專利名稱：丹酚酸b和羥基紅花黃色素a的提取方法及注射用丹紅的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及丹酚酸和羥基紅花黃色素的提取方法及丹紅制劑的制備方法。

背景技術(shù)：
在《國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)(試行)頒布件》中所公布的丹紅注射液是一種有很好臨床療效、應(yīng)用已有二十多年歷史的傳統(tǒng)中成藥，主要用于心腦血管的重要急癥治療，常見(jiàn)的有冠心病、心絞痛等，還可以治療淤血閉塞所致的胸痹即中風(fēng)等。現(xiàn)有提取的丹酚酸B和羥基紅花黃色素A的方法存在對(duì)丹酚酸B和羥基紅花黃色素A提取不徹底。而且現(xiàn)有的丹紅注射液〔部頒標(biāo)準(zhǔn)WS-11220(ZD-1220)-2002〕制備過(guò)程中采用混合提取工藝，提取出的有效成分含量低，而且制備出的是水針劑，由于水溶液中含氧氣，所以其中的丹酚酸B和羥基紅花黃色素A容易氧化分解，長(zhǎng)期儲(chǔ)存后顏色會(huì)變深并產(chǎn)生沉淀，穩(wěn)定性差，水針劑的運(yùn)輸和儲(chǔ)存不方便。


發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明是為了解決現(xiàn)有丹酚酸B和羥基紅花黃色素A的提取方法存在對(duì)丹酚酸B和羥基紅花黃色素A提取不徹底和制備丹紅注射液過(guò)程中采用混合提取工藝，提取出的有效成分含量低、長(zhǎng)期儲(chǔ)存后顏色會(huì)變深并產(chǎn)生沉淀，以及制備出的丹紅注射液的穩(wěn)定性差、運(yùn)輸和儲(chǔ)存不方便的問(wèn)題，而提供丹酚酸B和羥基紅花黃色素A的提取方法及注射用丹紅的制備方法。
本發(fā)明的丹酚酸B的提取方法按如下步驟進(jìn)行一、先向丹參藥材飲片加入丹參飲片質(zhì)量8～18倍、質(zhì)量濃度為35％～60％的乙醇和體積為乙醇體積1‰～4‰、濃度為1mol/L的鹽酸浸泡1～2小時(shí)，然后回流提取1.5～3小時(shí)，濾出丹參藥液，再向藥渣加入藥渣質(zhì)量6～16倍、質(zhì)量濃度為35％～60％的乙醇和體積為乙醇體積1‰～4‰、濃度為1mol/L的鹽酸，回流提取1～2小時(shí)，濾出丹參藥液，合并兩次提取的丹參藥液，再減壓濃縮成相對(duì)密度為1.16～1.24的丹參清膏；二、向丹參清膏中加入丹參清膏重量3～5倍的水，邊加水邊攪拌，室溫下靜置12～24小時(shí)，再過(guò)濾，丹參濾液用鹽酸調(diào)節(jié)pH值為2.8～3.2，得到丹參酸化濾液；三、將大孔吸附樹(shù)脂柱用pH值為2.8～3.2的鹽酸酸化，將步驟二得到的丹參酸化濾液上樣于大孔吸附柱上，用5～7倍樹(shù)脂體積pH值為2.8～3.2的鹽酸沖洗雜質(zhì)，再用質(zhì)量濃度為35％～55％的乙醇洗脫，收集1.5～2.5倍樹(shù)脂體積的丹參洗脫液，用氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)丹參洗脫液的pH值為4.0～4.2，減壓濃縮至相對(duì)密度為1.08～1.25的丹酚酸清膏；即得到丹酚酸B。
本發(fā)明的羥基紅花黃色素A的提取方法按如下步驟進(jìn)行一、先向紅花加入質(zhì)量為紅花質(zhì)量16～20倍的水浸泡20～40分鐘，煎煮20～40分鐘，濾出紅花藥液，再向藥渣加入質(zhì)量為藥渣質(zhì)量14～18倍的水，煎煮20～40分鐘，濾出紅花藥液，合并兩次濾出的紅花藥液，冷卻至室溫；二、紅花藥液用鹽酸調(diào)節(jié)pH值至1.9～2.2，靜置6～24小時(shí)，再過(guò)濾，得到紅花酸化濾液；三、將大孔吸附樹(shù)脂柱用pH值為1.9～2.2的鹽酸酸化，將步驟二得到的紅花酸化濾液上樣于大孔吸附柱上，用6～8倍樹(shù)脂體積pH值為1.9～2.2的鹽酸沖洗雜質(zhì)，再用質(zhì)量濃度為8％～15％的乙醇洗脫，收集4.5～6.0倍樹(shù)脂體積的紅花洗脫液，用氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)紅花洗脫液的pH值為4.0～4.2，減壓濃縮至相對(duì)密度為1.08～1.25的羥基紅花黃色素清膏；即得羥基紅花黃色素A。
用上述方法提取的丹酚酸B和羥基紅花黃色素A制備注射用丹紅的方法按如下步驟進(jìn)行一、按照丹參和紅花藥材重量比為3∶1的比例上述方法提取的丹酚酸B和羥基紅花黃色素A，加入注射用水使配制成丹紅藥液并使丹紅藥液的含水量為75％～99％，攪拌后用氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)丹紅藥液的pH值為4.0～4.5，在0～10℃的條件下靜置12～48小時(shí)；二、先用0.22μm或0.45μm的微孔濾膜過(guò)濾后，再經(jīng)過(guò)截流分子量為30K或50K的Millipore超濾柱進(jìn)行超濾，將丹紅濾液分裝并凍干；即得到注射用丹紅。
本發(fā)明的丹酚酸B的提取方法、羥基紅花黃色素A的提取方法及注射用丹紅的制備方法具有以下優(yōu)點(diǎn) 1、丹參采用35％～60％乙醇加鹽酸回流提取，有效地防止了有效成分丹酚酸B在水溶液中的受熱分解，并且提取完全充分，提取率為85％～95％，是現(xiàn)有方法的1.5～3倍。
2、羥基紅花黃色素A提取率為85％～95％，是現(xiàn)有方法的1.1～2.4倍。
3、丹參精制采取水洗液先過(guò)濾，后調(diào)pH值，再經(jīng)過(guò)大孔吸附樹(shù)脂柱，有效地防止了有效成分被濾掉，使得有效單體成分丹酚酸B的含量及轉(zhuǎn)移率都在80％以上。
4、在丹參和紅花的大孔樹(shù)脂精制時(shí)，均采用了大孔樹(shù)脂使用前酸化、洗脫時(shí)酸水沖洗雜質(zhì)的方法，有效地減少了有效成分的損失。
5、本發(fā)明的制備工藝所采用的大孔吸附樹(shù)脂成本低，在本制備工藝過(guò)程中吸附率高、洗脫效果好、再生容易、使用壽命長(zhǎng)，至少可重復(fù)使用20次以上。
6、本發(fā)明的制備工藝所采用的截流分子量為30K或50K的Millipore超濾柱既可以徹底有效地除掉藥液中的雜質(zhì)、細(xì)菌和熱原，又可以有效地保留有效成分。
7、本發(fā)明的制備工藝操作過(guò)程比較簡(jiǎn)單、容易、效率高、成本低，特別適合于工業(yè)化生產(chǎn)。
8、本發(fā)明產(chǎn)品有效成分含量控制采用丹酚酸B和羥基紅花黃色素A兩個(gè)單體有效成分指標(biāo)，采用高效液相色譜法測(cè)定，測(cè)定方法準(zhǔn)確、簡(jiǎn)單、穩(wěn)定，使得有效成分在生產(chǎn)過(guò)程中的檢測(cè)和控制都非常穩(wěn)定，二者含量合計(jì)在60％以上。
9、本發(fā)明將丹酚酸B和羥基紅花黃色素A根據(jù)它們物理性質(zhì)的差異分別進(jìn)行提取，提取出的丹酚酸B和羥基紅花黃色素A不但提取率高，丹酚酸B的純度也提高了40％～100％，羥基紅花黃色素A純度也提高了30％～50％。
10、現(xiàn)有的丹紅注射水針劑，由于水溶液中含氧氣，所以其中的丹酚酸B和羥基紅花黃色素A容易氧化分解，長(zhǎng)期儲(chǔ)存后顏色會(huì)變深并產(chǎn)生沉淀，藥物失效，而且水針劑不便于運(yùn)輸。

具體實(shí)施例方式具體實(shí)施方式
一本實(shí)施方式的丹酚酸B的提取方法按如下步驟進(jìn)行一、先向丹參藥材飲片加入丹參飲片質(zhì)量8～18倍、質(zhì)量濃度為35％～60％的乙醇和體積為乙醇體積1‰～4‰、濃度為1mol/L的鹽酸浸泡1～2小時(shí)，然后回流提取1.5～3小時(shí)，濾出丹參藥液，再向藥渣加入藥渣質(zhì)量6～16倍、質(zhì)量濃度為35％～60％的乙醇和體積為乙醇體積1‰～4‰、濃度為1mol/L的鹽酸，回流提取1～2小時(shí)，濾出丹參藥液，合并兩次提取的丹參藥液，再減壓濃縮成相對(duì)密度為1.16～1.24的丹參清膏；二、向丹參清膏中加入丹參清膏重量3～5倍的水，邊加水邊攪拌，室溫下靜置12～24小時(shí)，再過(guò)濾，丹參濾液用鹽酸調(diào)節(jié)pH值為2.8～3.2，得到丹參酸化濾液；三、將大孔吸附樹(shù)脂柱用pH值為2.8～3.2的鹽酸酸化，將步驟二得到的丹參酸化濾液上樣于大孔吸附柱上，用5～7倍樹(shù)脂體積pH值為2.8～3.2的鹽酸沖洗雜質(zhì)，再用質(zhì)量濃度為35％～55％的乙醇洗脫，收集1.5～2.5倍樹(shù)脂體積的丹參洗脫液，用氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)丹參洗脫液的pH值為4.0～4.2，減壓濃縮至相對(duì)密度為1.08～1.25的丹酚酸清膏；即得到丹酚酸B。
本實(shí)施方式中步驟一的丹參清膏的相對(duì)密度為40～60℃的條件下丹參清膏相對(duì)于水的密度；步驟三的丹酚酸清膏的相對(duì)密度為40～60℃的條件下丹酚酸清膏相對(duì)于水的密度。
具體實(shí)施方式
二本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一的不同點(diǎn)是步驟一中先向丹參藥材飲片加入丹參飲片質(zhì)量12～14倍、質(zhì)量濃度為45％～55％的乙醇和體積為乙醇體積2‰～3‰、濃度為1mol/L的鹽酸浸泡1.2～1.8小時(shí)，然后回流提取2～2.5小時(shí)。其它步驟及參數(shù)與具體實(shí)施方式
一相同。
具體實(shí)施方式
三本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一的不同點(diǎn)是步驟一中先向丹參藥材飲片加入丹參飲片質(zhì)量13倍、質(zhì)量濃度為50％的乙醇和體積為乙醇體積2.5‰、濃度為1mol/L的鹽酸浸泡1.5小時(shí)，然后回流提取2.2小時(shí)。其它步驟及參數(shù)與具體實(shí)施方式
一相同。
具體實(shí)施方式
四本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一的不同點(diǎn)是步驟一中再向藥渣加入藥渣質(zhì)量10～12倍、質(zhì)量濃度為48％～52％的乙醇和體積為乙醇體積1.5‰～3.5‰、濃度為1mol/L的鹽酸，回流提取1.2～1.8小時(shí)。其它步驟及參數(shù)與具體實(shí)施方式
一相同。
具體實(shí)施方式
五本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一的不同點(diǎn)是步驟一中再向藥渣加入藥渣質(zhì)量11倍、質(zhì)量濃度為51％的乙醇和體積為乙醇體積2‰、濃度為1mol/L的鹽酸，回流提取1.5小時(shí)。其它步驟及參數(shù)與具體實(shí)施方式
一相同。
具體實(shí)施方式
六本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一的不同點(diǎn)是步驟一中丹參藥液減壓濃縮成相對(duì)密度為1.1 8～1.22的丹參清膏。其它步驟及參數(shù)與具體實(shí)施方式
一相同。
具體實(shí)施方式
七本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一的不同點(diǎn)是步驟一中丹參藥液減壓濃縮成相對(duì)密度為1.20的丹參清膏。其它步驟及參數(shù)與具體實(shí)施方式
一相同。
具體實(shí)施方式
八本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一的不同點(diǎn)是步驟二中向丹參清膏中加入丹參清膏重量4倍的水。其它步驟及參數(shù)與具體實(shí)施方式
一相同。
具體實(shí)施方式
九本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一的不同點(diǎn)是步驟二中丹參清膏加水后靜置15～21小時(shí)。其它步驟及參數(shù)與具體實(shí)施方式
一相同。
具體實(shí)施方式
十本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一的不同點(diǎn)是步驟二中丹參清膏加水后靜置17～19小時(shí)。其它步驟及參數(shù)與具體實(shí)施方式
一相同。
具體實(shí)施方式
十一本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一的不同點(diǎn)是步驟二中丹參清膏加水后靜置18小時(shí)。其它步驟及參數(shù)與具體實(shí)施方式
一相同。
具體實(shí)施方式
十二本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一的不同點(diǎn)是步驟二中丹參濾液用鹽酸調(diào)節(jié)pH值為3.0。其它步驟及參數(shù)與具體實(shí)施方式
一相同。
本實(shí)施方式中鹽酸的質(zhì)量濃度為3％～10％。
具體實(shí)施方式
十三本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一的不同點(diǎn)是步驟三中將大孔吸附樹(shù)脂柱用pH值為3.0的鹽酸酸化。其它步驟及參數(shù)與具體實(shí)施方式
一相同。
具體實(shí)施方式
十四本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一的不同點(diǎn)是步驟三中用6倍柱體積pH值3.0的鹽酸沖洗雜質(zhì)。其它步驟及參數(shù)與具體實(shí)施方式
一相同。
具體實(shí)施方式
十五本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一的不同點(diǎn)是步驟三中再用質(zhì)量濃度為40％～50％的乙醇洗脫。其它步驟及參數(shù)與具體實(shí)施方式
一相同。
具體實(shí)施方式
十六本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一的不同點(diǎn)是步驟三中再用質(zhì)量濃度為55％的乙醇洗脫。其它步驟及參數(shù)與具體實(shí)施方式
一相同。
具體實(shí)施方式
十七本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一的不同點(diǎn)是步驟三中用氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)丹參洗脫液的pH值為4.1。其它步驟及參數(shù)與具體實(shí)施方式
一相同。
本實(shí)施方式中氫氧化鈉溶液的質(zhì)量濃度為3％～10％。
具體實(shí)施方式
十八本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一的不同點(diǎn)是步驟三中減壓濃縮至相對(duì)密度為1.16～1.20的丹酚酸清膏。其它步驟及參數(shù)與具體實(shí)施方式
一相同。
具體實(shí)施方式
十九本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一的不同點(diǎn)是步驟三中減壓濃縮至相對(duì)密度為1.18的丹酚酸清膏。其它步驟及參數(shù)與具體實(shí)施方式
一相同。
具體實(shí)施方式
二十本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一的不同點(diǎn)是步驟三中大孔吸附樹(shù)脂的型號(hào)為HZ801、AB-8或D101。其它步驟及參數(shù)與具體實(shí)施方式
一相同。
具體實(shí)施方式
二十一本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一的不同點(diǎn)是步驟三中上樣流速為1個(gè)樹(shù)脂體積/小時(shí)～1.5個(gè)樹(shù)脂體積/小時(shí)。其它步驟及參數(shù)與具體實(shí)施方式
一相同。
具體實(shí)施方式
二十二本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一的不同點(diǎn)是步驟三中沖洗雜質(zhì)的流速為1個(gè)樹(shù)脂體積/小時(shí)～1.5個(gè)樹(shù)脂體積/小時(shí)。其它步驟及參數(shù)與具體實(shí)施方式
一相同。
具體實(shí)施方式
二十三本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一的不同點(diǎn)是步驟三中洗脫流速為1個(gè)樹(shù)脂體積/小時(shí)～1.5個(gè)樹(shù)脂體積/小時(shí)。其它步驟及參數(shù)與具體實(shí)施方式
一相同。
具體實(shí)施方式
二十四本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一的不同點(diǎn)是步驟三中收集2倍樹(shù)脂體積的丹參洗脫液。其它步驟及參數(shù)與具體實(shí)施方式
一相同。
具體實(shí)施方式
二十五本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一的不同點(diǎn)是步驟三中大孔吸附樹(shù)脂的重量為丹參重量的2倍。其它步驟及參數(shù)與具體實(shí)施方式
一相同。
具體實(shí)施方式
二十六本實(shí)施方式的羥基紅花黃色素A的提取方法按如下步驟進(jìn)行一、先向紅花加入質(zhì)量為紅花質(zhì)量16～20倍的水浸泡20～40分鐘，煎煮20～40分鐘，濾出紅花藥液，再向藥渣加入質(zhì)量為藥渣質(zhì)量14～18倍的水，煎煮20～40分鐘，濾出紅花藥液，合并兩次濾出的紅花藥液，冷卻至室溫；二、紅花藥液用鹽酸調(diào)節(jié)pH值至1.9～2.2，靜置6～24小時(shí)，再過(guò)濾，得到紅花酸化濾液；三、將大孔吸附樹(shù)脂柱用pH值為1.9～2.2的鹽酸酸化，將步驟二得到的紅花酸化濾液上樣于大孔吸附柱上，用6～8倍樹(shù)脂體積pH值為1.9～2.2的鹽酸沖洗雜質(zhì)，再用質(zhì)量濃度為8％～15％的乙醇洗脫，收集4.5～6.0倍樹(shù)脂體積的紅花洗脫液，用氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)紅花洗脫液的pH值為4.0～4.2，減壓濃縮至相對(duì)密度為1.08～1.25的羥基紅花黃色素清膏；即得羥基紅花黃色素A。
本實(shí)施方式中步驟三的羥基紅花黃色素清膏的相對(duì)密度為40～60℃的條件下羥基紅花黃色素清膏相對(duì)于水的密度。
具體實(shí)施方式
二十七本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
二十六的不同點(diǎn)是步驟一中先向紅花加入質(zhì)量為紅花質(zhì)量17～19倍的水浸泡25～35分鐘，煎煮25～35分鐘。其它步驟及參數(shù)與具體實(shí)施方式
二十六相同。
具體實(shí)施方式
二十八本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
二十六的不同點(diǎn)是步驟一中先向紅花加入質(zhì)量為紅花質(zhì)量18倍的水浸泡30分鐘，煎煮30分鐘。
其它步驟及參數(shù)與具體實(shí)施方式
二十六相同。
具體實(shí)施方式
二十九本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
二十六的不同點(diǎn)是步驟一中再向藥渣加入質(zhì)量為藥渣質(zhì)量15～17倍的水，煎煮25～30分鐘。其它步驟及參數(shù)與具體實(shí)施方式
二十六相同。
具體實(shí)施方式
三十本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
二十六的不同點(diǎn)是步驟一中再向藥渣加入質(zhì)量為藥渣質(zhì)量16倍的，煎煮28分鐘。其它步驟及參數(shù)與具體實(shí)施方式
二十六相同。
具體實(shí)施方式
三十一本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
二十六的不同點(diǎn)是步驟二中紅花藥液用鹽酸調(diào)節(jié)pH值至2.0～2.1，靜置10～20小時(shí)。其它步驟及參數(shù)與具體實(shí)施方式
二十六相同。
具體實(shí)施方式
三十二本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
二十六的不同點(diǎn)是步驟二中紅花藥液用鹽酸調(diào)節(jié)pH值至2.0，靜置15小時(shí)。其它步驟及參數(shù)與具體實(shí)施方式
二十六相同。
本實(shí)施方式的鹽酸質(zhì)量濃度為3％～10％。
具體實(shí)施方式
三十三本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
二十六的不同點(diǎn)是步驟三中將大孔吸附樹(shù)脂柱用pH值為2.1的鹽酸酸化。其它步驟及參數(shù)與具體實(shí)施方式
二十六相同。
具體實(shí)施方式
三十四本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
二十六的不同點(diǎn)是步驟三中用7倍樹(shù)脂體積pH值2.0的鹽酸沖洗雜質(zhì)。其它步驟及參數(shù)與具體實(shí)施方式
二十六相同。
具體實(shí)施方式
三十五本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
二十六的不同點(diǎn)是步驟三中再用質(zhì)量濃度為10％～12％的乙醇洗脫。其它步驟及參數(shù)與具體實(shí)施方式
二十六相同。
具體實(shí)施方式
三十六本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
二十六的不同點(diǎn)是步驟三中再用質(zhì)量濃度為11％的乙醇洗脫。其它步驟及參數(shù)與具體實(shí)施方式
二十六相同。
具體實(shí)施方式
三十七本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
二十六的不同點(diǎn)是步驟三中用氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)紅花洗脫液的pH值為4.1。其它步驟及參數(shù)與具體實(shí)施方式
二十六相同。
本實(shí)施方式的氫氧化鈉溶液的質(zhì)量濃度為3％～10％。
具體實(shí)施方式
三十八本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
二十六的不同點(diǎn)是步驟三中減壓濃縮至相對(duì)密度為1.12～1.20的羥基紅花黃色素清膏。其它步驟及參數(shù)與具體實(shí)施方式
二十六相同。
具體實(shí)施方式
三十九本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
二十六的不同點(diǎn)是步驟三中減壓濃縮至相對(duì)密度為1.16的羥基紅花黃色素清膏。其它步驟及參數(shù)與具體實(shí)施方式
二十六相同。
具體實(shí)施方式
四十本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
二十六的不同點(diǎn)是步驟三中大孔吸附樹(shù)脂的型號(hào)為X-5或D4020。其它步驟及參數(shù)與具體實(shí)施方式
二十六相同。
具體實(shí)施方式
四十一本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
二十六的不同點(diǎn)是步驟三中上樣流速為1個(gè)樹(shù)脂體積/小時(shí)～1.5個(gè)樹(shù)脂體積/小時(shí)。其它步驟及參數(shù)與具體實(shí)施方式
二十六相同。
具體實(shí)施方式
四十二本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
二十六的不同點(diǎn)是步驟三中沖洗雜質(zhì)的流速為1個(gè)樹(shù)脂體積/小時(shí)～1.5個(gè)樹(shù)脂體積/小時(shí)。其它步驟及參數(shù)與具體實(shí)施方式
二十六相同。
具體實(shí)施方式
四十三本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
二十六的不同點(diǎn)是步驟三中洗脫流速為1個(gè)樹(shù)脂體積/小時(shí)～1.5個(gè)樹(shù)脂體積/小時(shí)。其它步驟及參數(shù)與具體實(shí)施方式
二十六相同。
具體實(shí)施方式
四十四本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
二十六的不同點(diǎn)是步驟三中收集5倍樹(shù)脂體積的紅花洗脫液。其它步驟及參數(shù)與具體實(shí)施方式
二十六相同。
具體實(shí)施方式
四十五本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
二十六的不同點(diǎn)是步驟三中大孔吸附樹(shù)脂的重量為紅花重量的4倍。其它步驟及參數(shù)與具體實(shí)施方式
二十六相同。
具體實(shí)施方式
四十六本實(shí)施方式用具體實(shí)施方式
一提取的丹酚酸B和具體實(shí)施方式
二十六提取的羥基紅花黃色素A制備注射用丹紅的方法按如下步驟進(jìn)行一、按照丹參和紅花藥材重量比為3∶1的比例取具體實(shí)施方式
一提取的丹酚酸B和具體實(shí)施方式
二十六提取的羥基紅花黃色素A，加入注射用水使配制成丹紅藥液并使丹紅藥液的含水量為75％～99％，攪拌后用氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)丹紅藥液的pH值為4.0～4.5，在0～10℃的條件下靜置12～48小時(shí)；二、先用0.22μm或0.45μm的微孔濾膜過(guò)濾后，再經(jīng)過(guò)截流分子量為30K或50K的Millipore超濾柱進(jìn)行超濾，將丹紅濾液分裝并凍干；即得到注射用丹紅。
具體實(shí)施方式
四十七本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
四十六的不同點(diǎn)是步驟一中使丹紅藥液的含水量為80％～95％。其它步驟及參數(shù)與具體實(shí)施方式
四十六相同。
具體實(shí)施方式
四十八本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
四十六的不同點(diǎn)是步驟一中使丹紅藥液的含水量為85％～90％。其它步驟及參數(shù)與具體實(shí)施方式
四十六相同。
具體實(shí)施方式
四十九本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
四十六的不同點(diǎn)是步驟一中使丹紅藥液的含水量為88％。其它步驟及參數(shù)與具體實(shí)施方式
四十六相同。
具體實(shí)施方式
五十本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
四十六的不同點(diǎn)是步驟一中用氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)丹紅藥液的pH值為4.2～4.4。其它步驟及參數(shù)與具體實(shí)施方式
四十六四相同。
本實(shí)施方式的氫氧化鈉溶液的質(zhì)量濃度為3％～10％。
具體實(shí)施方式
五十一本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
四十六的不同點(diǎn)是步驟一中用氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)丹紅藥液的pH值為4.3。其它步驟及參數(shù)與具體實(shí)施方式
四十六相同。
具體實(shí)施方式
五十二本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
四十六的不同點(diǎn)是步驟一中在2～8℃的條件下靜置18～30小時(shí)。其它步驟及參數(shù)與具體實(shí)施方式
四十六相同。
具體實(shí)施方式
五十三本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
四十六的不同點(diǎn)是步驟一中在4～6℃的條件下靜置25～28小時(shí)。其它步驟及參數(shù)與具體實(shí)施方式
四十六相同。
具體實(shí)施方式
五十四本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
四十六的不同點(diǎn)是步驟一中在5℃的條件下靜置27小時(shí)。其它步驟及參數(shù)與具體實(shí)施方式
四十六相同。
具體實(shí)施方式
五十五本實(shí)施方式的注射用丹紅的制備方法按如下步驟進(jìn)行一、提取丹酚酸B；二、提取羥基紅花黃色素A；三、按照丹參和紅花藥材重量比為3∶1的比例取步驟一提取的丹酚酸B和步驟二提取的羥基紅花黃色素A，加入注射用水使配制成丹紅藥液并使丹紅藥液的含水量為85％，攪拌后用氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)丹紅藥液的pH值為4.2，在5℃的條件下靜置40小時(shí)；四、先用0.22μm的微孔濾膜過(guò)濾后，再經(jīng)過(guò)截流分子量為30K的Millipore超濾柱進(jìn)行超濾，將丹紅濾液分裝并凍干；即得到注射用丹紅。
本實(shí)施方式步驟一提取丹酚酸B的方法為一、先向丹參藥材飲片加入丹參飲片質(zhì)量16倍、質(zhì)量濃度為50％的乙醇和體積為乙醇體積2‰、濃度為lmol/L的鹽酸浸泡1.5小時(shí)，然后回流提取2小時(shí)，濾出丹參藥液，再向藥渣加入藥渣質(zhì)量12倍、質(zhì)量濃度為55％的乙醇和體積為乙醇體積2‰、濃度為lmol/L的鹽酸，回流提取1.5小時(shí)，濾出丹參藥液，合并兩次提取的丹參藥液，再減壓濃縮成相對(duì)密度為1.18的丹參清膏；二、向丹參清膏中加入丹參清膏重量4倍的水，邊加水邊攪拌，室溫下靜置20小時(shí)，再過(guò)濾，丹參濾液用鹽酸調(diào)節(jié)pH值為2.9，得到丹參酸化濾液；三、將大孔吸附樹(shù)脂柱用pH值為2.9的鹽酸酸化，將步驟二得到的丹參酸化濾液上樣于大孔吸附柱上，上樣流速為1個(gè)樹(shù)脂體積/小時(shí)～1.5個(gè)樹(shù)脂體積/小時(shí)，用6倍樹(shù)脂體積pH值2.9的鹽酸沖洗雜質(zhì)，洗脫流速為1個(gè)樹(shù)脂體積/小時(shí)～1.5個(gè)樹(shù)脂體積/小時(shí)，再用2倍柱體積、質(zhì)量濃度為50％的乙醇洗脫，洗脫流速為1個(gè)樹(shù)脂體積/小時(shí)～1.5個(gè)樹(shù)脂體積/小時(shí)，收集2.0倍樹(shù)脂體積的丹參洗脫液，用氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)丹參洗脫液的pH值為4.1，減壓濃縮至相對(duì)密度為1.16的丹酚酸清膏；即得到丹酚酸B。
本實(shí)施方式步驟二提取羥基紅花黃色素A的方法為一、先向紅花加入質(zhì)量為紅花質(zhì)量18倍的水浸泡30分鐘，煎煮30分鐘，濾出紅花藥液，再向藥渣加入質(zhì)量為藥渣質(zhì)量16倍的水浸泡35分鐘，煎煮35分鐘，濾出紅花藥液，合并兩次濾出的紅花藥液，冷卻至室溫；二、紅花藥液用鹽酸調(diào)節(jié)pH值至2.0，靜置18小時(shí)，再過(guò)濾，得到紅花酸化濾液；三、將大孔吸附樹(shù)脂柱用pH值為2.0的鹽酸酸化，將步驟二得到的紅花酸化濾液上樣于大孔吸附柱上上樣流速為1個(gè)樹(shù)脂體積/小時(shí)～1.5個(gè)樹(shù)脂體積/小時(shí)，用7倍柱體積pH值2.0的鹽酸沖洗雜質(zhì)，洗脫流速為1個(gè)樹(shù)脂體積/小時(shí)～1.5個(gè)樹(shù)脂體積/小時(shí)，再用質(zhì)量濃度為12％的乙醇洗脫，洗脫流速為1個(gè)樹(shù)脂體積/小時(shí)～1.5個(gè)樹(shù)脂體積/小時(shí)，收集5.0倍樹(shù)脂體積的紅花洗脫液，用氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)紅花洗脫液的pH值為4.1，減壓濃縮至相對(duì)密度為1.16的羥基紅花黃色素清膏；即得羥基紅花黃色素A。
將本實(shí)施方式制得的注射用丹紅進(jìn)行如下藥效學(xué)試驗(yàn)研究 1、注射用丹紅對(duì)冠脈結(jié)扎所致犬心肌梗塞模型及血流動(dòng)力學(xué)的影響 目的觀察注射用丹紅給藥對(duì)冠脈結(jié)扎所致犬心肌梗死及血流動(dòng)力學(xué)的影響。
方法取健康成年家犬30只，雌雄各半，體重13.6±1.25kg，按體重隨機(jī)分為5組，分別為模型組、注射用丹紅低、中、高劑量組和丹紅注射液陽(yáng)性對(duì)照組。試驗(yàn)時(shí)將犬以戊巴比妥鈉30mg·kg-1麻醉，氣管插管，連接人工呼吸機(jī)，以針狀電極插入四肢及胸前皮下。沿胸骨左緣3-4肋間開(kāi)胸，充分暴露心臟。剪開(kāi)心包縫制心包吊床。用0號(hào)絲線結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支上中1/3處，結(jié)扎15min后各組分別給藥，注射用丹紅低、中、高劑量組給藥劑量分別為3mg·kg-1、6mg·kg-1、和12mg·kg-1，陽(yáng)性對(duì)照組給予丹紅注射液，給藥劑量為4ml·kg-1，模型組給予相應(yīng)體積的0.9％氯化鈉注射液。用多導(dǎo)生理記錄儀記錄結(jié)扎前、結(jié)扎穩(wěn)定后、給藥后15min、30min、60min、90min、120min、180min心外膜電圖EKG，并計(jì)算∑-ST和NST。用多導(dǎo)生理記錄儀、多普勒血流儀檢測(cè)記錄結(jié)扎前、結(jié)扎穩(wěn)定后和給藥后15min、30min、60min、90min、120min、180min血流動(dòng)力學(xué)生理參數(shù)。分離頸動(dòng)脈，抽取動(dòng)脈血，經(jīng)頸外靜脈插管至冠狀靜脈竇取冠狀靜脈血以血氧計(jì)測(cè)血氧含量。同時(shí)抽血2ml用自動(dòng)生化分析儀測(cè)定血清乳酸脫氫酶(LDH)、磷酸肌酸激酶(CK)的含量。藥后3h，取心臟稱重，TTC染色測(cè)定心肌梗死面積。
結(jié)果(1)心肌缺血程度(∑-ST)和心肌缺血范圍(NST)冠脈結(jié)扎后，各組犬ST段明顯抬高。與同期模型組相比，注射用丹紅各劑量組和陽(yáng)性對(duì)照藥丹紅注射液藥后∑-ST和NST均有降低，高劑量組藥后30～90min的∑-ST、藥后60～120min的NST顯著降低，與模型組比較有顯著性差異(P＜0.05)，其他時(shí)間點(diǎn)雖無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但均有降低趨勢(shì)；中劑量組藥后60min的∑-ST、藥后60～90min的NST顯著降低，與模型組比較有顯著性差異(P＜0.05)；低劑量組∑-ST和NST均有降低趨勢(shì)，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；丹紅注射液陽(yáng)性對(duì)照組藥后30min、60～90min分別對(duì)∑-ST的抬高和NST的增加有明顯抑制作用，與模型組比較有顯著性差異(P＜0.05)。與陽(yáng)性對(duì)照組比較，注射用丹紅低、中、高劑量組藥后各時(shí)間點(diǎn)∑-ST和NST無(wú)顯著性差異，但注射用丹紅高劑量有進(jìn)一步降低∑-ST和NST趨勢(shì)，具體實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)如表1和表2所示。
表1注射用丹紅對(duì)急性心肌缺血心外膜電圖∑-ST(

，mv)的影響 注①n＝6；②*P＜0.05，**P＜0.01，與模型組比較。
表2注射用丹紅對(duì)冠狀動(dòng)脈結(jié)扎犬心肌缺血范圍

的影響 注①n＝6；②*P＜0.05，**P＜0.01，與模型組比較；③ΔP＜0.05，ΔΔP＜0.01與藥前值比較。
(2)心肌梗死范圍冠脈結(jié)扎后195min各組犬均出現(xiàn)明顯的心肌梗死，與模型組相比，陽(yáng)性對(duì)照藥和注射用丹紅各劑量均明顯縮小心肌梗死范圍。注射用丹紅中劑量組心肌梗死區(qū)面積占左心室及全心的比例分別較模型組低2.68％和6.36％，高劑量組分別降低3.06％和6.55％，均有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；注射用丹紅低劑量組分別降低1.29％和5.15％，有降低趨勢(shì)，但無(wú)明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；陽(yáng)性對(duì)照組心肌梗死區(qū)面積占左心室及全心的比例分別較模型組低2.18％和5.75％，有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。與陽(yáng)性對(duì)照組比較，注射用丹紅低、中、高劑量組心肌梗死區(qū)面積無(wú)顯著性差異，但注射用丹紅高劑量有進(jìn)一步降低心肌梗死區(qū)面積趨勢(shì)，具體實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)如表3所示。
表3注射用丹紅對(duì)冠狀動(dòng)脈結(jié)扎犬心肌梗塞范圍

的影響 注①n＝6；②*P＜0.05，**P＜0.01，與模型組比較。
(3)肌酸激酶(CK)和乳酸脫氫酶(LDH)冠狀動(dòng)脈結(jié)扎后各組動(dòng)物血清CK和LDH較結(jié)扎前明顯升高。注射用丹紅各劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組藥后180min血清酶雖亦有升高，但升高的幅度均有不同程度的降低。與模型組比較，注射用丹紅3mg·kg-1藥后180min對(duì)血清酶的升高有一定抑制趨勢(shì)，但無(wú)顯著性差異；6mg·kg-1和12mg·kg-1給藥可明顯抑制血清LDH、CK的活性升高(P＜0.05或P＜0.01)。丹紅注射液藥后亦可顯著抑制血清LDH、CK的升高，與模型組比較有顯著性差異(P＜0.05)。與陽(yáng)性對(duì)照組比較，注射用丹紅低、中、高劑量組抑制血清LDH、CK的活性升高作用無(wú)顯著性差異，但注射用丹紅高劑量組可進(jìn)一步抑制LDH、CK的活性升高程度，具體實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)如表4和表5所示。
表4注射用丹紅對(duì)冠狀動(dòng)脈結(jié)扎犬血清乳酸脫氫酶(

，U/L)的影響 注①n＝6；②*P＜0.05，**P＜0.01，與模型組比較。
表5注射用丹紅對(duì)冠狀動(dòng)脈結(jié)扎犬血清肌酸肌酶(

，U/L)的影響 注①n＝6；②*P＜0.05，**P＜0.01，與模型組比較。
(4)左心室內(nèi)壓(LVP)、左心室舒張末壓(LVEDP)及左心室內(nèi)壓最大變化速率(dp/dtmax)與模型組比較，注射用丹紅各劑量和陽(yáng)性對(duì)照組結(jié)扎后15min給藥，LVP未見(jiàn)變化；對(duì)于LVEDP，注射用丹紅中、高劑量組和丹紅注射液陽(yáng)性對(duì)照組對(duì)心肌收縮性能下降引起的左心室舒張期末壓升高有顯著的降低作用，藥后90～180min與模型組比較有顯著性差異(P＜0.05或P＜0.01)，注射用丹紅低劑量給藥后對(duì)左心室舒張期末壓升高有一定抑制趨勢(shì)，但無(wú)顯著性差異，具體實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)如表6、表7和表8所示。
表6注射用丹紅對(duì)犬dp/dtmax的影響
注*P＜0.05，**P＜0.01，與模型組比較。
表7注射用丹紅對(duì)犬LVEDP的影響
注*P＜0.05，**P＜0.01，與模型組比較。
表8注射用丹紅對(duì)犬LVP的影響
注*P＜0.05，**P＜0.01，與模型組比較。
對(duì)于dp/dtmax，與模型組比較，注射用丹紅中、高劑量組和丹紅注射液陽(yáng)性對(duì)照組均有增加作用，藥后90～180min與模型組比較有顯著性差異(P＜0.05)，注射用丹紅低劑量給藥后對(duì)dp/dtmax有增加趨勢(shì)，但無(wú)顯著性差異。
與陽(yáng)性對(duì)照組比較，注射用丹紅低、中、高劑量組LVP、LVEDP和dp/dtmax差異不明顯，但注射用丹紅高劑量組LVEDP、dp/dtmax分別有進(jìn)一步降低和增加趨勢(shì)。
(5)主動(dòng)脈流量(CO)和冠狀動(dòng)脈流量(CAF)與模型組比較，注射用丹紅中、高劑量給藥后，對(duì)麻醉犬CO和CAF藥后變化率有增加作用，分別于藥后60～120min和60～180min有顯著性差異(P＜0.05)，其他時(shí)間點(diǎn)雖無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但均有增加趨勢(shì)；注射用丹紅低劑量藥后CO和CAF藥后變化率亦有增加趨勢(shì)，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。丹紅注射液陽(yáng)性對(duì)照組藥后90～120min對(duì)CO和CAF藥后變化率有明顯增加作用，與模型組比較有顯著性差異(P＜0.05)。與陽(yáng)性對(duì)照組比較，注射用丹紅低、中、高劑量組CO、CAF無(wú)顯著性差異，但注射用丹紅高劑量有進(jìn)一步增加CO、CAF趨勢(shì)，具體實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)如表9和表10所示。
表9注射用丹紅對(duì)犬CO的影響
注①n＝6；②*P＜0.05，**P＜0.01，與模型組比較。
表10注射用丹紅對(duì)犬CAF的影響
注①n＝6；②*P＜0.05，**P＜0.01，與模型組比較。
(6)動(dòng)靜脈血氧含量與模型組進(jìn)行比較，注射用丹紅中、高劑量組和丹紅注射液陽(yáng)性對(duì)照組于給藥后60min開(kāi)始，動(dòng)靜脈血氧含量差值明顯上升(P＜0.05或P＜0.01)，其中注射用丹紅高劑量組作用時(shí)間可達(dá)藥后180min。注射用丹紅低劑量組有增加趨勢(shì)，但無(wú)顯著性差異。與陽(yáng)性對(duì)照組比較，注射用丹紅低、中、高劑量組動(dòng)靜脈血氧含量差值各時(shí)間點(diǎn)均無(wú)顯著性差異，但注射用丹紅高劑量組可進(jìn)一步增加動(dòng)靜脈血氧含量差值，具體實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)如表11所示。
表11注射用丹紅對(duì)犬動(dòng)靜脈血氧含量差值的影響
注①n＝6；②*P＜0.05，**P＜0.01，與模型組比較。
結(jié)論(1)本試驗(yàn)?zāi)Ｐ腿诿}結(jié)扎后∑-ST和NST升高，血清LDH和CK活性增加，結(jié)扎后195min心肌梗死面積明顯，說(shuō)明模型制備成功。
(2)注射用丹紅對(duì)犬心肌缺血有明顯的保護(hù)作用，具有改善心血管功能、促進(jìn)血液循環(huán)、增加動(dòng)靜脈血氧含量差值等功效，其起效劑量為3～6mg·kg-1。在本試驗(yàn)條件下，陽(yáng)性對(duì)照藥丹紅注射液和注射用丹紅6mg·kg-1對(duì)犬心肌梗死引起的∑-ST、NST升高，血清LDH、CK活性增加和LVEDP升高有明顯的降低作用，對(duì)dp/dtmax、CO、CAF和動(dòng)靜脈血氧含量差值有增加作用，與模型組分別比較均有顯著性差異(P＜0.05)；注射用丹紅3mg·kg-1對(duì)以上指標(biāo)均有一定作用趨勢(shì)，但與模型組比較差異不明顯；注射用丹紅12mg·kg-1能進(jìn)一步改善犬心肌缺血指標(biāo)和dp/dtmax、CO、CAF和動(dòng)靜脈血氧含量。隨用藥劑量的增加注射用丹紅作用呈現(xiàn)一定的劑量效應(yīng)關(guān)系，藥后30min開(kāi)始起效，藥效時(shí)間可達(dá)藥后180min。
(3)與陽(yáng)性對(duì)照藥比較，注射用丹紅6mg·kg-1作用效果與其相當(dāng)。與丹紅注射液比較，注射用丹紅12mg·kg-1對(duì)∑-ST、NST升高、血清LDH、CK活性增加、LVEDP升高的降低作用和對(duì)dp/dtmax、CO、CAF和動(dòng)靜脈血氧含量差值的增加作用雖無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但程度有進(jìn)一步改善；注射用丹紅3mg·kg-1對(duì)以上指標(biāo)有一定作用趨勢(shì)，與丹紅注射液比較無(wú)顯著性差異，但作用程度較輕。
(4)由以上藥效學(xué)研究結(jié)果提示，注射用丹紅臨床用藥有效起始劑量約為1.5～3mg·kg-1，以人體體重60kg計(jì)推薦臨床擬用給藥劑量約為90～180mg。
2、注射用丹紅對(duì)大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷模型的影響 目的觀察注射用丹紅給藥對(duì)大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用。
方法取健康雄性Wistar大鼠，適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后，按體重隨機(jī)分為6組假手術(shù)組、模型組、注射用丹紅低、中、高劑量組，和陽(yáng)性對(duì)照組。采用改進(jìn)的Zea Longa’s大腦中動(dòng)脈內(nèi)栓線阻斷法(MCAO)制備大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷模型，并于缺血1.5h后進(jìn)行再灌注。試驗(yàn)過(guò)程中，MCAO手術(shù)失敗，造模不成功及24h內(nèi)死亡的動(dòng)物均棄之不用，不足預(yù)定數(shù)額者按照隨機(jī)抽樣原則補(bǔ)齊動(dòng)物并重新造模，并保證每組造模成功的動(dòng)物數(shù)為8只。假手術(shù)組給予相應(yīng)體積0.9％氯化鈉注射液，注射用丹紅低、中、高組給藥劑量分別為10mg·kg-1、20mg·kg-1和40mg·kg-1，陽(yáng)性對(duì)照組給予丹紅注射液，給藥劑量為12ml·kg-1。各組分別于腦缺血即刻尾靜脈注射相應(yīng)藥物。腦缺血1.5h再灌注24h后，各組動(dòng)物進(jìn)行神經(jīng)病學(xué)檢查，繼而斷頭取腦經(jīng)TTC染色后測(cè)定缺血側(cè)腦組織梗死體積。
結(jié)果與假手術(shù)組相比，模型組大鼠局灶性腦缺血1.5h再灌注損傷24h后神經(jīng)功能缺損體征明顯，缺血側(cè)腦組織肉眼可見(jiàn)明顯的乳白色梗死灶，并伴有水腫，同時(shí)缺血側(cè)血管腫脹較明顯，TTC染色可見(jiàn)明顯的梗死灶，說(shuō)明模型制備成功，滿足本試驗(yàn)要求。與模型組相比，陽(yáng)性對(duì)照組及各用藥組缺血再灌注損傷大鼠的神經(jīng)功能障礙均有改善，腦梗死體積明顯縮小，缺血側(cè)腦水腫程度減輕。陽(yáng)性對(duì)照組腦梗死面積減小12％，有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。低劑量組腦梗死體積減小5％，但無(wú)明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；中劑量組腦梗死體積降低14％，高劑量組降低18％，兩組均有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。與陽(yáng)性對(duì)照組比較，低、中劑量組無(wú)明顯差異，高劑量組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)，比丹紅注射液治療效果好，具體實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)見(jiàn)表12和表13。
表12注射用丹紅對(duì)大鼠神經(jīng)行為學(xué)改變的影響 注n＝8；*P＜0.05，**P＜0.01，與模型組比較。
表13注射用丹紅對(duì)大鼠腦梗死面積的影響
注n＝8；*P＜0.05，**P＜0.01，與模型組比較；ΔP＜0.05，與丹紅注射液組比較。
結(jié)論(1)本試驗(yàn)?zāi)Ｐ徒M大鼠神經(jīng)功能學(xué)評(píng)分符合模型成功的標(biāo)準(zhǔn)，TTC染色可見(jiàn)明顯腦梗死灶，說(shuō)明模型制備成功。陽(yáng)性對(duì)照藥可顯著改善大鼠腦缺血再灌注損傷。
(2)注射用丹紅10mg·kg-1對(duì)損傷有一定的改善作用，但在統(tǒng)計(jì)學(xué)上與模型組無(wú)明顯差異。20mg·kg-1對(duì)大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷有明顯的保護(hù)作用，可改善缺血1.5h再灌注24h后神經(jīng)功能缺損癥狀，顯著縮小腦梗死體積，減輕缺血側(cè)腦水腫程度。40mg·kg-1可進(jìn)一步降低腦損傷程度，且較陽(yáng)性對(duì)照組治療效果好。隨用藥劑量的增加，腦梗死體積逐漸減小，呈現(xiàn)一定的劑量效應(yīng)關(guān)系。
(3)與陽(yáng)性對(duì)照藥丹紅注射液比較，注射用丹紅低劑量10mg·kg-1效果不明顯，中劑量20mg·kg-1療效與其相當(dāng)；高劑量40mg·kg-1可明顯改善缺血再灌注損傷大鼠的神經(jīng)功能障礙，腦梗死體積顯著縮小，缺血側(cè)腦水腫程度減輕，較丹紅注射液治療效果好。
(4)由以上藥效學(xué)研究結(jié)果提示，注射用丹紅臨床用藥有效起始劑量約為1.7～3.3mg·kg-1，以人體體重60kg計(jì)推薦臨床治療腦中風(fēng)擬用給藥劑量約為100～200mg。
3、注射用丹紅對(duì)ADP誘發(fā)的小鼠急性肺栓塞的影響 目的觀察注射用丹紅多次尾給藥對(duì)ADP所致小鼠急性肺栓塞的影響。
方法取健康成年昆明小鼠50只，按體重隨機(jī)分為空白組(Veh)、注射用丹紅低、中、高劑量組及陽(yáng)性對(duì)照組，每組10只，雌雄各半。連續(xù)尾給藥3天，Veh組給予相應(yīng)體積的0.9％氯化鈉注射液，注射用丹紅給藥劑量分別為15、30、和60mg·kg-1，陽(yáng)性對(duì)照組給予丹紅注射液，劑量為20ml·kg-1。于末次給藥后1h尾靜脈注射ADP 0.25g·kg-1，造急性肺栓塞模型，記錄注射誘導(dǎo)劑后至小鼠呼吸正常，四肢恢復(fù)自主活動(dòng)所需的時(shí)間。
結(jié)果與Veh組相比，陽(yáng)性對(duì)照組小鼠恢復(fù)自主活動(dòng)所需時(shí)間降低131s，有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.01)。注射用丹紅低、中、高劑量組小鼠恢復(fù)自主活動(dòng)所需的時(shí)間明顯縮短，其中低劑量組縮短98s，中、高劑量分別縮短136s、165s，均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.01)。與陽(yáng)性對(duì)照組比較，低、中、高劑量組均無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，具體實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)見(jiàn)表14。
表14注射用丹紅對(duì)ADP致小鼠急性肺栓塞的影響(

，s) 注n＝10；**P＜0.01，與Veh組比較。
結(jié)論(1)注射用丹紅15mg·kg-1可顯著縮短ADP誘發(fā)的小鼠急性肺栓塞后恢復(fù)自主活動(dòng)所需時(shí)間(P＜0.01)，中劑量30mg·kg-1和高劑量60mg·kg-1也可明顯縮短恢復(fù)自主活動(dòng)所需時(shí)間(P＜0.01)。且隨給藥劑量的增加，可使ADP誘發(fā)的小鼠急性肺栓塞后恢復(fù)自主活動(dòng)所需時(shí)間逐漸縮短，存在明顯的劑量效應(yīng)關(guān)系。
(2)與陽(yáng)性對(duì)照藥丹紅注射液比較，低劑量組作用效果不顯著，中、高劑量組療效較其有改善，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
(3)由以上藥效學(xué)研究結(jié)果提示，注射用丹紅臨床用藥有效起始劑量約為1.5～3mg·kg-1，以人體體重60kg計(jì)推薦臨床治療淤血型肺心病擬用給藥劑量約為90～180mg。
4、注射用丹紅對(duì)小鼠凝血時(shí)間的影響 目的觀察注射用丹紅多次尾給藥對(duì)小鼠凝血時(shí)間的影響。
方法健康成年昆明小鼠50只，按體重隨機(jī)分為空白組(Veh)、注射用丹紅低、中、高劑量組及陽(yáng)性對(duì)照組，每組10只，雌雄各半。連續(xù)尾給藥3天，Veh組給予相應(yīng)體積的0.9％氯化鈉注射液，注射用丹紅給藥劑量分別為15mg·kg-1、30mg·kg-1和60mg·kg-1，陽(yáng)性對(duì)照組給予丹紅注射液，劑量為20ml·kg-1，于末次給藥后1小時(shí)用眼科彎鑷迅速摘去一側(cè)眼球，舍棄第一滴血，將血液滴于潔凈的載玻片上，直徑約為5～10mm，秒表計(jì)時(shí)，每隔30s用清潔大頭針自血液邊緣向里輕輕挑動(dòng)1次，觀察有無(wú)血絲挑起。從采血開(kāi)始至挑起絲時(shí)間血即為凝血時(shí)間。
結(jié)果與Veh組相比，注射用丹紅各劑量組小鼠凝血時(shí)間明顯延長(zhǎng)，其中低劑量組延長(zhǎng)27s，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。中劑量組延長(zhǎng)54s，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。高劑量組小鼠凝血時(shí)間延長(zhǎng)129s，具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.01)。與陽(yáng)性對(duì)照組比較，低劑量組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)，中、高劑量組無(wú)顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，具體實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)見(jiàn)表15。
表15注射用丹紅對(duì)小鼠凝血時(shí)間的影響
注n＝10；*P＜0.05 **P＜0.01，與Veh組比較；ΔP＜0.05，與丹紅注射液組比較。
結(jié)論(1)注射用丹紅15mg·kg-1可對(duì)小鼠凝血時(shí)間有一定的延長(zhǎng)作用，但與Veh組相比，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。30mg·kg-1可明顯延長(zhǎng)小鼠凝血時(shí)間，高劑量組60mg·kg-1效果更明顯。且隨用藥劑量的增加，注射用丹紅使小鼠凝血時(shí)間遞增，表現(xiàn)明顯的劑量效應(yīng)關(guān)系。
(2)與陽(yáng)性對(duì)照藥丹紅注射液比較，低劑量組療效沒(méi)有其明顯，中、高劑量組作用效果較其有改善，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
(3)由以上藥效學(xué)研究結(jié)果提示，注射用丹紅臨床用藥有效起始劑量約為1.5～3mg·kg-1，以人體體重60kg計(jì)推薦臨床治療擬用給藥劑量約為90～180mg。
5、注射用丹紅對(duì)大鼠血小板聚集率的影響 目的觀察注射用丹紅多次尾給藥對(duì)大鼠血小板聚集率的影響。
方法取健康成年Wistar大鼠50只，按體重隨機(jī)分為空白組(Veh)、注射用丹紅低、中、高劑量組及陽(yáng)性對(duì)照組。每組10只，雌雄各半。連續(xù)尾給藥3天，Veh組給予相應(yīng)體積的0.9％氯化鈉注射液，注射用丹紅給藥劑量分別為10mg·kg-1、20mg·kg-1和40mg·kg-1，陽(yáng)性對(duì)照組給予丹紅注射液，給藥劑量為12ml·kg-1，于末次給藥后1h頸靜脈竇取血，3.8％枸櫞酸鈉抗凝。將抗凝血離心(800rpm、10min)，吸取上層血漿(為富血小板血漿，PRP)將剩余部分再次離心(3000rpm、15min)，吸取上層血漿(為貧血小板血漿，PPP)，然后用血小板聚集儀測(cè)透光率的變化，求算血小板聚集率，具體實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)如表16所示。
表16注射用丹紅對(duì)大鼠血小板聚集率的影響的影響
注*P＜0.05，**P＜0.01，與Veh組比較；ΔP＜0.05，ΔΔP＜0.01，與丹紅注射液組比較。
結(jié)果與Veh組相比，注射用丹紅低、中、高劑量組大鼠血小板聚集率均明顯下降，其中低劑量使血小板聚集率下降10％，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。中、高劑量組下降14％、22％，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)，而高劑量組差異極顯著(P＜0.01)，說(shuō)明注射用丹紅可以有效抑制ADP及Collagen誘導(dǎo)的血小板聚集率。與陽(yáng)性對(duì)照組比較，注射用丹紅低、中、高劑量組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
結(jié)論(1)注射用丹紅10mg·kg-1可在一定程度上降低大鼠血小板聚集率。20mg·kg-1可顯著抑制血小板聚集，40mg·kg-1抑制作用更強(qiáng)。同時(shí)隨劑量增加，血小板聚集抑制作用增強(qiáng)，有一定的劑量效應(yīng)關(guān)系。
(2)與陽(yáng)性對(duì)照藥丹紅注射液比較，低、中劑量組效果不顯著，高劑量組療效較其有進(jìn)一步改善，但沒(méi)有顯著性差異。
(3)由以上藥效學(xué)研究結(jié)果提示，注射用丹紅臨床用藥有效起始劑量約為1.7～3.3mg·kg-1，以人體體重60kg計(jì)推薦臨床治療擬用給藥劑量約為100～200mg。
權(quán)利要求
1.丹酚酸B的提取方法，其特征在于丹酚酸B的提取方法按如下步驟進(jìn)行一、先向丹參藥材飲片加入丹參飲片質(zhì)量8～18倍、質(zhì)量濃度為35％～60％的乙醇和體積為乙醇體積1‰～4‰、濃度為1mol/L的鹽酸浸泡1～2小時(shí)，然后回流提取1.5～3小時(shí)，濾出丹參藥液，再向藥渣加入藥渣質(zhì)量6～16倍、質(zhì)量濃度為35％～60％的乙醇和體積為乙醇體積1‰～4‰、濃度為1mol/L的鹽酸，回流提取1～2小時(shí)，濾出丹參藥液，合并兩次提取的丹參藥液，再減壓濃縮成相對(duì)密度為1.16～1.24的丹參清膏；二、向丹參清膏中加入丹參清膏重量3～5倍的水，邊加水邊攪拌，室溫下靜置12～24小時(shí)，再過(guò)濾，丹參濾液用鹽酸調(diào)節(jié)pH值為2.8～3.2，得到丹參酸化濾液；三、將大孔吸附樹(shù)脂柱用pH值為2.8～3.2的鹽酸酸化，將步驟二得到的丹參酸化濾液上樣于大孔吸附柱上，用5～7倍樹(shù)脂體積pH值為2.8～3.2的鹽酸沖洗雜質(zhì)，再用質(zhì)量濃度為35％～55％的乙醇洗脫，收集1.5～2.5倍樹(shù)脂體積的丹參洗脫液，用氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)丹參洗脫液的pH值為4.0～4.2，減壓濃縮至相對(duì)密度為1.08～1.25的丹酚酸清膏；即得到丹酚酸B。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的丹酚酸B的提取方法，其特征在于步驟三中將大孔吸附樹(shù)脂柱用pH值為3.0的鹽酸酸化。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的丹酚酸B的提取方法，其特征在于步驟三中用6倍柱體積pH值3.0的鹽酸沖洗雜質(zhì)。
4.羥基紅花黃色素A的提取方法，其特征在于羥基紅花黃色素A的提取方法按如下步驟進(jìn)行一、先向紅花加入質(zhì)量為紅花質(zhì)量16～20倍的水浸泡20～40分鐘，煎煮20～40分鐘，濾出紅花藥液，再向藥渣加入質(zhì)量為藥渣質(zhì)量14～18倍的水，煎煮20～40分鐘，濾出紅花藥液，合并兩次濾出的紅花藥液，冷卻至室溫；二、紅花藥液用鹽酸調(diào)節(jié)pH值至1.9～2.2，靜置6～24小時(shí)，再過(guò)濾，得到紅花酸化濾液；三、將大孔吸附樹(shù)脂柱用pH值為1.9～2.2的鹽酸酸化，將步驟二得到的紅花酸化濾液上樣于大孔吸附柱上，用6～8倍樹(shù)脂體積pH值為1.9～2.2的鹽酸沖洗雜質(zhì)，再用質(zhì)量濃度為8％～15％的乙醇洗脫，收集4.5～6.0倍樹(shù)脂體積的紅花洗脫液，用氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)紅花洗脫液的pH值為4.0～4.2，減壓濃縮至相對(duì)密度為1.08～1.25的羥基紅花黃色素清膏；即得羥基紅花黃色素A。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的羥基紅花黃色素A的提取方法，其特征在于步驟二中紅花藥液用鹽酸調(diào)節(jié)pH值至2.0～2.1，靜置10～20小時(shí)。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的羥基紅花黃色素A的提取方法，其特征在于步驟三中用7倍柱體積pH值為2.0的鹽酸沖洗雜質(zhì)。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的羥基紅花黃色素A的提取方法，其特征在于步驟三中用氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)紅花洗脫液的pH值為4.1。
8.用權(quán)利要求1提取的丹酚酸B和權(quán)利要求4提取的羥基紅花黃色素A制備注射用丹紅的方法，其特征在于注射用丹紅的制備方法按如下步驟進(jìn)行一、按照丹參和紅花藥材重量比為3∶1的比例權(quán)利要求1提取的丹酚酸B和權(quán)利要求4提取的羥基紅花黃色素A，加入注射用水使配制成丹紅藥液并使丹紅藥液的含水量為75％～99％，攪拌后用氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)丹紅藥液的pH值為4.0～4.5，在0～10℃的條件下靜置12～48小時(shí)；二、先用0.22μm或0.45μm的微孔濾膜過(guò)濾后，再經(jīng)過(guò)截流分子量為30K或50K的Millipore超濾柱進(jìn)行超濾，將丹紅濾液分裝并凍干；即得到注射用丹紅。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的注射用丹紅的制備方法，其特征在于步驟一中使丹紅藥液的含水量為88％。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的注射用丹紅的制備方法，其特征在于步驟一中用氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)丹紅藥液的pH值為4.3。
全文摘要
丹酚酸B和羥基紅花黃色素A的提取方法及注射用丹紅的制備方法，它涉及丹酚酸和羥基紅花黃色素的提取方法及丹紅制劑的制備方法。本發(fā)明解決了現(xiàn)有提取方法存在對(duì)丹酚酸B和羥基紅花黃色素A提取不徹底和制備出的丹紅注射液運(yùn)輸和儲(chǔ)存不方便的問(wèn)題。本發(fā)明的丹酚酸B按如下步驟進(jìn)行提取一、回流；二、酸化；三、吸附；即得到丹酚酸B。本發(fā)明的羥基紅花黃色素A按如下步驟進(jìn)行提取一、煎煮；二、酸化；三、吸附；即得到羥基紅花黃色素A。本發(fā)明的注射用丹紅按如下步驟進(jìn)行提取一、配比，靜置；二、過(guò)濾，凍干；即得到注射用丹紅。本發(fā)明對(duì)丹酚酸B和羥基紅花黃色素A的提取率高，制備出的注射用丹紅便于儲(chǔ)存和運(yùn)輸。
文檔編號(hào)C07D307/00GK101168539SQ20071014474
公開(kāi)日2008年4月30日 申請(qǐng)日期2007年12月4日 優(yōu)先權(quán)日2007年12月4日
發(fā)明者李殿明, 饒 付, 任瑞濤, 吳志軍, 秦緒江, 劉占濱, 王英新, 馬志強(qiáng) 申請(qǐng)人:哈藥集團(tuán)中藥二廠