬硫蛋白粗提液中加入無水乙醇，4℃放置過夜后離心，去上清液取沉淀物，再用0.1mol/L的NH4HCO3溶液完全溶解，之后濾紙過濾；用Sephedex G-100層析柱對濾液進行層析，再用0.1mol/L NH4HCO3進行洗脫，流速為20mL/min，每5min收集1管；收集完成后，分別從各試管中取5μl樣品，各樣品加入10μl 1.2mol/L的鹽酸后，再加入395μl的巰基試劑，進行顯色定位；取顯色最深的樣品，在-80℃下冷凍20～30h，得凍干粉即為金屬硫蛋白純品；其中，離心溫度為4℃，轉(zhuǎn)速為10000r/min，時間為20min；⑤分裝將凍干粉分裝待用。
2、按權利要求1所述的牛肝金屬硫蛋白的提取方法，其特 征在于選用健康初生奶牛公犢，用配制好的ZnS0r7H20溶液 采用頸部肌肉注射法進行誘導，每隔Id誘導一次，共誘導5次， 每次齊!J量分另IJ為5mg/kg、 10mg/kg、 20mg/kg、 50mg/kg、 100mg/kg， 累計185mg/kg。
全文摘要
一種牛肝金屬硫蛋白的提取方法，包括用健康的犢牛，用頸部肌肉注射ZnSO₄溶液進行5-7次劑量逐級遞增的誘導合成金屬硫蛋白；定量檢測，要求每1g牛肝中金屬硫蛋白的含量≥7mg；將檢測合格的牛肝臟搗碎，進行預處理和粗提；最后進行分離與純化，得凍干粉即為金屬硫蛋白純品，含量為96％以上；從而，經(jīng)鋅誘導牛肝合成金屬硫蛋白可達到成本低、效果好、產(chǎn)量高、誘導劑來源廣、無副作用等特點；且為擴大金屬硫蛋白這一重要的生物活性物質(zhì)的來源、促進金屬硫蛋白的研究和應用開辟了新的途徑。
文檔編號C07K1/14GK101580532SQ20081003127
公開日2009年11月18日 申請日期2008年5月12日 優(yōu)先權日2008年5月12日
發(fā)明者彬 張, 李麗立, 瑩 王 申請人:湖南農(nóng)業(yè)大學