專(zhuān)利名稱(chēng)：：八棱絲瓜蛋白1及其編碼基因的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及生物化學(xué)領(lǐng)域，特別是涉及到生物化學(xué)中一種核糖體失活蛋白一-八棱絲瓜蛋白l及其編碼基因與其在制備抗腫瘤，抗病毒，特別是抗艾滋病毒的藥物中的應(yīng)用。技術(shù)背景從高等植物中提取的核糖體失活蛋白(Ribosome-InactivatingProtein,簡(jiǎn)稱(chēng)RIP)，核糖體失活蛋白是一類(lèi)能使真核生物細(xì)胞的核糖體失活，從而抑制細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)合成的細(xì)胞毒素，其作用機(jī)制是具有RNAN-糖苷酶或叫多核苷酸'腺苷糖苷酶[EC3.2.2.22]活性。根據(jù)蛋白分子及其基因的結(jié)構(gòu)，RIP可以分為3類(lèi)，類(lèi)型lRIP是具RNAN-糖苷酶活性的單肽鏈蛋白，例如，來(lái)自葫蘆科植物栝樓塊根的天花粉蛋白(Trichosanthin，簡(jiǎn)稱(chēng)TCS)，白瀉根蛋白(Bryodin，簡(jiǎn)稱(chēng)BRY),苦瓜種子的a，0_苦瓜蛋白(a，p-Momorcharin，簡(jiǎn)稱(chēng)MMA，MMB)和絲瓜(Luffacylindrica)種子的絲瓜蛋白a,b(Luffina，b簡(jiǎn)稱(chēng)LUA,LUB)。類(lèi)型2RIP是雙肽鏈蛋白，例如，來(lái)自大戟科植物蓖麻種子的蓖麻毒素(Ricin)和豆科植物相思樹(shù)種子的相思子毒素(Abrin)，它是由一條具有RNAN-糖苷酶活性的A鏈和一條具凝集素活性的B鏈通過(guò)二硫鍵連接而成的。類(lèi)型3RlP是一類(lèi)茉莉酮誘導(dǎo)的蛋白(jasmonate-inducedprotein),它是由具有RNAN-糖苷酶功能的N端結(jié)構(gòu)域和一個(gè)未知功能的C端結(jié)構(gòu)域組成，例如來(lái)自大麥的JIP60。從葫蘆科植物中分離出來(lái)的類(lèi)型1核糖體失活蛋白，例如天花粉蛋白、苦瓜蛋白、絲瓜蛋白、白瀉根蛋白等，均具有抗腫瘤，抗病毒活性，特別是抗艾滋病毒活性。葫蘆科絲瓜屬植物主要有兩個(gè)栽培種，一是普通絲瓜(LuffacylindricalRoem.或LuffaaegyptiacaMill.)，一般就叫絲瓜(中國(guó)植物志，中國(guó)高等植物圖鑒)；一是八棱絲瓜(LuffaacutangulaRoxb.)，又叫棱角絲瓜(中國(guó)高等植物圖鑒)，廣東絲瓜(中國(guó)植物志)。ZL97112602.X提供了從八棱絲瓜種子中分離出的類(lèi)型lRIP——八棱絲瓜蛋白l(Luffaculin1,簡(jiǎn)稱(chēng)LAl)，并公開(kāi)了它的制備方法。SDS-PAGE顯示它的分子量為28kDa，其N(xiāo)端氨基酸順序?yàn)锳sp-Val-Ser-Phe-Ser，具有強(qiáng)烈抑制細(xì)胞內(nèi)核糖體蛋白質(zhì)合成的活性。CN1473847A提供了八棱絲瓜蛋白1的等電點(diǎn)、二級(jí)結(jié)構(gòu)、糖苷酶活性和抗腫瘤活性及其應(yīng)用。林峻凱等(林峻凱，陳明晃，謝捷明，等，八棱絲瓜籽核糖體失活蛋白的分離純化及其理化性質(zhì)[J]，中國(guó)生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào)，2002，18，609—613)，從八棱絲瓜種子中提取到八棱絲瓜蛋白1，測(cè)定其分子量為28kD，等電點(diǎn)為8.86，具有RNAN—糖苷酶活性，細(xì)胞對(duì)蛋白質(zhì)合成有抑制活性，及體外對(duì)腫瘤細(xì)胞較強(qiáng)的抑制活性，認(rèn)為可以用于或構(gòu)成免疫毒素治療癌癥。陳明晃等人(陳明晃，石小莉，葉曉明，等，八棱絲瓜蛋白1的二級(jí)結(jié)構(gòu)及其生物活性[J]，結(jié)構(gòu)化學(xué)，2004，23，232-236)報(bào)道了八棱絲瓜蛋白1的N端順序，用CD譜測(cè)定二級(jí)結(jié)構(gòu)及對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制活性。陳明晃等人(ChenMH,YeXM,ShiXL，etal:Uiffaculins，ribosome-inactivatingproteinfromtheseedsofLuffaacutangula[J].TOXICOLOGY.2003,19148)報(bào)道了八棱絲瓜蛋白1的抗腫瘤活性。謝捷明等(謝捷明，陳明晃，許盈，等，八棱絲瓜蛋白1對(duì)B16細(xì)胞的誘導(dǎo)分化作用[J]，2005,12,1521-1524)報(bào)道了八棱絲瓜蛋白1對(duì)B16細(xì)胞的誘導(dǎo)分化作用。侯曉敏等(HouXM,ChenMH,XieJM，etal:Crystallizationandpreliminarycrystallogr即hicstudiesofluffaculin1，aribosome-inactivatingproteinfromtheseedsofUiffaacutangula)報(bào)道了八棱絲瓜蛋白1的初步結(jié)晶學(xué)研究。上述專(zhuān)利和文獻(xiàn)表明，提取自八棱絲瓜種子的核糖體失活蛋白一八棱絲瓜蛋白1，是類(lèi)型1核糖體失活蛋白，具有抗腫瘤，抗病毒作用等多種生物學(xué)功能，尤其八棱絲瓜蛋白1具有較強(qiáng)的抗腫瘤活性，并報(bào)道了八棱絲瓜蛋白1的誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分化的作用，促使我們進(jìn)一步了解八棱絲瓜蛋白1的一級(jí)結(jié)構(gòu)和空間結(jié)構(gòu)及其基因，闡明八棱絲瓜蛋白1的結(jié)構(gòu)與功能，研究基因的表達(dá)、調(diào)控，開(kāi)展蛋白質(zhì)工程和基因工程，并為獲得藥用蛋白質(zhì)或制備免疫毒素提供基礎(chǔ)知識(shí)。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是基于上述現(xiàn)有技術(shù)基礎(chǔ)，提供一種核糖體失活蛋白—八棱絲瓜蛋白1的成熟蛋白的全長(zhǎng)氨基酸序列及其編碼基因的核苷酸序列。通過(guò)一級(jí)結(jié)構(gòu)比較分析和晶體結(jié)構(gòu)(三級(jí)結(jié)構(gòu))的分析，為制備抗腫瘤，抗病毒，特別是抗艾滋病病毒的藥物和制備免疫毒素提供關(guān)鍵技術(shù)。本發(fā)明提純了八棱絲瓜蛋白1(Luffaculin1,簡(jiǎn)稱(chēng)LA1)，并在生物質(zhì)譜儀上測(cè)定了它的精確分子量為27960Da(ESI-MS測(cè)定)，或27893Da(MALDI-TOF-MS測(cè)定)。本發(fā)明從八棱絲瓜種子發(fā)芽后長(zhǎng)出來(lái)的第一片真葉，按天根公司的植物基因組DNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)上操作要求，提取八棱絲瓜總的DNA。本發(fā)明根據(jù)八棱絲瓜蛋白1的N端氨基酸順序(DVSFSLS)設(shè)計(jì)寡核苷酸上游引物(5，-GATGTGAGCTTCAGTTTGTC-3，)，并根據(jù)八棱絲瓜蛋白1的晶體學(xué)判斷C端氨基酸順序(NIQLLLN)設(shè)計(jì)寡核苷酸的下游引物(5'-[A/G]TTTAGAAGCAA[C/T]TGGATGT-3，)。PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)槭紫饶０?4。C變性2min，然后進(jìn)行35個(gè)循環(huán)包括94。C變性50s，49。C退火45s，72。C延伸lmin30s，最后再延伸10min結(jié)束PCR反應(yīng)。按照《精編分子生物學(xué)試驗(yàn)指南》(北京科學(xué)出版社，1998)中的操作說(shuō)明進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳及DAN片段回收.測(cè)序公司測(cè)定核苷酸順序.上述方法獲得的八棱絲瓜蛋白1DNA基因序列，見(jiàn)序列表SEQIDNo:2。結(jié)合八棱絲瓜蛋白1DNA基因順序所推斷出的氨基酸順序、八棱絲瓜蛋白1的晶體學(xué)研究判斷出來(lái)的C端順序，獲得了八棱絲瓜蛋白1的成熟蛋白的全長(zhǎng)氨基酸序列，見(jiàn)序列表SEQIDNo:l。將八棱絲瓜蛋白1全長(zhǎng)氨基酸序列與已報(bào)道的2種絲瓜蛋白a(Luffina)(一是LUA:SwissPort蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)登陸號(hào)為:Q00465,gil32590;一是LUS:即由CN1763087A提供的luffina的242個(gè)氨基酸序列)進(jìn)行序列同源性比較，LAI與LUA只有5個(gè)殘基不同，LAI與LUS有5個(gè)殘基不同(不包括LUS的C端缺少的5個(gè)殘基)，見(jiàn)圖l。比較表明這三者之間同源性很強(qiáng)，但由于來(lái)源于不同的種而有所差別。將八棱絲瓜蛋白1全長(zhǎng)氨基酸序列與已報(bào)道的幾種具有抗腫瘤，抗病毒，特別是抗艾滋病毒活性的類(lèi)型1核糖體失活蛋白進(jìn)行同源性比較，其中與LUA(SwissPort蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)登陸號(hào)為Q00465,gil32590)相比較，相同的占97%，相似的占98X;與LUB(登陸號(hào)為P22851,gil32591)相比較，相同的氨基酸殘基占80%,相似的氨基酸殘基占88%;與MMA(登陸號(hào)為P16094,gil32578)相比較，相同的占71%，相似的占81X;與BRY(登陸號(hào)為P33185，gil2644214)相比較，相同的占64X，相似的占79X;與TCS(登陸號(hào)為P132599，gil32599)相比較，相同的占62%，相似的占76X;與匪B(登陸號(hào)為P29339gil32581)相比較，相同的氨基酸殘基占53%，相似的氨基酸殘基占71%。并且這7種蛋白一起比較，同一位置7種蛋白序列都相同的殘基共91個(gè)，占36.8%見(jiàn)圖2。同一位置6種蛋白序列都相同的殘基共54個(gè)，同一位置6種以上蛋白都相同的殘基共145個(gè)，占58.7%。晶體學(xué)研究表明，組成蛋白活性中心位點(diǎn)的氨基酸殘基為T(mén)yr(Y)70，Tyr(Y)111，Glu(E)160，Arg(R)163(標(biāo)記氨基酸殘基的數(shù)字以TCS為標(biāo)準(zhǔn))，及其周?chē)陌被釟埢际窍嗤模@就從蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)和晶體結(jié)構(gòu)(三級(jí)結(jié)構(gòu))上闡明了八棱絲瓜蛋白1具有抗腫瘤，抗病毒，特別是抗艾滋病毒活性，并為蛋白質(zhì)的改造和構(gòu)造免疫毒素提供了關(guān)鍵技術(shù)。同時(shí)，這幾種RIP各自所具有不同的氨基酸殘基，及其在不同位置所帶(或不帶)的不同數(shù)量的糖基，構(gòu)成了各自不同的分子表面電荷基團(tuán)和抗原決定簇，這就為八棱絲瓜蛋白1的結(jié)構(gòu)和功能研究提供了技術(shù)平臺(tái)。尤其是八棱絲瓜蛋白1具有對(duì)腫瘤細(xì)胞誘導(dǎo)分化作用，本發(fā)明提供了重要的結(jié)構(gòu)信息。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下積極效果本發(fā)明提供了八棱絲瓜蛋白1的成熟蛋白的全長(zhǎng)氨基酸序列及其編碼基因的核苷酸序列。本發(fā)明提供了八棱絲瓜蛋白1在制備抗腫瘤，抗病毒，特別是抗艾滋病毒的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明所提供的方法與傳統(tǒng)的cDNA測(cè)序方法相比更快速、方便。圖1:八棱絲瓜蛋白1(LA1)247個(gè)氨基酸序列與絲瓜蛋白a(LUA,LUS)氨基酸序列比較，同一位置有蛋白序列不一樣的殘基以陰影標(biāo)出。圖2:八棱絲瓜蛋白1(LA1)247個(gè)氨基酸序列與天花粉蛋白(TCS)、白瀉根蛋白(BRY)，a，p-苦瓜蛋白(MMA，MMB)和絲瓜蛋白a,b(LUA,LUB)氨基酸順序比較，其中7個(gè)蛋白氨基酸殘基都一樣的以陰影標(biāo)出。具體實(shí)施方式實(shí)施例l:八棱絲瓜蛋白l(Luffaculin1,簡(jiǎn)稱(chēng)LA1)的氨基酸順序測(cè)定a、引物設(shè)計(jì)在對(duì)已知葫蘆科植物核糖體失活蛋白系統(tǒng)比較的基礎(chǔ)上，選取上下游高度保守的氨基酸序列和核苷酸順序及其密碼子的偏愛(ài)性設(shè)計(jì)引物，為了提高PCR正確性及其得率盡量避免使用簡(jiǎn)并引物(同時(shí)設(shè)計(jì)多條引物進(jìn)行篩選)，其中正確的引物如下-上游引物，5，-GATGTGAGCTTCAGTTTGTC-3，下游引物，5，—[A/G]TTTAGAAGCM[C/T]TGGATGT-3，b、總DNA的提取試劑天根公司的植物基因組DNA提取試劑盒液氮、e-巰基乙醇、氯仿、無(wú)水乙醇取自己培育的八棱絲瓜苗第一片真葉100mg置于預(yù)冷的研缽中，加入液氮迅速研磨成粉末狀加到離心管中，按照植物基因組DNA提取試劑盒的操作說(shuō)明提取八棱絲瓜蛋白的基因組DNA。c、PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為超純水39.3u1IOXPCR緩沖液(含15mMMg+)5uld,s(2.5mM)4u1上游引物(100uM)0.2ul下游引物(100uM)0.2"1總薩1u1PfuDNA聚合酶(250U)0.3u1總體積50ul反應(yīng)程序?yàn)槭紫饶０?4'C變性2min，然后進(jìn)行35個(gè)循環(huán)包括94'C變性50s，49。C退火45s，72。C延伸lmin30s，最后再延伸10min結(jié)束PCR反應(yīng)。d、瓊脂糖凝膠電泳及DAN片段回收按照《精編分子生物學(xué)試驗(yàn)指南》(北京科學(xué)出版社，1998)中的操作說(shuō)明進(jìn)行。e、測(cè)序公司測(cè)定核苷酸順序，由此推斷八棱絲瓜蛋白1的氨基酸順序。實(shí)施例2:質(zhì)譜測(cè)定八棱絲瓜蛋白1精確分子量本發(fā)明提純了八棱絲瓜蛋白1(Luffaculin1，簡(jiǎn)稱(chēng)LA1)，并在生物質(zhì)譜儀上測(cè)定了它的精確分子量為27960Da(ESI-MS)，或27893Da(MALDI-TOF-MS測(cè)定)。同時(shí)測(cè)定了絲瓜蛋白a(Luffina簡(jiǎn)稱(chēng)LUA)精確分子量為27871Da(ESI-MS)。晶體學(xué)石開(kāi)究表明八棱絲瓜蛋白1在Asn77和Asn84以N-0鍵各連接一個(gè)N—乙酰葡萄糖苷，而Islam等(IslamMR，NishidaH，F(xiàn)unatsuG.CompleteAminoAcidSequenceofUiffin-a，aribosome—inactivatingProteinfromtheSeedsofSpongeGourd(Z〃/!fac/iiW".ca2)[J].Agric.Biol.Chem.1990542967-2978)研究表明，絲瓜蛋白a在Asn28，Asn33，Asn77，Asn84，和Asn227各連結(jié)一個(gè)N-乙酰葡萄糖苷。這從分子量和所帶的糖鏈方面顯示了2種蛋白的差別。序列表〈110〉中國(guó)科學(xué)院福建物質(zhì)結(jié)構(gòu)研究所〈120〉八棱絲瓜蛋白l及其編碼基因〈160〉2〈170〉PatentlnVersion2.1〈210〉1〈211〉247〈212〉PRT〈213〉葫盧科植物絲瓜屬八棱絲瓜種(Luffaacutangula)〈400〉1AspValSerPheSerLeuSerGlySerSerSerThrSerTyrSerL>ys151015PhelieGlyAspLeuArgLysAlaLeuProSerAsnGlyThrValTyr202530AsnlieThrLeuLeuLeuSerSerAlaSerGlyAlaSerArgTyrThr354045<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>235240200710008401.1225230AsnTyrLysGinAsnValAla245〈210〉2〈211〉663〈212〉腿〈213〉葫戸科植物絲瓜屬八棱絲瓜種(Luffaacutangula)〈400〉1ctgaggaaggctcttccatctaatgggacagtctacaacataactctcttactctcctctgcctcgggcgtactttttcaacgagtctgatgctaaattagcttctcaatacgtattcaaaggtagcaccatcgtcacgcttccatattctggcaattacgaaaagcttcaaactgctgcaggcaagataagagagaagattccactgggattcccagctttggacagtgcgattaccaccttgtttcattacgattccacggctgctgctgcagcattcctcgtaatcattcagaccactgctgagtcttcgagattcaagtatatcgagggacagattattgagagaatttcgaaaaacggggtgccgagtctggcgactataagtttagaaaacgaatggtctgctctctccaaacaaattcagttggcacagacgaataacggaacgtttaaaactcccgttgtgataatggacgataaaggccaaa^t6012018024030036042048054060066066權(quán)利要求1.一種從八棱絲瓜(Luffaacutangula)種子中提取的核糖體失活蛋白-八棱絲瓜蛋白1，其特征在于，具有序列表中的SEQIDNo1氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)。2.編碼權(quán)力要求l所述的八棱絲瓜蛋白l的基因，其特征在于，具有序列表中的SEQIDNo:2核苷酸序列的基因。3.根據(jù)權(quán)力要求1的一種八棱絲瓜蛋白1，其特征在于，該蛋白作為制備抗腫瘤，抗病毒，特別是抗艾滋病毒藥物的應(yīng)用。全文摘要八棱絲瓜蛋白1及其編碼基因，涉及生物化學(xué)中一種核糖體失活蛋白。本發(fā)明公開(kāi)了從八棱絲瓜(Luffaacutangula)種子中提取的一種核糖體失活蛋白--八棱絲瓜蛋白1(Luffaculin1)的成熟蛋白的氨基酸序列及其編碼基因的核苷酸序列。一級(jí)結(jié)構(gòu)和晶體結(jié)構(gòu)分析表明它是類(lèi)型1核糖體失活蛋白，具有抗腫瘤，抗病毒，特別是抗艾滋病毒作用，為獲得藥用蛋白質(zhì)或制備免疫毒素提供關(guān)鍵技術(shù)。文檔編號(hào)C07K14/415GK101215326SQ20071000840公開(kāi)日2008年7月9日申請(qǐng)日期2007年1月4日優(yōu)先權(quán)日2007年1月4日發(fā)明者侯曉敏,陳明晃申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院福建物質(zhì)結(jié)構(gòu)研究所