人glp-1模擬體、組合物、方法和用途的制作方法

文檔序號：3476204閱讀：3552來源：國知局

專利名稱：人glp-1模擬體、組合物、方法和用途的制作方法
人GLP-l才莫擬體、組合物、方法和用途
背景技術：
發(fā)明領域
本發(fā)明涉及對有生物活性的蛋白、片段或配體具有特異性的哺乳動
物GLP - 1模擬體(mimetibody )、特定部分或變體，GLP - 1模擬體編碼核酸和互補核酸、宿主細胞，及其制備和使用方法，包括治療制劑、施用和裝置。
背景技術：
重組蛋白是一類新興的治療劑。這種重組體療法在蛋白質制劑和化學修飾方面已取得了進展。這種修飾可潛在地增強治療性蛋白質的治療效用，例如通過延長半衰期(例如，通過阻礙其暴露于蛋白水解酶)，增強生物活性或減少有害副作用。一種這樣的修飾是利用被融合至受體蛋白，如enteracept的免疫球蛋白片段。人們也曾利用Fc區(qū)構建治療性蛋白質，試圖提供較長的半衰期或整合諸如Fc受體結合、A蛋白結合和補體結合的功能。
糖尿病是一種正在發(fā)展的流行病，到2025年其估計感染超過3億人，還沒有有效的藥物治療方法。2型糖尿病占所有病例的90 - 95%。持續(xù)提高的血糖水平導致的并發(fā)癥包括心血管病、腎病、神經病和浮見網膜病。另外，在2型糖尿病的后期，胰臟的p-細胞死亡，因此停止分泌胰島素?，F(xiàn)在對于糖尿病的治療與各種各樣的副作用相聯(lián)系，所述的副作用包括低血糖和體重增加。另外，現(xiàn)在對于2型糖尿病的治療不能治愈疾病，而是筒單地延長時間直到病人需要胰島素療法為止。
胰高血糖素樣肽-1 (GLP-1)是一種在口服葡萄糖刺激之后由腸 L -細胞分泌的含有37個氨基酸的肽。隨后在第6位和第7位之間的內源性裂解產生了有生物活性的GLP - 1 (7-37)肽。GLP - 1 (7-37) 肽序列可以分為兩個結構域。肽的氨基酸末端結構域參與信號活動，而肽的其余部分看來似乎以螺旋構象與GLP- 1受體胞外環(huán)結合。對葡萄糖作出應答，活性GLP- 1與胰臟的GLP - 1受體結合，并導致胰島素分泌的增加(促胰島素活性)。另外，已經證明GLP-1減少胃排空'
其減少釋放到循環(huán)中的葡萄糖的量，并可能減少食物攝入。這些作用組合起來就降低了血糖水平。也已經證明GLP- 1抑制細胞凋亡，促進胰
臟中-細胞的增殖。因此，GLP-1是糖尿病患者降低血糖和保護胰臟 -細胞的有吸引力的治療劑。另夕卜，GLP-1的活性受血糖水平的控制。當血糖水平降低到某一閾值水平時，GLP-1無活性。因此，沒有發(fā)生與GLP - 1治療相關的低血糖癥的危險。
臨床上已經證明了 GLP - 1治療的可行性。六周的GLP - 1注射有效地降低了 2型糖尿病患者空腹血糖水平和8小時平均血糖水平。GLP -1治療也導致e -細胞功能的改善。目前在臨床試—驗中Exenatide是一種GLP - 1類似物。首先在希拉毒蜥(gila monster)唾液中鑒定出 Exenatide,其與GLP - 1有53%的同源性。Exenatide能結合GLP - 1受體，并起始由GLP-1 (7-37)引起的負責多種活性的信號傳導級聯(lián)。迄今為止，其已被證實能降低2型糖尿病患者的HbAlc水平和血清果糖胺水平。另外，其抑制健康受檢志愿者的胃排空，并且抑制他們的食物攝入。
但是，GLP-1在體內被蛋白酶二肽基肽酶IV (DPP-IV)所迅速失活。因此，涉及GLP-1肽的治療的用途受到了它們的迅速清除和短半衰期的限制。例如，GLP-1(7-37)的血清半衰期僅僅為3-5分鐘。當皮下給藥時，GLP-1 (7-36)酰胺的作用時間為約50分鐘。甚至抗內源性蛋白酶裂解的類似物和衍生物也沒有足夠長的半衰期以避免在 24小時的時間段中重復給藥。例如，Exenatide抗DPP-IV,然而由于其在體內藥物動力學中的短半衰期和顯著的變異性，仍然需要每日兩次餐前定量給藥。在臨床試驗普遍使用的另一種化合物NN2211,是一種富含脂質的GLP - 1類似物。它被認為能每日一次定量給藥。
當需要在長時間內維持治療劑的高血液水平時，治療劑的迅速清除是不方便的，因為必需重復給藥。此外，長效化合物對于過去的治療方案只包括口服藥物的糖尿病患者特別重要。這些患者通常對于包括多次藥物注射的方案具有極為困難的時間過渡。具有增長的半衰期的GLP-1治療相對其它開發(fā)中的GLP - 1肽和化合物而言具有明顯的優(yōu)勢。
因此，需要提供GLP-1治療性蛋白質的改良和/或修飾型，以克服上述一個或多個難題，以及本領域已知的其它難題。^t擬體技術為肽療法提供了新的遞送平臺。GLP-1模擬體就可以提供以持續(xù)的方式來遞
送GLP- 1肽的方法，提供了對目前開發(fā)中的GLP- 1肽進行的改進。此外，基于其二聚體結構和組織分布特性，GLP-1模擬體對于胰島素分泌、(3 -細胞保存和食物攝入有可辨的特征。
發(fā)明概述
如此處所描述和/或實現(xiàn)的內容，并結合本領域所已知的內容，本發(fā) 明提供了人GLP - 1模擬體，包括修飾的免疫球蛋白、裂解產物和其它特定部分及其變體，也提供了 GLP-l模擬體組合物、編碼或互補核酸、載體、宿主細胞、組合物、制劑、裝置、轉基因動物、轉基因植物，及其制備和應用方法。
本發(fā)明也提供了如此處所描述和/或本領域已知的至少一種分離 GLP - 1模擬體或特定部分或變體。該GLP- 1模擬體可任選地包含至少一個CH3區(qū)，該CH3區(qū)與至少一個CH2區(qū)直>|妻相連，該CH2區(qū)與至少一個鉸鏈區(qū)或其片段(H)直接相連，該鉸鏈區(qū)或其片段與至少一個部分可變區(qū)(V)直接相連，該部分可變區(qū)與任意接頭序列(L)直接相連，該接頭序列與至少一個GLP-1治療性肽(P)直接相連。
在一對CH3 - CH2 -鉸鏈-部分V區(qū)序列-接頭-治療性肽序列的一種優(yōu)選實施方案中，該對序列任選地通過締合或共價鍵連接，例如，但不僅限于至少一個Cys - Cys 二硫鍵連接或至少一個CH4或其它免疫球蛋白序列。一種實施方案中，GLP-1模擬體包括式(I): a. (P(n) - L(o) - V(p) - H(q) - CH2(r) - CH3(s))(t), 其中P為至少一個具有生物活性的GLP-1肽、變體或衍生物，L為至少一個接頭序列，其可以是通過使模擬體具有可選取向和結合特性，從而提供了結構柔性的多肽，V為免疫球蛋白可變區(qū)C-末端的至少一個部分，H為免疫球蛋白可變鉸鏈區(qū)的至少一個部分，CH2為免疫球蛋白 CH2恒定區(qū)的至少一個部分，CH3為免疫球蛋白CH3恒定區(qū)的至少一個部分，n為1 - 10的整lt， o、 p、 q、 r、 s和t可獨立地為0-10的整數(shù)，模擬不同類型的免疫球蛋白分子，例如，但不僅限于IgGl、 IgG2、 IgG3、 IgG4、 IgAl、 IgA2、 IgM、 IgD、 IgE等，或其亞類等，或其組合。
抗體序列的可變區(qū)可以是，但不僅限于SEQIDNO: 47 - 55中至少一種氨基酸序列的至少一個部分，或者如表l所示的其片段，進一步可選4奪地包含如PCT/^開文本WO 05/05604 ( PCT US04/19898 )圖1 - 9
所示的相應的SEQIDNO: 1-9的至少一個置換、插入或缺失，該申請在2004年6月24日遞交，在2005年1月20日公開。CH2區(qū)、CH3區(qū) 和鉸鏈區(qū)可以是，但不僅限于SEQIDNO: 56 - 64中至少一種氨基酸序列的至少一個部分，或者如表l所示的其片段，進一步可選擇地包含如 PCT公開文本WO 05/05604 ( PCT US04/19898 )相應的SEQIDNO: 32 -40的至少一個置換、插入或缺失，該申請在2004年6月24日遞交，在2005年1月20日7〉開。
因此，本發(fā)明的GLP - 1模擬體在保持固有特性和功能的情況下，模擬了抗體或免疫球蛋白結構或功能的至少一個部分，同時還提供了一種GLP-1治療性肽及其所固有或獲得的體外、體內或原位特性或活性。采用此處描述的方法，并結合本領域已知的方法，可改變本發(fā)明抗體的多個部分和GLP - 1模擬體的治療性肽部分。
本發(fā)明也提供了此處所描述和/或本領域已知的至少一種分離GLP - 1模擬體或特定部分或變體，其中GLP - 1模擬體或特定部分或變體具有至少一種活性，例如，但不僅限于與式(I)的P部分對應的至少一種具有生物活性的GLP - 1肽或多肽的已知生物活性，如在此所描述或本領域已知的。
本發(fā)明一方面提供了至少一種分離的人GLP - 1模擬體，其包含了 SEQIDNO: l中至少一種氨基酸序列，或可選擇地具有此處描述的或本領域已知的一或多個置換、缺失或插入。另一方面，本發(fā)明中的至少一種GLP - 1模擬體或特定部分或變體模擬了對應于式(I)中的模擬體 P部分的至少一種GLP - 1肽或多肽與至少一種表位的結合，該表位包含了至少一種配體的至少1 -3個氨基酸至完整氨基酸序列，該配體例如，但不僅限于GLP-1受體或其片段，其中配體與SEQ ID NO: l的至少一部分結合，或者可選擇地與如此處所描述的或如本領域所已知的具有一個或多個置換、缺失或插入。上述至少一種GLP-1模擬體可任選地與GLP-1受體結合，該結合具有選自至少10 —9M、至少10 —1QM、至少10—"M或至少1(T^M之一的親和力。因此，可以用已知方法根據相應的活性來篩選GLP-1模擬體，例如，但不僅限于與受體或其片段的結合活性。
本發(fā)明進一步提供了本發(fā)明至少一種GLP - 1模擬體的至少一種抗
模擬體相結合。該抗獨特型抗體包括任何含有蛋白或肽的分子，該分子包含免疫球蛋白分子的至少一部分，所述部分可以是，但不僅限于重鏈或輕鏈的至少一種互補決定區(qū)(CDR)或其配體結合部分、重鏈或輕《泉可變區(qū)、重鏈或輕鏈恒定區(qū)、構架區(qū)、或其任意部分，其竟爭性結合本
發(fā)明至少一種GLP- 1模擬體的GLP- 1配體結合區(qū)。本發(fā)明的該獨特型抗體可以包括或來源于任何哺乳動物，例如，但不僅限于人、小鼠、兔、大鼠、嚙齒類動物、靈長類動物等。
本發(fā)明一方面提供了包含特定多核苷酸的分離核酸分子，與該特定多核苷酸互補的分離核酸分子，與該特定多核苷酸具有顯著同一性的分離核酸分子或與其雜交的分離核酸分子，其中該特定多核苷酸編碼至少一個GLP - 1模擬體或GLP - 1模擬體抗獨特型抗體或其特定部分或變體，并包括其至少一個特定序列、區(qū)域、部分或變體。本發(fā)明進一步提供了包含至少一種上述分離GLP - 1模擬體或GLP - 1模擬體抗遺傳型抗體的編碼核酸分子的重組載體、含上述核酸和/或重組載體的宿主細胞，以及上述GLP - 1模擬體或GLP - 1模擬體抗遺傳型抗體的核酸、載體和/或宿主細月包的制備和/或應用方法。
本發(fā)明也提供了編碼至少一種分離哺乳動物GLP- 1模擬體或GLP -1模擬體抗獨特型抗體的分離核酸；包含該分離核酸的分離核酸載體，和/或包含該分離核酸的原核或真核宿主細胞。該宿主細胞可4壬選地至少為選自COS-1、 COS —7、 HEK293、 BHK21、 CHO、 BSC-1、 Hep G2、 653、 SP2/0、 293、 HeLa、骨髓瘤或淋巴瘤細胞，或上述細胞的任意衍生、無限增殖化或轉化細胞之一的細胞。
本發(fā)明也提供了至少一種用于在宿主細胞中表達至少一種GLP - 1 模擬體或GLP - 1模擬體抗獨特型抗體的方法，該方法包括在特定條件下培養(yǎng)此處所描述的和/或本領域已知的宿主細胞，在該條件下，至少一種GLP - 1模擬體或GPL - 1模擬體抗獨特型抗體、或特定部分或變體以可檢測和/或可回收的量被表達。也提供了一種生成至少一種GLP - 1 模擬體或GLP-1模擬體抗獨特型抗體的方法，包括在體外、體內或原位條件下，翻譯GLP - 1模擬體或GLP - 1模擬體抗獨特型抗體的編碼核酸，使GLP - 1模擬體或GLP - 1模擬體抗獨特型抗體以可檢測或可回收的數(shù)量被表達。
本發(fā)明也提供了一種制備至少一種分離的人GLP- 1模擬體或GLP
-1抗獨特型抗體的方法，該方法包括提供一種宿主細胞或轉基因動物或轉基因植物，所述的宿主細胞或轉基因動物或轉基因植物能以可回收
的量表達GLP - 1模擬體或GLP - 1抗遺傳型抗體。
本發(fā)明進一步提供了用以上方法制備的至少一種GLP - 1模擬體。
本發(fā)明也提供了至少一種組合物，該組合物包含(a)此處描述的分離的GLP-1模擬體或特定部分或變體編碼核酸和/或GLP-1模擬體；和(b) —種合適的載體或稀釋劑。根據已知的方式，該載體或稀釋劑可任選為藥學可接受載體或稀釋劑。該組合物可任選地進一步包含至少一種其它的化合物、蛋白質或組合物。
本發(fā)明也提供了一種組合物，該組合物包含至少一種分離的人GLP -1模擬體和至少一種藥學可接受的載體或稀釋劑。該組合物進一步含有有效量的至少一種化合物或蛋白，該化合物或蛋白選自可檢測標記或報道分子、抗感染藥物、糖尿病或胰島素代謝相關藥物、心血管(CV) 系統(tǒng)藥物、中樞神經系統(tǒng)(CNS)藥物、自主神經系統(tǒng)(ANS)藥物、呼吸道藥物、胃腸(GI)道藥物、激素藥物、用于平衡體液或電解液的藥物、血液系統(tǒng)藥物、抗肺瘤藥物、免疫調節(jié)藥物、眼、耳或鼻藥物、局部用藥物、營養(yǎng)藥、TNF拮抗劑、抗風濕藥物、肌肉松弛劑、麻醉劑、非類固醇抗炎癥藥物(NTHE)、鎮(zhèn)痛藥、麻醉藥、鎮(zhèn)靜劑、局部麻醉劑、神經肌肉阻斷劑、抗菌劑、抗銀屑病藥、皮質類固醇、促蛋白合成類固醇、促紅細胞生成素、免疫、免疫球蛋白、免疫抑制劑、生長激素、激素替代藥物、放射性藥物、抗抑郁藥、抗精神病藥、興奮劑、哞喘藥、 P激動劑、吸入類固醇、腎上腺素或類似物、細胞因子或細胞因子拮抗劑中的至少一種。
本發(fā)明也提供了至少一種用于送遞治療或預防有效量的至少一種本發(fā)明GLP - 1模擬體或特定部分或變體的組合物、裝置和/或方法。
本發(fā)明進一步提供了至少一種GLP - 1模擬體方法或組合物，當施加治療有效量時，可用于調節(jié)或治療細胞、組織、器官、動物或患者中的至少一種GLP - 1相關狀況，和/或如本領域已知和/或此處所描述的應用于相關狀況之前、之后或期間。
本發(fā)明進一步提供了至少一種GLP - 1模擬體、特定片段或變體的方法或組合物，當施加治療有效量時，用于調節(jié)、治療或緩解細胞、組織、器官、動物或患者中的至少一種代謝、免疫、心血管、傳染性、惡
性和/或神經疾病癥狀，和/或根據多種不同情況，例如，但不僅限于在本領域已知的相關疾病或治療條件之前、之后或期間的需要而施用。
本發(fā)明進一步提供了用于方法或組合物的至少一種GLP- 1模擬體、特定片段或變體，當施加治療有效量時，用于調節(jié)、治療或緩解至少一種糖尿病或胰島素代謝相關紊亂、骨和關節(jié)紊亂、心血管紊亂、牙齒或口腔紊亂、皮膚病紊亂、耳、鼻或喉紊亂、內分泌或代謝紊亂、胃腸道紊亂、婦科紊亂、肝或膽紊亂、產科紊亂、血液紊亂、免疫或變應性紊亂、感染性疾病、肌骨骼紊亂、腫瘤紊亂、神經紊亂、營養(yǎng)紊亂、視覺紊亂、兒科紊亂、中毒紊亂、精神紊亂、腎紊亂、肺紊亂、或任何
其它已殺口的紊舌L (見，例3口， Merck Manual, 17th ed., Merck Research Laboratories, Merck and Co., Whitehouse Station, NJ( 1999),以其整
體在此引入作為參考)，根據多種不同情況，例如，但不僅限于在本領域已知的相關疾病或治療條件之前、之后或期間的需要而施用。
本發(fā)明也提供了本發(fā)明的至少一種GLP - 1模擬體的至少一種組合物、裝置和/或遞送的方法，可診斷GLP-1相關狀況。
本發(fā)明進一步提供了至少一種GLP - 1模擬體的方法或組合物，可診斷細胞、組織、器官、動物或患者中的至少一種GLP-1相關狀況，和/或如本領域已知和/或此處所描述的施用于相關狀況之前、之后或期間。
本發(fā)明也提供了用于診斷或治療細胞、組織、器官或動物中的疾病癥狀的方法，包括(a)使細胞、組織、器官或動物接觸或對其施用包含有效量的本發(fā)明至少一種分離的人GLP - 1模擬體的組合物。該方法可任選地進一步包括采用在每0-24小時、1-7天、l-52周、l-24個月、1-30年或此處描述的任何范圍或值內每千克細胞、組織、器官或動物重量施用0.001-S0mg的有效量。該方法可任選地進一步包括通過至少一種選自腸胃外、皮下、肌肉內、靜脈內、關節(jié)內、支氣管內、腹內、嚢內、軟骨內、腔內、體腔內、小腦內、腦室內、結腸內、宮頸內、胃內、肝內、心肌內、骨內、骨盆內、心包內、腹膜內、胸膜內、前列腺內、肺內、直腸內、腎內、浮見網膜內、脊柱內、滑膜內、胸內、子宮內、膀胱內、藥團、陰道、直腸、頰、舌下、鼻內或經皮的方式接觸或施用。該方法可任選地進一步包括在(a)接觸或施用之前、同時或之后施用至少一種組合物，該組合物含有有效量的至少一種特定化合
物或蛋白質，該化合物或蛋白質選自至少一種可檢測標記或報道分子、抗感染藥物、心血管(CV)系統(tǒng)藥物、中樞神經系統(tǒng)(CNS)藥物、自
主神經系統(tǒng)(ANS)藥物、呼吸道藥物、胃腸(GI)道藥物、激素藥物、用于體液或電解液平衡的藥物、血液系統(tǒng)藥物、抗腫瘤、免疫調節(jié)藥物、眼、耳或鼻藥物、局部用藥物、營養(yǎng)藥、TNF拮抗藥、抗風濕藥物、肌肉松弛劑、麻醉劑、非類固醇抗炎癥藥物(NSAID)、鎮(zhèn)痛藥、麻醉藥、鎮(zhèn)靜劑、局部麻醉劑、神經肌肉阻斷劑、抗菌劑、抗銀屑病藥、皮質類固醇、促蛋白合成類固醇、促紅細胞生成素、免疫、免疫球蛋白、免疫抑制劑、生長激素、激素替代藥物、放射性藥物、抗抑郁藥、抗精神病藥、興奮劑、哞喘藥、P激動劑、吸入類固醇、腎上腺素或類似物、細胞因子或細胞因子桔抗劑。
本發(fā)明也提供了包含本發(fā)明至少一種分離的人GLP- 1模擬體的醫(yī) 學裝置，其中該裝置適合通過至少一種選自腸胃外、皮下、肌肉內、靜脈內、關節(jié)內、支氣管內、腹內、嚢內、軟骨內、腔內、體腔內、小腦內、腦室內、結腸內、宮頸內、胃內、肝內、心月幾內、骨內、骨盆內、心包內、腹膜內、胸膜內、前列腺內、肺內、直腸內、腎內、視網膜內、脊柱內、滑膜內、胸內、子宮內、膀胱內、藥團、陰道、直腸、頰、舌下、鼻內或經皮的方式接觸或施用至少一種人GLP - 1模擬體。
本發(fā)明也提供了用于人藥物或診斷用途的制品，包括包裝材料和含有溶液或凍干形式的本發(fā)明至少一種分離人GLP- 1模擬體的容器。該制品可任選地包括將容器作為腸胃外、皮下、肌肉內、靜脈內、關節(jié)內、支氣管內、腹內、嚢內、軟骨內、腔內、體腔內、小腦內、腦室內、結腸內、宮頸內、胃內、肝內、心肌內、骨內、骨盆內、心包內、腹月蕘內、胸膜內、前列腺內、肺內、直腸內、腎內、碎見網膜內、脊柱內、滑膜內、胸內、子宮內、膀胱內、藥團、陰道、直腸、頰、舌下、鼻內或經皮送遞裝置或系統(tǒng)的一個組成部分。
本發(fā)明進一步提供了此處所描述的任何發(fā)明。

圖l說明了顯示重要功能域的IgGl支架中GLP-1MMB的核苷酸
和肽序列。
圖2A - 2C說明了 GLP - 1 MMB的FACS結合試驗。圖2A顯示了GLP - 1 MMB與過表達GLP - 1R的HEK293細胞結合。灰色區(qū)域GLP -1MMB但無二抗；灰線僅有二抗；虛線陰性對照MMB和二抗；黑線GLP-1 MMB和二抗。圖2B顯示了 GLP - 1 MMB不與對照的 HEK293細胞結合?；疑珔^(qū)域GLP - 1 MMB但無二抗；黑線僅有二抗；灰線GLP - 1 MMB和二抗。圖2C顯示了 GLP - 1肽類似物(A2S 〉能與GLP - 1 MMB竟爭性結合過表達GLP - 1R的HEK293細胞?；疑?區(qū)域GLP - 1 MMB但無二抗；黑線GLP - 1 MMB和二抗；斷裂線 GLP-1MMB、 0.2nM竟爭物、二抗；虛線GLP-1 MMB, 20 nM竟爭物、二抗；灰線GLP-1MMB、 100nM竟爭物、二抗)。
圖3A - 3E說明了 GLP - 1 MMB的cAMP試驗。圖3A: IgGl支架中的野生型GLP - 1 MMB;圖3B: GLP - 1肽；圖3C: IgG4 ( Ala/Ala, Ser —〉 Pro)支架中的GLP - 1 ( A2G ) MMB;圖3D: IgG4 (Ala/Ala， Ser - 〉 Pro )支架中的GLP — 1 ( A2S ) MMB;圖3E: IgG4 ( Ala/Ala, Ser - > Pro )支架中的野生型GLP - 1 MMB。
圖4說明了 GLP - 1 MMB對DPP - IV裂解的抗性。
圖5說明了 GLP - 1 MMB在血清中的穩(wěn)定性。
圖6表示GLP - 1 MMB導致RINm細胞的胰島素分泌。圖6A顯示 GLP - 1 ( 7 - 36 )肽和毒蜥外泌肽-4肽刺激RINm細胞的胰島素分泌。圖6B顯示在IgGl或IgG4( Ala/Ala, Ser - > Pro )支架中的GLP - l( A2S ) MMB、或在IgG4 ( Ala/Ala, Ser - 〉 Pro )支架中的GLP - 1 ( A2G ) MMB 在刺激RINm細胞的胰島素分泌中能起作用。
圖7表示GLP- 1 MMB以劑量依賴的方式(圖7B)來降低葡萄糖 (圖7A )。
圖8顯示獼f吳的四種GLP-1 MMB (A2G、 A2S、 Ex-cap和野生型)藥物代謝動力學圖。
圖9顯示糖尿病鼠的口服葡萄糖耐量試驗中GLP- 1 MMB的作用。
圖10顯示長期給藥的糖尿病鼠中GLP-1 MMB對空腹血糖的作用。
圖"顯示糖尿病鼠長期給藥后進行口服葡萄糖耐量試驗中GLP- 1 MMB的作用。
圖12顯示糖尿病鼠長期給藥后GLP - 1 MMB對減少HbAlc的作用。
圖13顯示正常獼猴的口服葡萄糖耐量試驗中GLP-1MMB對血糖 (圖UA)和胰島素(圖1SB)水平的作用。
圖14顯示在單次給藥后，GLP-1 MMB對糖尿病鼠胰島的胰島素染色的作用。
圖15說明GLP-1 MMB對正常狗延遲胃排空。
圖16說明GLP - 1 MMB在飲食誘導肥胖鼠的口服葡萄糖耐量試驗中降低血糖。
圖17說明GLP - 1 MMB在糖尿病鼠的腹膜內葡萄糖耐量試驗中降低血糖(圖HA)和降低胰島素水平(圖17B)。
圖18說明GLP- l模擬體以劑量依賴性方式抑制細胞因子誘導的凋亡。將相對于未處理對照的凋亡百分比對GLP - 1 MMB的濃度作圖。
圖19說明GLP - 1模擬體增加INS - IE細胞中的葡萄糖依賴性胰島素分泌。A.柱形圖顯示在5.5mM葡萄糖存在下，在每個GLP - 1 MMB 濃度下分泌的胰島素的量。此外，僅僅對3和7.5 mM葡萄糖時分泌的胰島素作圖。B.用分泌的胰島素的量對GLP-1 MMB的濃度作圖。數(shù) 據代入Hill公式，得到EC5o為0.07nM。
圖20說明GLP - 1模擬體增加大鼠(圖20A)和人胰島(圖20B ) 中的葡萄糖依賴性胰島素分泌。
圖21顯示GLP - 1 MMB處理對正常C57/BLK6小鼠血糖水平的影響。
圖22顯示GLP- 1 MMB處理對移才直了人胰島的邊緣團塊的STZ處理的糖尿病棵小鼠中的血糖水平(圖22A)和葡萄糖耐量(圖22B)的影響。在圖22A中，用PBS處理的對照小鼠(X)和接受每日IP注射的 GLP - 1 MMB處理的小鼠(嗎的血糖對時間(天)作圖。在第0天移植人胰島的邊緣團塊(50IEQ/g)，此后監(jiān)測動物中的血糖。箭頭表明當除去移植的胰島時，導致迅速回復到糖尿病狀態(tài)。在圖22B中，用PBS處理的對照小鼠(X)和GLP - 1 MMB(0.5 mg/kg)處理的小鼠(B)的血糖對時間 (分鐘)作圖。在小鼠接受每日IP注射持續(xù)30天以上后，進行IVGTT。使動物禁食過夜，然后進行IV葡萄糖注射(1.5g/kg)。監(jiān)測小鼠的血糖，并且對注射后的時間作圖。插圖表示對照和GLP-1 MMB處理的動物的曲線下面積。
圖23顯示GLP- 1 MMB對非人靈長動物(NHP)胰島的葡萄糖誘導
的胰島素分泌的影響。
圖24顯示GLP - 1 MMB對移植了邊緣團塊的STZ糖尿病NHPs的外源性胰島素要求(圖MA)和血紅蛋白Ale (HgbAlc)(圖MB)的影響。
發(fā)明詳述
本發(fā)明提供了分離的、重組的和/或合成的模擬體或特定部分或變體，以及組合物和包含至少一種多核苷酸的編碼核酸分子，該特定多核苷酸編碼至少一種GLP - 1模擬體。上述本發(fā)明模擬體或特定部分或變體包含了特定的GLP-1模擬體序列、區(qū)域、片段及其特定變體，且本發(fā)明也提供了上述核酸和模擬體或特定部分或變體的制備和應用方法，包括治療性組合物、方法和裝置。
本發(fā)明也提供了此處所描述和/或本領域已知的至少一種分離的 GLP - 1模擬體或特定部分或變體。該GLP - 1模擬體可任選地包含至少一個CH3區(qū)，該CH3區(qū)與至少一個CH2區(qū)直接相連，該CH2區(qū)與至少一個鉸鏈區(qū)或其片段(H)直接相連，該鉸鏈區(qū)或其片段(H)與至少一個部分可變區(qū)(V)直接相連，該部分可變區(qū)(V)與任意接頭序列 (L)直接相連，該任意接頭序列(L)與至少一個治療性肽(P)直接相連。
一種優(yōu)選實施方案中，GLP-l模擬體包含式(I):
((P(n) - L(o) - V(p) - H(q) - CH2(r) - CH3(s))(t), 其中P為至少一個具有生物活性的GLP- 1多肽，L為至少一個接頭序列，其為通過使模擬體具有可選取向和結合特性，從而提供了結構柔性的多肽，V為免疫球蛋白可變區(qū)C-末端的至少一個部分，H為免疫球蛋白可變鉸鏈區(qū)的至少一個部分，CH2為免疫球蛋白CH2恒定區(qū)的至少一個部分，CH3為免疫球蛋白CH3恒定區(qū)的至少一個部分，m、 n、 o、 p、 q、 r、 s和t可為0-10的整數(shù)，模擬不同類型的免疫球蛋白分子，例如，但不僅限于IgGl、 IgG2、 IgG3、 IgG4、 IgAl、 IgA2、 IgM、 IgD、 IgE或其亞類等，或其組合。
因此，本發(fā)明GLP - 1模擬體模擬了具有抗體固有特性和功能的抗體結構，同時提供了一種治療性肽及其所固有或獲得的體外、體內或原
位特性或活性。在t = 1時的優(yōu)選實施例中，單體CH3 - CH2 -鉸鏈區(qū)-部分J序列-接頭序列-治療性肽可通過締合或共價鍵與其它單體相連，例如，但不僅限于Cys-Cys二硫鍵。采用此處所描述的方法，并結合本領域已知的方法，可改變本發(fā)明抗體的多個部分和至少一種GLP -l模擬體的治療性肽部分。
如果保持與補救受體的結合，CH3 - CH2 -鉸鏈區(qū)的部分可以依照本發(fā)明被大量修飾來形成變體。在這樣的受體中，可以去除一個或多個天然位點，這些位點提供了非本發(fā)明融合分子所需的結構特征或功能活性?？梢酝ㄟ^例如，置換或缺失殘基，將殘基插入該位點，或截去包含該位點的部分來去除該位點。插入或置換的殘基也可以是改變的氨基酸，例如肽模擬體或D-氨基酸。CH3-CH2-鉸鏈區(qū)的變體可能缺少一個或多個天然位點或殘基，其影響或者參與(l)二硫鍵形成，(2) 與所選的宿主細胞的不相容，(3)在所選的宿主細胞中表達的不均一，
(4)糖基化作用，(5)與補體的相互作用，(6)與除補救受體以外的Fc受體的結合，或(7 )抗體依賴性細胞毒性(ADCC )。典型的CH3
-CH2 -鉸鏈區(qū)變體包含如下的分子和序列1.參與二硫鍵形成的位點
達的其它含半胱氨酸的蛋白質相反應。為了該目的，半胱氨酸殘基可被缺失或用其它的氨基酸所置換(例如丙氨酰基、絲氨?；?。即使當半胱氨酸殘基被缺失時，單鏈CH3 - CH2 -鉸鏈區(qū)結構域仍然能形成以非共價結合在一起的二聚CH3 - CH2 -鉸鏈區(qū)結構域；2.CH3 - CH2 -4交鏈區(qū)被1資飾了，以1更其與選定的宿主細胞相容。例如，當在細菌細胞，例如E.Coli中重組表達該分子時，可去除鉸鏈的PA序列，該序列在 E.Coli中可能被消化酶，例如脯氨酸亞氨基肽酶所識別；3.當在選定的宿主細胞中表達時，鉸鏈區(qū)的一部分被缺失或用其它的氨基酸所置換來避免異質性；4.一個或多個糖基化位點被去除。典型糖基化(例如天冬酰胺)的殘基參與細胞溶解反應。這樣的殘基可被缺失或用其它的非糖基化殘基所置換(例如丙氨酸)；5.參與同補體反應的位點，例如 Clq結合位點被去除了。補體募集可能對本發(fā)明中的分子不利，所以可消除這樣的變體；6.影響與Fc受體結合，而非補救受體結合的位點被去除。CH3-CH2-鉸鏈區(qū)可能具有與特定的白細胞相互作用的位點，這些位點也不是本發(fā)明的融合分子所需要的，所以可被去除；7.ADCC位
點被去除了。 ADCC位點是本領域公知的，見，例如，Molec.Immunol.29 (5 ) : 633 - 9 ( 1992 )關于IgGl中的ADCC位點。這些位點也不是本發(fā)明的融合分子所需要的，所以可被去除。
接頭多肽通過使模擬體具有可選取向和結合特性，從而提供了結構柔性。當出現(xiàn)時，它的化學結構不是關鍵的。接頭優(yōu)先由氨基酸通過肽鍵連接在一起而形成。因此，在優(yōu)選實施例中，接頭由1到20個氨基酸通過肽鍵連接在一起而形成，其中氨基酸是從20種天然存在的氨基酸中選擇出來的。這些氨基酸中的一些可以是糖基化的，其在本領域是公知的。在一個更優(yōu)選的實施例中，1到20個氨基酸是從以下氨基酸中選擇出來的，所述的氨基酸為甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸、脯氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺和賴氨酸。更優(yōu)選地，接頭由大多數(shù)空間上不受阻礙的氨基酸而形成，例如甘氨酸和丙氨酸。因此，優(yōu)選的接頭是多聚(Gly -Ser),多聚甘氨酸(特別地,(Gly)4, (Gly)5)，多聚(Gly - Ala )和多聚丙氨酸。其它接頭的特定實例是(Gly)3Lys(Gly)4(SEQ ID NO: 65), (Gly)3AsnGlySer(Gly)2 ( SEQ ID NO: 66 ) , (Gly)3Cys(Gly)4 ( SEQ ID NO: 67 )和GlyProAsnGlyGly ( SEQ ID NO: 68 )。
為了解釋以上的術語，例如，(Gly)3Lys(Gly)4的意思是Gly-Gly-Gly - Lys - Gly - Gly - Gly - Gly。也優(yōu)選Gly和Ala的組合體。此處所示的接頭是可以模仿的；在本發(fā)明范圍內的接頭可能更長，也可能包含其它殘基。
也允許非肽接頭。例如，烷基接頭，如-NH - (CH2)s - C(O)-,其中使用了 s=2-20。這些烷基連接可能進一步由非立體阻礙群來替代，如短鏈烷基(例如C廣C6)、短鏈?；Ⅺu素(例如Cl、 Br) 、 CN、 NH2、笨基等。一種典型的非肽接頭為PEG接頭，其具有100到5000 kD 的分子量，優(yōu)選100到500 kD。如前所述，可能以同4f的方式改變肽4妄頭來形成衍生物。
此處所用的"GLP-l肽"、"GLP-l肽、變體或衍生物"可以是至少一種GLP—l肽、GLP—l片l殳、GLP—l同系物、GLP—l類A乂物或GLP - 1衍生物。GLP - 1肽有從大約25個到大約45個天然存在或非天然存在的氨基酸，其與天然的GLP-1 (7-37)有足夠的同源性，以至于其通過與胰臟的(3-纟田胞上GLP-1受體結合，顯示了促胰島素活性。GLP-1 (7-37)具有SEQ ID NO: 15的氨基酸序列His - Ala - Glu - Gly - Thr - Phe - Thr - Ser - Asp - Val - Ser - Ser -Tyr - Leu - Glu - Gly - Gin - Ala - Ala - Lys - Glu - Phe - lie - Ala -Trp - Leu - Val - Lys _ Gly - Arg - Gly。
GLP - 1片段是在從GLP - 1 ( 7 - 37 )或其類似物或衍生物的N -末端和/或C-末端截去一或多個氨基酸所得到的多肽。GLP-1同系物是將一或多個氨基酸添加到GLP - 1 (7-37)或其片段或類似物的N-末端和/或C -末端的肽。GLP - 1類似物是將GLP - 1 ( 7 - 37 )的一或多個氨基酸進行修飾和/或置換的肽。GLP - 1類似物與GLP - 1 ( 7 - 37 ) 或GLP-1 (7-37)的片段具有顯著的同源性，以至于類似物具有促胰島素活性。GLP-1衍生物被定義為這樣的分子，其具有GLP-1肽或其同系物或類似物的氨基酸序列，^旦又具有其一個或多個氨基酸側基、 a-碳原子、末端氨基或末端羧基的化學修飾。
很多活性GLP - 1片段、類似物和衍生物已被本領域所知，任何這些類似物和衍生物也可以是本發(fā)明中GLP - 1模擬體的部分。本領域所公知的一些GLP - 1類似物和GLP - 1片段公開于美國專利號 5,118,666, 5,977,071和5,545,618和Adelhorst,等.，J.Biol.Chem.269: 6275 ( 1994 )。實例包4舌，但不僅限于GLP - 1 (7-34) 、 GLP - 1 (7 -35) 、 GLP-1 (7-36) 、 Gln9 - GLP - 1 (7-37) 、 D - Gln9 - GLP -1 (7-37) 、 Thrl6-Lysl8-GLP- 1 (7-37)和Lysl8-GLP- 1 (7 _37)。
"GLP - 1模擬體"、"GLP - 1模擬體部分"、或"GLP - 1才莫擬體片段"和/或"GLP-1模擬體變體"和類似模擬物，均模擬或模仿至少一種GLP-1肽、變體或衍生物的至少一種生物活性，例如，^a不4又限于體外、原位和/或優(yōu)選的體內的配體結合活性，該GLP-l肽、變體或衍生物例如但不限于至少一種的SEQ ID NO: 1。例如，合適的GLP -1模擬體、特定部分或變體也可調節(jié)、提高、改變、活化至少一種GLP -1受體的信號或其它可測定或可檢測活性。
在本發(fā)明方法和組合物中有用的GLP- 1模擬體的特征在于具有與蛋白質配體(例如GLP-1受體)結合的合適親和性，并任選和優(yōu)選地具有低毒性。具體而言，具有下述情況的GLP- 1模擬體在本發(fā)明中均有用，即其中的獨立組分，諸如可變區(qū)、恒定區(qū)(無CH1部分)和框架部分，或其任意部分(例如可變重或輕鏈的J、 D或V區(qū)的一部分；至
少一個鉸鏈區(qū)、恒定重鏈或輕鏈的至少一部分等)獨立和/或共同任選和優(yōu)選地具有低免疫原性。可應用于本發(fā)明的模擬體任選的特征在于其具有可長期治療患者，并可從良好到極佳地緩解癥狀，且毒性低的能力。低免疫原性和/或高親和性，以及其它未明特性均可能對其可實現(xiàn)的治療效果起作用。"低免疫原性"在此處被定義為在少于大約75%,或優(yōu)選
地少于大約50、 45、 40、 35、 30、 25、 20、 15、 10、 9、 8、 7、 6、 5、 4、
3、 2和/或1%經過治療的患者中出現(xiàn)顯著的HAMA、 HACA或NAHA
應答，和/或在經過治療的患者中出現(xiàn)低的滴度(采用雙抗原酶免疫測定法測定為少于大約300,優(yōu)選地少于大約IOO)(見，例如Elliott等.， Lancet 344: 1125 - 1127 ( 1994))。
效用。本發(fā)明的分離核酸可被用于生成至少一種GLP- 1模擬體、片段或其特定變體，該GLP-l模擬體、片段或其特定變體可被用于在細胞、組織、器官或動物(包括哺乳動物和人)中起作用，以調節(jié)、治療、緩解至少一種蛋白質相關狀況，幫助預防其發(fā)病，或減少其癥狀，該蛋白質相關狀況選自，但不僅限于，至少一種糖尿病相關失調、胰島素相關失調、免疫失調或疾病、心血管失調或疾病、傳染病、惡性病和 /或神經失調或疾病，以及其它已知或特定的蛋白質相關狀況。
該方法可包括對需要上述調節(jié)、治療、緩解、預防或減少癥狀、影響或機制的細胞、組織、器官、動物或患者施用有效量的特定組合物或藥物組合物，該組合物包含至少一種GLP-1模擬體或特定部分或變體。該有效量可包括單次或多次施用大約0.0001 - 500mg/kg的量，或單次或多次施用使血清濃度達0.01 - 5000ug/ml血清的量，或任意有效范圍或其中的數(shù)值，其施用和濃度測定方法均為此處所描述或相關領域已夕、口的方;條。
引證。此處所引用的全部出版物或專利由于體現(xiàn)了與本發(fā)明同時的本領域現(xiàn)狀，和/或提供了本發(fā)明的描述和實施方法，因而被完整引入作為參考。出版物指任何學術或專利出版物，或可以任意媒介格式被提供的其它任何資料，包括所有的記錄、電子或打印格式。下述參考文獻均被完整引入作為參考Ausubel，等.，ed.， Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley &Sons, Inc., NY, NY ( 1987 - 2003 ) ; Sambrook，等.,Molecular Cloning: A Laboratory Marmual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor, NY( 1989 ); Harlow and Lane, Antibodies, a Laboratory Manual,
Cold Spring Harbor, NY ( 1989); Colligan，等.，eds., Current Protocols in Immunology, John Wiley &Sons, Inc., NY ( 1994 - 2003 ) ; Colligan 等.，Current Protocols in Protein Science, John Wiley &Sons， NY, NY, (1997- 2003 )。
本發(fā)明的模擬體。GLP-1模擬體可包含至少一個CH3區(qū)，該CH3 區(qū)與至少一個CH2區(qū)直接相連，該CH2區(qū)與至少一個鉸鏈區(qū)或其片段
(H)直接相連，例如包含至少一個核心鉸鏈區(qū)，該鉸鏈區(qū)或其片段(H) 與至少一個部分可變區(qū)(V)直接相連，該部分可變區(qū)(V)與一個任選接頭序列(L)直接相連，該任選接頭序列與至少一個GLP- 1治療性肽(P)直接相連。一種優(yōu)選實施方案中，一對CH3-CH2-H-V-L
-P是通過締合或共價鍵，例如，〗旦不〗又限于Cys - Cys 二碌"建連接成對的。因此，本發(fā)明的GLP-1模擬體模擬了具有抗體固有特性和功能的抗體結構，同時提供了一種治療性肽及其在體外、體內或原位所固有或獲得的特性或活性。采用此處描述的方法，并結合本領域已知的方法，可改變本發(fā)明抗體的多個部分和至少一種GLP- 1模擬體的治療性肽部分。
本發(fā)明的模擬體與已知蛋白質相比提供了至少一種合適特性，例如，但不僅限于，延長的半衰期、提高的活性、更為特異的活性、提高的親和力、提高或降低的清除率、特選或更為合適的活性亞型、較小的免疫原性、至少一種預期治療效果被提高的質量或延長的持續(xù)時間、較少的副作用等特性中的至少一種。
式(I)的模擬體的片段可通過本領域已知和/或此處所描述的酶裂解、合成或重組技術制備。利用抗體基因也可制備多種截短形式的模擬體，在該抗體基因中一個或多個終止密碼子已被導入天然終止位點的上游。模擬體的多個部分可通過常規(guī)技術被化學連接在一起，或者通過利用遺傳工程技術被制備為鄰接蛋白。例如，可表達編碼人抗體鏈中至少一個恒定區(qū)的核酸，以生成可應用在本發(fā)明模擬體中的鄰4妻蛋白。見，例如，Ladner等.，美國專利號4,946,778和Bird, R.E.等.，Science, 242: 423 - 426 ( 1988 ),有關單《連抗體的部分。
此處所用的術語"人^t擬體"指一種抗體，其中該蛋白質的每一部分(例如GLP - 1模擬肽、C h區(qū)(例如C h 2、 C h 3 )、鉸鏈、V )基本上均被預期在人中基本無免疫原性，且僅具有較少的序列變化或變異。相對于未修飾的人抗體或本發(fā)明模擬體而言，該變化或變異任選并優(yōu)選地在人中保留或降低了免疫原性。因此，人抗體和相應的本發(fā)明 GLP- 1模擬體與嵌合或人源化抗體截然不同。應指出的是，GLP- l模擬體可由非人的動物或細胞生成，該非人的動物或細胞能夠表達人免疫
球蛋白(例如重鏈和/或輕鏈)基因。
針對合適的配體，例如分離的GLP - 1受體，或其一部分(包括合成分子，例如合成肽)，可設計出特異于其至少一種蛋白質配體的人模擬體。利用可鑒定并表征至少一種蛋白質或其部分的配體結合區(qū)或序列的已知技術，可制備上述模擬體。
一種優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的至少一種GLP - 1模擬體或特定部分或變體由至少一種細胞系、混合細胞系、無限增殖化細胞，或無限增殖化和/或培養(yǎng)細胞的克隆群體生成。采用合適的方法便可獲得無限增殖化的蛋白質生產細胞。優(yōu)選地，該至少一種GLP-1模擬體或特定部分或變體是通過提供特定核酸或載體而得以制備的，該核酸或載體含有來源自至少一個人免疫球蛋白位點的DNA，或者具有與該至少一個人免疫球蛋白位點基本上相似的序列，其中上述至少一個人免疫球蛋白位點被功能重排或可接受功能重排，上述核酸或載體可進一步包含此處所描述的模擬體結構，例如，但不僅限于式(I)，其中如本領域所已知的，C -末端可變區(qū)部分可被用作V,鉸鏈區(qū)可被用作H， CH2可被用作CH2 ， CH3可被用作CH3。
此處所用的術語"功能重排"指來源于特定免疫球蛋白位點的核酸片段，其中該片段已經歷V(D) J重組，從而生成了編碼免疫球蛋白鏈 (例如重鏈)或其任何部分的免疫球蛋白基因。功能重排的免疫球蛋白基因可通過采用合適方法直接或間接地得到鑒定，合適的方法例如，核苷酸測序、利用可退火至基因片段之間的編碼結合處的探針所進行的雜交(例如Southern印跡、Northern印跡)或采用可退火至基因片^殳之間的編碼結合處的引物對免疫球蛋白基因所進行的酶擴增(例如聚合酶鏈反應)。細胞是否生成了 GLP-1模擬體或其部分或變體也可通過合適的方法得到確定，其中該GLP-]模擬體或其部分或變體包含了特定的可變區(qū)或含特定序列(例如至少一個P序列)的可變區(qū)。
本發(fā)明的模擬體、特定部分和變體也可通過下述方法制備，即利用至少一種GLP - 1模擬體或特定部分或變體編碼核酸，以獲得轉基因動
物或哺乳動物，例如山羊、奶牛、馬、綿羊等，使其在乳汁中生成上述模擬體或特定部分或變體。采用與應用于抗體編碼序列的方法類似的已
知方法便可獲得上述動物。見，例如，但不僅限于美國專利號5,827,690; 5,849,992; 4,873,316; 5,849,992; 5,994,616; 5，565,362; 5,304,489等，這些專利均被完整引入此處作為參考。
本發(fā)明的模擬體、特定部分和變體也可另外通過下述方法制備，即利用至少一種GLP - 1模擬體或特定部分或變體編碼核酸，以獲得轉基因植物和培養(yǎng)的植物細胞(例如，但不僅限于煙草和玉蜀黍)，使其在植物部分或從中所培養(yǎng)的細胞中生成上述模擬體或特定部分或變體。一個非限制性實例，即表達重組蛋白的轉基因煙草葉已被成功地用于提供大量的重組蛋白，例如，利用誘導型啟動子。見，例如Cramer等.， Curr.Top.Microbol.Immunol.240: 95 - 118 ( 1999 )及其引用的參考文獻。同樣，轉基因玉蜀黍或谷物也已被用于以工業(yè)生產水平表達哺乳動物蛋白質，這些蛋白的生物學活性等同于由其它重組系統(tǒng)生成或由天然來源純化所得蛋白質。見，例如Hood等.，Adv.Exp.Med.Biol.464: 127- 147
(1999)及其引用的參考文獻。包括抗體片段，例如單鏈模擬體(scFv's) 在內的抗體也已被大量地從包括煙草種子和馬鈴薯塊莖在內的轉基因植物種子中生成。見，例如Conrad等.，Plant Mol.Biol.38: 101-109
(1998 )及其引用的參考文獻。因此，本發(fā)明的模擬體、特定部分和變體也可根據已知方法，利用轉基因植物而得以制備。也見，例如Fischer 等.，Biotechnol.Appl.Biochem.30: 99 — 108 ( 1999年10月)，Ma等.， Trends Biotechnol. 13: 522 - 7 ( 1995 ) ; Ma等.，Plant Physiol. 109: 341 - 6 ( 1995 ) ; Whitelam等.，Biochem.Soc.Trans.22: 940 — 944 ( 1994 ); 及上述文中所引用的參考文獻。上述參考文獻均被完整引入在此作為參考。
本發(fā)明的模擬體可以廣泛的親和性(KD)結合人蛋白質配體。一種優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明至少一種人GLP- 1模擬體可任選地以高親和性結合至少一種蛋白質配體。例如，本發(fā)明至少一種GLP-1模擬體可以等于或小于大約l(T7 M的KD,或更為優(yōu)選的，等于或小于大約0.1 -9.9 (或其中的任意范圍或數(shù)值)x 1(T7, l(T8， 10 — 9, 10 —1()， 10 —"， 10—12或1(T13M，或其中的任意范圍或數(shù)值的Ko結合至少一種蛋白質配體。
GLP - 1模擬體對至少一種蛋白質配體的親和性或親和力可通過采用任何合適方法得以實驗測定，例如用于測定抗體-抗原結合親和性或
親和力的方法。(見，例如Berzofsky,等.,在Fundamental Immunology, Paul, W.E.， Ed., Raven Press: New York, NY ( 1984)中的"Antibody —Antigen Interaction"; Kuby, Janis Immunology, W.H.Freeman and Company: New York, NY ( 1992);及其描述的方法)。不同條件(例如鹽濃度、pH)下所測定的特定GLP-l模擬體-配體相互作用的親和性不同。因此，優(yōu)選采用GLP-1模擬體和配體的標準溶液，和諸如此處所描述的或本領域已知的標準緩沖劑測定親和性及其它配體結合參數(shù)(例如Kd、 Ka、 Kd)。
核酸分子。利用此處提供的資料，采用此處描述或本領域已知的方法，可獲得諸如編碼SEQIDNO: 1和6中至少一個序列的至少90-100 %連續(xù)氨基酸以及特定抗體的至少一個部分的核苷酸序列，其中上述序列被作為式(I)的P序列插入，可獲得本發(fā)明的GLP - 1模擬體，進一步包括其特定片段、變體或一致序列，或者可獲得包含了至少一種上述序列的保藏載體，和編碼至少一種GLP - 1模擬體或特定部分或變體的本發(fā)明核酸分子。
本發(fā)明的核酸分子可以是RNA形式，i者如mRNA、 hnRNA、 tRNA 或其它任何形式，或者是DNA形式，包括，但不僅限于通過克隆或合成或它們的組合所獲的cDNA和基因組DNA。該DNA可為三鏈、雙鏈或單鏈，或三種鏈形式的任意組合。DNA或RNA的至少一條鏈的任意部分均可為編碼鏈，也是通常所說的有義4連，或者可以是非編碼《連，也被稱為反義鏈。
本發(fā)明的分離核酸分子可包括含有一個讀碼框(ORF),并任選地具有一個或多個內含子的核酸分子，含有GLP - 1模擬體或特定部分或變體的編碼序列的核酸分子；和含有與上述核苷酸序列基本上不同的核苦酸序列，但由于遺傳密碼的簡并性，仍然編碼此處所描述和/或本領域已知的至少一種GLP-1模擬體的核酸分子。當然，該遺傳密碼是本領域熟知的。因此，對本領域技術人員而言，制備編碼本發(fā)明特定GLP-1模擬體或特定部分或變體的上述簡并核酸變體是常規(guī)工作。見，例如上述Ausubel，等.，且上述核酸變體也被包括在本發(fā)明中。
如此處所指出的，包含編碼GLP - 1模擬體或特定部分或變體的核
酸的本發(fā)明核酸分子可包括，但不僅限于，自身編碼GLP- 1模擬體片
段的氨基酸序列的核酸分子；完整GLP-1模擬體或其部分的編碼序列；GLP-1模擬體、片段或部分的編碼序列，以及其它序列，諸如至少一種信號前導或融合肽的編碼序列，具有或不具有上述其它編碼序列，諸如至少一個內含子，連同其它非編碼序列，包括但不僅限于非編碼5，和3，序列，諸如在轉錄、mRNA加工中發(fā)揮作用的經轉錄的非翻譯序列，包括剪接和多腺苷酸化信號(例如_ mRNA的核糖體結合和穩(wěn)定性)；編碼其它氨基酸，諸如可提供其它功能性的氨基酸的其它編碼序列。因此，編碼GLP-1模擬體或特定部分或變體的序列可被融合至標記序列，諸如編碼特定肽的序列，該肽有助于純化含有GLP - 1模擬體片段或部分的融合GLP - 1模擬體或特定部分或變體。
與此處所描述的多核苷酸選擇性雜交的多核苦酸。本發(fā)明提供了可在選擇性雜交條件下與此處公開的多核苷酸或包括其特定變體或部分的其它多核苷酸雜交的分離核酸。因此，該實施方案的多核普酸可被用于分離、檢測和/或定量含有該多核苷酸的核酸。
低或中等嚴格性雜交條件典型地，但并不專有地應用于與互補序列相比序列同一性被降低的序列。中等和高嚴格性條件可任選地被用于較高同一性的序列。低嚴格性條件可實現(xiàn)具有大約40 - 99 %序列同一性的序列的選擇性雜交，并可被用于鑒定直向同源或共生同源序列。
任選地，本發(fā)明的多核苦酸可編碼由此處描述的多核苦酸所編碼的 GLP-1模擬體或特定部分或變體的至少一個部分。本發(fā)明的多核苦酸包含了可被用于與編碼本發(fā)明GLP- 1模擬體或特定部分或變體的多核苷酸選4奪性雜交的核酸序列。見，例如，上述Ausubel;上述Colligan, 均被完整引入此處作為參考。
核酸的構建。本發(fā)明的分離核酸可采用本領域熟知的(a)重組方法，(b)合成技術，(c)純化技術，或其組合而得以制備。
該核酸可方便地包含除本發(fā)明多核苷酸之外的序列。例如，可將包含一個或多個內切核酸酶限制位點的多克隆位點插入該核酸中，以助于分離該多核苷酸。同樣，可將可翻i奪序列插入該核酸中，以助于分離本發(fā)明的翻譯多核苷酸。例如，六組氨酸標記序列提供了純化本發(fā)明蛋白質的方便途徑。本發(fā)明核酸除了編碼序列外，任選地可作為用于克隆和 Z或表達本發(fā)明多核苦酸的載體、接合體或接頭。
其它序列也可被加入上述克隆和/或表達序列，以優(yōu)化其在克隆和/ 或表達方面的功能、以助于分離本發(fā)明多核苷酸，或促使本發(fā)明多核苷酸被導入細胞?？寺≥d體、表達載體、接合體和接頭的用途均是本領域
熟知的。見，例如上述Ausubel; 或上述Sambrook。
構建核酸的重組法。利用本領域技術人員已知的任意種克隆方法，均可從生物學來源中獲得本發(fā)明的分離核酸組合物，諸如RNA、 cDNA、基因組DNA或其任意組合。某些實施方案中，采用了在合適的嚴格性條件下可與本發(fā)明多核苷酸選擇性雜交的寡核苷酸探針，以在cDNA或基因組DNA文庫中鑒定所需要的序列。RNA的分離、cDNA和基因組文庫的構建均是本領域普通技術人員熟知的。(見，例如上述Ausubel; 或上述Sambrook)。
用于構建核酸的合成法。本發(fā)明的分離核酸也可通過已知的直接化學合成法制備(見，例如上述Ausubel，等.)?；瘜W合成通常生成單鏈寡核苷酸，通過與互補序列雜交，或通過以該單鏈為模板，采用DNA 聚合酶進行聚合，可將該單鏈寡核苷酸轉化為雙鏈DNA。本領域任何一位技術人員均會認識到，雖然DNA的化學合成可被局限于大約100個或更多堿基的序列，較長序列可通過較短序列的連接獲得。
重組表達盒。本發(fā)明進一步提供了包含本發(fā)明核酸的重組表達盒。本發(fā)明的核酸序列，例如編碼本發(fā)明GLP - 1模擬體或特定部分或變體的cDNA或基因組序列，可被用于構建特定重組表達盒，該盒可被導入至少一種理想的宿主細月包中。重組表達盒將典型地包含一皮可才喿作連4妄至特定轉錄起動調節(jié)序列的本發(fā)明多核苷酸，其中該轉錄起動調節(jié)序列將引導本發(fā)明多核苷酸在指定宿主細胞中的轉錄。異源和非異源(即內源)啟動子均可被用于引導本發(fā)明核酸的表達。
在某些實施方案中，充當啟動子、增強子或其它元件的分離核酸可被導入本發(fā)明非異源形式多核苷酸的合適位置上(上游、下游或內含子中)，以正或負調節(jié)本發(fā)明多核苷酸的表達。例如，如本領域已知，內源啟動子可通過突變、缺失和/或置換在體內或體外被改變。本發(fā)明多核普酸可按指定的有義或反義方向被表達。應當理解的是，對有義或反義方向基因表達的控制可直接影響可觀測特征。抑制的另一種方法是有義抑制。導入被設定為有義方向的核酸已被證明是阻斷目標基因轉錄的一種有效途徑。載體和宿主細胞。本發(fā)明也涉及包含本發(fā)明分離核酸分子的載體、經由該重組載體遺傳改造的宿主細胞，以及通過本領域所熟知的重組^支術對至少一種GLP- 1模擬體或特定部分或變體的制備。見，例如上述
Sambrook，等.；上述Ausubel,等.，均被完整引入此處作為參考。
本發(fā)明多核苷酸可任選地被連接至特定載體，該載體含有用于在宿主內增殖的可選擇標記。通常，采用合適的已知方法，諸如電穿孔和類似的其它已知的方法將質粒載體導入細胞，其它已知方法包括利用可作為沉淀物的載體，如磷酸鈣沉淀物，或與帶電荷脂質形成復合體的載體。如果該載體為病毒，可采用合適的包裝細胞系將其體外包裝，并隨
后將其導入宿主細^^。
DNA插入應被操作性地連接至合適啟動子。該表達構建體可進一步
含有任選用于至少一種轉錄起始、終止，且位于轉錄區(qū)內的位點，以及用于翻i斧的核糖體結合位點。該構建體所表達成熟轉錄物的編碼部分將優(yōu)選地包括開始的翻譯起始密碼子和適當?shù)匚挥诖gmRNA末端的終止密碼子(例如，UAA、 UGA或UAG ) , UAA和UAG優(yōu)選用于哺乳動物或真核細胞表達。
表達載體可優(yōu)選，^旦也可4壬選地包括至少一種可選纟奪標記。這才羊的標記包括，例如，但不僅限于對真核細胞培養(yǎng)而言的氨甲喋呤(MTX)、二氪葉酸還原酶(DHFR，美國專利號4,399,216; 4,634,665; 4，656,134; 4,956,288; 5,149,636; 5,179,017)、氨千青霉素、新霉素(G418)、霉酚酸或谷氨酰胺合成酶(GS、美國專利號5，122，464; 5,770,359; 5,827,739 )抗性基因，和用于在E.coli和其它細菌或原核生物中培養(yǎng)的四環(huán)素或氨千青霉素抗性基因(上述專利均被完整引入此處作為參考)。用于上述宿主細胞的合適培養(yǎng)基和條件是本領域已知的。合適的載體應是熟練技術人員熟知的。將載體構建體導入宿主細胞可通過磷酸鉤轉染、DEAE-葡聚糖介導的轉染、陽離子脂質介導的轉染、電穿孔、轉導、侵染或其它已知方法實現(xiàn)。本領域諸如上述Sambrook, 1-4和 16-18章；上述Ausubel， 1、 9、 13、 15、 16章中描述了這些方法。
本發(fā)明至少一種GLP- 1模擬體或特定部分或變體均可以修飾形式被表達，諸如融合蛋白質，并且可以不僅包括分泌信號，還包括其它異源功能區(qū)。例如，一個區(qū)域的附加氨基酸，尤其是帶電荷氨基酸可被加入GLP -]模擬體或特定部分或變體的N末端，從而改善該GLP - 1模
擬體或特定部分或變體在宿主細胞中、純化期間或后續(xù)處理和保存期間的穩(wěn)定性和持久性。同樣，本發(fā)明GLP- 1模擬體或特定部分或變體也
可加入肽部分，從而有助于其純化。最終制備GLP-1模擬體或其至少
一個片段之前，可將上述區(qū)域除去。許多標準實驗室手冊，諸如上述
Sambrook, 17.29 - 17.42和18.1 - 18.74章;上述Ausubel, 16、 17和18
章中均描述了上述方法。
本領域的普通4支術人員熟知可用于表達編碼本發(fā)明蛋白質的核酸的諸多表達系統(tǒng)。
對本發(fā)明模擬體、特定部分或其變體的制備有用的細胞培養(yǎng)物實例是哺乳動物細胞。哺乳動物細胞系統(tǒng)通常為單層細胞形式，但也可采用
哺乳動物細胞懸浮液或生物反應器。本領域已發(fā)展出可表達完整糖基化蛋白的大量合適宿主細胞系，包括COS-1 (例如ATCCCRL- 1650)、 COS - 7 (例如ATCC CRL - 1651 ) 、 HEK293、 BHK21 (例如ATCC CRL
-10 ) 、 CHO (例如ATCC CRL 1610， DG - 44 )和BSC - 1 (例如ATCC CRL-26)細胞系、hepG2細胞、P3X63Ag8.653 、 SP2/0-Agl4、 293 細月包、HeLa細月包等，均可容易地從例如，American Type Culture Collection
(美國典型菌種保藏中心)，Manassas, Va獲得。優(yōu)選宿主細胞包括淋巴來源的細胞，諸如骨髓瘤和淋巴瘤細胞。尤其優(yōu)選的宿主細胞為 P3X63Ag8.653細胞(ATCC編號CRL- 1580 )和SP2/0-Agl4細胞
(ATCC編號CRL - 1851 )。
用于上述細月包的表達載體可包括一個或多個下述表達控制序列，例如，但不僅限于復制起點；啟動子(例如末期或早期SV40啟動子、CMV 啟動子(例如美國專利號5,168,062; 5,385,839 ) 、 HSVtk啟動子、pgk
(磷酸甘油酸激酶)啟動子、EF - 1 a啟動子(例如美國專利號 5,266,491 )、至少一種人免疫球蛋白啟動子)；增強子和/或加工信息位點，例如核糖體結合位點、RNA剪接位點、聚腺苷酸化位點(例如SV40 大T Ag聚腺苷酸加入位點)，和轉錄終止子序列。見，例如，上述Ausubel 等.；上述Sambrook,等.。對本發(fā)明核酸或蛋白質的制備有用的其它細月包均是已知的，和/或可A人，例j口 American Type Culture Collection Catalogue of Cell Lines and Hybridomas (美國典型菌種保藏中心細月包系和雜交瘤目錄)(www.atcc.org)或其它已知或商業(yè)來源獲得。
應用真核宿主細胞時，是將聚腺苷酸化或轉錄終止序列典型地整合
進上述載體中。終止序列的一個實例是牛生長激素基因來源的聚腺苷酸化序列。也可包括用于準確剪接轉錄物的序列。剪接序列的一個實例是
SV40來源的VP1內含子(Sprague，等.，J.Virol.45: 773 - 781 ( 1983 ))。
另外，如本領域已知，可將控制宿主細胞內復制的基因序列整合進上述載體中。
GLP - 1模擬體或特定部分或其變體的純化。GLP - 1模擬體或特定部分或變體可通過熟知的方法，包括，^旦不i^義限于蛋白A純化、石克酸4妄或乙醇沉淀、酸提取、陰離子或陽離子交換色語、磷酸纖維素色譜、疏水作用色譜、親和色譜、羥磷灰石色譜和凝集素色譜，從重組細胞中得以回收及純化。也可應用高效液相色譜("HPLC")進行純化。見，例如 Colligan, Current Protocols in Immunology,或Current Protocols in Protein Science, John Wiley &Sons, NY, NY, ( 1997- 2002),例如l、 4、 6、 8、 9、 10章，均被完整引入此處作為參考。
操作的產物，和通過重組技術從真核細胞，包括例如酵母、高等植物、昆蟲和哺乳動物細胞中獲得的產物。根據重組制備操作中應用的宿主，本發(fā)明GLP - 1模擬體或特定部分或變體可以是糖基化或非糖基化的，優(yōu)選糖基化的。許多標準實驗室手冊，諸如上述Sambrook， 17.37- 17.42 節(jié)；上述A飄bel， 10、 12、 13、 16、 18和20章,上述Colligan, Protem Science, 12 - 14章中均描述了上述方法，均被完整引入此處作為參考。
模擬體、特定片段和/或變體。本發(fā)明的分離模擬體包括由此處更完整論述的本發(fā)明任意一種多核苷酸編碼的GLP - 1模擬體或特定部分或變體，或任何分離或制備的GLP - 1模擬體或特定部分或其變體。
優(yōu)選的GLP - 1 ^t擬體或配體結合部分或變體結合了至少一個GLP -l蛋白配體，并從而提供了相應蛋白質或其片段的至少一種GLP-l 生物學活性。多種在治療或診斷方面具有重要作用的蛋白質均是本領域
對本發(fā)明而言，合適的GLP-1肽、變體或衍生物的非限制性實例如下SEQ ID NO: 1: His — Xaa2 - Xaa3 - Gly - Xaa5 - Xaa6 - Xaa7 -Xaa8 - Xaa9 - Xaa10 - Xaal 1 - Xaal2 - Xaal3 - Xaal4 - Xaal5 - Xaal6 -XaaH - Xaal8 - Xaal9 - Xaa20 - Xaa21 - Phe - Xaa23 - Xaa24 -Xaa25 — Xaa26 - Xaa27 - Xaa28 - Xaa29 - Xaa30 - Xaa31,其中Xaa2
為Ala, Gly, Ser, Thr, Leu, Ile， Val, Glu, Asp,或Lys; Xaa3為 Glu， Asp,或Lys; Xaa5為Thr, Ala, Gly, Ser, Leu， Ile, Val, Arg, His, Glu, Asp,或Lys; Xaa6為Phe, His, Trp,或Tyr; Xaa7為Thr 或Asn; Xaa8為Ser， Ala, Gly, Thr, Leu， Ile, Val, Glu, Asp,或Lys; Xaa9為Asp或Glu; XaalO為Val, Ala, Gly, Ser， Thr， Leu, Ile, Met, Tyr, Trp， His， Phe， Glu， Asp，或Lys; Xaall為Ser, Val, Ala， Gly， Thr, Leu, lie, Glu， Asp，或Lys; Xaal2為Ser, Val, Ala， Gly， Thr， Leu， Ile, Glu, Asp或Lys; Xaal3為Tyr, Phe, Trp, Glu, Asp或Lys; Xaal4為Leu, Ala， Met, Gly, Ser， Thr, Leu， Ile, Val， Glu, Asp或Lys; Xaal5為Glu, Ala, Thr, Ser, Gly, Gin, Asp或Lys; Xaal6為Gly， Ala, Ser, Thr, Leu， Ile， Val, Gln， Asn, Arg, Cys， Glu, Asp或Lys; Xaal7為Gln， Asn, Arg, His, Glu, Asp或Lys; Xaal8為Ala, Gly, Ser， Thr， Leu, Ile, Val, Arg， Glu, Asp或Lys; Xaal9為Ala, Gly, Ser， Thr， Leu, Ile, Val, Met， Glu, Asp或Lys; Xaa20為Lys， Arg, His， Gln, Trp， Tyr, Phe， Glu或Asp; Xaa21為 Glu， Leu， Ala， His, Phe， Tyr， Trp， Arg, Gln， Thr， Ser, Gly, Asp 或Lys; Xaa23為lie, Ala， Val， Leu或Glu; Xaa24為Ala， Gly， Ser， Thr, Leu， lie, Val, His, Glu， Asp或Lys; Xaa25為Trp， Phe, Tyr， Glu, Asp或Lys; Xaa26為Leu， Gly, Ala， Ser， Thr, Ile, Val， Glu， Asp或Lys; Xaa27為Val， Leu， Gly, Ala, Ser， Thr， Ile, Arg， Glu， Asp或Lys; Xaa28為Lys, Asn， Arg, His, Glu或Asp; Xaa29為Gly， Ala, Ser, Thr， Leu, Ile， Val， Arg， Trp, Tyr， Phe， Pro， His, Glu， Asp或Lys; Xaa30為 Arg， His, Thr, Ser， Trp， Tyr， Phe, Glu, Asp 或Lys;和Xaa31為Gly, Ala， Ser， Thr, Leu, lie, Val， Arg， Trp， Tyr， Phe， His, Glu， Asp, Lys。
另一組優(yōu)選的GLP-1肽、變體或衍生物的實例如下SEQIDNO: 6: His - Xaa2 - Xaa3 - Gly - Thr - Xaa6 - Xaa7 - Xaa8 - Xaa9 - XaalO -Ser - Xaal2 - Tyr - Xaal4 - Glu - Xaal6 - Xaal7 - Xaal8 - Xaal9 - Lys -Xaa21 - Phe - Xaa23 - Ala - Trp - Leu - Xaa27 - Xaa28 - Gly -Xaa30,其中Xaa2為Ala, Gly，或Ser; Xaa3為Glu或Asp; Xaa6 為Phe或Tyr; Xaa7為Thr或Asn; Xaa8為Ser， Thr或Ala; Xaa9為 Asp或Glu; XaalO為Val， Leu， Met或Ile; Xaal2為Ser或Lys; Xaal4
為Leu, Ala或Met; Xaal6為Gly， Ala, Glu或Asp; Xaal7為Gin或 Glu; Xaal8為Ala或Lys; Xaal9為Ala， Val, lie, Leu或Met; Xaa21 為Glu或Leu; Xaa23為lie, Ala, Val, Leu或Glu; Xaa27為Val或Lys; Xaa28為Lys或Asn; 和Xaa30為Arg或Glu。
這些肽可通過已/>開和/或本領域已知的方法制備。這些序列中(以及通篇該說明書中，在特定實例中如無另外指明)的Xaas包括特定的氨基酸殘基或其衍生物，或其經修飾的氨基酸。因為酶，二肽基肽酶IV (DPP-IV)可能負責GLP-1的觀測到的迅速體內失活，所以優(yōu)選在模擬體范圍內不受DPP - IV活性影響的GLP - 1肽、同系物、類似物和書亍生物。
GLP - 1模擬體或特定部分或其變體部分地或基本上優(yōu)選地提供了的至少一種GLP-1生物活性，其可結合GLP-l配體，因此提供了一種活性，該活性是通過使GLP-1與至少一種配體，例如GLP-l受體
結合，或通過其它蛋白質依賴或介導機制而被另外介導的。此處所用的術語"GLP-l模擬體活性"指根據測定可以大約20-10， 000%,優(yōu)選地以至少大約60、 70、 80、 90、 91、 92、 93、 94、 95、 96、 97、 98、 99、 100、 110、 120、 130、 140、 150、 160、 170、 180、 190、 200、 250、 300、 350、 400、 450、 500、 550、 600、 700、 800、卯O、 1000、 2000、 3000、 4000、 5000、 6000、 7000、 8000、 9000 %或更高比例調節(jié)或引起至少一種GLP - 1依賴活性的GLP - 1模擬體。
GLP - 1模擬體或特定部分或變體可提供至少一種蛋白質依賴活性的能力優(yōu)選地通過此處所描述和/或本領域已知的至少一種合適的蛋白質生物學測定而得以評定。本發(fā)明的人GLP - 1模擬體或特定部分或變體可與任何種類的免疫球蛋白(IgG、 IgA、 IgM等)或同種型相似，并可包含至少一個部分的k或入輕鏈。一種實施方案中，人GLP-l才莫擬體或特定部分或變體包含了 IgG重鏈可變片段、鉸鏈區(qū)、CH2和CH3，至少一種同種型，例如，IgGl、 IgG2、 IgG3或IgG4。
本發(fā)明至少一種GLP - 1模擬體或特定部分或變體結合了至少一種特定配體、亞單位、片段、部分或這幾項的任意組合。本發(fā)明至少一種 GLP - 1模擬體、特定部分或變體的至少一種GLP - 1肽、變體或衍生物可任選地結合配體的至少一個特定配體表位。該結合表位可包含至少一種特定氨基酸序列的任意組合，該特定氨基酸序列包含蛋白質配體的至
少1-3個氨基酸直至蛋白質配體序列的連續(xù)氨基酸的完整特定部分，該蛋白質配體諸如GLP - 1受體或其部分之一。
該模擬體可通過下述方法制備，即采用已知技術將式(I)的GLP
-1模擬體的不同部分連接在一起，通過采用已知的重組DNA技術制備并表達編碼該GLP - 1模擬體的至少一種核酸分子，或通過使用其它任何合適方法，諸如化學合成法。
采用合適方法，諸如噬菌體展示(Katsube, Y.，等.，Int.J Mol.Med, 1 ( 5 ): 863 - 868 ( 1998 ))或本領域已知和/或此處所描述的應用轉基因動物的方法，可制備與人GLP-1配體，例如受體結合，并包含確定重或輕鏈可變區(qū)或其部分的模擬體。通過利用GLP-1模擬體、特定部分或變體編碼核酸或其部分在合適宿主細月包中便可表達該GLP - 1才莫擬體、特定部分或變體。
本發(fā)明也涉及模擬體、配體結合片段和免疫球蛋白鏈，其包含與此處所描述的氨基酸序列基本相同的氨基酸序列。優(yōu)選地，該模擬體或其配體結合片段可與人GLP-1配體，例如受體高親和性地結合(例如，小于或等于大約10 — M的Kd)。與此處所描述序列基本相同的氨基酸序列包括含有保守氨基酸置換，以及氨基酸缺失和/或插入的序列。保守氨基酸置換指第一個氨基酸被具有與其相似的化學和/或物理特性(例如電荷、結構、極性、疏水性/親水性)的第二個氨基酸置換。保守置換包括在下組氨基酸范圍內，一種氨基酸被另一種氨基酸置換，即賴氨酸 (K )、精氨酸(R )和組氨酸(H );天冬氨酸(D )和谷氨酸(E ); 天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)、絲氨酸(S)、蘇氨酸(T)、酪氨酸(Y ) 、 K、 R、 H、 D和E;丙氨酸(A )、纈氨酸(V )、亮氨酸(L )、異亮氨酸(I)、脯氨酸(P)、苯丙氨酸(F)、色氨酸(W)、蛋氨酸 (M)、半胱氨酸(C)和甘氨酸(G) ; F、 W和Y; C、 S和T。
氨基酸密碼。組成本發(fā)明模擬體或特定部分或變體的氨基酸通常被縮寫。通過由氨基酸的單字母代碼、三字母代碼、名稱或本領域熟知的三個核苷酸密碼子標明該氨基酸，便可表示出該氨基酸名稱(見 Alberts, B.，等.，Molecular Biology of The Cell, Third Ed.， Garland Publishing, Ino., New York, 1994 ):
單字母三字母名稱三核苷酸密碼子代碼代碼
AAla丙氨酸GCA,GCC,GCG,GCU
CCys半胱氨酸UGC,UGU
DAsp天冬氨酸GAC,GAU
EGlu谷氨酸GAA,GAG
FPhe苯丙氨酸UUC,UUU
GGly甘氨酸GGA,GGC,GGG,GGU
HHis組氨酸CAC,CAU
Ilie異亮氨酸AUA,AUC,AUU
KLys賴氨酸AAA，AAG
Leu亮氨酸UUA,UUG,CUA,CUC， CUG,CUU
MMet蛋氨酸AUG
NAsri天冬酰胺AAC，AAU
PPro脯氨酸CCA,CCC,CCG，ecu
QGin谷氨酰胺CAA,CAG
RArg精氨酸AGA,AGG，CGA，CGC, CGG,CGU
SSer絲氨酸AGC，AGU,UCA，UCC， UCG,UCU
TThr蘇氨酸ACA,ACC,ACG，ACU
VVal纈氨酸GUA,GUC，GUG，GUU
WTrp色氨酸UGG
YTyr酪氨酸UAC,UAU
本發(fā)明的GLP- 1模擬體或特定部分或變體可以包括來自天然突變或如此處說明的人工操作的一個或多個氨基酸置換、缺失或添加。在本發(fā)明中使用的這樣的或其它的序列包括，但不僅限于表1所示的下述序列，如其所示，其與SEQIDNOS: 47 - 64的特定部分相對應，其中抗體序列的部分可變區(qū)可以是，但不僅限于SEQIDNO: 47 - 55中至少一種氨基酸序列的至少一個部分，或者如表l所示的其片段，進一步可選擇地包含如PCT公開文本WO 05/05604 ( PCT US04/19898 )圖1-9所示的相應的SEQIDNO: 1-9的至少一個置換、插入或缺失，該申請在
2004年6月24日遞交，在2005年1月20日公開。CH2區(qū)、CH3區(qū)和鉸鏈區(qū)可以是，但不僅限于SEQIDNO: 56 - 64中至少一種氨基酸序列的至少一個部分，或者如表1所示的其片段，進一步可選擇地包含如PCT 7i^開文本WO 05/05604 (PCTUS04/19898)相應的SEQIDNO: 32-40 的至少一個置換、插入或缺失，該申請在2004年6月24日遞交，在2005 年1月20日公開。當然，熟練技術人員可以進行的氨基酸置換數(shù)取決于許多因素，包括上面描述的那些因素。一般來說，至少一種GLP-1 模擬體的氨基酸置換、插入或缺失數(shù)將不超過40、 30、 20、 19、 18、 17、 16、 15、 14、 13、 12、 11、 10、 9、 8、 7、 6、 5、 4、 3、 2、 1個氨基酸，如l-30或其中的任意范圍或數(shù)值，如此處說明的。
本發(fā)明的式I ((P(n) — L(o) — V(p) - H(q) — CH2(r) - CH3(s))(t)中, 根據式I的V部分、H部分、CH2部分、CH3部分可以是任何合適的人序列或人相容序列，例如，如表1所示，其中抗體序列的部分可變區(qū)可以是，但不僅限于SEQIDNO: 47 - 55中至少一種氨基酸序列的至少一個部分，或者如表l所示的其片段，進一步可選擇地包含如PCT公開文本WO 05/05604 (PCTUS04/19898 )圖1 - 9所示的相應的SEQ ID NO: l-9的至少一個置換、插入或缺失，該申請在2004年6月24日遞交，在2005年1月20日公開。CH2區(qū)、CH3區(qū)和鉸鏈區(qū)可以是，但不僅限于SEQIDNO: 56 - 64中至少一種氨基酸序列的至少一個部分，或者如表l所示的其片^殳，進一步可選擇地包含如PCT/〉開文本WO 05/05604 (PCT US04/19898)相應的SEQ ID NO: 32 - 40的至少一個置換、插入或缺失，該申請在2004年6月24日遞交，在2005年1月20日公開，或其組合或共有序列，或其融合蛋白，當用于人體時優(yōu)選人源的或設計將免疫原性降到最小的。
P部分包含本領域已知的或此處所描述的至少一種GLP- 1治療性肽，例如但不僅限于，SEQ ID NO: l所示的序列，或其組合或共有序列，或其融合蛋白。在優(yōu)選的實施例中，P部分可包含至少一種GLP-1 肽，其具有SEQIDNO: 6的至少一種的序列，或其組合或共有序列，或其融合蛋白。
可選的接頭序列可以是本領域已知的任何合適的肽接頭。優(yōu)選的序列包含G和S的4壬何組合，例如XI - X2 - X3 - X4 - ... - Xn,其中X 可以是G或S， n可以是5-30。非限制性實例包括GS、 GGS、 GGGS (SEQIDNO: 16) 、 GSGGGS (SEQIDNO: 17) 、 GGSGGGS ( SEQ ID NO: 18 ) 、 GGSGGGSGG ( SEQ ID N〇19 )和GGGSGGGSGG ( SEQ ID NO: 20)等。
本發(fā)明的GLP- 1模擬體或特定部分或變體中的對功能來說必不可少的氨基酸可由本領域已知的方法來鑒別，例如定點突變、丙氨酸檢測誘變(例如Ausubel， supra, Chapters 8, 15; Cunningham and Wells, Science 244: 1081 - IO85 ( ))。后一種方法在分子中每個殘基上進行單個丙氨酸突變。然后測定得到的突變體分子的生物活性，例如但不僅限于此處詳細說明的或本領域已知的至少一種蛋白相關活性。對 GLP - 1模擬體或特定部分或變體的結合關鍵的位點也可用結構分析來鑒別，例如結晶、核;茲共振或光親和標記(Smith,等.，J.Mol.Biol.224: 899 -904 ( 1992)和deVos,等.，Science 255: 306 - 312 ( 1992 ))。
本發(fā)明的模擬體或特定部分或變體可以包含式(I)的P部分，例如但不僅限于SEQ ID NOS: 1和6中至少一種的至少一個部分。GLP - 1 模擬體或特定部分或變體可進一步包含與SEQIDNOS: 1和6中至少一種有至少90 - 100。/。同源性的至少一個多肽的至少一個功能部分作為式 (I)的P部分。能增強或維持如上所列的至少一種活性的非限制性變體包含，但不僅限于任何以上的多肽，進一步包含與至少一種置換、插入或缺失相應的至少一種突變，所述的置換、插入或缺失不明顯影響所述 GLP - 1模擬體的適合的生物活性或功能。
一種實施方案中，P氨基酸序列或其部分與SEQ ID NO: l和6中至少一個序列的相應部分的相應氨基酸序列具有大約90 - 100 %同一性 (即90、 91、 92、 93、 94、 95、 96、 97、 98、 99、 100或其中的4壬意范圍或數(shù)值)。優(yōu)選地，利用本領域已知的合適計算機算法確定90-100 %氨基酸同一性(即90、 91、 92、 93、 94、 95、 96、 97、 98、 99、 100 或任意范圍或其中的數(shù)值)。
本發(fā)明模擬體或特定部分或變體可包含來源于本發(fā)明GLP - 1模擬體或特定部分或變體的任意數(shù)量連續(xù)氨基酸殘基，其中該數(shù)量選自由 GLP-1模擬體中連續(xù)殘基數(shù)量的10-100%組成的整數(shù)群之一。任選
9、 10、 11、 12、 13、 14、 15、 16、 17、 18、 19、 20、 21、 22、 23、 24、 25、 26、 27、 28、 29、 30、 40、 50、 60、 70、 80、 90、 100、 110、 120、
130、 140、 150、 160、 170、 180、 190、 200、 210、 220、 230、 240、 250
或更多氨基酸，或含有其中任意范圍或數(shù)值的氨基酸。此外，該子序列的數(shù)量可為選自1-20的任意整數(shù)，諸如至少2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 11、 12、 13、 14、 15、 16、 17、 18、 19、 20或更大的整數(shù)。
技術人員應理解的是，本發(fā)明包括至少一種具有生物活性的本發(fā)明 GLP-1模擬體或特定部分或變體。具有生物活性的模擬體或特定部分或變體的特定活性為天然(非合成)、內源或相關和已知的插入或融合蛋白或特定部分或變體的活性的至少20%、 30%或40%,優(yōu)選為至少 50%、 60%或70%,最為優(yōu)選的是至少80%、 90%或95% - 1000%。
分析并定量測定酶活性和底物特異性的方法是本領域技術人員熟知的。
另一方面，本發(fā)明涉及此處所描述通過共價添加有才幾部分而一皮修飾的人模擬體和配體結合片段。該修飾可產生具有改良藥物動力學特性 (例如延長的體內血清半衰期)的GLP - 1模擬體或配體結合片段。有機部分可以是線型或分支親水聚合基團、脂肪酸基團或脂肪酸酯基團。特定實施方案中，親水聚合基團可具有大約800 -大約120,000道爾頓的分子量，并可為聚鏈烷二醇(例如聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇(PPG))、碳水化合物聚合物、氨基酸聚合物或聚乙烯吡咯烷酮，且脂肪酸或脂肪酸酯基團可包含大約8 -大約40個碳原子。
本發(fā)明的修飾模擬體和配體結合片段可包含一個或多個與GLP- 1
基團、脂肪酸基團或脂肪酸酯基團。此處所用的術語"脂肪酸"包括單羧基酸和雙羧基酸。此處所用的術語"親水聚合基團"指在水中比在辛烷中更易溶的有機聚合物。例如，聚賴氨酸在水中比在辛烷中更易溶。因此，本發(fā)明包括通過共價添加聚賴氨酸而得以修飾的GLP-1模擬體。適用于修飾本發(fā)明模擬體的親水聚合物可為線型或分支狀，且包括，例如聚鏈烷二醇(例如PEG、單甲氧基-聚乙二醇(mPEG) 、 PPG 等)、碳水化合物(例如葡聚糖、纖維素、寡糖、多糖等)、親水氨基酸的聚合物(例如聚賴氨酸、聚精氨酸、聚天冬氨酸等)、聚環(huán)氧鏈烷 (例如聚環(huán)氧乙烷、聚環(huán)氧丙烷等)和聚乙烯吡咯烷酮。優(yōu)選地，修飾本發(fā)明GLP- l模擬體的親水聚合物為單分子實體形式時，具有大約800
-大約150, 000道爾頓的分子量。例如，可采用PEG2500、 PEG5000、 PEG7500、 PEG9000、 PEG10000、 PEG12500、 PEG15000和PEG20, 000,其中下標為該聚合物的道爾頓平均分子量。
親水聚合基團可被1至大約6個烷基、脂肪酸或脂肪酸酯基團置換。被脂肪酸或脂肪酸酯基團置換的親水聚合物可通過應用合適的方法制備。例如，包含胺基團的聚合物可被偶聯(lián)至脂肪酸或脂肪酸酯的羧基上，且脂肪酸或脂肪酸酯上的活化羧基(例如經由N, N-羰基二咪唑活化)可被偶聯(lián)至聚合物上的羥基基團。
適用于修飾本發(fā)明模擬體的脂肪酸和脂肪酸酯可以是飽和或可含有一個或多個不飽和單位。適用于修飾本發(fā)明模擬體的脂肪酸包括，例如，n-十二烷酸(C12,月桂酸)、n-四癸酸(C14,肉豆蔻酸)、n
-八癸酸(C18，硬脂酸)、n-二十烷酸(C20，廿烷酸)、n-二十二烷酸(C22，山崳酸)、n-三十烷酸(C30) 、 n-四十烷酸(C40)、順
- A9-十八烷酸(C18,油酸)、所有順-A5,8,ll,14-二十四烯酸甲酯(C2Q,花生四烯酸)、辛二酸、四癸二酸、八癸二酸、二十二烷二酸等。合適的脂肪酸酯包括含有線型或分支低級烷基基團的二羧酸的單酯。較低級烷基基團可包括1至大約12個，優(yōu)選的1至大約6個碳原子。
修飾的人模擬體和配體結合片段可采用諸如，通過與一種或多種修飾劑反應的合適方法制備。此處所用的術語"修飾劑"指包含活化基團的合適有機基團(例如親水聚合物、脂肪酸、脂肪酸酯)。"活化基團" 指可在適當條件下與第二化學基團反應，從而在上述修飾劑與第二化學基團之間形成共價鍵的化學部分或功能基團。例如，胺反應性活化基團包括親電子基團，諸如曱苯磺酸酯、甲磺酸酯、鹵化(氯、溴、氟、捵)、 N-羥琥珀酰亞胺酯(NHS)等?？膳c石克醇反應的活化基團包括，例如馬來酰亞胺、碘乙酰、丙烯酰、吡啶基二硫化物、5-硫羥-2-硝基苯曱酸硫醇(TNB-硫醇)等。醛功能基團可被偶聯(lián)至含有胺-或酰肼的分子上，且疊氮基團可與三價磷基團反應，從而形成氨基磷酸酯或磚酰胺鍵。將活化基團導入分子的合適方法是本領域已知的(見，例如 Hermanson， G.T.， Bioconjugate Techniques, Academic Press: San Diego, CA( 1996 ))?；罨鶊F可被直接結合至有機基團(例如親水聚合物、脂肪酸、脂肪酸酯)，或通過接頭部分，例如二價d-Cl2基團實現(xiàn)結
合，其中一個或多個碳原子可被諸如氧、氮或硫的雜原子置換。合適的
接頭部分包括，例如四乙二醇、-(CH2)3-、 - NH - (CH2)6 - NH -、 -(CH2)2 - NH -和-CH2 - O - CH2 - CH2 - O - CH2 - CH2 - O - CH - NH -。包含接頭部分的修飾劑可通過下述方法制備，例如使單Boc(叔丁基)-烷基二胺(例如單Boc-乙烯二胺、單Boc-二氨基己烷)在1 -乙基-3- (3-雙曱基氨丙基)碳化二亞胺(EDC)的存在條件下與脂肪酸反應，從而在自由胺與脂肪酸羧酸之間形成酰胺鍵。通過下述方法可從產物中除去Boc保護基團，即采用三氟乙酸(TFA)處理，以暴露可與所述另一羧酸鹽偶聯(lián)，或可與馬來酸酐反應的伯胺，并使所獲產物環(huán)化，生成該脂肪酸被活化的馬來酰亞胺衍生物(見，例如 Thompson,等.，WO 92/16221,其完整內容被引入此處作為參考)。
本發(fā)明的修飾模擬體可通過使人GLP - 1模擬體或配體結合片段與修飾劑反應而得以生成。例如，通過應用胺反應性修飾劑，例如PEG的 NHS酯，可以無位點特異性方式將有機部分結合至GLP - 1模擬體。修飾的人模擬體或配體結合片段也可通過還原GLP - 1模擬體或配體結合片段的二硫鍵(例如鏈內二硫鍵)而得以制備。隨后，可使還原的GLP -1模擬體或配體結合片段與硫醇反應性修飾劑反應，以獲得本發(fā)明的修飾GLP-1模擬體。通過采用合適方法，諸如反向蛋白水解(Fisch 等.，Bioconjugate Chem., 3: 147 - 153 ( 1992 ); Werlen等.，Bioconjugate Chem., 5: 411 -417 ( 1994) ; Kumaran等.，Protein Sci.6 ( 10 ) : 2233 —2241 ( 1997) ; Itoh等.，Bioorg.Chem., 24 ( 1 ) : 59 — 68 ( 19%); Capellas等.，Biotechnol.Bioeng., 56 ( 4 ) : 456 - 463 ( 1997 ))和 Hermanson， G..T.， Bioconjugate Techniques, Academic Press: SanDiego， CA ( 1996 )所描述的方法，可制備含有特定有機部分的修飾人模擬體和配體結合片段，其中該特定有機部分被結合至本發(fā)明GLP-1模擬體或特定部分或變體的特定位點。
GLP-1模擬體組合物。本發(fā)明也提供了至少一種GLP-1模擬體或
特定部分或變體組合物，該組合物包含了此處所描述和/或本領域已知，以非天然存在組合物、混合物或形態(tài)被提供的至少一種、至少兩種、至少三種、至少四種、至少五種、至少六種或更多才莫
爾濃度表示。
該組合物可包括0.00001 -99.9999%的重量、體積、濃度、摩爾濃度或本領域已知或此處所描述的液體、氣體或速干劑、混合物、懸液、
乳劑或膠體形式的摩爾濃度，或其中的任意范圍或數(shù)值，例如，但不僅限于0.00001、 0.00003、 0.00005、 0.00009、 0.0001、 0.0003、 0.0005、 0.0009、 0.001、 0.003、 0.005、 0.009、 0.01、 0.02、 0.03、 0.05、 0.09、 0.1、 0.2、 0.3、 0.4、 0.5、 0.6、 0.7、 0.8、 0.9、 1.0、 1.1、 1.2、 1.3、 1.4、
1.5、 1.6、 1.7、 1.8、 1.9、 2.0、 2.1、 2.2、 2.3、 2.4、 2.5、 2.6、 2.7、 2.8、 2.9、 3.0、 3.1、 3.2、 3.3、 3.4、 3.5、 3.6、 3.7、 3.8、 3.9、 4.0、 4.3、 4.5、
4.6、 4.7、 4.8、 4.9、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 15、 20、 25、 30、 35、 40、 45、 50、 55、 60、 65、 70、 71、 72、 73、 74、 75、 76、 77、 78、 79、 80、 81、 82、 83、 84、 85、 86、 87、 88、 89、 90、 91、 92、 93、 94、 95、 96、 97、 98、 99、 99.1、 99.2、 99.3、 99.4、 99.5、 99.6、 99.7、 99.8、 99.9%。因此，本發(fā)明的該組合物包括，但不僅限于0.00001 - 100mg/ml和/或 0.00001 - 100mg/g。
該組合物可任選地進一步包括選自至少一種糖尿病或胰島素代謝相關藥物、抗感染藥物、心血管(CV)系統(tǒng)藥物、中樞神經系統(tǒng)(CNS) 藥物、自主神經系統(tǒng)(ANS)藥物、呼吸道藥物、胃腸(GI)道藥物、激素藥物、用于體液或電解液平衡的藥物、血液系統(tǒng)藥物、抗腫瘤、免疫調節(jié)藥物、眼、耳或鼻藥物、局部用藥物、營養(yǎng)藥等藥物的有效量的至少一種化合物或蛋白質。上述藥物均是本領域熟知的，包括此處所列各藥物的制劑、適應癥、劑量和施用(見，例:V Nursing 2001 Handbook of Drugs, 21 st edition, Springhouse Corp., Springhouse， PA， 2001; Health Professional's Drug Guide 2001 ， ed., Shannon, Wilson, Stang, Prentice - Hall, Inc, Upper Saddle River， NJ; Pharmcotherapy Handbook, Wells等.，ed., Appleton &Lange， Stamford, CT,均被完整引入此處作為參考)。
與糖尿病相關的藥物可以是以下藥物中的至少一種格列酮類、胰島素和衍生物、磺酰脲類、氯茴苯酸類、縮二胍、a-糖苷酶抑制劑、蛋白酪氨酸磷酸酶-lB、糖原合酶激酶3、糖異生抑制劑、丙酮酸脫氫酶激酶(PDH)抑制劑、脂肪分解抑制劑、脂肪氧化抑制劑、肉毒堿棕櫚酰轉移酶I和/或II抑制劑、P -3腎上腺受體顯效藥、鈉與葡萄糖共
輸送體(SGLT)抑制劑或具有以下一種或多種作用，至少一種作用的化合物自體免疫抑制、免疫調節(jié)、活化、增殖、T-細胞的遷移和/或抑制細胞的功能、自身反應的T細胞的去除、跨越血腦屏障的減少、促炎癥反應(Thl)和免疫調制的(Th2)細胞活素類的平衡的改變、基質金屬蛋白酶抑制劑的抑制、神經保護、神經膠質增生的減少、髓鞘再形成的促進。
抗感染藥物可為選自殺阿米巴藥或至少一種抗原生動物藥、驅腸蟲藥、抗真菌藥、抗瘧藥、抗結核藥或至少一種抗麻風藥、氨基糖苷類藥、青霉素、頭孢菌素、四環(huán)素、磺胺、氟喹諾酮、抗病毒藥、大環(huán)內酯抗感染藥、綜合性抗感染藥中的至少一種藥物。CV藥物可為選自變力性藥、抗心#:不齊藥、防心絞痛藥、抗高血壓藥、抗血脂藥、綜合性心血管藥物中的至少一種藥物。CNS藥物可為選自非麻醉性鎮(zhèn)痛藥的至少一種藥物，或選自退熱劑、非類固醇抗炎癥藥物、麻醉藥中的至少一種藥物，或至少一種阿片樣鎮(zhèn)痛藥、鎮(zhèn)靜-催眠藥、抗驚厥藥、抗抑郁藥、抗焦慮藥、抗精神病藥、中樞神經系統(tǒng)刺激劑、抗帕金森病藥、綜合性中樞神經系統(tǒng)藥物。ANS藥物可為選自膽堿能藥物(擬副交感神經藥)、抗膽堿能藥、腎上腺素能藥(擬交感神經藥)、腎上腺素能阻斷劑(抗交感神經藥)、骨骼肌松弛藥、神經肌肉阻斷劑中的至少一種藥物。呼吸道藥物可為選自抗組胺劑、支氣管舒張藥、祛痰劑中的至少一種藥物或至少一種鎮(zhèn)咳藥、綜合性呼吸藥物。GI道藥物可為選自抗酸劑的至少一種藥物，或至少一種吸附劑，或至少一種抗氣脹藥、消化酶或至少一種膽結石增溶劑、止瀉藥、輕瀉藥、止吐劑、抗?jié)兯?。激素藥物可?選自皮質激素類、雄激素中的至少一種藥物，或至少一種促同化激素類、雌激素或至少一種孕酮、促性腺激素、抗糖尿病藥物或至少一種胰高血糖素、甲狀腺激素類、甲狀腺激素類拮抗劑、垂體激素、類甲狀旁腺藥物。用于平衡體液和電解液的藥物可為選自利尿劑、電解質中的至少一種藥物或至少一種置換溶液、酸化劑或至少一種堿化劑。血液系統(tǒng) 藥物可為選自補血藥、抗凝血藥、血液衍生物、溶^全酶中的至少一種藥物?？狗瘟鏊幬锟蔀檫x自烷基化藥物、抗代謝物、抗菌素抗腫瘤藥物、可改變激素平衡的抗腫瘤藥物、綜合性抗腫瘤藥物中的至少一種藥物。免疫調節(jié)藥物可為選自免疫抑制劑、疫苗中的至少一種藥物，或至少一種類毒素、抗毒素或至少一種抗蛇毒素、免疫血清、生物反應調節(jié)物。
眼、耳和鼻用藥可為選自眼科抗感染藥、眼科抗炎癥藥、縮瞳藥、擴瞳藥、眼部血管收縮劑、綜合性眼、耳、鼻用藥中的至少一種藥物。局部用藥物可為選自局部抗感染藥、抗疥螨劑中的至少一種藥物或至少一種抗虱劑、局部皮質激素類。營養(yǎng)藥可為選自維生素、礦物質或熱質中的
至少一種藥物。見，例如上述Nursing 2001 Drug Handbook中的內容。
上述至少一種殺阿米巴藥或抗原生動物藥可為選自阿托伐醌、鹽酸氯奎、磷酸氯奎、甲硝基羥乙唑、鹽酸曱硝基羥乙唑、戊烷脒羥乙基磺酸鹽中的至少一種藥物。上述至少一種驅腸蟲藥可為選自曱苯咪唑、雙羥萘酸喹嘧咬、p塞苯咪唑中的至少一種藥物。上述至少一種抗真菌劑可為選自兩性霉素B、兩性霉素B膽固醇基硫酸鹽復合物、兩性霉素B脂質復合物、兩性霉素B脂質體、氟康唑、氟胞嘧啶、微小尺寸灰黃霉素、超微小尺寸灰黃霉素、伊曲康唑、酮康唑、制霉菌素、鹽酸特比萘芬中的至少一種藥物。上述至少一種抗癥藥可為選自鹽酸氯查、磷酸氯查、強力霉素、硫酸羥化氯奎、鹽酸甲氟奎、磷酸伯氨喹、息瘧定、含周效磺胺的息疾定中的至少一種藥物。上述至少一種抗結核藥或抗麻風藥可為選自氯苯吩。秦、環(huán)絲氨酸、氨苯砜、鹽酸乙胺丁醇、異煙肼、吡。秦酰胺、利福布汀、利福平、利福噴汀、碌^酸鏈霉素中的至少一種藥物。上述至少一種氨基糖苦類藥物可為選自硫酸丁胺卡那霉素、硫酸艮他霉素、硫酸新霉素、硫酸鏈霉素、硫酸妥布霉素中的至少一種藥物。上述至少一種青霉素可為選自阿莫西林/棒酸鉀、三水合阿莫西林、氨千青霉素、氨芐青霉素鈉、三水合氨芐青霉素、氨芐青霉素鈉/舒巴坦鈉、鄰氯苯甲異嚅唑青霉素鈉、二氯笨甲異w惡唑青霉素鈉、美洛西林鈉、乙氧萘青霉素鈉、曱苯異嚅哇青霉素鈉、千星青霉素G、青霉素G鉀、青霉素 G普魯卡因、青霉素G鈉、青霉素V鉀、氧哌嗪青霉素鈉、氧哌嗪青霉素鈉/他唑巴坦鈉、羧p塞吩青霉素二鈉、羧噻吩青霉素二鈉/棒酸鉀中的至少一種。上述至少一種頭孢菌素可為選自至少一種氯頭孢菌素、頭孢羥氨、頭孢鈉素、頭孢地尼、鹽酸頭孢吡將、頭孢克肝、氰唑甲氧頭孢鈉素、頭孢尼西鈉、氧哌羥苯唑頭鈉、頭孢p塞肝鈉、頭孢雙石克唑甲氧二鈉、虔吩曱氧頭孢鈉素、頭孢泊月虧酯、頭孢丙烯、頭孢p塞甲羧肝、頭孢布坦、頭孢唑肟鈉、頭孢三。秦噻將鈉、頭孢呋辛酯、頭孢呋辛鈉、鹽酸頭孢氨千、一水合頭孢氨千、頭孢環(huán)已烯、氯碳頭孢中的至少一種。上述至少一種四環(huán)素可為選自鹽酸地美環(huán)素、強力霉素4丐、鹽酸多西環(huán)
素、鹽酸強力霉素、一水合強力霉素、鹽酸米諾環(huán)素、鹽酸四環(huán)素中的至少一種。上述至少一種磺胺可為選自增效磺胺甲基異噴唑、磺胺嘧啶、磺胺甲基異噔、唑、磺胺二曱異^唑、磺胺乙酰異噴唑中的至少一種。上述至少一種氟喹諾酮可為選自曱磺酸阿拉曲伐沙星、環(huán)丙沙星、依諾沙星、左氧氟沙星、鹽酸洛美沙星、萘啶酸、氟哌酸、氧氟沙星、司帕沙星、曱磺酸曲伐沙星中的至少一種。上述至少一種抗病毒藥物可為選自硫酸阿巴卡韋、無環(huán)鳥苷鈉、鹽酸金剛烷胺、安普那韋、西多福韋、甲磺酸地拉維定、去羥肌苷、依非韋倫、泛昔洛韋、福米韋生鈉、磷曱酸鈉、更昔洛韋、^ u酸茚地那韋、拉米呋啶、拉米呋啶/齊多呋啶、甲石黃酸奈非那韋、內維拉平、磷酸奧司他韋、三氮唑核苷、鹽酸金剛乙胺、利托那韋、沙套那維、甲磺酸沙查那維、司他呋啶、鹽酸伐昔洛韋、扎西他濱、扎納米韋、齊多呋啶中的至少一種。上述至少一種大環(huán)內酯抗感染藥可為選自阿奇霉素、克拉霉素、地紅霉素、紅霉素基質、無味紅霉素、琥珀酸乙酯紅霉素、乳糖酸紅霉素、^^脂酸紅霉素中的至少一種。上述至少一種綜合抗感染藥可為選自氨曲南、桿菌肽、琥珀酸鈉氯霉素、鹽酸氯潔霉素、鹽酸氯潔霉素棕櫚酸酯、氯潔霉素磷酸酯、亞胺培南。和西司他丁鈉、美羅培南、呋喃妥因大晶體、呋喃妥因微晶體、查奴普丁/達福普汀、鹽酸壯觀霉素、三曱氧芐二氨嘧啶、鹽酸萬古霉素中
的至少一種。(見，例如Nursmg 2001 Drug Handbook中的24 —214頁)。上述至少一種變力性藥物可為選自乳酸氨聯(lián)吡啶酮、地高辛、乳酸米立農中的至少一種。上述至少一種抗心律失常藥可為選自腺苷、鹽酸乙胺石典吹酮、石克酸阿托品、甲苯石黃酸溴千胺、鹽酸石克氮酮、雙異丙吡胺、磷酸雙異丙吡胺、鹽酸艾司洛爾、乙酸哌氟酰胺、富馬酸伊布利特、鹽酸利多卡因、鹽酸麥西雷丁、鹽酸莫雷西。秦、苯妥英、苯妥英鈉、鹽酸普魯卡因胺、鹽酸普羅帕酮、鹽酸普奈洛爾、酸式^L酸奎尼定、葡萄糖酸奎尼定、聚半乳糖醛酸奎尼定、硫酸奎尼定、梭達羅、鹽酸妥卡尼、鹽酸異搏定中的至少一種。上述至少一種防心絞痛藥可為選自苯磺酸氨氯地平、亞硝酸戊酯、鹽酸,普地爾、鹽酸碌u氮酮、二硝酸異山梨醇酯、一硝酸異山梨醇酯、萘羥心安、鹽酸尼卡地平、硝苯吡啶、硝酸甘油、鹽酸心得安、異搏定、鹽酸異搏定中的至少一種。上述至少一種抗高血壓藥可為選自鹽酸醋丁酰心安、苯石黃酸阿姆羅赫、氨酰心安、鹽酸貝那普利、鹽酸貝他洛爾、富馬酸比索洛爾、坎地沙坦酯、卡托普利、鹽酸
山羊豆苷、卡維地洛、可樂寧、鹽酸可樂寧、二氮溱、鹽酸硫氮酮、甲磺酸多沙唑。秦、依那普利拉、馬來酸依那普利、甲磺酸依普羅沙坦、非洛地平、甲磺酸非諾多泮、福辛普利鈉、醋酸氯壓胍、硫酸胍那決爾、鹽酸谷氨法新、鹽酸肼苯噠溱、厄貝沙坦、伊拉地平、鹽酸柳胺節(jié)心定、賴諾普利、氯沙坦鉀、甲基多巴、鹽酸甲基多巴鹽、琥珀酸美多心安、酒石酸美多心安、長壓定、鹽酸莫昔普利、萘羥心安、鹽酸尼卡地平、硝苯吡啶、乳鏈菌肽、硝普鹽鈉、硫酸環(huán)戊丁心安、培哚普利、曱磺酸芬托拉明、心得靜、鹽酸哌唑溱、鹽酸普奈洛爾、鹽酸喹那普利、雷米普利、替米沙坦、鹽酸特拉唑嗪、馬來酸噻嗎心安、群多普利、纈沙坦、鹽酸異搏定中的至少一種。上述至少一種抗血脂藥可為選自阿托伐他汀 4丐、西立伐他汀鈉、膽苯烯胺、鹽酸考來替泊、非諾貝特(微粉化)、氟伐他丁鈉、吉非貝齊、洛伐他汀、煙酸、普伐他汀鈉、辛伐他汀中的至少一種。上述至少一種綜合性CV藥物可為選自阿昔單抗.、前列地爾、鹽酸阿布他明、西洛他唑、二硫酸氯吡格雷、雙嘧。底胺醇、埃替非巴肽、鹽酸曱氧胺福一木、己酮可可石成、鹽酸噻氯匹定、鹽酸替羅非班中
的至少一種(見，例如Nursmg 2001 Drug Handbook中的215-336頁)。上述至少一種非麻醉性鎮(zhèn)痛藥或退熱劑可為選自醋氨酚、阿司匹林、三水楊酸膽堿鎂、二氟苯水楊酸、水楊酸酶中的至少一種。上述至少一種非甾族抗炎癥藥物可為選自塞來昔布、環(huán)氟拉嗪鉀、環(huán)氟拉嗪鈉、伊托多雷、苯氧苯丙酸鈣、氟聯(lián)苯丙酸、異丁苯丙酸、茚曱新、三水合茚曱新鈉、酮丙酸、酮咯酸氨丁三醇、萘丁美酮、甲氧萘丙酸、甲氧萘丙酸鈉、丙嗪、吡氧噻嗪、羅非昔布、舒林酸中的至少一種。上述至少一種麻醉藥或阿片樣鎮(zhèn)痛藥可為選自鹽酸阿芬太尼、鹽酸丁丙諾啡、酒石酸布托啡諾、磷酸可待因、硫酸可待因、枸櫞酸芬太尼、芬太尼經皮系統(tǒng)、芬太尼跨粘膜、鹽酸二氳嗎啡酮、度冷丁、鹽酸美沙酮、鹽酸嗎啡、硫酸嗎啡、酒石酸嗎啡、鹽酸環(huán)丁甲羥氫嗎啡、鹽酸羥基二氫可待因酮、梳狀l， 4-羥基二氳可待因酮、鹽酸氧嗎啡酮、鹽酸鎮(zhèn)痛新、鹽酸鎮(zhèn)痛新和鹽酸納絡酮、乳酸鎮(zhèn)痛新、鹽酸丙氧吩、萘磺酸丙氧吩、鹽酸瑞芬太尼、檸檬酸舒芬太尼、鹽酸曲馬多中的至少一種。上述至少一種鎮(zhèn)痛藥-催眠藥可為選自水合氯醛、三唑氮、鹽酸氟胺安定、戊巴比妥、戊巴比妥鈉、苯巴比妥鈉、司可巴比妥鈉、雙香豆素、三唑苯二氮、扎萊普隆、酒石酸唑吡坦中的至少一種。上述至少一種抗驚厥
藥可為選自醋唑磺胺鈉、卡馬西平、氯硝安定、氯氮二鉀、安定、雙丙戊酸鈉、乙琥胺、磷苯妥英鈉、加巴噴丁、拉莫三。秦、硫酸鎂、苯巴比妥、苯巴比妥鈉、苯妥英、苯妥英鈉、苯妥英鈉(稀釋)、普里米酮、鹽酸替加賓、托吡酯、丙戊酸鈉、丙戊酸中的至少一種。上述至少一種抗抑郁藥可為選自鹽酸阿米替林、雙羥萘酸阿米替林、氯哌氧、鹽酸丁氨苯丙酮、氫淡酸西酞普蘭、鹽酸氯米帕明、鹽酸脫甲丙咪、秦、鹽酸多慮平、鹽酸氟西汀、鹽酸丙咪溱、雙羥萘酸丙咪溱、米氮平、鹽酸奈法唑酮、鹽酸去曱替林、鹽酸帕羅西汀、硫酸苯乙肼、鹽酸舍曲林、硫酸反苯環(huán)丙胺、馬來酸三曱丙咪溱、鹽酸萬拉法新中的至少一種。上述至少一種抗焦慮藥可為選自阿普唑侖、鹽酸丁螺旋酮、甲氨二氮、鹽酸曱氨二氮、氯氮二鉀、安定、鹽酸多慮平、雙羥萘酸羥。秦、鹽酸羥。秦、雙
羥萘酸羥，秦、氯羥安定、mephrobamate、鹽酸咪達唑侖、去曱羥安定中的至少一種。上述至少一種抗精神病藥可為選自鹽酸氯丙。秦、氯氮平、癸酸氟非那。秦、庚酸氟非那嗪、鹽酸氟非那。秦、氟哌啶醇、癸酸氟哌啶醇、乳酸氟哌啶醇、鹽酸克塞平、琥珀酸克塞平、苯磺酸曱砜噠溱、鹽酸莫林酮、奧氮平、奮乃靜、哌迷清、普魯氯溱、富馬酸喹硫平、利培酮、鹽酸曱硫噠溱、氨砜噻噸、鹽酸氨砜p塞化、鹽酸三氟啦噢中的至少一種。上述至少一種中樞神經系統(tǒng)刺激劑可為選自^L酸安非他明、咖啡堿、硫酸右旋安非他明、鹽酸嗎吡啉酮、鹽酸脫氧麻黃堿、鹽酸利他林、莫達非尼、佩默林、鹽酸苯丁胺中的至少一種。上述至少一種抗帕金森病藥可為選自鹽酸金剛胺、曱磺酸苯托品、鹽酸比哌立登、乳酸比哌立登、甲磺酸溴麥角環(huán)肽、卡比多巴-左旋多巴、恩他卡朋、左旋多巴、曱磺酸培高利特、二鹽酸普拉克索、鹽酸羅匹尼羅、鹽酸司來吉蘭、托卡朋、鹽酸三己芬迪中的至少一種。上述至少一種綜合性中樞神經系統(tǒng) 藥物可為選自鹽酸丁氨苯丙酮、鹽酸多奈哌齊、達哌啶醇、馬來酸氟伏沙明、碳酸鋰、檸檬酸鋰、鹽酸納雷曲坦、曱基丙烯酸煙堿(一種戒煙口香糖的活性成分)、煙堿經皮系統(tǒng)、異丙酚、苯甲酸利扎曲普坦、鹽酸西布曲明、琥珀酸舒馬普坦、鹽酸塔克林、佐米曲普坦中的至少一種。 (見，例如Nursmg 2001 Drug Handbook中的337 - 530頁)。
上述至少一種膽堿能藥(例如擬副交感神經藥)可為選自氯化氨甲酰甲膽石咸、氯化滕西隆、溴化新斯的明、甲基石克酸新斯的明、水楊酸毒扁豆堿、溴化3-二甲氨基甲酰氧基-1曱基吡啶中的至少一種。上述
至少一種抗膽堿能藥可為選自硫酸阿托品、鹽酸雙環(huán)胺、胃長寧、艮菪堿、硫酸復菪堿、溴化丙胺太林、東萊菪堿、丁基溴化東萊菪堿、氫溴化東莨菪堿中的至少一種。上述至少一種腎上腺素能藥(擬交感神經藥)可為選自鹽酸多巴酚丁胺、鹽酸多巴胺、酸式酒石酸間羥胺、酸式酒石酸去曱腎上腺素、鹽酸苯腎上腺素、鹽酸假麻黃堿、硫酸假麻黃石威中的至少一種。上述至少一種腎上腺素能阻斷劑(抗交感神經藥)可為選自曱磺酸雙氳麥角胺、酒石酸麥角胺、馬來酸二甲麥角新堿、鹽酸普奈洛爾中的至少一種。上述至少一種骨骼肌松弛劑可為選自氯苯氨丁酸、肌安寧、氯羥笨唑、鹽酸環(huán)苯扎林、硝苯呋海因鈉、氨曱酸愈甘醚酯、鹽酸替扎尼定中的至少一種。上述至少一種神經肌肉阻斷劑可為選自笨磺酸阿曲庫銨、苯磺酸順阿曲庫銨、多庫氯銨、米庫氯銨、泮庫溴銨、哌庫溴銨、雷庫溴銨、羅庫溴銨、氯琥珀膽4^、氯化筒箭毒44、維
庫溴銨中的至少一種。(見，例如Nurmg 2001 Drug Handbook中的531 -84頁)。
上述至少一種抗組胺劑可為選自馬來酸溴苯吡胺、鹽酸西替利嗪、馬來酸氯苯吡胺、富馬酸鐵線蓮亭、鹽酸二苯環(huán)庚啶、鹽酸苯海拉明、鹽酸非索非那定、氯雷他定、鹽酸異丙。秦、茶異丙。秦、鹽酸丙吡咯啶中的至少一種。上述至少一種支氣管擴張藥可為選自舒喘寧、硫酸舒喘寧、氨茶堿、硫酸阿托品、硫酸麻黃堿、腎上腺素、酒石酸氫腎上腺素、鹽酸腎上腺素、異丙托溴銨、異丙基腎上腺素、鹽酸異丙基腎上腺素、石克酸異丙基腎上腺素、鹽酸左^走沙丁胺醇、石克酸異丙喘寧、膽茶石威、醋酸吡布特羅、羥萘甲酸沙美特羅、硫酸特普他林、茶堿中的至少一種。上述至少一種祛痰劑或鎮(zhèn)咳藥可為選自退咳露、磷酸可待因、石克酸可待因、氫浹酸右美沙芬、鹽酸苯海拉明、愈創(chuàng)木酚甘油醚、鹽酸二氫嗎啡酮中的至少一種。上述至少一種綜合性呼吸藥物可為選自乙酰半胱氨酸、二丙酸氯地米+>、 beractant、布地奈德、calfactant、色甘酸鈉、《連道酶oc、前列腺環(huán)素鈉、9-去氟膚輕松、丙酸氟替卡松、孟魯司特鈉、奈多羅米鈉、帕利珠單抗、丙炎松、扎魯司特、齊留通中的至少一種。 (見Nursing 2001 Drug Handbook中的585 - 642頁)。
上述至少一種抗酸劑、吸附劑或抗氣脹藥可為選自碳酸鋁、氫氧化鋁、碳酸鈣、氫氧化鎂鋁、氫氧化鎂、氧化鎂、二曱基硅油、碳酸氫鈉中的至少一種。上述至少一種消化酶或膽結石增溶劑可為選自胰酶、胰
脂肪酶、脫氧熊膽酸中的至少一種。上述至少一種止瀉藥可為選自硅鎂土、堿式水楊酸鉍、聚卡波非釣、鹽酸氰苯哌酯或硫酸阿托品、洛哌丁胺、醋酸奧曲肽、阿片酊、阿片酊(含樟腦)中的至少一種。上述至少一種輕瀉劑可為選自bisocodyl、聚卡波非鈣、藥鼠李皮、藥鼠李皮芳香烴流浸膏、藥鼠李皮流浸膏、蓖麻油、多庫酯鈣、多庫酯鈉、甘油、半乳糖苦果糖、檸檬酸鎂、氫氧化鎂、硫酸鎂、曱基纖維素、礦物油、聚乙二醇或電解質溶液、車前子、番瀉葉、磷酸鈉中的至少一種。上述至少一種止吐劑可為選自鹽酸氯丙溱、氯茶鹼苯海拉明、曱磺?；嗬?br> 瓊、屈大麻酚、鹽酸才各4立司瓊、美克洛。秦、metocloproamide hydrochloride、鹽酸昂丹司瓊、羥哌氯丙。秦、普魯氯口秦、乙二石黃酸曱。底氯丙嗪、馬來酸甲哌氯丙嗪、鹽酸異丙嗪、東莨菪堿、馬來酸硫乙哌丙。秦、鹽酸曲美,胺中的至少一種。上述至少一種抗?jié)兯幙蔀檫x自甲氰咪胺、鹽酸曱氰咪胺、法莫替丁、羊毛二烯、米索前列醇、對氨基苯、奧美々立哇、雷貝4立哇鈉、rantidine bismuth citrate、鹽酸吹喊硝胺、碌^酸鋁中的至少一種。(見，例如Nursing 2001 Drug Handbook中的643 -95頁)。上述至少一種類固醇可為選自倍他米松、醋酸倍他米松或倍他米爭丄磷酸鈉、倍他米纟公磷酸鈉、醋酸可的松、地塞米+>、醋酸地塞米+>、地塞米+>磷酸鈉、醋酸氟氫可的松、氫化可的爭>、醋酸氫化可的杠、環(huán) 戊丙酸氫化可的^K磷酸鈉氫化可的松、氳化考的松琥珀酸鈉、甲潑尼龍、醋酸曱潑尼龍、曱氫潑尼松琥珀酸鈉、波尼松龍、醋酸強的松龍、氬化潑尼+>石舞酸鈉、prednisolone tebutate、脫氫可的+>、氟烴氳化潑尼松、去炎舒松、雙醋去炎松中的至少一種。上述至少一種雄激素或促同化激素類可為選自炔羥雄烯異唑、氟羥曱睪酮、甲基睪甾酮、癸酸諾龍、苯丙酸諾龍、睪酮、環(huán)戊丙酸睪丸甾酮、庚酸睪酮、丙酸睪丸甾酮、 estosterone經皮的系統(tǒng)中的至少一種。上述至少一種雌激素或黃體激素類可為選自酯化的雌激素、J難二醇、環(huán)戊丙酸雌二醇、雌二醇/醋炔i若酮經皮的系統(tǒng)、戊酸雌二醇、雌激素(偶聯(lián)的)、雌酮碌u酸酯"底。秦、乙炔雌二醇、乙炔雌二醇和去氧孕烯、乙炔雌二醇和雙醋炔諾醇、乙炔雌二醇和去氧孕烯、乙炔雌二醇和雙醋炔諾醇、乙炔雌二醇和左炔諾孕酮、乙炔雌二醇和炔諾酮、乙炔雌二醇和醋炔諾酮、乙炔雌二醇和炔諾肝酯、乙炔雌二醇和甲基炔諾酮、乙炔雌二醇和炔諾酮和醋酸鹽和富馬酸鐵、左炔諾孕酮、6a曱基17cx乙酸基孕甾酮、雌醇曱醚和炔諾酮、炔
諾酮、醋炔諾酮、甲基炔諾酮、孕酮。上述至少一種gonadr叩tr叩m可為選自醋酸加尼瑞克、醋酸促性腺激素釋放因子、醋酸組氨瑞林、 menotropins中的至少一種。上述至少一種抗糖尿病藥或胰高血糖素可為選自阿卡波糖、氯磺丙脲、谷胱甘肽、格列甲嗪、胰高血糖素、優(yōu)降糖、胰島素、鹽酸曱福明二曱雙胍、米格列醇、鹽酸吡咯列酮、瑞格列奈、馬來酸羅格列酮、曲格列酮中的至少一種。上述至少一種甲狀腺激素可為選自左旋甲狀腺素鈉、碘曱腺氨酸鈉、復方甲狀腺素、干甲狀腺粉中的至少一種。上述至少一種曱狀腺激素拮抗劑可為選自甲疏咪唑、碘化鉀、硤化鉀(飽和溶液)、丙硫尿嘧。定、放射性碘(碘化鈉1311)、濃碘溶液中的至少一種。上述至少一種垂體激素可為選自促腎上腺皮質激素、al-24促腎上腺皮質激素、desmophressin acetate 、乙酸亮脯利特、長效促腎上腺皮質激素、人蛋氨生長素、生長激素、加壓素中的至少一種。上述至少一種類甲狀旁腺藥物可為選自骨化二醇、降鈣素(人)、降鈣素(鮭魚)、鈣三醇、二氫速甾醇、依替膦酸鈉中的至少一種。(見，例如Nursing 2001 Drug Handbook中的696 - 796頁)。
上述至少一種利尿劑可為選自乙酰唑(磺)胺、乙酰唑(磺)胺鈉、鹽酸氨氯吡脒、丁苯氧酸、氯噻酮、利尿酸鈉、利尿酸、利尿^黃胺、雙氫氯噻嗪、茚磺苯酰胺、甘露醇、美拉托宗、安體舒通、托拉塞米、三氨苯蝶啶、脲中的至少一種。上述至少一種電解質或置換溶液可為選自乙酸鈣、碳酸鈣、氯化鈣、檸檬酸鈣、葡乳醛酸鈣、葡庚糖酸鈣、葡萄糖酸釣、乳酸4丐、磷酸4丐(二元)、磷酸鈣(三元)、葡聚糖(高分子量)、萄聚糖(低分子量)、羥乙基淀粉、氯化鎂、硫酸鎂、乙酸鉀、碳酸氫鉀、氯化鉀、葡萄糖酸鉀、Ringer氏注射液、Ringers氏注射液(乳酸化)、氯化鈉中的至少一種。上述至少一種酸化劑或堿化劑可為選自碳酸氫鈉、乳酸鈉、氨基丁三醇中的至少一種。(見，例如Nursmg2001 Drug Handbook中的797 — 833頁)。
上述至少一種補血藥可為選自富馬酸鐵、葡萄糖酸鐵、石克酸亞鐵、硫酸亞鐵(千燥)、右旋糖酐鐵、山梨醇鐵、多糖-鐵復合物、葡萄糖酸鐵鈉復合物中的至少一種。上述至少一種抗凝血劑可為選自阿地肝素鈉、達肝素鈉、達那肝素鈉、依諾肝素鈉、肝素鈣、肝素鈉、芐丙酮香豆素鈉中的至少一種。上述至少一種血液書f生物可為選自白蛋白5%、白蛋白25 % 、抗血友病因子、抗抑制劑促凝劑復合物、抗凝血酶III(人)、
IX因子(人)、IX因子復合物、血漿蛋白組分中的至少一種。上述至少一種溶血栓藥可為選自阿替普酶、阿尼鏈酶、瑞替普酶(重組)、鏈
激酶、尿激酶中的至少一種。(見，例如Nursing 2001Dmg Handbook 中的834 - 66頁)。
上述至少一種烷基化藥物可為選自白消安、卡鉑、卡氮芥、苯丁酸氮芥、順氯氨鉑、環(huán)磷酰胺、異環(huán)磷酰胺、環(huán)己亞硝脲、鹽酸氮芥、苯丙氨酸氮芥、鹽酸苯丙氨酸氮芥、鏈脲霉素、替莫唑胺、硫替派中的至少一種。上述至少一種抗代謝物可為選自卡培他濱、克拉屈濱、阿糖胞苷、氟苷、磷酸氟達拉濱、氟尿嘧啶、羥基脲、巰基嘌呤、氨甲蝶呤、氨甲蝶呤鈉、硫鳥噤呤中的至少一種。上述至少一種抗生素抗肺瘤藥物可為選自硫酸博萊霉素、放線菌素D、檸檬酸柔紅霉素脂質體、鹽酸柔紅霉素、鹽酸阿霉素、鹽酸阿霉素脂質體、鹽酸表柔比星、鹽酸伊達比星、絲裂霉素、戊糖苷、普卡霉素、戊柔比星中的至少一種。上述至少一種可改變激素平衡的抗肺瘤藥物可為選自阿那曲唑、比卡魯胺、雌二醇氮芥磷酸鈉、依西美坦、氟他胺、乙酸戈舍瑞才木、來曲唑、乙酸亮脯利特、醋酸曱地孕酮、尼魯米特、檸檬酸三苯氧胺、睪內脂、枸櫞酸托瑞米芬中的至少一種。上述至少一種綜合性抗腫瘤藥物可為選自天冬酰胺酶、桿菌Calmette - Guerm ( BCG )(活體膀胱內)、氮烯咪胺、多烯紫杉醇、鬼臼乙叉苷、磷酸鬼臼乙叉苷、鹽酸吉西他濱、鹽酸伊立替康、鄰氯苯對氯苯二氯乙烷、鹽酸米托蒽醌、紫杉醇、培加帕酶、卟吩姆鈉、鹽酸曱基下肼、利妥昔單抗、替尼泊甙、鹽酸拓樸替康、曲妥珠單抗、全反維生素A酸、硫酸長春花堿、硫酸長春花新堿、酒石酸長春瑞賓中的至少一種。(見，例如Nursmg 2001Drug Handbook中的867 -963頁)。
上述至少一種免疫抑制劑可為選自硫唑嘌呤、巴利昔單抗、環(huán)孢霉素、達克珠單抗、淋巴細胞免疫球蛋白、莫羅單抗-CD3、霉酚酸嗎啉乙酯、鹽酸霉酚酸嗎啉乙酯、西羅莫司、他克莫司中的至少一種。上述至少一種疫苗或類毒素可為選自BCG疫苗、霍亂疫苗、白喉和破傷風類毒素(吸附型)、白喉和破傷風類毒素和非細胞百日咳疫苗吸附型、白喉和破傷風類毒素和全細胞百日咳疫苗、b型嗜血桿菌結合疫苗、甲型肝炎疫苗(滅活)、乙型肝炎疫苗(重組)、流感病毒疫苗1999 - 2000 三聯(lián)型A&B(純化的表面抗原)、流感病毒疫苗1999 -2000三聯(lián)型A&B
(亞病毒體或純化的亞病毒體)、流感病毒疫苗1999 - 2000三聯(lián)型A&B (全病毒體)、日本腦炎病毒疫苗(滅活)、Lyme氏疏螺i走體病疫苗 (重組OspA)、麻滲和腮腺炎和風滲病毒疫苗(活)、麻滲和腮腺炎和風滲病毒疫苗(減活)、麻滲病毒疫苗(減活)、腦膜炎雙球菌多糖菌苗、腮腺炎病毒疫苗(活)、鼠疫疫苗、肺炎球菌疫苗(多聯(lián))、脊髓灰質炎病毒疫苗(滅活)、脊髓灰質炎病毒疫苗(活、口服、三聯(lián))、狂犬病疫苗(吸附型)、狂犬病疫苗(人二倍體細胞)、風滲和腮腺炎病毒疫苗(活)、風滲病毒疫苗(活、減活)、破傷風類毒素(吸附型)、破傷風類毒素(液體)、傷寒疫苗(口服)、傷寒疫苗(腸胃外施用)、傷寒Vi多糖疫苗、水痘病毒疫苗、黃熱病疫苗中的至少一種。上述至少一種抗毒素或抗蛇毒素可為選自黑寡婦蜘蛛抗蛇毒素、響尾蛇科抗蛇毒素(多聯(lián))、白喉抗毒素(馬)、金黃珊瑚蛇毒血清中的至少一種。上述至少一種免疫血清可為選自巨細胞病毒免疫球蛋白(靜脈內)、乙型肝炎免疫球蛋白(人)、免疫球蛋白肌肉內、免疫球蛋白靜脈內、狂犬病免疫球蛋白(人)、呼吸道合胞病毒免疫球蛋白靜脈內(人)、Rho (D)免疫球蛋白(人)、Rho (D)免疫球蛋白靜脈內(人)、破傷風免疫球蛋白(人)、水痘-帶狀皰滲免疫球蛋白中的至少一種。上述至少一種生物反應調節(jié)物可為選自阿地流津、依泊艾汀a、非拉司汀、注射用glatiramer acetate、干擾素alfacon - 1 、干擾素a - 2a (重組)、干擾素a - 2b (重組)、干擾素p - la、干擾素(3 - lb (重組)、干擾素 Y - lb、鹽酸左S走四咪哇、重組人白介素11、沙才各司亭中的至少一種。 (見，例如Nursmg 2001Dmg Handbook中的964 - 1040頁)。
上述至少一種眼科抗感染藥可選自桿菌肽、氯霉素、鹽酸環(huán)丙沙星、紅霉素、硫酸艮他霉素、吡。定羧酶0.3%、硫酸多粘菌素B、磺胺醋酰鈉10%、》黃胺醋酰鈉15%、 -黃胺醋酰鈉30%、托普霉素、阿糖腺苦中的至少一種。上述至少一種眼科抗炎癥藥可為選自地塞米松、地塞米松磷酸鈉、二氯苯胺苯乙酸鈉0.1%、氯曱龍、氟比洛芬鈉、酮咯酸氨丁三醇、醋酸強的杠、龍(懸液)、強的+〉龍磷酸鈉(溶液)中的至少一種。上述至少一種縮瞳劑可為選自氯乙酰膽石咸、氨曱酰膽》成(眼內)、氨甲酰膽堿(局部)、依可碘酯、毛果蕓香堿、鹽酸毛果蕓香堿、硝酸毛果蕓香堿中的至少一種。上述至少一種擴瞳劑可為選自^L酸阿托品、鹽酸環(huán)戊通、鹽酸腎上腺素、硼酸腎上腺素、氫溴酸后馬托品、鹽酸苯
腎上腺素、氫溴酸東莨菪4i、托品酰胺中的至少一種。上述至少一種眼血管收縮劑可為選自鹽酸萘唑啉、鹽酸羥間唑啉、鹽酸四氬萘唑啉中的至少一種。上述至少一種綜合性眼藥可為選自鹽酸阿可樂定、鹽酸倍他洛爾、酒石酸溴莫尼定、鹽酸山羊豆苷、鹽酸地匹福林、鹽酸杜塞酰胺、富馬酸依美斯汀、熒光素鈉、延胡索酸甲哌噻庚酮、拉坦前列素、鹽酸左布諾洛爾、鹽酸美替卜拉格、氯化鈉(高滲)、馬來酸噻嗎心安中的至少一種。上述至少一種耳用藥可為選自硼酸、過氧化氫脲、氯霉素、油酸三乙醇胺多肽-冷凝液中的至少一種。上述至少一種鼻用藥可為選自二丙酸氯地米松、布地奈德、石克酸麻黃》威、鹽酸腎上腺素、9-去氟膚輕松、丙酸氟替卡松、鹽酸萘唑啉、鹽酸羥間唑啉、鹽酸苯腎上腺素、鹽酸四氫萘唑啉、丙炎松、鹽酸丁千唑啉中的至少一種。(見，例如
Nu腿g 2001 Drug Handbook中的1041 - 97頁)。
上述至少一種局部抗感染藥可為選自無環(huán)鳥苷、兩性霉素B、壬二酸乳脂、桿菌肽、硝酸布康唑、磷酸氯林肯霉素、克霉唑、硝酸益康唑、紅霉素、硫酸艮他霉素、酮康唑、醋酸高磺胺、甲硝基羥乙唑(局部)、硝酸霉抗唑、莫匹羅星、鹽酸萘替芬、硫酸新霉素、硝基糖腙、制霉菌素、石黃胺嘧咬銀、鹽酸特比奈酚、特康唑、鹽酸四環(huán)素、噻康唑、發(fā)癬退中的至少一種。上述至少一種抗疥螨劑或抗虱劑可為選自克羅他米通、林丹、芐氯菊脂、除蟲菊酯中的至少一種。上述至少一種局部皮質類固醇可為選自雙丙酸倍他米+》、戊酸倍他米+>、丙酸氯氟美^K丙縮羥強龍、去氧米杠、地塞米松、地塞米爭>-粦酸鈉、.雙醋二氟爭》、丙酮膚輕松、氟新諾龍酯、氟氫縮松、丙酸氟替卡松、halciomde、氫化可的松、醋酸氳化可的松、丁酸氫化可的松、戊酸氫化可的松、糠酸莫美他爭>、丙炎松中的至少一種。(見，例如Nursing 2001 Drug Handbook中的1098 -1136頁)。
上述至少一種微生素或礦物質可為選自維生素A、復合維生素B、氰鈷胺素、葉酸、鞋鈷胺素、甲酰四氫葉酸鈣、煙酸、煙酰胺、鹽酸吡噴醇、核黃素、鹽酸硫胺素、維生素C、維生素D、膽鈣化醇、麥角鈣化醇、維生素D類似物、度骨化醇、帕利骨化醇、維生素E、維生素K 類似物、維生素Kl、氟化鈉、氟化鈉(局部)、痕量元素、鉻、銅、石典、錳、硒、鋅中的至少一種。上迷至少一種熱質可為選自氨基酸浸劑 (晶狀)、右旋糖中的氨基酸浸劑、含電解質的氨基酸浸劑、右旋糖中含電解質的氨基酸浸劑、針對肝衰竭的氨基酸浸劑、針對高代謝壓力的氨基酸浸劑、針對腎衰竭的氨基酸浸劑、右旋糖、脂肪乳狀液、中鏈脂
肪f復甘〉、由三酉旨中的至少一種。(見，仿j ^口 Nursing 2001 Drug Handbook 中的1137 — 63頁)。
本發(fā)明也提供至少一種任何合適的和/或有效量的特定組合物或藥物組合物中，該特定組合物或藥物組合物包含了至少一種GLP - 1模擬體或特定部分或變體，該特定組合物或藥物組合物任選地進一步包含了選自至少一種TNF拮抗劑(例如，但不僅限于TNF化學或蛋白質拮抗劑、TNF單克隆或多克隆抗體或片段、可溶TNF受體(例如p55、 p70 或p85)或片段、其融合多肽，或小分子TNF拮抗劑，例如TNF結合蛋白I或II (TBP-1或TBP-II) 、 nerelimonmab、英利昔單抗、 enteracept、 CDP-571、 CDP- 870、阿非莫單抗、來那西普等)、抗風濕藥(例如，氨甲蝶呤、醋硫葡金、金硫代葡萄糖、硝基咪唑硫。票呤、依那西普、硫代蘋果酸金鈉、硫酸幾基氯套、來氟米特、柳氮磺胺吡啶)、肌肉松弛劑、麻醉藥、非類固醇抗炎癥藥物(NSAID)、鎮(zhèn)痛藥、麻醉劑、鎮(zhèn)靜劑、局部麻醉劑、神經肌肉阻斷劑、抗菌劑(例如氨基糖苷類、抗真菌劑、抗寄生蟲藥、抗病毒藥物、氨基甲酰、頭孢菌素、氟喹諾酮、大環(huán)內酯、青霉素、磺胺、四環(huán)素、其它抗菌劑)、抗銀屑病藥、皮質類固醇、促蛋白合成類固醇、糖尿病相關藥物、礦物質、營養(yǎng)物質、甲狀腺藥物、維生素、鈣相關激素、止瀉藥、鎮(zhèn)咳藥、止吐劑、抗?jié)兯帯?輕瀉劑、抗凝血劑、促紅細胞生成素(例如依泊艾汀a )、非拉司汀(例如G-CSF、 Neupogen)、沙格司亭(GM-CSF、 Leukine)、免疫、免疫球蛋白、免疫抑制劑(例如巴利昔單抗、環(huán)胞多肽、達克珠單抗)、生長激素、激素替代藥物、雌激素受體調節(jié)物、擴瞳劑、睫狀肌麻瘠藥、烷基化藥物、抗代謝物、有絲分裂抑制劑、放射性藥物、抗抑郁藥、抗躁狂劑、抗精神病藥、抗焦慮藥、催眠藥、擬交感神經藥、興奮劑、多奈哌齊、塔克林、哮喘藥、P激動劑、吸入型類固醇、白細胞三烯抑制劑、曱基黃嘌呤、色甘酸、腎上腺素或類似物、鏈球菌DNA酶a (Pulmozyme)、細胞因子或細胞因子拮抗劑中的至少一種。上述細胞因子的非限制性實例包括，但不僅限于IL-1 - IL-23中的任意一種。合適劑量是本4頁i或熟知的。見，例^口 Wells etal.， eds., Pharmacotherapy Handbook, 2nd Edition, Appleton and Lange， Stamford, CT ( 2000 );
PDR Pharmacopoeia, Tarascon Pocket Pharmacopoeia 2000, Deluxe Edition, Tarascon Publishing, Loma Linda, CA (2000)，上述參考文獻均被完整引入此處，作為參考。
上述組合物也可包括與本發(fā)明至少一種抗體或多肽締合、結合、協(xié) 同配制或協(xié)同施用的毒素分子。該毒素可任選地起選4奪性殺死病理細胞或組織的作用。該病理細月包可為癌細月包或其它細胞。該毒素可以是，4旦不僅限于包含了特定毒素的至少一個功能性細胞毒素區(qū)的純化或重組毒素或毒素片段，該特定毒素選自例如，至少一種蓖麻毒蛋白、白喉毒素、蛇毒毒素或細菌毒素之一。術語毒素也包括由任何可在人和其它哺乳動物中引起包括中毒性休克在內的病理狀況，并可導致死亡的天然存在、突變或重組細菌或病毒所生成的內毒素和外毒素。該毒素可包括，但不僅限于產生腸毒性的大腸桿菌熱不穩(wěn)定腸毒素(LT)、熱穩(wěn)定腸毒素(ST)、志賀菌細胞毒素、氣單胞菌腸毒素、中毒性休克綜合征毒素
-1 (TSST- 1 )、葡萄球菌腸毒素A ( SEA) 、 B ( SEB)或C ( SEC)、鏈球菌腸毒素等。上述細菌包括，但不僅限于產腸毒素大腸桿菌
(ETEC)、致腸出血大腸桿菌(例如血清型0157: H7的菌才朱)、葡萄球菌種(例如金黃色葡萄球菌、釀膿葡萄球菌)、志賀菌種(例如志賀氏痢疾桿菌、福氏志賀桿菌、波伊德氏志賀氏菌和宋內氏志賀氏桿菌)、沙門氏菌種(例如傷寒桿菌、豬霍亂沙門氏菌、腸炎沙門氏菌)、梭狀芽胞桿菌種(例如產氣莢膜梭狀芽胞桿菌、艱難桿菌、肉毒桿菌)、彎曲桿菌種(例如空腸彎曲桿菌、胚胎彎曲桿菌)、螺桿菌種(例如幽門螺桿菌)、氣單胞菌種(例如，溫和氣單胞菌、嗜水氣單胞菌、豚鼠氣單胞菌)、類志賀鄰單胞菌、小腸結腸炎耶爾森菌、弧菌種(例如霍亂弧菌、副溶血性弧菌)、克雷白桿菌種、銅綠假單胞菌和鏈球菌。見，例如Stem, ed., INTERNAL MEDICINE, 3rded.， ppl — 13, Little, Brown and Co., Boston, ( 1990 ); Evans等.,eds.， Bacterial Infections of Humans; Epidemiology and Control, 2d.Ed., pp 239 — 254, Plenum Medical Book Co.， New York( 1991 ); Mandell等.，Principles and Practice of Infectious Diseases, 3d.Ed., Churchill Livingstone, New York ( 1990 ); Berkow等.，eds.， The Merck Manual, 16 th edition, Merck and Co., Rahway， N.J., 1992; Wood等.，F(xiàn)EMS Microbiology Immunology, 76: 121 - 134 ( 1991 ) ; Marrack等.，Science, 248: 705 - 711 ( 1990),
上述參考文獻的內容均被完整引入此處作為參考。
本發(fā)明GLP - 1模擬體或特定部分或變體組合物可進一步包括至少一種任意的合適輔助物，例如，但不僅限于稀釋劑、粘合劑、穩(wěn)定劑、緩沖劑、鹽、親脂溶劑、防腐劑、佐劑等。藥學可接受輔助物是優(yōu)選的。
不i義卩艮于Gennaro， Ed., Remington's Pharmaceutical Sciences, 18 th Edition, Mack Publishing Co. (Easton, PA) 1990。通過本4頁域熟知和/ 或此處描述的常規(guī)方法可選擇出與GLP - 1模擬體組合物的施用方式、溶解度和/或穩(wěn)定性相配的藥學可接受載體。
在本發(fā)明組合物中有用的藥物賦形劑和添加劑包括，但不僅限于蛋白質、肽、氨基酸、脂質和碳水化合物類(例如，糖、包括單糖、二糖、三糖、四糖和寡糖；衍生糖，諸如糖醇、糖醛酸、酯化糖等；多糖或糖類聚合物)它們可單獨或以組合形式存在，包括單獨或在組合中以l-9.9.99%重量或體積比例存在。蛋白質賦形劑的實例包括血清白蛋白，諸如人血清白蛋白(HSA)、重組人白蛋白(rHA)、明膠、酪蛋白等。也可發(fā)揮緩沖作用的代表性氨基酸/GLP - 1模擬體或特定部分或變體組分包括丙氨酸、甘氨酸、精氨酸、甜菜堿、組氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、賴氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、天冬酰苯丙氨酸曱酯等。一種優(yōu)選的氨基酸是甘氨酸。
適用于本發(fā)明的碳水化合物類賦形劑包括，例如，單糖，諸如果糖、麥芽糖、半乳糖、葡萄糖、D-甘露糖、山梨糖等；二糖，諸如乳糖、蔗糖、海藻糖、纖維二糖等；多糖，諸如棉子糖、松三糖、麥芽糖糊精、葡聚糖、淀粉等；和糖醇，諸如甘露糖醇、木糖醇、麥芽糖醇、乳糖醇、木糖醇、山梨糖醇(葡糖醇)、肌醇等。適用于本發(fā)明的優(yōu)選糖類賦形劑為甘露糖醇、海藻糖和棉子糖。
GLP- 1模擬體組合物也可包括緩沖劑或pH調節(jié)劑；典型的緩沖劑是從有機酸或堿制備而得的鹽。代表性緩沖劑包括有機酸鹽，諸如檸檬酸、抗壞血酸、葡糖酸、碳酸、酒石酸、琥珀酸、乙酸或苯二甲酸的鹽； Tns、鹽酸三羥曱基氨基曱烷或磷酸鹽緩沖劑。適用于本發(fā)明組合物的優(yōu)選緩沖劑為有機酸鹽，諸如檸檬酸鹽。
另外，本發(fā)明的GLP - 1模擬體或特定部分或變體組合物可包括聚合的賦形劑/添加劑，諸如聚乙烯吡咯烷酮、水溶性聚蔗糖(一種聚合
糖)、葡萄糖結合劑(例如環(huán)糊精，諸如2-羥丙基-p環(huán)糊精)、聚乙二醇、調味劑、抗菌劑、甜味劑、抗氧劑、抗靜電劑、表面活性劑(例
如聚山梨醇酯，諸如"TWEEN 20"和"TWEEN 80")、月旨質(例如磷脂、脂肪酸)、類固醇(例如膽固醇)和螯合劑(例如EDTA)。
適用于本發(fā)明GLP - 1模擬體組合物的上述及其它已知藥物賦形劑和/或添力口齊i)均是本4頁&戈已《口的，例^口在 "Remington : The Science&Practice of Pharmacy", 19thed., Williams&Williams， ( 1995 ), 和在 "Physician's Desk Reference", 52nd ed., Medical Economics, Montvale, NJU998 )中所列出的藥物賦形劑和/或添加劑，上述參考文獻的公開內容均被完整引入此處作為參考。優(yōu)選的載體或賦形劑材料為碳水化合物類(例如糖類和糖醇)和緩沖劑(例如檸檬酸鹽)或聚合劑。
制劑。如上所述，本發(fā)明提供了穩(wěn)定制劑，該制劑可優(yōu)選地包括含鹽水或特定鹽的合適緩沖劑和任選的含有防腐溶液，以及提供了含有防腐劑的制劑和適合藥用或獸醫(yī)用途的多用防腐制劑，這些制劑包含了藥學可接受制劑形式的至少一種GLP - 1模擬體或特定部分或變體。防腐制劑含有至少一種已知的防腐劑，或選自下列的任選防腐劑，即至少一種苯酚、m-曱酚、p-曱S分、o-甲酚、氯甲酚、苯甲醇、亞硝酸苯汞、苯氧乙醇、曱醛、氨丁醇、氯化鎂(例如六水合物)、烷基對羥基苯曱酸(甲基、乙基、丙基、丁基等)、殺藻胺、氯化芐乙氧銨、脫氫乙酸鈉和硫柳汞，或上述物質在水性稀釋劑中的混合物。可4艮據本領域已知的知識應用任意合適的濃度或混合物，諸如0.001-5%,或其中的任意范圍或凄i^直，例^口， 4旦不^又卩艮于0.001、 0.003、 0.005、 0.009、 0.01、 0.02、 0.03、 0.05、 0.09、 0.1、 0.2、 0.3、 0.4、 0.5、 0.6、 0.7、 0.8、 0.9、 1.0、 1.1、 1.2、 1.3、 1.4、 1.5、 1.6、 1.7、 1.8、 1.9、 2.0、 2.1、 2.2、 2.3、 2.4、 2.5、 2.6、 2.7、 2.8、 2.9、 3.0、 3.1、 3.2、 3.3、 3.4、 3.5、 3.6、 3.7、 3.8、 3.9、 4.0、 4.3、 4.5、 4.6、 4.7、 4.8、 4.9或其中的任意范圍或數(shù)值。非限制性實例包括，無防腐劑、0.1-2%m-曱酚(例如0.2、 0.3、 0.4、 0.5、 0.9、 1.0%)、 0.1-3%苯曱醇(,B口0.5、 0.9、 1.1、 1.5、 1.9、 2.0、 2.5 % ) 、 0.001 — 0.5%石克湘卩汞(例^口 0.005、 0.01% ) 、 0.001 —2.0%苯酉分(例如0.05、 0.25、 0.28、 0.5、 0.9、 1.0%) 、 0.0005 - 1.0 。/"克基5于羥基苯甲酸(例如0.00075、 0.0009、 0.001、 0.002、 0.005、 0.0075、 0.009、 0.01、 0.02、 0.05、 0.075、 0.09、 0.1、 0.2、 0.3、 0.5、 0.75、 0.9、 1.0%)等。
如上所述，本發(fā)明提供了一種制品，該制品包括包裝材料和至少一個含有特定溶液的小瓶，該特定溶液含有至少一種GLP- 1模擬體或特定部分或變體和上述緩沖劑和/或防腐劑，并任選地為水性稀釋液形式，
其中上述包裝材料包括標示了上述溶液可保存超過1、 2、 3、 4、 5、 6、 9、 12、 18、 20、 24、 30、 36、 40、 48、 54、 60、 66、 72小時或更長時間段的標簽。本發(fā)明進一步包括一種制品，該制品包括包裝材料、含至少一種凍干GLP - 1模擬體或特定部分或變體的第一個小瓶，和含有上述緩沖劑或防腐劑的水性稀釋液的第二個小瓶，其中上述包裝材料包括一個標簽，可向患者說明如何將至少一種GLP - 1模擬體或特定部分或變體重新混入水性稀釋液中，并從而形成可保存超過24小時或更長時間段的溶液。
根據本發(fā)明應用的至少一種GLP - 1模擬體或特定部分或變體可通過重組途徑，包括從哺乳動物細胞或轉基因制品中制備，或者可從此處所描述或本領域已知的其它生物學來源純化獲得。
在本發(fā)明的產品中，至少一種GLP - 1模擬體或特定部分或變體的數(shù)量范圍包括在濕/干體系中的情況下，在復原基礎上可獲得大約 l.Oug/ml-大約1000mg/ml濃度的量，但較低和較高濃度也是可行的，并取決于特定送遞載體，例如溶液制劑不同于經皮藥帖、肺、跨粘膜，或卩參透或孩i量泵法。
優(yōu)選地，上述水性稀釋液任選地進一步包括藥學可接受防腐劑。優(yōu) 選的防腐劑包括選自下列的防腐劑，即苯酚、m-甲酚、p-甲酚、0-曱酚、氯曱酚、苯曱醇、烷基對羥基苯曱酸(曱基、乙基、丙基、丁基等)、殺藻胺、氯化千乙氧銨、脫氫乙酸鈉和碌^柳汞，或上述物質的混合物。應用在本發(fā)明制劑中的防腐劑濃度是足以產生抗微生物效果的濃度。該濃度取決于所選防腐劑，且技術人員可容易地測定該濃度。
其它賦形劑，例如等滲劑、緩沖劑、抗氧化劑、防腐增強劑，均可被任選和優(yōu)選地加入上述稀釋液中。等滲劑，如甘油，通常采用其已知濃度。生理可耐受緩沖劑被優(yōu)選加入，以改善pH控制。本發(fā)明制劑可覆蓋大范圍的pH，諸如大約pH4-大約pH10，優(yōu)選的范圍是大約pH5 -大約pH9，最為優(yōu)選的范圍是大約pH6.0 -大約pH8.0。本發(fā)明制劑的優(yōu)選pH值在大約6.8 -大約7.8之間。優(yōu)選的緩沖劑包括磷酸鹽緩沖劑，最為優(yōu)選的是磷酸鈉，尤其是磷酸緩沖鹽溶液(PBS)。
其它添加劑，諸如藥學可接受增溶劑，如Tween 20 (聚氧化乙烯 (20)山梨糖醇酐單月桂酸酯)、Tween 40 (聚氧化乙烯(20 )山梨糖醇酐單棕櫚酸酯)、Tween 80 (聚氧化乙烯(20 )山梨糖醇肝單油酸酯)、 Pluromc F68 (聚氧化乙烯聚氧化丙烯嵌段共聚物)和PEG (聚乙二醇) 或非離子表面活性劑，諸如聚山梨醇酯20或80或聚羥亞烴184或188, Pluronic polyls、其它嵌段共聚物，和諸如EDTA和EGTA的螯合劑，均可被任選地加入本發(fā)明制劑或組合物中，以減少凝聚。當采用泵或塑料容器施用本發(fā)明制劑時，上述添加劑尤其有效。藥學可接受表面活性劑的存在減低了蛋白質凝聚的傾向。
本發(fā)明制劑可通過特定方法制備，該方法包括將至少一種GLP-1 模擬體或特定部分或變體與選自下列之一的防腐劑混合，即苯酚、m-曱酚、p-甲酚、o-甲酚、氯曱酚、苯曱醇、烷基對羥基苯甲酸(甲基、乙基、丙基、丁基等)、殺藻胺、氯化千乙氧銨、脫氫乙酸鈉和硫柳汞，或上述物質在水性稀釋液中的混合物。將至少一種GLP - 1模擬體或特定部分或變體與防腐劑混合在水性稀釋液中，是采用常規(guī)溶解和混合操作實現(xiàn)的。為制備合適制劑，例如，將緩沖液中精確量的至少一種GLP -1模擬體或特定部分或變體與緩沖液中的指定防腐劑按特定量值配伍，該特定量值足以提供蛋白質和防腐劑的指定濃度。本領域任何一位普通4支術人員均應認可該方法的改動形式。例如，加入組分的順序，是否采用其它添加劑，制備該制劑的溫度和pH，均是可被優(yōu)化從而適用于所采用濃度和施用途徑的因素。
本發(fā)明所要求權利的制劑可作為清液或雙瓶形式被提供給患者，其中在雙瓶中，有一瓶含有至少一種凍千的GLP - 1模擬體或特定部分或變體，可利用含有水、防腐劑和/或賦形劑，優(yōu)選磷酸鹽緩沖劑和/或鹽溶液和特定鹽，并形成水性稀釋液的另一小瓶將其復原。單溶液瓶或需復原的雙瓶均可被重復利用多次，并足以滿足對患者的單次或多循環(huán)治療需要，因而可提供比現(xiàn)有通用治療方案更為便利的治療方法。
本發(fā)明所要求權利的制品適用于從立即到24小時或更長時間段跨度的施用。相應地，本發(fā)明所要求權利的制品為患者提供了顯著的益處。本發(fā)明制劑可任選地在大約2-大約40。C的溫度下安全保存，并長時間地保持蛋白質的生物活性，因而可在包裝標簽上標示該溶液可在 6、 12、 18、 24、 36、 48、 72或96小時或更長的時間段跨度上被保存和
/或使用。如采用防腐稀釋劑，該標簽可包括直至1 _ 12個月中的至少一個月數(shù)、半年、一年半和/或兩年的使用期。
在本發(fā)明中，至少一種GLP _ 1模擬體或特定部分或變體的溶液可
通過特定方法制備，該方法包括將至少一種GLP - 1模擬體或特定部分
或變體混合在水性稀釋液中。該混合是采用常規(guī)溶解和混合操作實現(xiàn) 的。為制備合適的稀釋液，例如，以在水或緩沖液中，以特定量值配伍
精確量的至少一種GLP - 1模擬體或特定部分或變體，該量值足以提供蛋白質和任選防腐劑或緩沖劑的指定濃度。本領域任何一位普通技術人員均應認可該方法的改動形式。例如，加入組分的順序，是否采用其它添加劑，制備本發(fā)明制劑的溫度和pH,均是可被優(yōu)化從而適用于所采用濃度和施用途徑的因素。
本發(fā)明所要求權利的產品可作為清液或雙瓶形式被提供給患者，其中在雙瓶中，有一瓶含有至少一種凍干的GLP - 1模擬體或特定部分或變體，可利用含水性稀釋液的另一小瓶將其復原。單溶液瓶或需復原的雙并瓦均可一皮重復利用多次，并足以滿足對患者的單次或多循環(huán)治療需要，因而可提供比現(xiàn)有通用治療方案更為便利的治療方法。
通過向藥房、診所或其它類似機構和設施提供本發(fā)明所要求權利的清液或雙瓶形式的產品，可將其間接提供給患者，其中在雙瓶中，有一瓶含有至少一種凍干的GLP- 1模擬體或特定部分或變體，可利用含水性稀釋液的另一小瓶將其復原。該情況中的清液可達一升或更大體積，因而需提供一種大的儲液器，由其分一次或多次地將較少量的至少一種 GLP-1模擬體或特定部分或變體溶液轉移進較小的瓶中，該較小的瓶可由藥房或診所向其顧客和/或患者提供。
包含上述單瓶體系的公認裝置包括用于送遞溶液的筆式-注射器裝置，諸如Humaject⑧、NovaPen 、 B - D Pen、 AutoPen⑧和ptiPen 。包含雙瓶體系的公認裝置包括可用于將凍干藥物在藥筒中復原，并送遞該復原溶液的筆式-注射器裝置，諸如HumatroPen 。
本發(fā)明所要求權利的產品包括包裝材料。除管理機構所要求的信息外，該包裝材料還提供了應用該產品的條件。本發(fā)明的包裝材料向患者提供了說明書，講述了在產品為雙瓶，濕/干形式時，水性稀釋劑中復原至少一種GLP-1才莫擬體或特定部分或變體，形成溶液的方法，以及在超過2-24小時或更長時間段的跨度上使用該溶液的方法。對單瓶溶液
產品而言，標簽標示了該溶液可被使用超過2-24小時或更長時間段。本發(fā)明所要求權利的產品在人藥物產品用途方面有用。
本發(fā)明制劑可通過特定方法制備，該方法包括將至少一種GLP-1 模擬體或特定部分或變體與特定緩沖劑，優(yōu)選含鹽水或特定鹽的磷酸鹽緩沖劑混合。將至少一種GLP - 1模擬體或特定部分或變體與緩沖劑混合在水性稀釋液中，是采用常規(guī)溶解和混合操作實現(xiàn)的。為制備合適制劑，例如，將水或緩沖劑中準確量的至少一種GLP - 1模擬體或特定部分或變體與水中的指定緩沖劑按特定量值配伍，該量值足以提供蛋白質
和緩沖劑的指定濃度。本領域任意一位普通技術人員均應認可該方法的變動形式。例如，加入組分的順序，是否采用其它添加劑，制備本發(fā)明制劑的溫度和pH,均是可被優(yōu)化從而適用于所采用濃度和施用途徑的因素。
本發(fā)明所要求權利的穩(wěn)定或防腐制劑可以清液或雙瓶形式被提供給患者，該雙瓶中，有一瓶含有至少一種凍干的GLP-1模擬體或特定部分或變體，可利用含水性稀釋液形式的防腐劑或緩沖劑和賦形劑的另一'卜瓶將其復原。單溶液瓶或需復原的雙瓶均可^皮重復利用多次，并足以滿足對患者的單次或多循環(huán)治療需要，因而可提供比現(xiàn)有通用治療方案更為便利的治療方法。
根據本發(fā)明，此處所描述的穩(wěn)定或防腐制劑或溶液中的至少一種 GLP-模擬體或特定部分或變體可通過多種送遞方法被施用給患者，包括SC或IM注射；經皮、肺、跨粘膜、移植、滲透泵、藥筒、微量泵或本領域熟知，并纟皮熟練4支術人員理解的其它途徑。
治療應用。關于模擬體的本發(fā)明也提供了一種在細胞、組織、器官、動物或患者中調節(jié)或治療的糖尿病、I型或II型糖尿病的方法，包括成年開始的或幼年的、胰島素依賴性的、非胰島素依賴性的等，包括相關的體征和癥狀，例如但不僅限于胰島素抗性、高血糖、低血糖、胰腺炎、 Sushmg氏綜合癥、黑l束皮病、脂肪萎縮型糖尿病、一見網膜病、腎病、多發(fā)性神經病、單神經病、自發(fā)性神經病、潰瘍、足潰瘍、關節(jié)病、感染(例如，真菌的或細菌的)等。
本發(fā)明也提供了一種在細胞、組織、器官、動物或患者中調節(jié)或治療至少一種與糖尿病相Jf關系的免疫相關疾病的方法，包才舌4旦不^J艮于I 型或II型糖尿病中的至少一種，包括成年開始的或幼年的、胰島素依賴
性的、非胰島素依賴性的等，包括相關的體征和癥狀，例如但不僅限于
胰島素抗性、高血糖、低血糖、胰腺炎、Sushing氏綜合癥、黑棘皮病、脂肪萎縮型糖尿病、視網膜病、腎病、多發(fā)性神經病、單神經病、自發(fā) 性神經病、潰瘍、足潰瘍、關節(jié)病、感染(例如，真菌的或細菌的)等。見，例如Merck Manual, 12th - 17th Editions, Merck & Company, Rahway, NJ ( 1972， 1977, 1982， 1987, 1992， 1999), Pharmacotherapy Handbook, Wells等.，eds., Second Edition, Appleton and Lange, Stamford, Conn. ( 1998, 2001 ),每個文獻均被完整引入作為參考。
該方法可任選地包括將有效量的至少一種特定組合物或藥物組合物施用于需要這種調節(jié)、處理或治療的細胞、組織、器官、動物或患者，該組合物或藥物組合物含有至少一種GLP-1模擬體或特定部分或變體。
本發(fā)明也提供了在細胞、組織、器官、動物或患者中調節(jié)或治療至少一種心血管病的方法，該心血管病包括，j旦不^又限于，至少一種心臟
暈厥綜合征、心肌梗塞、充血性心力衰竭、中風、局部缺血性中風、出血、動月永石更化、動月永粥樣石更化、糖尿病動脈石更化性疾病、高血壓、動脈性高血壓、腎血管性高血壓、暈厥、休克、心血管系統(tǒng)的梅毒、心力衰竭、肺源性心臟病、原發(fā)性肺動脈高壓、心律失常、房性異位搏動、心房樸動、心房纖維性顫動(持續(xù)或陣發(fā)性)、紊亂性或多病灶房性心動過速、規(guī)律性狹窄QRS心動過速、特殊心律失常、心室纖顫、His束心律失常、房室傳導阻滯、束支性傳導阻滯、心肌局部缺血性失調、冠心病、心絞痛、心"幾4更塞、心"幾病、擴張充血性心"幾病、限制性心"幾病、瓣月莢性心臟病、心內月菱炎、心包疾病、心臟腫瘤、主動脈和周圍動月永動脈瘤、主動脈解剖、主動脈炎癥、腹主動脈及其分枝的閉塞、外周血管失調、閉塞性動脈失調、外周動脈粥樣^^化病、血^f全閉塞性脈管炎、功能性外周動脈失調、雷諾氏現(xiàn)象和疾病、力支端發(fā)紺癥、紅斑性肢痛癥、靜脈病、血纟全靜脈炎、曲張靜l永、動靜脈瘺、淋巴水腫、脂肪水腫、不穩(wěn)定心絞痛、再灌注損傷、泵后綜合征、局部缺血-再灌注損傷等。該方法可任選地包括將有效量的特定組合物或藥物組合物施用于需要這種調節(jié)、處理或治療的細胞、組織、器官、動物或患者，該組合物或藥物組合物含有至少一種GLP - 1模擬體或特定部分或變體。
本發(fā)明的任一方法均可包括將有效量的特定組合物或藥物組合物
施用于需要這種調節(jié)、處理或治療的細胞、組織、器官、動物或患者，該組合物或藥物組合物含有至少一種GLP-1模擬體或特定部分或變體。該方法可任選地進一步包括針對治療上述免疫病的協(xié)同施用或聯(lián)合
治療，其中上述至少一種GLP-1模擬體、特定部分或其變體的施用進一步包括在其之前、同時和/或之后，施用選自下列的至少一種藥物，即至少一種TNF拮抗劑(例如，但不僅限于TNF抗體或片l爻、可溶性TNF 受體或片段、其融合蛋白或小分子TNF拮抗劑)、抗風濕藥、肌肉松弛劑、麻醉藥、非類固醇抗炎癥藥物(NSAID)、鎮(zhèn)痛藥、麻醉劑、鎮(zhèn)靜劑、局部麻醉劑、神經肌肉阻斷劑、抗菌劑(例如，氨基糖苷類、抗真菌劑、抗寄生蟲藥、抗病毒藥、氨基甲酰、頭孢菌素、氟喹諾酮、大環(huán) 內酯、青霉素、磺胺、四環(huán)素、其它抗菌劑)、抗銀屑病藥、皮質類固醇、促蛋白合成類固醇、糖尿病相關藥物、礦物質、營養(yǎng)物、甲狀腺藥物、維生素、鈣相關激素、止瀉藥、鎮(zhèn)咳藥、止吐劑、抗?jié)兯?、輕瀉劑、抗凝血劑、促紅細胞生成素(例如依泊艾汀cx )、非^立司汀(例如 G-CSF、 Neupogen)、沙格司亭(GM-CSF、 Leukine)、免疫、免疫球蛋白、免疫抑制劑(例如巴利昔單抗、環(huán)孢霉素、達克珠單抗)、生長激素、激素替代藥物、雌激素受體調節(jié)物、擴瞳藥、睫狀肌麻痹藥、烷基化劑、抗代謝物、有絲分裂抑制劑、放射性藥物、抗抑郁藥、抗躁狂劑、抗精神病藥、抗焦慮藥、催眠藥、擬交感神經藥、興奮劑、多奈哌齊、塔克林、哮喘藥、P激動劑、吸入類固醇、白細胞三烯抑制劑、曱基黃嘌呤、色甘酸、腎上腺素或類似物、鏈道酶a (Pulmozyme)、細胞因子或細胞因子拮抗劑。合適的劑量是本領域熟知的。見，例如 Wells等.,eds., Pharmacotherapy Handbook, 2 nd Edition, Appleton and Lange, Stamford, CT ( 2000 ) ; PDR Pharmacopoeia, Tarascon Pocket Pharmacopoeia 2000, Deluxe Edition, Tarascon Publishing, Loma Linda, CA(2000)，各參考文獻均被完整引入此處作為參考。
模擬體也可被應用于體外，諸如自體骨髓培養(yǎng)。筒言之，在化學治療之前，從患者體內取出骨髓，并采用TPO和/或GLP-1處理，任選地結合模擬體，任選地結合一種或多種其它細胞因子。隨后，將經過處理的骨髓返還給經過化學治療的患者，以加速骨髓的恢復。另外，TPO 可單獨應用和與GLP - 1模擬體和/或GLP - 1聯(lián)合應用，也可被用于體外擴展骨髓或外周血祖細胞(PBPC)。在化學治療之前，可采用干細胞生長因子(SCF)或G-CSF刺激骨髓，以將早期祖細胞釋放進外周循環(huán)中。任選地，從外周血中收集并濃縮這些祖細胞，并隨后采用TPO 和模擬體處理其培養(yǎng)物，任選地結合一種或多種其它細胞因子，包括，但不l又限于SCF、 G-CSF、 IL-3、 GM-CSF、 IL-6或IL-11, ^f吏其分化并增生為高密度巨核細胞培養(yǎng)物，隨后將其任選地返還給經過高劑量化學治療后的患者體內。用于體外處理骨髓的TPO劑量范圍應為 100pg/ml-10ng/ml,優(yōu)選的為500pg/ml - 3ng/ml。模擬體的劑量應在活性上等同于GLP-l,可采用的劑量范圍是0.1個單位/ml-20個單位 /ml,優(yōu)選地是0.5個單位/ml-2個單位/ml，或其中的任意范圍或數(shù)值。
適用于本發(fā)明組合物、聯(lián)合治療、協(xié)同施用、裝置和/或方法(進一步包括本發(fā)明至少一種抗體、特定部分或其變體)的TNF拮抗劑包括，但不僅限于抗TNF抗體、其配體結合片段，和與TNF特異性結合的受體分子；阻止和/或抑制TNF合成、TNF釋放或其對目標細胞的作用的化合物，諸如反應停、替尼達普、磷酸二酯酶抑制劑(例如己酮可可磁< 和咯利普蘭)、A2b腺苦受體拮抗劑和A2b腺苷受體增強劑；阻止和/ 或抑制TNF受體發(fā)信號的化合物，諸如促分裂原活化蛋白(MAP)激酶抑制劑；阻滯和/或抑制膜TNF裂解的化合物，諸如金屬蛋白醇抑制劑；阻滯和/或抑制TNF活性的化合物，諸如血管緊張肽轉化酶(ACE ) 抑制劑(例如卡托普利)；和阻滯和/或抑制TNF生成和/或合成的化合物，諸如MAP激酶抑制劑。
此處所用"腫瘤壞死因子抗體"、"TNF抗體"、"TNFa抗體" 或片段等降低、阻滯、抑制、消除或干擾了體外、原位和/或優(yōu)選體內的 TNFcc活性。例如，合適的本發(fā)明TNF人抗體可結合TNFa，并包括抗 TNF抗體、其抗原結合片段，和特定突變體或其與TNFa特異性結合的區(qū)域。合適的TNF抗體或片段也可降低、阻滯、消除、干擾、阻止和/ 或抑制TNF RNA、 DNA或蛋白質合成、TNF釋放、TNF受體發(fā)信號、膜TNF裂解、TNF活性、TNF生成和/或合成。
嵌合抗體cA2由高親和性中和小鼠抗人TNFocIgGl抗體，即A2的抗原結合可變區(qū)和人IgGl,即K免疫球蛋白的恒定區(qū)組成。該人IgGlFc 區(qū)改善了同種異型抗體效應子功能，延長了該抗體的循環(huán)血清半衰期，并降低了其免疫原性。嵌合抗體cA2的親和力和表位特異性來源于鼠科動物抗體A2的可變區(qū)。一種特定實施方案中，對編碼該鼠科動物抗體
A2可變區(qū)的核酸而言，優(yōu)選的來源是A2雜交瘤細胞系。
嵌合A2 (cA2)以劑量依賴方式中和了天然和重組人TNFoc二者的細胞毒效應。從嵌合抗體cA2與重組人TNFoc的結合試驗中，推算出嵌合抗體cA2的親和常數(shù)為1.04x10 1Q M-1。通過竟爭抑制測定單克隆抗體特異性和親和力的優(yōu)選方法可參考Harlow,等.，Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1988; Colligan etal., eds., Current Protocols in Immunology, Greene Publishing Assoc.and Wiley Interscience, New York.
(1992 -2002 ) ; Kozbor等.，Immunol.Today, 4: 72 - 79 ( 1983 ); Ausubel 等.，eds.Current Protocols in Molecular Biology ， Wiley Interscience, New York ( 1987 - 2002 );和Muller, Meth.Enzymol., 95: 589 - 601 ( 1983 ),這些參考文獻均被完整引入此處作為參考。
本領域已描述了可應用于本發(fā)明的其它單克隆抗TNF抗體實例
(見，例如美國專利號5,231,024; M6ller, A.等.，Cytokine 2 ( 3 ) : 162
-169( 1990);美國申請?zhí)?7/943,852( 1992年9月11日提交)；Rathjen 等.，國際/>開號WO 91/02078 ( 1991年2月21日出版)；Rubm等， GLP- 1專利/>開號0218868 ( 1987年4月22日出版)；Yone等.， GLP-1專利/>開號0288088 ( 1988年10月26日)；Liang,等.， Biochem.Biophys.Res.Comm.137: 847 - 854 ( 1986 ) ; Meager,等.， Hybndoma6: 305 — 311 ( 1987) ; Fendly等.，Hybridoma6: 359 — 369
(1987) ; Bringman,等.，Hybridoma6: 489 - 507 ( 1987);和Hirai，等.，J.Immunol.Meth.96: 57 - 62 ( 1987),這些參考文獻均被完整引入此處作為參考)。
TNF受體分子。本發(fā)明優(yōu)選采用的TNF受體分子是那些與TNFa 高親和力結合(見，例如Feldmann等.，國際/^開號WO 92/O7076 ( 1992 年4月30日出版)；Schall等.，Cell 61: 361 — 370( 19卯)；和Loetscher 等.，Cell 61: 351 - 359 ( 1990 ),這些參考文獻均被完整引入此處作為參考)，并任選地具有低免疫原性的TNF受體分子。55kDa(p55TNF - R )和75kDa ( p75TNF - R ) TNF細胞表面受體在本發(fā)明中尤其有用。這些受體的截短形式包括該受體的胞外域(ECD)或其功能部分(見，例如Corcoran等.，Eur.J.Biochem.223: 831 - 840 ( 1994 )),在本發(fā) 明中也有用。在尿和血清中已檢測到該TNF受體包含ECD的截短形式，
即30kDa和40kDa的TNFcc抑制結合蛋白(Engelmann, H.等.， J.Biol.Chem.265: 1531 - 1536 ( 1990 ) )。 TNF受體多聚體分子和TNF 免疫受體融合分子，及其衍生物和片段或部分，是可應用于本發(fā)明方法和組合物的其它TNF受體分子實例?？蓱糜诒景l(fā)明的TNF受體分子的特征在于其具有長期治療患者，并可良好到極好地緩解癥狀的能力，且毒性低。低免疫原性和/或高親和力，以及其它未明確的特征，均可能對所獲的治療效果起作用。
在本發(fā)明中有用的TNF受體多聚體分子包括經由一個或多個多肽接頭或其它非肽接頭，諸如聚乙二醇(PEG),連接在一起的兩個或多個TNF受體的ECD的全部或一個功能部分。該多聚體分子可進一步包括分泌性蛋白的信號肽，以引導該多聚體分子的表達。美國申請?zhí)?08/437, 533 ( 1995年5月9日提交)中描述了這些多聚體分子及其制備方法，該參考文獻的內容被完整引入此處作為參考。
在本發(fā)明方法和組合物中有用的TNF免疫受體融合分子包括一個或多個免疫球蛋白分子的至少一個部分，和一個或多個TNF受體的全部或一個功能部分。這些免疫受體融合分子可被裝配為單體，或異源多聚體或同源多聚體。該免疫受體融合分子也可為單價或多價。這種TNF 免疫受體融合分子的一個實例是TNF受體/IgG融合蛋白。本領域已描述了 TNF免疫受體融合分子及其制備方法(Lesslauer等.， Eur丄Imm翻1.21 :2883 - 2886 ( 1991 ) ;Ashkenazi 等.， Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88: 10535 — 10539 ( 1991 ) ; Peppel等.， J.Exp.Med.174: 1483 - 1489( 1991 ); Kolls等.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91: 215 -219 ( 1994) ; Butler等.，Cytokine 6(6); 616 - 623 ( 1994); Baker等.，Eur丄Immunol.24: 2040 — 2048 ( 1994) ; Beutler等.，美國專利號5,447,851;和美國申請?zhí)?8/442, 133 ( 1995年5月16日提交)，這些參考文獻均被完整引入此處作為參考)。制備免疫受體融合分子的方法也可參考Capon等.，美國專利號5,116,964; Capon等.，美國專利號5,225,538;和Capon等.，Nature 337: 525 - 531 ( 1989),這些參考文獻均被完整引入此處作為參考。
TNF受體分子的功能等價物、衍生物、片段或區(qū)指該TNF受體分子的特定部分，或該TNF受體分子序列中編碼TNF受體分子的部分，其尺寸和序列足以使其在功能上與可應用于本發(fā)明的TNF受體分子相
似(例如，與TNFoc高親和力地結合，并具有低免疫原性)。TNF受體分子的功能等價物也包括在功能上與可應用于本發(fā)明的TNF受體分子相似(例如，與TNFoc高親和力地結合，并具有低免疫原性)的修飾 TNF受體分子。例如，TNF受體分子的功能等價物可含有"沉默 (SILENT)"密碼子或一個或多個氨基酸置換、缺失或添加(例如將一個酸性氨基酸置換為另一個酸性氨基酸；或將一個編碼相同或不同疏水氨基酸的密碼子置換為另一個編碼疏水氨基酸的密碼子)。見Ausubel 等.,Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc.and Wiley - Intersdence, New York ( 1987 - 2003 )。
細胞因子包括，但不僅限于所有已知的細胞因子。見，例如 CopewithCytokmes.com。纟田胞因子拮抗劑包^舌，^f旦不l又限于《壬^可抗體、片段或模擬體、任何可溶受體、片段或模擬體、任何小分子拮抗劑，或上述物質的任意組合。
本發(fā)明的任何方法均可包括用于治療蛋白質介導的失調的方法，該方法包括將有效量的特定組合物或藥物組合物施用于需要這種調節(jié)、處理或治療的細胞、組織、器官、動物或患者，該組合物或藥物組合物含有至少一種GLP - 1模擬體或特定部分或變體。該方法可任選地進一步包括針對治療免疫病的協(xié)同施用或聯(lián)合治療，其中上述至少一種GLP -l模擬體、特定部分或其變體的施用進一步包括在其之前、同時和/或之后，施用選自至少一種其它細胞因子，諸如IL-3、 -6和-ll;干細胞生長因子；G-CSF和GM-CSF中的至少一種物質。
典型地，對病理情況的治療是通過施用有效量或劑量的至少一種 GLP-1模擬體組合物實現(xiàn)的，即根據該組合物所含的特定活性，每一劑量的范圍共計平均為，每公斤患者體重施用至少大約0.0001 - 500毫克的至少一種GLP- 1模擬體或特定部分或變體，優(yōu)選地是每公斤患者體重單次或多次施用至少大約0.001 - 100毫克GLP - l模擬體或特定部分或變體?？蛇x地，有效血清濃度可包括單次或多次施用所獲的0.001 -5000ug/ml血清濃度。合適的劑量是醫(yī)師已知的，并當然地取決于特定疾病狀況、所施用組合物的特定活性和正接受治療的特定患者。某些情況下，為獲得指定治療量，有必要進行重復施用，即以特定監(jiān)控劑量或計量劑量的重復單獨施用，且在獲得指定日劑量或效果之前重復該單獨施用。
優(yōu)選劑量可任選地包括每次施用0.0001、 0.0002、 0.0003、 0.0004、 0扁5、 0扁6、 0扁7、 0扁8、 0細9、 0.001、 0.002、 0細、0駕、 0.005、 0.006、 0.007、 0.008、 0.009、 0.01、 0.02、 0.03、 0.04、 0.05、 0.06、 0.07、 0.08、 0.09、 0.1、 0.2、 0.3、 0.4、 0.5、 0.6、 0.7、 0.8、 0.9、 1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 11、 12、 13、 14、 15、 16、 17、 18、 19、 20、 21、 22、 23、 24、 25、 26、 27、 28、 29和/或30mg/kg，或其中的任意范圍、數(shù)值或分數(shù)，或通過單次或多次施用獲得0.0001、 0.0002、 0細3、 0扁4、 0.0005、 0.0006、 0細7、 0細8、 0扁9、 0.001、 0.002、 0.003、 0.004、 0.005、 0.006、 0.007、 0駕、0.009、 0.01、 0.02、 0.03、 0.04、 0.05、 0.06、 0.07、 0.08、 0.09、 0.1、 0.5、 0.9、 1.0、 l.K 1.2、 1.5、
I. 9、 2.0、 2.5、 2.9、 3.0、 3.5、 3.9、 4.0、 4.5、 4.9、 5.0、 5.5、 5.9、 6.0、 6.5、 6.9、 7.0、 7.5、 7.9、 8.0、 8.5、 8.9、 9.0、 9.5、 9.9、 10、 10.5、 10.9、
II、 11.5、 11.9、 12、 12.5、 12.9、 13.0、 13.5、 13.9、 14.0、 14.5、 15、 15.5、 15.9、 16、 16.5、 16.9、 17、 17.5、 17.9、 18、 18.5、 18.9、 19、 19.5、 19.9、 20、 20.5、 20.9、 21、 22、 23、 24、 25、 26、 27、 28、 29、 30、 35、 40、 45、 50、 55、 60、 65、 70、 75、 80、 85、 90、 96、 100、 200、 300、 400和/或500ug/ml血清濃度，或其中的任意范圍、數(shù)值或分數(shù)。
可選地，可根據已知因素，諸如特定藥劑的藥物動力學特性，及其施用模式和途徑；接受者的年齡、健康情況和體重；癥狀的性質和程度、合并治療的種類、治療的頻率和預期效果改變施用劑量。通常，活性成分的劑量可為每^^斤體重施用大約0.0001 - 100毫克。普通劑量為0.001 -10,優(yōu)選劑量為每^^斤體重每次施用0.001 - 1毫克，或通過續(xù)釋放形
式有效地獲得預期效果。
一個非限制性實例是，對人或動物的治療可通過一次性或周期性地
施用0.0001 - 100mg/kg的本發(fā)明至少一種GLP- l模擬體或特定部分或變體劑量，諸如采用單一、輸注或重復劑量，在第1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 11、 12、 13、 14、 15、 16、 17、 18、 19、 20、 21、 22、 23、 24、 25、 26、 27、 28、 29、 30、 31、 32、 33、 34、 35、 36、 37、 38、 39或40天中的至少一天，或可選地在1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 11、 12、 13、 14、 15、 16、 17、 18、 19或20周中的至少一周內，或上述天數(shù)和周數(shù)的任意組合周期內的每一天施用0.0002、 0.0003、 0.0004、 0.0005、 0.0006、 0.0007、 0.0008、 0.0009、 0.001、 0.002、 0.003、
0.004、 0.005、 0.006、 0.007、 0.008、 0.009、 0.01、 0.02、 0.03、 0.04、 0.05、 0.06、 0.07、 0.08、 0.09、 0.1、 0.2、 0.3、 0.4、 0.5、 0.9、 1.0、 1.1、 1.5、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9或10mg/kg的本發(fā)明至少一種GLP - 1 模擬體或或特定部分或變體。
適合內部施用的劑量形式(組合物)通常每單位或每個容器含有大約0.0001毫克-大約500毫克活性成分。在這些藥物組合物中，活性成分的量通常按重量計算應為該組合物總重量的大約0.5 - 99.999% 。
對腸胃外施用而言，GLP-1模擬體或特定部分或變體可與藥學可接受的腸胃外賦形劑一起或以分別提供的方式被配制為溶液、懸液、乳狀液或凍干并分。該JU武形劑的實例是水、鹽溶液、Ringer氏溶液、葡萄糖溶液和5%人血清白蛋白。也可采用脂質體和非水性賦形劑，諸如不揮發(fā)油。賦形劑或凍干粉可含有維持等滲性(例如氯化鈉、甘露糖醇)和化學穩(wěn)定性(例如緩沖劑和防腐劑)的添加劑。該制劑通過已知或合適的4支術滅菌。
合適的藥物載體在該領域內的標準參考文獻，即Remington's Pharmaceutical Sciences, A.Osol的最新版本中均有所描述。
治療性施用。才艮據本發(fā)明，可采用許多已知和已研發(fā)的施用才莫式，用于施用治療有效量的本發(fā)明至少一種GLP - 1模擬體或特定部分或變體。本發(fā)明GLP - 1模擬體可在載體內形成溶液、乳狀液、膠體或懸液，或以粉末形式，通過利用多種適用于吸入或此處所描述或本領域其它已知模式施用的裝置和方法中的任意一種，而得以送遞。
腸胃外制劑和施用。用于腸胃外施用的制劑可含有常用賦形劑，無菌水或鹽水、諸如聚乙二醇的聚烷撐二醇、植物來源的油、氫化萘等。根據已知方法，可通過采用合適的乳化劑或增濕劑和懸浮劑制備注射用的水性或油性懸液。注射用的藥劑可以是無毒、不可口服的稀釋劑，諸如水性溶液或無菌可注射溶液或在溶劑中形成的懸液。有效的賦形劑或
溶劑可采用水、Rmger氏溶液、等滲鹽水等；普通溶劑或懸浮溶劑則可采用無菌不揮發(fā)油。就這些用途而言，可采用任何種類的不揮發(fā)油和脂肪酸，包括天然或合成或半合成的脂肪油或脂肪酸；天然或合成或半合成的甘油單酯或二酯或三酯。腸胃外施用是本領域已知的，包括，但不僅限于，常規(guī)注射途徑，美國專利號5，851,198中描述的氣壓式無針注射裝置，和美國專利號5,839,446中描述的激光穿孔器裝置，這兩項專
利均被完整引入此處作為參考。
可選送遞。本發(fā)明進一步涉及通過腸胃外、皮下、肌內、靜脈內、藥丸、陰道、直腸、口腔、舌下、鼻內或經皮途徑施用至少一種GLP-1模擬體或特定部分或變體。蛋白質、GLP- 1模擬體或特定部分或變體組合物可被制備用于腸胃外(皮下、肌內或靜脈內)施用，尤以液體溶液或懸液形式為佳；用于陰道或直腸施用時，則尤以半固體形式，諸如膏狀物和栓劑為佳；口腔或舌下施用時，則尤以片劑或膠嚢形式為佳；鼻內施用時，尤以粉末、滴鼻劑或氣霧劑或特定藥劑形式為佳；經皮施用則尤以凝膠劑、軟膏劑、洗劑、懸液或藥貼送遞系統(tǒng)形式為佳，該送遞系統(tǒng)含有可改變皮膚結構或提高經皮藥帖中藥物濃度的化學增強齊'J ，諸如二甲亞石風(Junginger,等.，在"Drug Permeation Enhancement"; Hsieh, D.S.， Eds., pp59 - 90 ( Marcel Dekker， Inc.New York 1994,完整引入此處作為參考))，或含有可使含蛋白質和肽制劑應用于皮膚的氧化劑(WO 98/53847),或可施加電場，而造成短暫送遞途徑，諸如電穿孔，或可提高帶電荷藥物穿過皮膚的遷移率，諸如離子電滲療法，或可應用超聲波，諸如超聲波導入法(美國專利號4，309,989和 4，767,402 )(上述出版物和專利均被完整引入此處作為參考)。
肺/鼻部施用。對肺部施用而言，優(yōu)選地，至少一種GLP-l模擬體
顆粒大小送遞。4艮據本發(fā)明，可通過本領域已知用于吸入式施用治療藥劑的多種吸入或鼻用裝置中的任意一種送遞至少一種GLP - 1模擬體或特定部分或變體。這些可使霧化制劑沉積于患者竇腔或肺泡中的裝置包括計量劑量吸入器、霧化器、干粉發(fā)生器、噴霧器等。適用于引導GLP -1模擬體或特定部分或變體肺或鼻部施用的其它裝置也是本領域已知的。上述所有裝置均可應用適合施用的制劑，以使GLP-l模擬體或特定部分或變體分配在氣溶膠中。該氣溶月交可由溶液(水性和非水性)或固體顆粒組成。計量劑量吸入器，如Ventoln^計量劑量吸入器，典型地采用推進氣，并需在吸氣期間開動(見，例如WO 94/16970, WO 98/35888 )。千粉吸入器，如Turbuhaler ( Astra ) 、 Rotahaler ( Glaxo )、 Diskus (Glaxo) 、 SpirosTM吸入器(Dura)、由 Inhale Therapeutics 經銷的裝置，和Spmhaler 粉末吸入器(Fisons)，均通過呼吸活動吸入混合粉末(US 4668218Astra， EP 237507Astra， WO 97/25086 Glaxo,
WO 94/08552 Dura, US 5458135 Inhale, WO 94/06498 Fisons,完整引入此處作為參考)。霧化器如AERxTM Aradigm、 Ultravent 霧化器 (Mallinckrodt),和Acorn II 霧化器(Marquest Medical Products ) ( US 5404871 Aradigm, WO 97/22376 ),可由溶液生成氣溶月交，而計量劑量吸入器、干粉吸入器等吸入器則可產生小顆粒氣溶膠，上述參考文獻均被完整引入此處作為參考。商業(yè)可提供吸入裝置的上述特定實例僅為適用于實踐本發(fā)明的特定裝置的代表，并不對本發(fā)明范疇構成限制。優(yōu)選地，通過干粉吸入器或噴霧器送遞包含至少一種GLP - 1模擬體或特定部分或變體的組合物。適用于施用本發(fā)明至少一種GLP - 1模擬體或特定部分或變體的吸入裝置具有若干令人滿意的特征。例如，通過吸入裝置送遞的優(yōu)勢在于可靠、可重現(xiàn)和準確。該吸入裝置可任選地送遞小的干顆粒，例如對良好的可吸入性而言，該顆粒小于大約10 jum，優(yōu)選地為大約1 - 5 n m。
以噴霧形式施用GLP-1模擬體或特定部分或變體組合物。包括 GLP - 1才莫擬體或特定部分或變體組合物蛋白的噴霧可通過迫使至少一種GLP - 1模擬體或特定部分或變體的懸液或溶液在壓力下通過噴嘴而得以制備。該噴嘴的尺寸和構型、應用壓力和液體進料速率均可選擇以獲得預期的輸出量和顆粒尺寸。電噴霧可通過，例如電場及毛細管或噴嘴進料獲得。通過噴霧器送遞至少一種GLP - 1模擬體或特定部分或變體組合物蛋白顆粒的優(yōu)勢在于，顆粒尺寸小于大約10|am,優(yōu)選范圍是大約lum-大約5pm,最為優(yōu)選的范圍是大約2)am-大約3ym。
適用于噴霧器的至少一種GLP - 1模擬體或特定部分或變體組合物蛋白制劑典型地包括水性溶液形式的GLP - 1模擬體或特定部分或變體組合物蛋白，其濃度為每毫升溶液含有大約lmg-大約20mg的至少一種GLP - 1模擬體或特定部分或變體組合物蛋白。該制劑可包括諸如賦形劑、緩沖劑、等滲劑、防腐劑、表面活性劑，和優(yōu)選的鋅。該制劑也可包括用于使GLP - 1模擬體或特定部分或變體組合物蛋白穩(wěn)定的賦形劑或試劑，諸如緩沖劑、還原劑、填充蛋白或碳水化合物。可用于配制 GLP-1模擬體或特定部分或變體組合物蛋白的填充蛋白包括白蛋白、魚精蛋白等?？捎糜谂渲艷LP - 1模擬體或特定部分或變體組合物蛋白的典型碳水化合物包括蔗糖、甘露糖醇、乳糖、海藻糖、葡萄糖等。該 GLP - 1模擬體或特定部分或變體組合物蛋白制劑也可包括表面活性
劑，可減少或預防由溶液形成氣溶膠時的霧化所導致的GLP - 1模擬體或特定部分或變體組合物蛋白的表面誘導性凝聚。多種常規(guī)表面活性劑均可被應用，諸如聚氧乙烯脂肪酸酯和乙醇，和聚氧乙烯山梨糖醇脂肪
酸酯。其應用量范圍通常應為制劑重量的0.001-14%。對本發(fā)明的應用而言尤其優(yōu)選的表面活性劑是聚氧乙烯山梨糖醇酐單油酸酯、聚山梨醇酯80、聚山梨醇酯20等。用于配制諸如模擬體或特定部分或變體的蛋白質的其它試劑是本領域已知的，也被包括在制劑內。
通過霧化器施用GLP - 1模擬體或特定部分或變體組合物。GLP - 1 模擬體或特定部分或變體組合物蛋白可通過霧化器，諸如噴射霧化器或
超聲波霧化器而得以施用。典型地，在噴射霧化器中，采用壓縮空氣源以通過噴嘴形成高速空氣噴射流。當氣體從噴嘴擴散出時，形成了低壓區(qū)，將GLP - 1模擬體或特定部分或變體組合物蛋白的溶液吸入，并使其通過與貯液器相連的毛細管。來源自毛細管的液流離開該毛細管時，被剪切為不穩(wěn)定的絲狀體和液滴，便形成了氣溶膠?？蓱靡幌盗械臉?造、流速和導流片類型，以從特定噴射霧化器中獲得預期的性能特征。在超聲波霧化器中，采用高頻電能以形成震蕩的機械能，典型地應用壓電式轉換器。該能量直接或借助于偶聯(lián)液被傳輸給GLP - 1模擬體或特定部分或變體組合物蛋白制劑，便形成了包含該GLP - 1模擬體或特定部分或變體組合物蛋白的氣溶膠。通過霧化器送遞GLP - 1模擬體或特定部分或變體組合物蛋白顆粒的優(yōu)勢在于，顆粒尺寸小于大約10ym, 優(yōu)選范圍是大約1 nm-大約5ym，最為優(yōu)選的范圍是大約2nm-大約3 pm。
適用于噴射或起聲波型霧化器的至少一種GLP - 1模擬體或特定部分或變體制劑典型地包括水性溶液形式的GLP- 1模擬體或特定部分或變體組合物蛋白，其濃度為每毫升溶液含有大約lmg-大約20mg的至少一種GLP- 1模擬體或特定部分或變體蛋白。該制劑可包括諸如賦形劑、緩沖劑、等滲劑、防腐劑、表面活性劑，和優(yōu)選的鋅。該制劑也可包括用于使至少一種GLP - 1模擬體或特定部分或變體組合物蛋白穩(wěn)定的賦形劑或試劑，諸如緩沖劑、還原劑、填充蛋白或碳水化合物?？捎?于配制至少一種GLP- 1模擬體或特定部分或變體組合物蛋白的填充蛋白包括白蛋白、魚精蛋白等。可用于配制至少一種GLP-1模擬體或特定部分或變體的典型碳水化合物包括蔗糖、甘露糖醇、乳糖、海藻糖、葡萄糖等。該至少一種GLP - 1模擬體或特定部分或變體制劑也可包括表面活性劑，可減少或預防由溶液形成氣溶膠時的霧化所導致的至少一種GLP - 1模擬體或特定部分或變體的表面誘導性凝聚。多種常規(guī)表面活性劑均可被應用，諸如聚氧乙烯脂肪酸酯和乙醇，和聚氧乙烯山梨糖
醇脂肪酸酯。其應用量范圍通常應為制劑重量的0.001 -4%。對本發(fā)明的應用而言尤其優(yōu)選的表面活性劑是聚氧乙烯山梨糖醇酐單油酸酯、聚山梨醇酯80、聚山梨醇酯20等。用于配制諸如至少一種GLP-1模擬體或特定部分或變體蛋白質的其它試劑是本領域已知的，也被包括在制劑內。
通過計量劑量吸入器施用GLP-1模擬體或特定部分或變體組合物。在計量劑量吸入器(MDI)中，推進劑，至少一種GLP-l模擬體或特定部分或變體，和任意賦形劑或其它添加劑均被包容在金屬罐內，形成了包括液化壓縮氣體在內的混合物。計量閥的開動將該混合物以氣溶膠形式釋放，該氣溶膠優(yōu)選地含有尺寸范圍小于大約10um的顆粒，優(yōu)選的尺寸范圍是大約lum-大約5um,最為優(yōu)選的尺寸范圍是大約 2um-大約3um。通過應用由本領域技術人員已知的多種方法，包括噴射研磨、噴霧干燥、臨界點冷凝等方法制備的GLP-1模擬體或特定部分或變體組合物蛋白制劑，可獲得理想的氣溶膠顆粒尺寸。優(yōu)選的計量劑量吸入器包括由3M或Glaxo生產的計量劑量吸入器，并應用了氫化氟代烴推進劑。
適用于計量劑量吸入器裝置的至少一種GLP - 1模擬體或特定部分或變體制劑通常包括含有至少一種GLP - 1模擬體或特定部分或變體，并可在非水性介質中形成懸液的微細粉末，例如，借助于表面活性劑懸
氟代烴、氫化氯氟代烴、氫化氟代烴或烴，包括三氯氟曱烷、二氯二氟曱烷、二氯四氟乙醇和l, 1, 1, 2-四氟乙烷、HFA-134a (氫氟烷-134a) 、 HFA-227 (氬氟烷-227)等。優(yōu)選的推進劑為氫化氟代烴。可選擇表面活性劑，以穩(wěn)定該推進劑中懸浮形式的至少一種GLP - 1模擬體或特定部分或變體，以保護該活性劑不被化學降解等。合適的表面活性劑包括山梨糖醇酐三油酸酯、大豆卵磷脂、油酸等。某些情況中，溶液氣溶月交優(yōu)選地采用諸如乙醇的溶劑。本領域已知可用于配制蛋白質，諸如本發(fā)明蛋白質的其它試劑也可被包括在本發(fā)明制劑中。
本領域任何一位普通技術人員均應認識到本發(fā)明方法可借助此處未描述的裝置通過肺部施用至少一種GLP - 1模擬體或特定部分或變體組合物而得以實現(xiàn)。
粘膜制劑和施用。對經由粘膜表面的吸收而言，至少一種GLP-1
模擬體或特定部分或變體的組合物和施用方法包括含有大量超微末微粒、粘膜附著大分子、具有生物活性的肽和水性連續(xù)相的乳狀液，可通過實現(xiàn)該乳狀液顆粒的粘膜附著促進其經由粘膜表面的吸收(美國專利
號5,514,670)。適合應用本發(fā)明乳狀液的粘膜表面可包括角膜、結膜、口腔、舌下、鼻、陰道、肺、胃、腸和直腸的施用途徑。用于陰道或直腸施用的制劑，例如栓劑，可含有賦形劑，例如聚烷撐二醇、凡士林、可可脂等。用于鼻內施用的制劑可為固體，并含有賦形劑，例如乳糖，或者可以是滴鼻劑的水性或油性溶液。對口服而言，賦形劑包括糖、硬脂酸鈣、硬脂酸鎂、預糊化淀粉等(美國專利號5,849，695 )。
口服制劑和施用。用于口服的制劑依賴于佐劑的協(xié)同施用(例如間苯二酚和非離子性表面活性劑，諸如聚氧乙烯油醚和n-十六烷基聚乙烯醚)，以人為提高腸壁的通透性，該制劑也依賴于酶抑制劑的協(xié)同施用(例如胰蛋白酶抑制劑、二異丙基氟磷酸(DFF)和抑肽酶)，以抑制酶降解。用于口服的固體類型劑型的活性組成化合物可與至少一種添加劑混合，該添加劑包括蔗糖、乳糖、纖維素、甘露糖醇、海藻糖、棉子糖、麥芽糖醇、葡聚糖、淀粉、瓊脂、精氨酸、殼多糖、脫乙酰殼多糖、果膠、黃蓍樹膠、阿拉伯樹膠、明膠、膠原蛋白、酪蛋白、白蛋白、合成或半合成聚合物，和甘油酯。這些劑型也可含有其它類型的添加劑，例如不活潑稀釋劑、潤滑劑，諸如硬脂酸鎂、對羥基苯甲酸、諸如山梨酸、抗壞血酸、oc-生育酚的防腐劑，諸如半胱氨酸的抗氧化劑、崩解劑、粘合劑、稠化劑、緩沖劑、甜味劑、調味劑、加香劑等。
片劑和丸劑可被進一步加工進腸溶包衣制劑中。用于口^^的液體制劑包括乳劑、糖漿、酏劑、混懸劑和可用于醫(yī)學用途的溶液制劑。這些制劑可含有常用于該領域的不活潑稀考奪劑，如水。脂質體也曾一皮描述為是胰島素和肝素的藥物送遞系統(tǒng)(美國專利號4,239,754)。更為新近的是，混合氨基酸人工聚合物的微球體(類蛋白)曾被用于送遞藥物(美國專利號4,925,673 )。此外，美國專利號5，879，681和美國專利號 5,5,871,753中描述的載體化合物被用于口服送遞生物活性劑是本領域
已知的。
經皮制劑和施用。對經皮施用而言，該至少一種GLP - 1 ;漠擬體或特定部分或變體被密封于送遞裝置中，諸如脂質體或聚合毫微粒、微粒、微膠嚢或微球體(如無另外指出，可被共同稱為微粒)。有許多合適的裝置是已知的，包括由合成聚合物，如多羥基酸，如聚乳酸、聚羥基乙酸及其共聚物、聚原酸酯、聚酸酐和聚聚磷腈，和天然聚合物，諸如膠原蛋白、聚氨基酸、白蛋白及其它蛋白質、海藻酸鹽及其它多糖，以及上述物質的組合制成的微粒(美國專利No. 5,814,599 )。
長期施用和制劑。某些時候，使本發(fā)明化合物跨越較長的時間段再施用于患者是理想的，例如，從單次施用開始一周至一年的時間段?？?利用多種緩釋、dGLP-lt或移植劑型。例如，劑型可含有特定化合物的藥學可接受的無毒鹽，該鹽在體液中具有低溶解度，例如，(a)具有多元酸，諸如磷酸、硫酸、檸檬酸、酒石酸、鞣酸、雙羥萘酸、海藻酸、多聚谷氨酸、萘磺酸或萘二磺酸、多聚半乳糖搭酸等酸的酸加成鹽；(b) 具有多價金屬陽離子，諸如鋅、鈣、鉍、鋇、鎂、鋁、銅、鈷、鎳、鎘等，或具有由例如N, N， - 二苯基-乙二胺或乙二胺形成的有機陽離子的鹽；(c) (a)與(b)的組合，例如鞣酸鋅鹽。另外，本發(fā)明化合物，或優(yōu)選的，相對不溶性鹽，如上述鹽，可被配制成凝膠，例如適用于注射，并含有例如，芝麻油的一硬脂酸鋁凝膠。尤其優(yōu)選的鹽是鋅鹽、鞣酸鋅鹽、雙羥萘酸鹽等。注射用的其它類型緩釋dGLP-lt制劑應含有被分散以密封于緩慢降解、無毒、非抗原性多聚物，諸如美國專利號 3,773,919所描述的聚乳酸/聚羥基乙酸聚合物中的化合物或鹽。該化合物或，優(yōu)選的相對不溶性鹽，如上述鹽也可被配制在膽固醇基質硅酮丸中，尤其應用于動物。其它緩釋、dGLP-lt或移植制劑，例如氣體或液體脂質體可見本領域參考文獻(美國專利號5,770,222和"Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems"(持續(xù)和4空#奪藥物送遞系統(tǒng))， J.R.Robmson ed., Marcel Dekker， Inc., N.Y., 1978 )。
上文已概述了本發(fā)明，通過下述實例將更容易理解本發(fā)明，且下述實例僅用于例證，對本發(fā)明不構成限制。
實施例1: GLP-1模擬體在哺乳動物細胞中的克隆化和表達。典型哺乳動物表達載體含有至少一個可介導mRNA轉錄起始的啟動子元件，GLP-1模擬體或特定部分或變體編碼序列，以及轉錄終止和轉錄
產物聚腺苷酸化所需要的信號。其它元件包括增強子、Kozak序列和兩側伴有RNA剪切供體和受體位點的間插序列。高效轉錄可通過采用 SV40來源的早期和晚期啟動子、逆轉錄病毒如RSV、 HTLVI、 HIVI來源的長末端重復序列(LTRS)和巨細胞病毒(CMV)來源的早期啟動子實現(xiàn)。但也可采用細胞元件(例如人肌動蛋白啟動子)?？捎糜趯崿F(xiàn) 本發(fā)明的合適表達載體包4舌，例如，pIRESlneo、 pRetro - Off、 pRetro -On、 PLXSN,或pLNCX( ClonetechLabs， PaloAlto, CA ) 、 pcDNA3.1 (+/ - ) 、 pcDNA/Zeo ( +/ -)或pcDNA3.1/Hygro ( +/ - ) (Invitrogen )、 PSVL和PMSG( Pharmacia, Uppsala， Sweden ) 、 pRSVcat( ATCC 37152 )、 pSV2dhfr (ATCC 37146)和pBC12MI (ATCC 67109 )?？杀徊捎玫牟?乳動物細胞包括人Hela 293、 H9和Jurkat纟田胞、小鼠NIH3T3和C127 細胞、Cosl、 Cos7和CVl、鵪鵓QCl-3細胞、小鼠L細胞和中國倉鼠卵巢(CHO)細胞。
可選地，基因可被表達于特定的穩(wěn)定細胞系中，該細胞系含有被整合進入其染色體中的上述基因。與可選標記，諸如dhfr、 gpt、新霉素或潮霉素的共轉染可實現(xiàn)對轉染細胞的鑒定和分離。
轉染基因也可被擴增，以表達大量編碼的GLP - 1模擬體或特定部分或變體。DHFR (二氫葉酸還原酶)標記有助于開發(fā)攜帶了所關心基因的數(shù)百或甚至數(shù)千個拷貝的細胞系。另一有用的選擇標記為谷氨酰胺合酶(GS)( Murphy,等.，Biochem丄227: 277- 279 ( 1991 ); Bebbmgton, 等.，Bio/Technology 10: 169 - 175 ( 1992))。利用這些標記，可在選擇性培養(yǎng)基中培養(yǎng)哺乳動物細胞，并選擇具有最高抗性的細胞。這些細
胞系含有被整合進入其染色體中的擴增基因。中國倉鼠卵巢(CHO)和 NSO細胞通常被用于生成GLP - 1模擬體或特定部分或變體。
表達載體pCl和pC4含有勞斯(Rous)肉瘤病毒的強啟動子(LTR) (Cullen，等.，Molec.Cell.Biol.5: 438 - 447 ( 1985 ))，外加CMV— 增強子的一個片段(Boshart，等.，Cell41: 521 - 530 ( 1985 ))。多克隆位點，例如具有限制酶裂解位點BamHI、 Xbal和Asp718,有助于目的基因的克隆化。該載體除含有3'內含子外，還含有大鼠前胰島素原基因的聚腺苷酸化和終止信號。
在CHO細胞中的克隆化和表達。載體pC4被用于GLP模擬體或特定部分或變體的表達。質粒pC4是質粒pSV2-dhfr的衍生物(ATCC
編號為No.37146)。該質粒含有受SV40早期啟動子控制的小鼠DHFR 基因。通過在補充有化學治療劑氨甲蝶呤的選擇性培養(yǎng)基(例如oc負型 MEM, Life Technologies, Gaithersburg, MD)中培養(yǎng)細胞，可篩選出由這些質粒轉染，并缺乏二氫葉酸活性的中國倉鼠卵巢細胞或其它細胞。許多參考文獻均記錄了 DHFR基因在對氨曱蝶呤(MTX)具有抗性的細胞中的擴增(見，例如F.W.Alt，等，J.Biol.Chem.253: 1357 - 1370 (1978 ) ; J L.Hamlin和C.Ma, Biochem.et Biophys.Acta 1097: 107 - 143
(1990) ;和M.J.Pa ge和M.A.Sydenham, Biotechnology 9: 64-68
(1991) )。在遞增濃度MTX中生長的細胞通過因擴增DHFR基因所導致目標酶DHFR的過度產生，從而產生了對藥物的抗性。如果將第二基因連接至該DHFR基因，則該第二基因通常被共同擴增并過度表達。本領域已知該方法可被用于開發(fā)攜帶了超過該擴增基因1, 000個拷貝的細胞系。隨后，當提取出氨曱蝶呤時，可獲得含有擴增基因的細胞系，該擴增基因已被整合進宿主細胞的一個或多個染色體中。
質粒pC4含有用于表達目的基因的勞斯肉瘤病毒長末端重復序列 (LTR)的強啟動子(Cullen,等.，Molec.Cell.Biol.5: 438 - 447( 1985 )), 外加分離自人巨細胞病毒(CMV)立即早期基因增強子的一個片段 (Boshart，等.，Cell 41: 521 - 530 ( 1985 ))。該啟動子的下游是可實現(xiàn)上述基因整合的BamHI、 Xbal和Asp718限制酶裂解位點。在這些克隆位點后，該質粒含有3'內含子和大鼠前胰島素原基因的聚腺苷酸化位點。其它高效啟動子也可被用于表達，例如人b -肌動蛋白啟動子、SV40 早期或晚期啟動子或其它逆轉錄病毒如HIV和HTLVI來源的長末端重復序列。Clontech的Tet - Off和Tet - On基因表達系統(tǒng)和類似系統(tǒng)可被用于在哺乳動物細l包中以可調節(jié)途徑表達GLP - 1 (M.Gossen,和 H.Bujard, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89: 5547 — 5551 ( 1992 ))。對mRNA 的聚腺苦酸化而言，也可采用其它信號，例如來自人生長激素或球蛋白基因的信號。在采用可選標記，諸如gpt、 G418或潮霉素共同轉染的基礎上，也可選擇出攜帶了所關心基因的穩(wěn)定細胞系，該基因已被整合進其染色體中。首先采用一種以上可選標記是有優(yōu)勢的，例如G418外加氨甲蝶呤。
通過本領域已知的操作方法，采用限制酶消化質粒pC4，并隨后采用小牛腸內磷酸酶脫磷酸化。隨后從1 %瓊脂糖凝膠中分離出該載體。
根據已知方法步驟，采用編碼完整GLP- 1模擬體或特定部分或變
體的DNA序列，該DNA序列與本發(fā)明GLP - 1模擬體的HC和LC可變區(qū)對應。該構建體中也可采用編碼合適人恒定區(qū)(即HC和LC區(qū)) 的分離核酸。
隨后使編碼DNA的分離可變和恒定區(qū)和脫磷酸化載體與T4 DNA 連接酶連接。隨后，轉染大腸桿菌HB101或XL-1 Blue細胞，并采用，例如限制酶分析法鑒定質粒pC4中含有上述插入片段的細菌。
采用缺乏活性DHFR基因的中國倉鼠卵巢(CHO)細胞用于轉染。采用陽離子脂質體lipofectin，由0.5ug質粒pSV20 - neo共轉染5 m g表達質粒pC4。質粒pSV2neo含有顯性選才奪標記，來源于Tn5的neo基因編碼可使其對一組抗生素，包括G418具有抗性的酶。將該細胞接種進補充有l(wèi)ug/ml G418的cc負型MEM中。2天后，胰蛋白酶消化該細胞，并接種進雜交瘤克隆化平板(Gremer， Germany)中，該平板已加入了補充有10、 25或50ng/ml氨甲蝶呤外加lug/ml G418的a負型MEM。大約10-14天后，胰蛋白酶消化單個克隆，并隨后接種進含有不同濃度氨甲蝶呤(50nM、 100nM、 200nM、 400nM、 800nM)的6孔培養(yǎng)皿或10ml搖瓶中。隨后，將最高濃度氨甲蝶呤條件下生長的克隆轉移至含有還要高濃度氨曱蝶呤(lmM、 2mM、 5mM、 10mM、 20mM )的新6 孔平板中。重復相同步驟直至獲得可于100- 200mM濃度條件下生長的克隆為止。分析理想的基因產物的表達，例如，通過SDS-PAGE和蛋白質印跡(Western blot)，或通過反相HPLC分析。
實施例2:本發(fā)明GLP-1模擬體的非限制性實例。GLP-1為在口服葡萄糖刺激之后由腸L -細胞所分泌的"個氨基酸長的肽。包括生物活性GLP-1 (7-37)肽、變體或衍生物的模擬體構建體被認為能延長體內肽的半衰期且對于2型糖尿病患者來說，提供一種新的用于降低血糖的治療方法。編碼天然GLP - 1 ( 7 - 37 )肽或DPP - IV抗性類似物的肽能被插入到模擬體支架結構中。已制備了一些這樣的分子，并且證明了產生的模擬體在體外基于細胞的試驗中有活性。應當指出的是，上述研究中可采用不同的體外實驗與體內模型，且所報導效價彼此之間或與此處所介紹結果不可比較。
為了產生GLP-1模擬體變體，模擬體中的GLP-l肽、接頭序列、鉸鏈序列或CH2和CH3序列可被缺失、添加、置換、變異或修飾來改
進其表達、效價、穩(wěn)定性或效應器功能。
里予生型GLP — 1序歹'J以及DPP — IV #元GLP — 1變體，例力o GLP — 1 (A2S)或GLP-1 (A2G),能被插入到模擬體支架結構中?？梢赃M行肽的突變來改進GLP - 1模擬體的特性。例如在氨基末端殘基的突變可能改進信號作用，而在螺旋結構域的突變可能穩(wěn)定螺旋，從而改進與受體的結合和/或模擬體的穩(wěn)定性。
可以突變接頭序列的長度和組成來改變GLP - 1肽與Fc區(qū)之間的連接的柔性和穩(wěn)定性。不同的同種型能被插入到分子的鉸鏈區(qū)中。另夕卜，可在模擬體的鉸鏈區(qū)進行突變來穩(wěn)定該分子。例如，可突變人IgG4鉸
鏈區(qū)來制備Ser228 - >Pro的突變體，從而穩(wěn)定模擬體中的鏈間二硫鍵。模擬體Fc部分的變異能導致改進分子的穩(wěn)定性，并改變效應器功能，如FcR連接。例如，可以使用人或鼠類的同種型(或這些分子的變體)，如Ala/Ala突變的IgG4。
本發(fā)明的GLP - 1模擬體。本發(fā)明的一個特定非限制性實例是根據式(I)的GLP - 1模擬體構建體(SEQ ID NO: 2 ):
(P(n) - L(o) - V(p) - H(q) - CH2(" - CH3(s))(t)，其中p為具有生物活性的GLP- 1肽(7 - 36)的單拷貝，L為Gly - Ser 或Gly-Gly-Gly - Ser柔性接頭的串聯(lián)重復，V為Vh序列的C-末端，即天然存在IgG的J區(qū)，H為完整IgGl鉸鏈區(qū)，而CH2&CH3屬于IgGl 同種型亞類。該構建體的半衰期被認為應是GLP-1肽本身或其變體或衍生物半衰期的許多倍，并與IgG的半衰期近似。
除上述基礎結構外，本文也描述了具有潛在有利生物學特征的變體。這些變體包括自聯(lián)接傾向可能降低、免疫效應子功能減弱或免疫原性降低的構建體。本發(fā)明也展望了其它可賦予特定特征，諸如生物活性肽的改善構象，和可^爭越血腦屏障的修飾。建議的變體和修飾可以任何方式組合，以獲得具有特定活性的構建體。
利用重組DNA法，將GLP-1肽插入中間載體中，位于免疫球蛋白信號肽與人J序列之間。該操作采用了互補合成寡核苷酸，其末端與該載體中的限制位點相容。這些寡核苦酸含有GLP- 1肽的編碼序列，和由兩個GGGS重復組成的柔性接頭編碼序列。含有上述功能元件的限制片段隨后被轉移進表達載體中。該載體含有抗CD4免疫球蛋白啟動子和增強子、人IgGl鉸鏈區(qū)的編碼序列、HC恒定區(qū)2 (CH2)和恒定區(qū)3 (CH3),也含有對細菌內質粒復制和篩選，以及對哺乳動物細胞內穩(wěn) 定表達子的篩選而言所必需的元件。
該載體被導入到HEK293E細胞中，并在瞬時轉染細胞中獲得了野生型GLP - 1 MMB的表達。用標準蛋白A和Superose 12親合色譜法來完成GLP-1 MMB的純化，大約產生1.5 mg/L轉染細胞。該蛋白是下面所述實驗的起始材料。
GLP-1的氨基酸序列如圖l所示。功能域為上述肽的編碼序列。J 序列被認為可提供更大的柔性，使GLP-1 二聚體呈現(xiàn)正確構象，并使該二聚體從免疫球蛋白的球形結構中突出，并深入至兩個GLP-1受體之間的裂口中。IgGl鉸鏈區(qū)中含有三個半胱氨酸。第一個半胱氨酸通常與免疫球蛋白輕鏈(LC)配對，另外兩個半胱氨酸則參與了兩個HC之間的鏈間鍵。CH2&CH3區(qū)構成了該蛋白的填充部分。免疫球蛋白被認為具有長血清半衰期的原因之一是其與FcRn結合的能力，該FeRn可通過將胞飲免疫球蛋白恢復至胞外間隙，從而延長血清半衰期。FeRn的結合位點與CH2和CH3區(qū)的連接處重疊(Sheilds等.，2O01,丄Bio.Chem.， vol.276 ( 9) , 6591 - 6604)。
眾所周知，兩條IgG重鏈在細胞加工期間通過鉸鏈區(qū)中兩個半胱氨酸之間的二辟"建而被裝配在一起，形成了同二聚體。人們^人為該現(xiàn)象也可發(fā)生在修飾肽之間，從而形成裝配的GLP-1模擬體構建體。另外，人們認為GLP-1肽中的兩個半胱氨酸之間也將形成鏈內二硫鍵。GLP
-1模擬體的預期結構含有兩個GLP- 1肽。該肽在N末端的空間排列，以及鄰接序列的柔性使該肽形成了具有生物活性的二聚體。
實施例3: FACS結合試驗。用體外FACS結合試驗來檢測GLP-1 模擬體的活性。為了確定GLP-1 MMB是否與GLP-1R結合，將過表達GLP - 1R的HEK293細胞(lx106細胞)與GLP - 1 MMB ( 20 nM ) 在4。C下培養(yǎng)2小時。洗滌細胞，在4。C下加入熒光標記的二次4全測抗體(lug/mL，羊抗人IgG, Fc Y特異性)，保持30分鐘。這些細胞的熒光強度通過流式細胞光度計進行檢測。圖2A顯示GLP - 1 MMB與過表達GLP - 1R的HEK293細胞(灰色，GLP - 1 MMB但無二抗；黑色， ^5l有二抗；紅色，陰性對照MMB和二抗；藍色，GLP - 1 MMB和二抗) 結合。圖2B顯示GLP - 1 MMB不與對照的HEK293細胞(灰色，GLP
-1MMB但無二抗；黑色，僅有二抗；藍色，GLP - 1 MMB和二抗)
結合。圖2C顯示GLP - 1肽類似物(A2S )能夠與GLP - 1 MMB竟爭性結合過表達GLP - 1R的HEK293細胞(灰色，GLP - 1 MMB但無二抗；黑色，陰性對照MMB和二抗；橙色，GLP-1MMB， 0.2 nM竟爭者，二抗；藍色，GLP-1MMB， 20nM竟爭者，二抗；紅色，GLP - 1 MMB， 100nM竟爭者，二抗)。
實施例4: cAMP試驗。GLP - 1與其受體G -蛋白偶聯(lián)受體相結合，導致信號分子3，， 5，-環(huán)AMP (cAMP)的計量依賴性增加?？稍诒磉_ GLP - 1R的細胞(Applied Biosystems )中通過體外分析來測定cAMP。筒要地說，將Rmm細胞(100， 000細胞)與濃度遞增的GLP - 1肽(0 - 30 nM )或GLP - 1 MMB ( 0 - 100 nM ) —起培養(yǎng)。細胞一皮溶解，4吏用竟爭分析法來確定cAMP的量，該竟爭分析法使用堿性磷酸酶標記的 cAMP結合物和化學發(fā)光底物(Tropix CDPD )。野生型GLP - 1 MMB 的濃度依賴性cAMP活性(圖3A )可以比得上GLP - 1肽(圖3B )(各自是EC5(r=ll nM對0.4nM)。在相似的試驗中，在lgG4支架結構中的GLP - 1 ( A2G)(圖3C)和在IgG4支架結構中的GLP - 1 ( A2S ) MMB(圖3D)，與在IgG4支架結構中的野生型GLP-1 MMB相比，都使Rmm細胞中的cAMP水平增加到一個顯著更高的水平。
實施例5: DPP - IV裂解試驗。因為GLP - 1被DPP - IV迅速失活，所以進行體外試驗對完整的(即未裂解的)GLP-1MMB定量。簡要地i兌，將GLP — 1 MMB或肽(1.2 nM )與DPP — IV ( 1 )ug/mL, R&D系統(tǒng))在室溫下培養(yǎng)。在不同時間(0， 5， 10, I5, 20， 30, 40分鐘)之后，力口入DPP-IV抑制齊'j (100uM， Lmco)來終止該反應。用GLP - 1 活性ELISA測定完整的GLP - 1 MMB或肽的量，并繪制GLP - 1 MMB 或肽各自的標準曲線。圖4顯示相對于GLP-l來說，GLP-1 MMB對 DPP - IV的裂解明顯有更強抗性。
實施例6:人血清穩(wěn)定性試驗。也測定了血清中GLP - 1 MMB的穩(wěn) 定性來確保其它血清蛋白酶不能裂解或失活GLP-1 MMB。筒要地說，將GLP - 1肽或GLP - 1 MMB ( 30 nM )在人血清中在37°C下培養(yǎng)。在不同時間之后，用DPP-IV抑制劑(lOOuM, Lmco)來終止該反應，用來自Lmco的GLP - 1活性ELISA分析樣品。圖5顯示GLP - 1 MMB 在人血清中24小時內穩(wěn)定，而肽被迅速分解了。
實施例7: GLP-1 MMB導致RINm細胞中的胰島素分泌。為了測
定GLP-1 MMB在胰島素分泌中的作用，使用濃度遞增的GLP-1 (7 -36 )肽(0 - 5 nM )、毒蜥外泌肽-4肽(0-5 nM)或各種GLP - 1 模擬體(5或50 nM)來處理RINm細胞，并用ELISA測定胰島素分泌的量。測試的在RINm細胞中的所有GLP-1 MMB都具有增強胰島素分泌的活性(圖6 )。在50 nM時，MMB具有比得上野生型GLP -1(7 -36)肽的活性。
實施例8: GLP - 1 MMB降低db/db鼠的葡萄糖水平。六周齡的db/db 鼠禁食兩小時，然后用載體靜脈定量注射GLP - 1肽或GLP - 1 (A2S) MMB。在注射后0.5、 1、 2、 3和4小時監(jiān)測血糖。GLP - 1肽在30分鐘內降低血糖，但在60分鐘內血糖可能由于GLP - 1肽的短半衰期而開始再次增加。相比而言，劑量比GLP-1肽劑量低100倍的GLP-1 (A2S) MMB在整個4小時的周期中引起血糖的降低(圖7A)。另夕卜，血糖的降低是劑量依賴性的(圖7B)。
實施例9:在鼠和獼猴中GLP - 1 MMB的藥物代謝動力學。為了測定四種GLP-l才莫擬體(A2G, A2S, exedm - cap和野生型)的藥物^ 謝動力學，向C"/B16鼠靜脈注射lmg/kg的MMB。在不同的時間點通過處死鼠進行心臟穿刺來獲得血漿。應用不同的ELISA來測定在動物體內代謝的Fc、總MMB、活性MMB和活性片段?；钚訫MB表現(xiàn)肽的完整N-末端仍然與模擬體的Fc區(qū)相連。肽的第二個氨基酸(丙氨酸) 置換為絲氨酸或甘氨酸，延長了循環(huán)中活性MMB的半衰期。
以1.0 mg/kg向獼猴鼠靜脈注射四種不同的GLP - 1 MMB構建體，在注射后從10分鐘到5天的不同時間點取血清樣品。用ELISA鑒定血清樣品來進^f亍活性MMB的定量。如圖8所示，所有四種MMB都顯示了快速的分布相，其后為較慢的間隔相。適合每一種構建體的藥物代謝動力學常數(shù)顯示P/2為大約3天，其與從T = 0到T二120小時的AUC 所決定的暴露相近似。
實施例10:在糖尿病鼠口服葡萄糖耐量試驗中GLP - 1 MMB的作用。八周齡的db/db鼠在皮下注射GLP - 1 MMB ( 0.02至2 mg/kg)之前禁食6小時。在注射后，鼠再被禁食6小時，并測得空腹血糖基線。當1 = 0時，對鼠從口強飼1.0 mg/g的葡萄糖，并在不同時間測定血糖。圖9所示的結杲暗示在所有劑量的口服葡萄糖耐量試驗中GLP - 1 MMB 對于減小葡萄糖變化范圍是有效的。
實施例11: GLP - 1 MMB對糖尿病鼠慢性用藥中空腹血糖的作用。對十周齡的糖尿病db/db鼠，連續(xù)六周每天皮下注射載體或GLP- 1 MMB (1 mg/kg)。在研究過程中每周兩次測定空腹血糖。研究中，處理的動物的空腹血糖比對照要低(圖10),經過六周，差距超過了 200 mg/dL (對照和處理的動物分別為466 vs 221 mg/dL )。
實施例l2: GLP-1 MMB在對糖尿病鼠慢性用藥后口服葡萄糖耐量試驗中的作用。如實施例ll,對十周齡的糖尿病db/db鼠，連續(xù)六周每天皮下注射載體或GLP - 1 MMB ( 1 mg/kg) 。 40天的給藥之后，對鼠進行口服葡萄糖耐量試驗。筒要地說，當t-0時，對鼠從口強飼l.O mg/g的葡萄糖，并在不同時間測定血糖。圖11所示的結果暗示在口月良葡萄糖耐量試驗中GLP-1 MMB對于減小葡萄糖變化范圍是有效的，該口服葡萄糖耐量試驗說明長期用GLP-1 MMB處理的鼠與對照動物相比能夠更有效地解決葡萄糖負載。
實施例13: GLP - 1 MMB對糖尿病鼠慢性用藥后降低HbAlc的作用。如實施例11和12,對十周齡的糖尿病db/db鼠，連續(xù)六周每天皮下注射載體或GLP - 1 MMB ( 1 mg/kg) 。 40天的給藥之前或之后，取全血樣品，并分析HbAlc的百分數(shù)。如圖12所示，在六周時間內，用 GLP - 1處理的動物的HbAlC增加109%,而對照的動物增加142%。該數(shù)據說明經處理的動物與對照相比，能更好地調節(jié)它們的長期血糖。
實施例I4: GLP-1 MMB在對正常獼浙美的口服葡萄糖耐量試驗中的作用。在對正常獼浙吳單次^^藥GLP - 1 MMB ( 1 mg/kg)之前或六天之后，進行口服葡萄糖耐量試驗(OGTT)。簡要地說，當t-0時，對猴從口強飼2.0mg/g的葡萄糖，并在不同時間測定血糖。在給藥六天后所做的OGTT中血糖水平明顯降低(圖13A)，胰島素水平明顯升高(圖 13B)。這說明GLP-1 MMB導致胰臟在高葡萄糖濃度時分泌胰島素。
實施例15: GLP-1 MMB在單次劑量用藥后對胰島素鼠(db/db) 的胰島染色中的作用。十二周齡的糖尿病鼠(db/db)，皮下注射單次劑量的GLP-1MMB (1.5 mg/kg) ， 4周后取胰腺。為了確定胰島素的存在，將胰腺切片、染色。如圖14所示，經處理的動物與對照動物相比，明顯有更多的胰島素染色。
實施例16: GLP-1 MMB對正常狗延遲胃排空。通過外科手術將胃管插入到全身麻醉的雌性獵犬(10- 15kg)體內，并允許其恢復至少兩周。狗被禁食24小時，之后水可自由獲取。打開胃管，用40 - 50 ml 溫水除去胃液和殘余的食物。在餐前60分鐘對六只狗的組皮下注射利達脒，oc2激動劑(0.63mg/kg),即胃排空的延遲的陽性對照。對狗餐前15分鐘頭靜脈注射載體對照或GLP-1 MMB (0.1 mg/kg)。餐前5
分鐘，打開胃管來確定當時在胃中流體的量，作為基線值，將流體迅速再次導入胃中。然后通過插管給予包含250ml葡萄糖溶液(5g/1)的試驗餐，并允許其在胃中停留30分鐘。在30分鐘后，將胃內容物從胃中導出來測定總量。留下lml的胃內容物來進行分析，將余量通過插管再次導入胃中。在60、 90和120分鐘時重復胃內容物量的測定和樣品的提取。對收集的樣品測定葡萄糖濃度，并用于測定在每個時間點處胃中剩余的葡萄糖的絕對數(shù)量。通過起始值、在每個時間點處葡萄糖的濃度并作為時間的函數(shù)描點作圖可以確定胃中剩余的葡萄糖的百分數(shù)。胃內容物剩余50%的時間通過曲線對一次冪的擬合確定。如圖15所示，給予載體的狗在之后12.35士3.69分鐘內50%的胃內容物被排空，而利達脒陽性對照和給予GLP-1 MMB的狗顯示了明顯的胃排空的延遲(分別為30.60±6.47和59.23±14.46 )。
實施例17: GLP-1 MMB在對飲食誘導肥胖的鼠的口服葡萄糖耐量試驗(IPGTT )中降低血糖。為了建立一種飲食誘導肥胖的鼠類模型，至少27周使鼠保持提供高脂肪飲食。鼠變得肥胖，并當其空腹血糖值超過120mg/dl時，確定其患糖尿病。為了評價GLP-1MMB治療對餐后血糖水平的作用，飲食誘導肥胖的鼠被禁食過夜，且皮下注射0.02, 0.2, or 2 mg/kg GLP - 1 MMB或載體對照。注射后六小時，對鼠胃管飼 1.5mg/g葡萄糖。在注射MMB之前、t = 0、 15、 30、 60、 90、 120、 150 和180分鐘時用尾靜脈血來測定血糖水平。如圖16所示，在t = 0和所有后來的時間點處，空腹血糖值有明顯的GLP-1 MMB劑量依賴性降低。計算了 1 = 0和1= 180之間的曲線下面積，顯示所有劑量下葡萄糖處理都顯著降低。
實施例18: GLP - 1 MMB在對db/db鼠的腹膜內葡萄糖耐量試驗中 (IPGTT )降低血糖。將大約13-15周齡的雄性db/db鼠根據空腹血糖水平，隨機地分為每組6只的治療組。在葡萄糖耐量試驗6小時前，將 GLP- 1 MMB按0.02mg/kg或0.1 mg/kg對鼠給藥，或將陰性對照MMB 按0.1 mg/kg對鼠給藥。在葡萄糖耐量試驗5分鐘前，用手提式血糖測
計〗義從尾部靜脈血液中測定葡萄糖。然后向鼠腹膜注射lmg/g D -葡萄糖，在10分鐘、20分鐘、30分鐘、60分鐘、90分鐘、120分鐘、150 分鐘和180分鐘監(jiān)測血糖水平。如圖17A所示，在用GLP-1 MMB處理的兩組中血糖水平在全部時間內明顯降低。處死用同樣方式處理的另外幾組動物，在t-10分鐘時測定胰島素水平。在10分鐘內釋放的胰島素的量有伴隨GLP - 1 MMB給藥量的劑量依賴性增加。
實施例19: GLP-1 MMB劑量依賴性地抑制細胞因子誘導的凋亡。將RIN - m細胞以50,000個細胞/孔種植在96孔板上，W。C下溫育過夜。第二天，用一定劑量范圍的GLP-1 MMB (從100nM系列稀釋)處理細胞30分鐘，然后加入細胞因子TNFa (10ng/mL)或IL - 113 (4ng/mL)。將平氺反37。C下溫育16小時。為了測定凋亡，采用了 Cell Death ELISA - Plus 測定試劑盒(Roche Applied Science, Cat. No. 11920685001)。從孔中吸出培養(yǎng)基，在每個孔中加入200 nL裂解緩沖液，室溫下將平板溫育30分鐘。溫育后，將20 |iL裂解液轉移到鏈霉親和素包被的96孔微量滴定板中。也在每孔中加入80 (iL免疫試劑(抗組蛋白-生物素和抗DNA-過氧化物酶在提供的溫育緩沖液中的l:20稀釋液)。然后將100 [iL懸浮液在室溫下溫育2小時，輕柔振蕩。2小時后，用溫育緩沖液洗滌平^反3 次，在平板中加入顯影溶液。大約5分鐘后在405nm讀出吸光度。數(shù)據表明GLP - 1 MMB保護RIN - m細胞免受TNF - oc或IL - ip誘導的凋亡 (圖18)。
在1型糖尿病(T1D)中，存在分泌胰島素的胰腺p細胞的特異性石皮壞。盡管p細胞^皮壞的確切分子機理是未知的，但已經顯示T1D患者的血清促進凋亡，表明凋亡在糖尿病發(fā)病中起作用。通過用GLP- 1 MMB治療最近發(fā)病的患者(一個患者在蜜月期)，甚至是有發(fā)生糖尿病傾向的患者，可以抑制凋亡并且保留(3 -細胞團。
在T1D中，P-細胞凋亡可能在糖尿病的兩個不同階l殳的疾病發(fā)展中起作用。首先，胰島凋亡的發(fā)展波可能影響T-細胞生物，其最終影響自身免疫性糖尿病的發(fā)病。其次，胰島凋亡也是最終導致P -細胞大量^ 皮壞的細胞死亡才莫式。因此，GLP-1 MMB抑制(3-細胞凋亡的用途
可以用于通過保留P -細胞團，預防自身免疫性糖尿病發(fā)病或進展為明顯糖尿病。
T1D由分泌胰島素的p-細胞的不可逆喪失導致。但是，在某些具
有長期T1D的人體內可以檢測到胰島素分泌，表明存在一小群存活的(3 -細胞或正在進行自身免疫破壞的P-細胞的持續(xù)更新。已經顯示T1D 具有在復制后持續(xù)進行凋亡的P-細胞。p-細胞在T1D中發(fā)生的頻率是對照受試者中的兩倍。大多數(shù)具有長期T1D的人具有持續(xù)破壞的p -細胞。P -細胞死亡增加的機理可能涉及正在進行的自身免疫和葡萄糖毒性。通過定義，盡管正在進行凋亡，但仍然存在(3-細胞的事實說明必須發(fā)生伴隨的新(3-細胞形成，即使在長期T1D之后。我們得出結論，可以通過P -細月包石皮壞的輩巴向GLP - 1 MMB抑制，防止或逆轉T1D。
在多器官供體中，胰腺中的胰島在導致尸體器官供體腦死亡的事件中進行凋亡和壞死，所述事件在器官捐獻前的臨床期持續(xù)進行。此外，胰島在制備用于移植的胰島素生成細胞的胰島分離過程中進行凋亡。此外，當胰島移植到糖尿病受體的肝臟中時，存在細胞因子激活的級聯(lián)，特別是TNFa、 IL1B和丫INF。在分離過程和隨后的移植中將GLP - 1 MMB用于供體的胰島移植，減少凋亡并且改進胰島功能。其也減少為了達到臨床益處所需要的胰島數(shù)目，并且提供了活供體在胰島移植中應用的機會。
實施例20: GLP-1 MMB增加INS-1E細胞中的葡萄糖依賴性胰島素分泌。以200,000個細胞/孔的細胞密度將INS-1E細胞在RPMI 1640 + 10% FBS + 1% L-谷氨酰胺+ 1%丙酮酸鈉+ 1%非必須氨基酸+ 50 p -巰基乙醇培養(yǎng)基中鋪板于24孔板中。37。C和5% C〇2的條件下使細胞生長7添，第3或4天補料。用0.4mlKRBH緩沖液/3 mM 葡萄糖洗滌細胞兩次，在該緩沖液中溫育30 - 60分鐘。從細胞除去培養(yǎng)基，每孔加入0.4mlKRBH中的測試物和適量葡萄糖。在丁=0時間點從每孔取出20孩i升上清液，37。C和5% C02的條件下溫育60分鐘，用于測量胰島素。采用超敏大鼠胰島素ELISA試劑盒(Crystal Chem)，用大鼠標準曲線(12.8 - 0.1 ng/ml)確定胰島素濃度。在測定中采用時間點上清液的5微升l:50稀釋液，以獲得落入標準曲線的值。在OD45o對ELISA
如圖19所示，GLP-1 MMB以劑量依賴性方式增加胰島素分泌，但僅僅在血^唐升高的情況下如此。
實施例21: GLP-1 MMB增加大鼠和人胰島中的葡萄糖依賴性胰島素分泌。通過膠原酶消化和隨后的Ficoll梯度純化，獲得大鼠胰島。
用Ricordi et al. Diabetes (1998) 37; 4, 413 - 420中詳細描述的酶消化和密度梯度純化分離人胰島。將胰島在20 x 100 mm的培養(yǎng)皿中，在CMRL - 1066 (Gibco),青霉素/鏈霉素(5,000單位/5,000 |ug)， 10%FBS, 1% L -谷氨酰胺25mMHEPES, pH7.2-7.4培養(yǎng)基中鋪板過夜，37。C下在5% C02中培養(yǎng)18-24小時。第二天，將胰島渦旋到培養(yǎng)皿中心，收集到 50mL錐形試管中。通過重力，使胰島沉降到試管底部，持續(xù)大約IO-15分鐘。除去上清液，加入功能性/存活力培養(yǎng)基(MediaTech， cat#99-786 -CV),通過重力，使胰島沉降到試管底部。總共將胰島洗滌3次。除去上清液，將胰島以每mL20個胰島的密度重懸于含有1%BSA, 1%L -谷氨酰胺，1%青霉素/鏈霉素和0.5 mM葡萄糖溶液的功能性/存活力培養(yǎng)基中。在24孔板的每個孔中加入lmL細胞懸浮液(約20個胰島)， 37。C下在5%C02中溫育2小時。2小時后，加入1 mL含有1%BSA, 1% L -谷氨酰胺，1%青霉素/鏈霉素，GLP - 1 MMB (50 nM終濃度；100 nM 初始濃度)和終濃度為3.5mM(n爿2)或15 mM (n—2)的葡萄糖的功能性 /存活力培養(yǎng)基。在時間=0 (胰島素的基線)和加入處理后4小時收集 25pL上清液。上清液在-20。C下保存直到進行胰島素ELISA。用Crystal Chem (Downers Grove， IL)超敏ELISA測定試劑盒(cat #卯060)對大鼠胰島素進行定量。用Lmco Research (St. Charles, MI, cat#EZHI - 14K)的人胰島素ELISA試劑盒對人胰島素進行定量。圖20顯示GLP - 1 MMB 顯著增加大鼠(圖20A)和人胰島(圖20B)的胰島素分泌。
1型和2型糖尿病最終都是由于個體的P-細胞分泌的胰島素量不足。通過用GLP-1 MMB治療，增強糖尿病個體的胰島素分泌能力將改進或消除他們的糖尿病狀況。重要的是，胰島素分泌的增加是葡萄糖依賴性的，僅僅在血糖水平升高的情況下增加。因此，通過使用GLP-1 MMB,患者經歷危險的低血糖發(fā)作的風險降低到最小。
同樣，胰島素分泌的增加也使胰島移植程序受益。通過增加移植的胰島的胰島素分泌能力，可以有效減少提供臨床益處所需要的胰島數(shù) 目。由于可以用于支持胰島移植的尸體胰腺的量有限，GLP-1 MMB的使用將顯著增加可以從胰島移植程序受益的患者數(shù)目。此外，增加胰島素分泌的能力可以將供體群體延伸到活供體，而不會帶來使他們的胰島素分泌能力耗竭的風險，而這在沒有GLP-1 MMB干預的情況下，導致供體由于胰島素分泌能力不足而發(fā)生糖尿病。
實施例22:GLP- 1 MMB對正常小鼠血糖的影響。將正常C57BLK/6 小鼠隨機分為兩組，每組13只動物。第l組每日接受腹膜內(IP)施用 PBS載體或GLP - 1 MMB (0.5 mg/kg)。兩組都處理10天。每日監(jiān)測小鼠體重，并且監(jiān)測(LifeScan, CA)血糖32天，在32天時結束研究。
與PBS處理的小鼠相比，接受GLP-1 MMB處理的小鼠表現(xiàn)出在 10天的處理期間血糖降低(圖21 )。一旦處理終止，血糖回到PBS組的水平。兩組在研究期間表現(xiàn)出相同的體重增加(數(shù)據未示出)。
1型和2型糖尿病中都存在高血糖，并且導致該疾病的石皮壞性繼發(fā) 合并癥的進展。GLP- 1 MMB降低血糖而沒有不利影響受體的總體健康的能力(如與上文未處理對照相同的進行性體重增加所示)將對1型和 2型糖尿病都有益。
實施例23: GLP - 1 MMB防止糖尿病小鼠P -細胞減少。使小鼠(12 周齡db/db)禁食過夜。在研究的第l天，給小鼠(4組；n^5/組)皮下施用 GLP - 1 MMB (1.5 mg/kg)或陰性對照模擬體。在研究第4天，測量空腹血糖并且進行OGTT ( 口服糖耐量測試)。用尾靜脈血在15、 30、 60、 90、 120、 150和180分鐘測量血糖水平。麻醉小鼠，取出胰腺，浸入 10%的中性緩沖福爾馬林中固定。將來自每只小鼠的胰腺包埋在石蠟中，切片，用H&E和免疫組化染色。胰島素染色的形態(tài)分析顯示與對照相比，GLP-1MMB處理的小鼠具有顯著更高的胰島素染色強度。用給藥后14天處死的小鼠重復實驗，以評估單次施用GLP-1MMB的持續(xù)時間。胰島素染色的形態(tài)分析再次顯示單次施用后2周時GLP- 1 MMB處理的動物中的胰島素染色具有更高強度。胰島素染色的強度與胰島內儲存的胰島素量直接相關，表明GLP-1 MMB處理增加糖尿病動物模型的胰島內的胰島素分泌和儲存。
在2型糖尿病中，胰島素合成和儲存不足導致高血糖，這導致該疾病的激發(fā)合并癥的起病和進展。GLP- 1 MMB增加胰島素合成和儲存的能力將減少2型糖尿病的高血糖，從而限制激發(fā)合并癥的起病和進展。
實施例24: GLP-1 MMB對免疫受損的糖尿病小鼠中的人胰島邊緣團塊移植物的效力的影響。從Harlan Laboratories購買無胸腺nu/nu (凈果) 小鼠。將動物在無病毒抗體室中的分開的小籠中飼養(yǎng)，自由攝取消毒食物和水。所有實驗都是根據實驗動物管理和使用指導中的標準進行的。
通過靜脈內施用新溶解于檸檬酸緩沖液中的鏈脲霉素(200mg/kg)誘
發(fā)糖尿病。在誘發(fā)之后監(jiān)測非空腹血糖值證實糖尿病的誘發(fā)，僅僅具有
^350mg/dL的值的動物被用作受體。移植邊緣胰島團塊(a 50 IEQ/g體重，表明該團塊不足以立即使受體血糖正常)后，通過在移植后第一周每日測量非空腹血糖值，監(jiān)測動物的移植物功能，此后多達一周監(jiān)測3次。改進胰島植入、存活力和功能的治療干預將減少移植了邊緣胰島團塊的動物中達到正常血糖需要的時間。包括了兩組人邊緣胰島團塊的受體；一種接受每日IP注射GLP - 1 MMB (0.5 mg/kg)，對照組接受載體IP注射。
當至少連續(xù)兩次測量值^200mg/dL時，〖人為動物是血糖正常的。此外，通過在移植后30天以上，禁食過夜后在處理的和對照動物中進行的糖耐量測試(1.5 g/kg)評估移植物功能，以便研究葡萄糖刺激后的葡萄糖清除。達到血糖正常的動物進行移植物去除，以便排除天然胰島的殘留功能。
如圖22所示，在移植胰島的邊緣團塊后，相對于對照小鼠，GLP -1 MMB處理的小鼠更快達到正常血糖。此外，GLP-1MMB處理的小鼠表現(xiàn)更有效清除葡萄糖刺激。這些數(shù)據強烈表明GLP-1 MMB處理改進了移植的人胰島的植入、存活力和功能，并且支持將GLP-1 MMB用于供體(包4舌活供體和腦死亡供體)和進行胰島移才直程序的受體。這些結果證明了 GLP-1 MMB對移植到糖尿病受體的人胰島的有益作用。此外，數(shù)據表明用GLP-1 MMB處理改進了胰島植入、存活和功能，將成為胰島移植情況下的有價值的輔助治療。
實施例25: GLP-1 MMB對非人靈長動物胰島中反應于葡萄糖的
胰島素分泌的影響用酶消化和密度梯度純化分離非人靈長動物的胰島，并且分為兩組，在非組織培養(yǎng)處理的175 cm2燒瓶(Corning, MA) 中以約20,000 IE的密度37。C下在潮濕的混合95%空氣/5% C02中培養(yǎng)。一組胰島單獨培養(yǎng)，另一組在補加了 50 nM GLP-1 MMB的MM1
中培養(yǎng)。
培養(yǎng)2天后，收集胰島，對胰島樣品(2個來自對照，1個來自GLP -l MMB組)進行動態(tài)刺激測定，以評估葡萄糖濃度對胰島的胰島素分泌的影響。37。C下用含有125-mM NaCl, 5.9 - mM KC1, 1.28-mM CaCl2, 1.2-mM Mg Cl2, 25 - mM HEPES, 0.P/。牛血清白蛋白和3 - mM 葡萄糖的緩沖液將胰島預先灌注在色譜柱(Bi0-gel Fine 45-90 nm; Bio
-Rad)中，持續(xù)20分鐘。將胰島灌注在相同緩沖液中，持續(xù)十分鐘，然后依次暴露于11 -mM和3 - mM葡萄糖。在用3 - mM葡萄糖灌注期間每2分鐘收集灌注液的級分，刺激過程中每分鐘收集。通過ELISA 測定每個級分中的胰島素濃度。
在GLP-1 MMB存在下溫育胰島，i正明與未處理的對照相比，葡萄糖刺激的胰島素分泌顯著增加(圖23 )。該數(shù)據強烈支持GLP - 1 MMB 在體外對胰島素合成和分泌的正面影響，進一步支持其在胰島移植前的使用。在移植前用GLP-1 MMB增加胰島的效力，將導致在進行胰島移植程序的1型糖尿病個體中達到相同的療效所需的胰島數(shù)目減少。此外，從這些結果可以預測，用GLP-1 MMB處理個體，將增加^1島的體內效力。這進一步支持處理胰島移植的供體(包括活供體和腦死亡供體)和受體，以增加他們的邊緣胰島團塊的功能。
實施例26: GLP-1 MMB對獼猴邊緣團塊才莫型中同種異體胰島植
入和長期存活的影響。非人靈長動物邊緣團塊模型的使用使得人們能夠研究具有用數(shù)目減少的胰島逆轉糖尿病的潛能的移植方法。在邊緣團塊模型中，移植了大約5,000 IEQ/kg,或者說是達到正常血糖所需數(shù)目(通常是10,000正Q/kg)的一半。通過利用獲自相同同種異體供體的胰島，消除了供體和分離的變異。通過具有相似的移植前胰島素需要的猴的移植配對，可以觀察到與不接受試劑的猴相比，用設計用于增強胰島功能和限制早期胰島損失的試劑處理的猴中胰島植入增強。
受體是2-3歲的來自毛里求斯的獼猴，相同抹的供體大于四歲。用1250 mg/m2鏈脲霉素誘發(fā)糖尿病。早飯前用NPH胰島素處理糖尿病動物，晚飯前用NPH/Lantus處理，以試圖將血糖水平保持在150 - 300 mg/dl。誘發(fā)糖尿病后4周，猴進行胰高血糖素刺激，以證實沒有產生刺激的c -肽。
收獲供體器官，通過實施例A和實施例B引用的半自動方法分離胰島，然后是2次過夜的培養(yǎng)期，第1次是在37。C,然后是在22。C。在標準MM1中培養(yǎng)對照猴的胰島，在補加了 50 nM GLP - 1 MMB的MM1 中培養(yǎng)實驗猴的胰島。通過門靜脈到肝，猴進行了微剖腹手術和移才直。一對猴接受了來自相同供體的約5,000 IEQ/kg (按照上文描述培養(yǎng))；一只猴接受GLP - 1 MMB (0.2 mg/kg)每周皮下注射2次，而對照猴則沒有注射。對于對照和GLP-1 MMB處理的浙美，用臨床上使用的不含類固醇的免疫抑制(縮寫為SFIS，由低劑量FK506、高劑量雷帕霉素、抗 IL2R誘導治療組成)防止排斥。每日監(jiān)測動物兩次，以確定空腹和餐后血糖水平(后跟粘貼，血糖計)，并且在移植后根據需要用胰島素處理，將血糖維持在100 - 200 mg/dl范圍。每隔一周測定空腹c-肽，每8周進行靜脈內葡萄糖耐量測試(IVGTT)，以評估移植物功能。
GLP- 1 MMB處理的動物具有良好的葡萄糖控制，外源胰島素需要顯著減少(圖24A)。與未處理的對照相比，GLP-1 MMB處理的動物中HgbAlc的迅速減少進一步說明了葡萄糖水平的改進(圖24B)。該研究進一步支持將GLP - 1 MMB用于進^f亍胰島移植程序的1型糖尿病患者。
優(yōu)點這個新分子作為治療2型糖尿病的治療劑的應用，提供了超過其它GLP- 1類似物的一些優(yōu)點。例如，它可能延長GLP- 1肽的半衰期。而且，模擬體結構支架中的野生型GLP-1肽耐蛋白酶降解，尤其是DPP-IV。這可能使得野生型GLP-1肽能用于治療，而不是突變體肽。因為GLP - 1是一種天然的肽，所以可能在用GLP- 1模擬體治療的病人中的免疫反應比在用突變體GLP- 1類似物治療的病人中的免疫反應要小。另外，GLP-1 MMB的大尺寸可能防止了其穿越血腦屏障。這可能提供了一個優(yōu)點，因為惡心和焦慮與腦中GLP- 1結合的GLP -1R相關聯(lián)。此外，模擬體平臺導致在一個模擬體分子上的兩個肽的表達。這可能使GLP-1肽能夠相互作用，形成一個能夠增加對細胞表面GLP- 1受體親和力的二聚體配體。
應當清楚的是，可采用與上述說明和實例中具體描述方法不同的其它方法實踐本發(fā)明。
根據上述內容，本發(fā)明的許多改進和變化均是可能的，因而也在本發(fā)明的范圍內。
權利要求
1. 至少一種GLP-1CH1缺失模擬體核酸，包含編碼SEQ ID NO:2或4的氨基酸序列的至少一種多核苷酸，或與其互補的多核苷酸。
2. 至少一種GLP - 1 CHI缺失模擬體核酸，包含編碼SEQ ID NO: 7-14中至少一種氨基酸序列的至少一種多核苷酸，或與其互補的多核苦酸。
3. 至少一種GLP-1 CHI缺失模擬體核酸，包含編碼式(I)的多肽的至少一種多核苦酸(Pep(n) - L(o) - V(p) - H(q) - CH2(r) - CH3(s))(t)，其中P為至少一個具有生物活性的GLP-1肽、變體或衍生物，L為至少一個接頭序列，其可以是通過使模擬體具有可選取向和結合特性，從而為其提供了結構柔性的多肽，V為免疫球蛋白可變區(qū)C-末端的至少一個部分，H為免疫球蛋白可變鉸鏈區(qū)的至少一個部分，CH2為免疫球蛋白CH2恒定區(qū)的至少一個部分，CH3為免疫球蛋白CH3恒定區(qū)的至少一個部分，n為l-10的整凄t， o、 p、 q、 r、 s和t可獨立地為0-10 的整數(shù)。
4. 至少一種GLP-1 CHI缺失模擬體多肽，包含SEQ ID NO: 2或 4中的所有連續(xù)氨基酸。
5. 至少一種GLP-1 CHI缺失模擬體多肽，包含SEQ ID NO: 7-14中至少一種的所有連續(xù)氨基酸。
6. 至少一種GLP-1 CHI缺失模擬體多肽，包括式(I)的多肽(Pep(n) - L(o) - V(p) - H(q) - CH2(r) - CH3(s))(t)，其中P為選自SEQ ID NO: 1和6的至少一種具有生物活性的GLP - 1 肽，L選自GS、 GGS、 GGGS( SEQIDNO: 16) 、 GSGGGS ( SEQ ID NO: 17) 、 GGSGGGS ( SEQIDNO: 18) 、 GGSGGGSGG ( SEQ ID NO: 19) 和GGGSGGGSGG( SEQ ID NO: 20 ); V選自GTLVTVSS( SEQ ID NO: 21 ) 、 GTLVAVSS ( SEQ ID NO: 22 ) 、 GTAVTVSS ( SEQ ID NO: 23 )、 TVSS ( SEQ ID NO: 24 )和AVSS ( SEQ ID NO: 25 ) ; H為 EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGP ( SEQIDNO: 26) ， CH2為SVFLFPPAK( SEQ ID NO: 43 ) ， CH3為GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCL2dfcMTiAS ^乙HO ' ( 8乙ONL dl ^)3S ) d00VV3dVd0ddDdcK)入2S3 ^ H : ( H :ON dl t)3S ) SSAV 4 (，乙ON dl D3S ) SSA丄、(￡乙ON ai 。3S ) SSA丄AV工O 、(乙乙ON ai D3S ) SSAVATLO 、 ( l乙 :ONL ai b3S ) SSA丄A1丄0 t|來八(0乙ON CI D3S ) DOSOOOSODO 4 (61 :ON CQ D3S) 00S090S00 、 (81 :ONL CII加S ) S090SOD 、("ONdlb3S ) SOOOSO 、 (91 :ON CQ t)3S ) SOOO 、SOD 、SO哮宋l '鄰I-cTIO W莉劣錄禾單1f W 9 :ON ai D3S+—、f百^d+葉 '(0((s)OT3 —(咖。—(b)H — (d)A — (o)i — (u)d3j):鄰《^(I)^鄰^ '鄰《浙辨錄^游IHO l - cHO '8 。碌箭^ 01 - 0《，^被J^Ks " 、b 、d 、o '豫昜W01-u '(外ONCII加S)。丄lSADNXLIM33bScIcn工入ADcI3Hd^)9 ^ ￡H3 ' ( W :ON dl t)3S )2dcLTUAS ^乙H3 ' U乙0N dl 。3S ) cK)CrLmcIVdDScI0(W0入3S3 ^ H : ( S乙ON ai D3S ) SSAV 4 ( W : ON dl D3S ) SSA1 、(￡乙0N ai t)3S ) SSA丄AV工O 、(乙乙0N dl D3S ) SSAVA1工0 、 ( l乙 :0N ai b3S ) SSA丄Al丄O淳來A : ( 0乙0N dl D3S ) OOSOOOSOOO 4(61 :〇N ai D3S ) OOSOOOSOO 、 ( 81 :0N GI b3S ) SOOOSOO 、"1 :0NLdlD3S) SOODSO 、 (91 :ON ai D3S ) SOOO 、SOO 、S0淳 T['鄰I - cHO W到'劣彿下單首W 9 :0N ai D3Sd +常 '(l)((s)eH?！繦O — (b)H — (d)A — (o)T[ — (u)d3d)(I) ^孕f^ '鄰f浙辨錄》游H0 l - cHO #—、^百 ?！飞莩衈 01 - 0《，^"被丘l確s 、J 、b 、d 、o '碌^W01-l《 (忭ON ai加S ) ，dSlSlS2b丄入HNITIV3腦ASOSilANObD叢 n為l-IO的整數(shù)，o、 p、 q、 r、 s和t可獨立地為0 - 10的整凄t。
7.
8.
9.至少一種GLP-1 CH1缺失模擬體多肽，包括式(I)的多肽(Pep(n) - L(o) - V(p) - H(q) - CH2(r) - CH3(s))(t), 其中P為至少一個具有生物活性的GLP-1肽、變體或衍生物，L為至少一個接頭序列，其可以是通過使模擬體具有可選取向和結合特性，從而為其提供了結構柔性的多肽，V為免疫球蛋白可變區(qū)C-末端的至少一個部分，H為免疫球蛋白可變鉸鏈區(qū)的至少一個部分，CH2為EKTISKAK( SEQ ID NO: 43 ), CH3為GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQ(SEQ ID NO:44 ) ， n為1 - 10的整凄t， o、 p、 q、 r、 s和t可獨立:t也為0-10的整凄t。 10.至少一種GLP-1 CHI缺失模擬體多肽，包括式(I)的多肽(P印(n) - L(o) - V(p) - H(q) - CH2(r) - CH3(s))(t)，其中P為至少一個具有生物活性的GLP-1肽、變體或衍生物，L為至少一個接頭序列，其可以是通過使模擬體具有可選取向和結合特性，從而為其提供了結構柔性的多肽，V為免疫球蛋白可變區(qū)c-末端的至少一個部分，H為免疫球蛋白可變鉸鏈區(qū)的至少一個部分，CH2為EKTISKAK( SEQ ID NO: 45 ), CH3為GQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQ(SEQ ID NO:46 ) , n為1 - 10的整數(shù)，o、 p、 q、 r、 s和t可獨立地為0-10的整凄t。 11.至少一種GLP-1 CHI缺失模擬體多肽，包括式(I)的多肽(Pep(n) - L(o) - V(p) - H(q) - CH2(r) - CH3(s))(t)，其中P為至少一個SEQ ID NO: 6的具有生物活性的GLP - 1肽，L為至少一個接頭序列，其可以是通過使模擬體具有可選取向和結合特性，從而為其提供了結構柔性的多肽，V為免疫球蛋白可變區(qū)C-末端的至少一個部分，H為免疫球蛋白可變鉸鏈區(qū)的至少一個部分，CH2為免疫球蛋白CH2恒定區(qū)的至少一個部分，CH3為免疫球蛋白CH3恒定區(qū)的至少一個部分，n為l-io的整凄t, o、 p、 q、 r、 s和t可3蟲立i也為0-10的整數(shù)。
10.
11.
12. 至少一種GLP-1 CH1缺失模擬體多肽，包括式(I)的多肽(Pep(n) - L(o) - V(p) - H(q) - CH2(r) - CH3(s》(t), 其中P為至少一個具有生物活性的GLP-1肽、變體或書f生物，L選自 GS、 GGS、 GGGS (SEQIDNO: 16) 、 GSGGGS ( SEQ ID NO: 17)、 GGSGGGS (SEQ ID NO: 18) 、 GGSGGGSGG (SEQ ID NO: 19)和 GGGSGGGSGG ( SEQIDNO: 20); V為免疫球蛋白可變區(qū)C -末端的至少一個部分，H為免疫球蛋白可變鉸鏈區(qū)的至少一個部分，CH2為免疫球蛋白CH2恒定區(qū)的至少一個部分，CH3為免疫球蛋白CH3恒定區(qū) 的至少一個部分，n為l-IO的整I史，o、 p、 q、 r、 s和t可獨立地為0 -10的整數(shù)。
13. 至少一種GLP-1 CHI缺失模擬體多肽，包括式(I)的多肽(Pep(n) - L(o) - V(p) - H(q) - CH2(r) - CH3(s))(t)，其中P為至少一個具有生物活性的GLP - 1肽、變體或衍生物；L為至少一個接頭序列，其可以是通過使模擬體具有可選取向和結合特性，從而為其提供了結構柔性的多肽；V選自GTLVTVSS ( SEQ ID NO: 21)、 GTLVAVSS ( SEQ ID NO: 22 ) 、 GTAVTVSS ( SEQ ID NO: 23 ) 、 TVSS (SEQIDNO: 24)和AVSS (SEQIDNO: 25) ; H為免疫球蛋白可變4交<隨區(qū)的至少一個部分；CH2為免疫3求蛋白CH2恒定區(qū)的至少一個部分；CH3為免疫球蛋白CH3恒定區(qū)的至少一個部分；n為1 - 10的整數(shù)，o、 p、 q、 r、 s和t可獨立地為0-10的整凄t。
14. 至少一種GLP-1 CH1缺失模擬體多肽，包括式(I)的多肽(Pep(n) - L(o) - V(p) - H(q) - CH2(r) - CH3(s))(t), 其中P為至少一個具有生物活性的GLP-1肽、變體或衍生物，L為至少一個接頭序列，其可以是通過使模擬體具有可選取向和結合特性，從而為其提供了結構柔性的多肽；V為免疫球蛋白可變區(qū)C-末端的至少一個部分，H選自EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGP ( SEQ ID NO: 26 )， ESKYGPPCPSCPAPEFLGGP ( SEQ ID NO : 27 )和 ESKYGPPCPP CPAPEAAGGP ( SEQ ID NO: 28 ) , CH2為免疫球蛋白CH2恒定區(qū)的至少一個部分，CH3為免疫球蛋白CH3恒定區(qū)的至少一個部分，n為1 -10的整凄t， o、 p、 q、 r、 s和t可獨立地為0 - 10的整凄史。
15. 至少一種GLP-1 CH1缺失模擬體多肽，包括式(I)的多肽(Pep(n) — L(o) — V(p) - H(q) — CH2(r) — CH3(s》(t)，其中P為至少一個具有生物活性的GLP-1肽、變體或衍生物，L為至少一個接頭序列，其可以是通過使模擬體具有可選取向和結合特性，從而為其提供了結構柔性的多肽，V為免疫球蛋白可變區(qū)C-末端的至少一個部分，H選自EPKSADKTHTCPPCPAPEAAGGP ( SEQ ID NO: 29 )、 EPKSADKTHTCPPCPAPELAGGP ( SEQ ID NO: 30 ) 、 EPKSADKTHT CPPCPAPEALGGP( SEQ ID NO: 31 ) 、 EPKSADKTHTCPPCPAPELEGGP(SEQ ID NO: 32) 、 EPKSSDKTHTCPPCPAPEFLGGP ( SEQ ID NO: 33) 、 EPKSADKTHACPPCPAPELLGGP ( SEQ ID NO: 34) 、 EPKSADK AHTCPPCPAPELLGGP ( SEQ ID NO: 35 )和EPKSADKTHTCPPC PAPELLGGP ( SEQ ID NO: 36 ) 、 ADKTHTCPPCPAPELLGGP ( SEQ ID NO: 37) 、 THTCPPCPAPELLGGP (SEQ ID NO: 38) 、 ESKYGPPC PSCPAPEAAGGP( SEQ ID NO: 39 ) 、 ESKYGPPCPPCPAPELLGGP ( SEQ ID NO: 40 ) 、 CPPCPAPELLGGP( SEQ ID NO: 41 )及CPPCPAPEAAGGP(SEQ ID NO: 42) , CH2為免疫球蛋白CH2恒定區(qū)的至少一個部分， CH3為免疫球蛋白CH3恒定區(qū)的至少一個部分，n為l-10的整數(shù)，o、 p、 q、 r、 s和t可獨立地為0-10的整凄t。
16. 至少一種GLP-1 CHI缺失模擬體多肽，包括式(I)的多肽(Pep(n) - L(o) - V(p) - H(q) - CH2(r) - CH3(s》(t)，其中P為至少一個具有生物活性的GLP-1肽、變體或衍生物，L為至少一個接頭序列，其可以是通過使模擬體具有可選取向和結合特性，從而為其提供了結構柔性的多肽；V為免疫球蛋白可變區(qū)C-末端的至少一個部分，H為免疫球蛋白可變鉸鏈區(qū)的至少一個部分，CH2為免疫球蛋白CH2恒定區(qū)的至少一個部分，CH3為免疫球蛋白CH3恒定區(qū)的至少一個部分，n為1 - 10的整lt， o、 p、 q、 r、 s和t可獨立;也為0 - 10 的整數(shù)。
17. 根據權利要求1 - 16任一項中所述的GLP - 1 CHI缺失模擬體核酸或GLP- 1 CHI缺失模擬體多肽，其中所述多肽具有至少一種P多肽的至少一種活性。
18. —種抗獨特型單克隆或多克隆抗體，融合蛋白，或其片段，其與權利要求4 - ]6任一項中的至少一種GLP - 1 CHI缺失模擬體多肽特異性結合。
19. 根據權利要求1 - 3任一項中所述的GLP-1 CH1缺失模擬體核酸或編碼權利要求4-18任一項中的至少一種GLP - 1 CH1缺失模擬體多肽或GLP-1 CH1缺失模擬體抗體的GLP-1 CHI缺失模擬體核酸，或與其互補的多核苷酸。
20. 包含權利要求19的至少一種分離核酸的GLP - 1 CHI缺失模擬體載體。
21. 包含權利要求19的分離核酸的GLP - 1 CHI缺失模擬體宿主細胞。
22. 根據權利要求21中所述的GLP - 1 CHI缺失模擬體宿主細胞，其中所述宿主細胞為選自COS-l、 COS-7、 HEK293、 BHK21、 CHO、 BSC - 1、 HepG2、 653、 SP2/0、 293、 NSO、 DG44 CHO、 CHO Kl 、 HeLa、骨髓瘤或淋巴瘤細胞，或上述細胞的任意衍生、無限增殖化或轉化細胞中的至少一種細胞。
23. —種生成至少一種GLP - 1 CHI缺失模擬體多肽或GLP - 1 CHI 缺失模擬體抗體的方法，包括在體外、體內或原位條件下，翻譯權利要求19的核酸，使GLP-1 CHI缺失模擬體或抗體以可檢測或可回收的數(shù)量被表達。
24. —種組合物，包含權利要求1 - 19任一項中的至少一種GLP-1 CHI缺失模擬體核酸、GLP - 1 CHI缺失模擬體多肽，或GLP - 1 CHI缺失模擬體抗體。
25. 才艮據權利要求24中所述的組合物，其中該組合物進一步包含至少一種藥學可接受的載體或稀釋劑。
26. 根據權利要求24中所述的組合物，進一步包括至少一種組合物，該組合物含有治療有效量的至少一種化合物、組合物或多肽，該化合物、組合物或多肽選自糖尿病或胰島素代謝相關藥物、可檢測標記或報道分子、TNF拮抗劑、抗感染藥物、心血管(CV)系統(tǒng)藥物、中樞神經系統(tǒng)(CNS)藥物、自主神經系統(tǒng)(ANS)藥物、呼吸道藥物、胃腸(GI)道藥物、激素藥物、用于平4軒體液或電解液的藥物、血液系統(tǒng) 藥物、抗腫瘤藥物、免疫調節(jié)藥物、眼、耳或鼻藥物、局部用藥物、營養(yǎng)藥、細胞因子或細胞因子拮抗劑中的至少一種。
27. 根據權利要求24中所述的組合物，其形式為選自液體、氣體或干燥物、溶液、混合物、懸液、乳狀液或膠體、凍干制劑或粉末中的至少一種。
28. —種診斷或治療細胞、組織、器官或動物中的GLP-1相關狀況的方法，包括(a)使細胞、組織、器官或動物接觸或對其施用一種組合物，該組合物含有有效量的權利要求1 - 19任一項中的至少一種GLP- 1 CH1缺失模擬體核酸、多肽或抗體。
29. 根據權利要求28中所述的方法，其中GLP- 1相關狀況是糖尿病或充血性心力衰竭。
30. 根據權利要求28中所述的方法，其中所述有效量為每千克上述細胞、組織、器官或動物0.0001 - 50mg的GLP - 1 CH1缺失才莫擬體抗體；0.1 - 500mg的上述GLP - 1 CH1缺失才莫擬體；或0.0001 - 100 W g的上述GLP — 1 CH1在夾失才莫私乂體斗亥i^。
31. 根據權利要求28中所述的方法，其中上述接觸或施用是通過選自腸胃外、皮下、肌內、靜脈內、關節(jié)內、支氣管內、腹內、嚢內、軟骨內、腔內、體腔內、小腦內、腦室內、結腸內、宮頸內、胃內、肝內、心肌內、骨內、骨盆內、心包內、腹膜內、胸膜內、前列腺內、肺內、直腸內、腎內、視網膜內、脊柱內、滑膜內、胸內、子宮內、膀胱內、病變內、藥團、陰道、直腸、頰、舌下、鼻內或經皮途徑中的至少一種模式實現(xiàn)的。
32. 根據權利要求28中所述的方法，進一步包括在上述(a)接觸或施用之前、同時或之后，施用至少一種組合物，該組合物含有有效量的至少一種化合物或多肽，該化合物或多肽選自糖尿病或胰島素代謝相關藥物、可檢測標記或受體、TNF拮抗劑、抗感染藥物、心血管(CV) 系統(tǒng)藥物、中樞神經系統(tǒng)(CNS)藥物、自主神經系統(tǒng)(ANS)藥物、呼吸道藥物、胃腸(GI)道藥物、激素藥物、用于平衡體液或電解液的藥物、血液系統(tǒng)藥物、抗腫瘤藥物、免疫調節(jié)藥物、眼、耳或鼻藥物、局部用藥物、營養(yǎng)藥、細胞因子或細胞因子拮抗劑中的至少一種。
33. 根據權利要求28中所述的方法，其中所述有效量降低有需要的動物中的血糖水平。
34. 根據權利要求28中所述的方法，其中所述有效量增加胰島素生成細胞的胰島素分泌。
35. 根據權利要求28中所述的方法，其中所述有效量防止胰島素生成細^>的凋亡。
36. 根據權利要求28中所述的方法，其中所述有效量增加胰島素生成細胞的增殖。
37. —種處理細胞、組織、器官或動物的方法，包括使其接觸或對其施用有效量的權利要求1 - 19任一項中的至少一種GLP - 1 CH1缺失模擬體核酸、多肽或抗體。
38. 根據權利要求37中所述的方法，其中所述有效量為每千克上述細胞、組織、器官或動物0.0001 - 50mg的GLP - 1 CH1缺失模擬體抗體；0.1 - 500mg的上述GLP - 1 CH1缺失才莫擬體；或0.0001 - 100 ju g的上述GLP - 1 CH1缺失模擬體核酸。
39. 根據權利要求37中所述的方法，其中上述接觸或施用是通過選自腸胃外、皮下、肌內、靜脈內、關節(jié)內、支氣管內、腹內、嚢內、軟骨內、腔內、體腔內、小腦內、腦室內、結腸內、宮頸內、胃內、肝內、心肌內、骨內、骨盆內、心包內、腹膜內、胸月蕘內、前列腺內、肺內、直腸內、腎內、視網膜內、脊柱內、滑膜內、胸內、子宮內、膀胱內、病變內、藥團、陰道、直腸、頰、舌下、鼻內或經皮途徑中的至少一種模式實現(xiàn)的。
40. 根據權利要求37中所述的方法，進一步包括在上述(a)接觸或施用之前、同時或之后，施用至少一種組合物，該組合物含有有效量的至少一種化合物或多肽，該化合物或多肽選自糖尿病或胰島素代i射相關藥物、可檢測標記或受體、TNF拮抗劑、抗感染藥物、心血管(CV) 系統(tǒng)藥物、中樞神經系統(tǒng)(CNS)藥物、自主神經系統(tǒng)(ANS)藥物、呼吸道藥物、胃腸(GI)道藥物、激素藥物、用于平衡體液或電解液的藥物、血液系統(tǒng)藥物、抗肺瘤藥物、免疫調節(jié)藥物、眼、耳或鼻藥物、局部用藥物、營養(yǎng)藥、細胞因子或細胞因子拮抗劑中的至少一種。
41. 根據權利要求37中所述的方法，其中所述有效量降低有需要的動物中的血糖水平。
42. 根據權利要求37中所述的方法，其中所述有效量增加胰島素生成細胞的胰島素分泌。
43. 根據權利要求37中所述的方法，其中所述有效量防止胰島素生成細胞的凋亡。
44. 根據權利要求37中所述的方法，其中所述有效量增加胰島素生成細胞的增殖。
45. —種裝置，含有權利要求1 - 19任一項中的至少一種分離的 GLP-1 CH1缺失模擬體多肽、抗體或核酸，其中該裝置適用于通過選自腸胃外、皮下、肌內、靜脈內、關節(jié)內、支氣管內、腹內、嚢內、軟骨內、腔內、體腔內、小腦內、腦室內、結腸內、宮頸內、胃內、肝內、心肌內、骨內、骨盆內、心包內、腹膜內、胸膜內、前列腺內、肺內、直腸內、腎內、視網膜內、脊柱內、滑膜內、胸內、子宮內、膀胱內、病變內、藥團、陰道、直腸、頰、舌下、鼻內或經皮途徑中的至少一種模式，接觸或施用所述至少一種GLP-1 CH1缺失模擬體多肽、抗體或核酸。
46. —種用于人藥物或診斷用途的制品，包括包裝材料和容器，該容器含有權利要求1 - 19任一項中的至少一種分離的GLP - 1 CH1缺失模擬體多肽、抗體或核酸。
47. 權利要求46的制品，其中上述容器為腸胃外、皮下、肌內、靜脈內、關節(jié)內、支氣管內、腹內、嚢內、軟骨內、腔內、體腔內、小腦內、腦室內、結腸內、宮頸內、胃內、肝內、心1幾內、骨內、骨盆內、心包內、腹膜內、胸膜內、前列腺內、肺內、直腸內、腎內、視網膜內、脊柱內、滑膜內、胸內、子宮內、膀胱內、病變內、藥團、陰道、直腸、頰、舌下、鼻內或經皮送遞裝置或系統(tǒng)的一個組成部分。
48. —種用于生成權利要求1 - 19任一項中的至少一種分離的GLP - 1 CH1缺失模擬體多肽、抗體或核酸的方法，該方法包括提供至少一種能夠以可檢測或可回收的量表達上述多肽、抗體或核酸的宿主細胞、轉基因動物、轉基因植物、植物細胞。
49. 由權利要求48的方法所生成的至少一種GLP - 1 CH1缺失模擬體多肽、抗體或核酸。
全文摘要
本發(fā)明涉及至少一種新的人GLP-1模擬體或特定部分或變體，包括編碼至少一種GLP-1模擬體或特定部分或變體的分離核酸、GLP-1模擬體或特定部分或變體、載體、宿主細胞、轉基因動物或植物，及其制備和使用方法，包括治療組合物、方法和裝置。
文檔編號C07K14/00GK101389346SQ200580049931
公開日2009年3月18日申請日期2005年12月22日優(yōu)先權日2005年3月28日
發(fā)明者K·T·奧奈爾, K·皮查申請人:森托科爾公司

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該技術已申請專利。僅供學習研究，如用于商業(yè)用途，請聯(lián)系技術所有人。
技術研發(fā)人員：K.T.奧奈爾;K.皮查
技術所有人：森托科爾公司
我是此專利的發(fā)明人

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