專利名稱：抑制hiv tat反式激活作用的化合物的制作方法
本案是分案中請，母案申請?zhí)枮?5196035.0(國際申請?zhí)朠CT/US95/11779)，申請日為1995年9月22日，發(fā)明名稱“抑制HIVTAT反式激活作用的化合物”。
本發(fā)明背景1.本發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及1，4-雙-(3，4-二羥基苯)-2，3-二甲基丁烷(去甲二氫愈創(chuàng)木酸，NDGA)的衍生物的分離、純化和鑒別的方法。這些衍生物來源于雜酚油木(Larrea tridentata，Zygophyllaceae)葉片及花的分離和提取，它們與NDGA一起可以抑制包括HIV病毒的慢病毒中Tat的反式激活作用。
2.相關(guān)技術(shù)Tat是人類免疫缺損病毒(HIV)基因表達的一個反式激活蛋白。在HIV基因表達中，Tat是必不可少的兩個或更多的病毒調(diào)節(jié)因子之一(Tat and Rev)。Tat的作用是與TAR RNA結(jié)合，并從長末端重復(fù)(LTR)啟動子方向激活轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。
Tat蛋白質(zhì)使轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的延長得以穩(wěn)定，并且也已經(jīng)證明Tat蛋白質(zhì)參與了轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的啟動。前人的許多研究證明Tat調(diào)控與抗體相關(guān)的T細(xì)胞增生的減少，對免疫反應(yīng)的失敗具有重大作用。Tat還直接刺激卡波濟細(xì)胞(Kaposi’s cell)的生長。
由于Tat沒有明顯的細(xì)胞同源物并且它是一個很重要的陽性調(diào)節(jié)因子，因此Tat已成為人們開發(fā)抗愛滋病(AIDS)藥物的一個很有吸引力的目標(biāo)(見圖1)。另一方面，與現(xiàn)在也得到一些HIV反轉(zhuǎn)錄酶的抑制物(AZT，DDT)或防止再次感染的潛在的蛋白酶抑制物相比，抑制病毒基因Tat調(diào)控的整合前病毒DNA表達的抑制物將在早期捕捉到病毒(Hsu et al.，Science 2541799-1802，1991)。
對在真核宿主細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄和后期轉(zhuǎn)錄水平上控制基因表達的抑制物的研究，近來使對現(xiàn)Tat功能的定量評估成為可能(Sim，Ann.N.Y.Acad，Sci.61664-70，1990)。為了篩選抑制物用于Tat調(diào)節(jié)的反式激活作用(Tat-TRS)，抑制物將分泌胎盤堿性磷酸酶(SEAP)的識別基因放入質(zhì)粒pBC12/HIV/SEAP并置于HIV-1 LTR啟動子的控制之下。Tat編碼活性由另一個質(zhì)粒pBC12/CMV/t2提供。COS細(xì)胞與這兩種質(zhì)粒的短暫共轉(zhuǎn)染，使得堿性磷酸酶分泌到培養(yǎng)基中，再被用樣品色度計分析(Berger et al.，Gene 661-10，1988)。因此，對SEAP的測定，間接提供了Tat反式激活作用的鑒別方法。一個抑制因子應(yīng)該降低SEAP的活性，其原因是由于Tat蛋白質(zhì)(Tat-TRS)引起的HIV-I LTR啟動子的反式激活作用抑制了SEAP m RNA表達的結(jié)果。
本發(fā)明概述在本發(fā)明申請中，我們發(fā)現(xiàn)沙漠植物雜酚油木(Larreatridentata)對Tat-TRS有抑制活性。在從熱帶雨林和被傳統(tǒng)用于抗病毒感染的沙漠藥用植物中所提取的幾種植物成份中，只有雜酚油木(Larrea tridetata)的葉和花的全部提取物對Tat-TRS有抑制作用。對慢性感染了HIV病毒的人成淋巴細(xì)胞，這種提取物也可以抑制HIV細(xì)胞病理作用，這一作用可以用新發(fā)現(xiàn)的可溶甲脂方法測定(Weislow etal.，JNCI 81577-586，1989)。
本發(fā)明所涉及的化合物具下述結(jié)構(gòu)式 其中R1，R2，R3和R4分別選自HO-、CH3O-和CH3(C＝O)O-基團，并且R1、R2、R3和R4不同時是HO-基團。
每種化合物都是從雜酚油木的葉與花分離提取而來，并且每種化合物都是1，4-雙-(3，4-二羥基苯)-2，3-二甲基丁烷(去甲二氫愈創(chuàng)木酸，NDGA)的衍生物。
除此以外，將DNGA或一種其衍生物給予細(xì)胞，NDGA和每一種其衍生物可以抑制包括HIV在內(nèi)的慢病毒的Tat反式激活作用。


圖1圖解說明HIV-1的生活史，以及包括Tat-TRS抑制物在內(nèi)的可能性治療物的不同作用位點。1表示轉(zhuǎn)錄步驟，2表示病毒調(diào)節(jié)性的蛋白依賴性反式激活步驟。
圖2表示在標(biāo)準(zhǔn)SEAP測定中誘導(dǎo)出的分泌堿性磷酸酶的水平。
圖3表示在分泌堿性磷酸酶(SEAP)測定中，雜酚油木葉花提取物對Tat-TRS的抑制活性。
圖4表示以分析用不易損壞的毛細(xì)管交聯(lián)5％苯甲基硅氧烷(HP-5)柱子的氣相色譜(GC)方法，分析在組分Lo中植物衍生的HIVTat抑制物質(zhì)。組分Lo是四種成份的混合物。各洗脫時間(分鐘)表示在峰頂上。
圖5表示以分析用不易損壞的毛細(xì)管交聯(lián)5％苯甲基硅氧烷(HP-5)柱子的氣相色譜(GC)方法，分析在組分Gr中植物衍生物的HIV Tat抑制物質(zhì)。組分Gr是一復(fù)合混合物。每一成份被洗脫下的時間(分鐘)標(biāo)在峰頂上。
圖6表示植物衍生物中單一化合物Malachi 45-6(Mal4)對Tat誘導(dǎo)的SEAP表達水平的抑制以及NOGA在分泌的堿性磷酸酶(SEAP)測定中的水平。
圖7描述在分別兩個實驗中，用Mal4分別處理感染了HIV和沒有感染上HIV的CEM-SS細(xì)胞，用XTT甲脂的產(chǎn)生進行定量用以衡量活細(xì)胞。在實驗1中，未經(jīng)Mal4處理的感染了HIV的細(xì)胞中XTT甲脂的產(chǎn)生是8.9％，在實驗2中是7.5％。在實驗1中，未感染HIV的細(xì)胞用·-·表示，感染的細(xì)胞用×-×表示。在實驗2中，未感染的細(xì)胞用·...·表示，感染的細(xì)胞用×...×表示。EC50是4.25μg/ml或13.4μM。IC50估計為100μg/ml或325μM。
圖8表示雜酚油木NDGA衍生物的逆流色譜(CCC)和分級分離過程。
最佳實施例本發(fā)明揭示1，4-雙-(3，4-二羥基苯)-2，3-二甲基丁烷或去甲二氫愈創(chuàng)木酸(NDGA)的衍生物的分離、純化和鑒別的方法。根據(jù)下面的各種方法，分離、純化和鑒別NDGA的每一種衍生物。
材料和方法細(xì)胞系在補充加入10％小牛胎兒血清(FCS)和抗菌素的Isocove修改過的Dulbecco培養(yǎng)基中(Isocove’s Modified Dulbecco’sMedium)(IMDM)，培養(yǎng)帶有SV40原始復(fù)制段的COS-7細(xì)胞。將細(xì)胞放在37℃，濕潤的加有95％O2/5％CO2的溫箱中培養(yǎng)。
質(zhì)粒質(zhì)粒pBC12/HIV SEAP包含Tat敏感的HIV LTR啟動子與SEAP識別基因，但不具備Tat編碼的功能，用這種質(zhì)粒表達SEAP的基本活性；質(zhì)粒pBC12/CMV/t2提供Tat編碼的功能，如誘發(fā)SEAP。質(zhì)粒pBC12/RSV/SEAP包括構(gòu)造的禽內(nèi)瘤病毒(RSV)的Tat非敏感的LTR啟動子，作為陽性對照。上述所有質(zhì)粒來自杜克醫(yī)學(xué)中心(DukeMedical Center)的Bryan Cullen博士。質(zhì)粒pSEAP和pBKCMV，以及HIVLTR和Tat DNA購于Clontech和Stratagene公司。用大腸肝菌(E.coli)MC1061菌株完成質(zhì)粒的轉(zhuǎn)換，該菌株來自耶魯大學(xué)(YaleUniversity)，生物系的Barbara Bachmann博士。大腸肝菌MC1061菌株也可從Clontech公司購買到。使用Qiagen提純盒(Qiagen公司)純化所有質(zhì)粒DNA。
化學(xué)試劑二乙醇胺(#31589)和P-硝基苯磷酸酯(#71768)購于Fluka Biochemika公司，L-高精氨酸(#H-1007)購于SigmaCo.公司。脂精胺DOGS(Transfectam，#E123A，Promega)用于DNA轉(zhuǎn)染的研究。
植物試驗材料根據(jù)醫(yī)學(xué)藥理學(xué)的要求，采集雜酚油木的葉片和花。干燥植物材料并用一個帶有3mm篩孔的Willy研磨機研磨。在試驗性的研究中，用1g這種植物粉末，加入氯仿∶甲醇溶液連續(xù)浸泡并提取。提取物被濃縮至殘留物。所得到的總重量是176mg的粗提物用3ml己醇處理7次。該步驟產(chǎn)生137mg不溶于已醇的物質(zhì)(HI)和31mg可溶于己醇的物質(zhì)(HS)。所有這些提取按步驟被SiO2TLC與硫酸鈰炭化法檢驗2％CeSO4(W/V)于5.6％H2SO4(V/V)中，并用SEAP測定抗Tat-TRS的活性。
對于SEAP測定法，被測試的材料溶解在以無鈣/鎂離子的PBS制備的10％DMSO溶液中。離心懸浮液，并用Millex-GS 22μm(Millipore)的無菌過濾器過濾原液(10mg/ml)。適當(dāng)稀釋原液，使最終DMSO在PBS中的濃度為0.2％，以得到各種濃度的測試化合物。
應(yīng)用逆流色譜法(CCC)進行不同的分級分離以及活性成份的純化基于上述SEAP檢測的分餾初步結(jié)果，用CCC方法進一步分級分離HI中的活性成份。因而得到被認(rèn)為具有活性的兩種主要活性餾份，定為“綠色”和“黃色”組分。上述識別出主要活性組分的研究，促進了為得到大量的綠色和黃色組分物，而對大量的植物碎末材料進行全面的分級分離。這種分級分離采用了101.4g的植物碎末，并用己醇處理作為開始，如表1所述。
利用逆流液體-液體分配色譜法，使用如Ito和Conway(CRC.Critical Reviews of Analytical Chemistry 1765et seq；1986)所描述的萬能橫軸行星式離心機(CPC)對氯仿∶水提取后所得到有機相的主要化合物進一步分級分離。最佳溶劑體系是己醇∶EtOAC∶MeOH∶0.5％NaCl的混合物，它們之間的比例為6∶4∶5∶5，溶劑上層(有機層)為流動相。5g有機分離的溶解到23ml具有兩相的混合溶劑中，并使其通過回路閥放入到蛇形管中。當(dāng)轉(zhuǎn)速為800rpm時，流動相經(jīng)蛇形管泵出。在流速大約為每分鐘4ml時，固定相約損失32％(保留下68％)。流動相進入流出液后，收集流動相的分離物，并將其蒸發(fā)至干燥，用TLC檢測，并相應(yīng)地將其合并為五批流頭(SF)，綠色(Gr)，黃色(Ye)，紅色和固定相(Stp)。然后所有這些分離物用SEAP方法來測定抗Tat-TRS的活性。
利用CCC方法，使用一個行星蛇形管式離心機，該離心機也稱作Ito多層蛇形管分離-提取器(Ito and Conway，CRC.Cribical Reviewsof Analytical Chemistry 1765et seq，1986)對上述所得的綠色和黃色分離物進一步純化。溶劑是己醇∶EtoAC∶MeoH∶0.5％NaCl混合物(7∶3∶5∶5)。200mg綠色分離物純化出6.8mg被稱作Gr的成份，總產(chǎn)量大約是原始植物碎末的0.051％。用類似的方法，從黃色分離物中可純化出9.3mg被稱作Lo的成份。這些被提純了的成份(Lo和Gr)各自都由幾種化合物組成。純化的Lo和Gr作為“原”分離物，在測定其生物活性和用于更進一步的特征研究前，將它們保存在4℃條件下。
細(xì)胞培養(yǎng)和DNA轉(zhuǎn)染COS細(xì)胞培養(yǎng)在如前所述的培養(yǎng)基中(Cullen，Cell 46973-982，1986)。應(yīng)用經(jīng)過修改的脂精胺(Transfectam，Promega#E123A)方法，進行DNA轉(zhuǎn)染，該方法最早在其它地方描述過(Loeffler and Behr，Methods in Enzymology217599-618，1993)。簡單地說，DNA轉(zhuǎn)染前一天，直徑為17mm的平底培養(yǎng)平板的Linbro24孔，以0.5ml的0.1％明膠無菌液預(yù)處理。該平板在無菌通風(fēng)罩內(nèi)放置1小時(除特別指出以外，所有轉(zhuǎn)染步驟均在無菌通風(fēng)罩內(nèi)進行)。明膠溶液被吸出后，用0.5ml補充加入10％小牛胎盤血清和抗菌素(完全培養(yǎng)基)的IMDM培養(yǎng)液沖洗平板。COS細(xì)胞以每一個17mm板大約1.5×105個細(xì)胞的密度接種，并在37℃，濕潤的，95％O2/5％CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)30-50％的細(xì)胞融合時，進行DNA轉(zhuǎn)染。按照生產(chǎn)廠家的建議，將Transfectam制劑，DOGS配制成在10％的乙醇蒸餾水中的濃度為1mg/0.380ml(2.38mg/ml or3.4mM)。
在無菌試管中加入兩種溶液組成的轉(zhuǎn)染制劑a)溶液A中含有150mM無菌NaCl溶液十質(zhì)粒DNAs(非選擇性/選擇性基團的比例為2∶1)每孔加入0.35μg的pBC12/HIV/SEAP+0.175μg的pBC12/CMB/t2(對Tat功能編碼)。
b)溶液B含有等體積的150mM NaCl和Transfectam制劑，該制劑為DNA總量的6倍。將溶液A和B各自均化并立刻混合。
反應(yīng)進行十分鐘。同時，將生長培養(yǎng)基從亞融合的COS細(xì)胞中除去，并加300μl(100μl完全IMDM培養(yǎng)基+200μl未添加血清的培養(yǎng)基)于每一個孔中。在每一孔中加入相同體積的轉(zhuǎn)染制劑。對照樣品孔內(nèi)不加DNA，只加入150mM無菌NaCl溶液，其它處理相同。所有樣品培養(yǎng)10到12小時后，加入700μl完全培養(yǎng)基。將在5％DMSO/無Ca-Mg離子PBS中制備的測試化合物，以不同的濃度迅速加入孔內(nèi)。未經(jīng)藥品處理的對照樣中只加入5％DMSO/PBS溶液(DMSO最終濃度是0.2％)。所有樣品再繼續(xù)培養(yǎng)48小時后，取出300μl每一培養(yǎng)樣品的上清液用作SEAP分析。
分泌的堿性磷酸酶(SEAP)測定按照最初描述的(Berger et al.，Gene 661-10，1988)方法進行分泌堿性磷酸酶的分析。簡言之，取250μlCOS細(xì)胞培養(yǎng)基上清液的等分試樣，在65℃加熱5分鐘以選擇性地使內(nèi)源磷酸酶失去活性(SEAP具熱穩(wěn)定性)，在一小型離心機中離心2分鐘。取2×SEAP測定緩沖溶液100μl(1.0M二乙醇胺，pH9.8；0.5mMMgCl2；10mM L-高精氨酸)，加入到100μl的樣品等分試樣中。二者混合后，轉(zhuǎn)移到一個96孔的平底培養(yǎng)盤中(Corning)。將預(yù)先加熱的底物溶液(120mM P-硝基苯磷酸酯溶于1×SEAP測定緩沖溶液)20μl，用一個多頭移液器加到已加好反應(yīng)混合物的每一個孔中。在37℃培養(yǎng)60分鐘，每5分鐘用EL340i微盤續(xù)數(shù)儀(Bio-tek Instruments，Inc.)在A405吸收波下讀數(shù)，每次讀數(shù)前自動振動培養(yǎng)盤5秒鐘。在標(biāo)準(zhǔn)SEAP誘導(dǎo)測定中，依據(jù)吸收度的改變，以時間為橫坐標(biāo)作圖。在篩選藥物測定中，在30分時SEAP表達抑制的百分率計算如下％抑制＝100-〔(CT+-C+)×100〕其中C-對照樣品(無DNA，無藥物)CT-對照樣品(+DNA，無藥物)C+藥物處理的樣品(無DNA，+藥物)CT+藥物處理的樣品(+DNA，+藥物)最佳的轉(zhuǎn)染技術(shù)多種多樣的技術(shù)被應(yīng)用于真核細(xì)胞的DNA轉(zhuǎn)染。這些方法包括磷酸鈣或陽離子聚合物與DNA一同沉淀，以及應(yīng)用化學(xué)的方法(洗滌劑、溶劑、酶、雙嗜性聚合體)或物理的方法(熱學(xué)、滲透壓或電擊、或粒子碰撞)改變細(xì)胞膜的通透性。這些技術(shù)都有不同程度的細(xì)胞毒性，并且轉(zhuǎn)染的效率不穩(wěn)定。
使DNA順利穿過完整無損的細(xì)胞質(zhì)，被細(xì)胞攝取的先決條件是，“其DNA分子呈緊密狀態(tài)，并將其所帶的電荷包埋起來”。(Loefflerand Behr，Methods in Enzymology 217599-618，1993)。新近應(yīng)用的Transfectam方法，已經(jīng)成功地實現(xiàn)了上述要求。Transfectam試劑(雙十八烷基酰氨基氨基乙酰精胺)是一種合成的陽離子脂多胺化合物，它具有一個帶正電荷的領(lǐng)頭的精胺集團并與DNA(Kd＝10-5-10-7M)有很強的親和力。這一領(lǐng)頭的精胺集團以共價鏈通過肽鍵與脂相連。這種脂精胺分子與DNA分子結(jié)合，將DNA分子用脂肪層包埋起來。在足夠多的脂精胺存在條件下，形成帶正電荷的脂類包埋的小球形狀的質(zhì)粒DNA，而且復(fù)合體的脂肪部分與細(xì)胞膜融合，細(xì)胞內(nèi)吞作用將DNA攝入細(xì)胞。
用Transfectam試劑調(diào)控的DNA轉(zhuǎn)染方法，已經(jīng)被證明具有比其它現(xiàn)有方法更高的轉(zhuǎn)染效率。(Barthel et al.，DNA和Cell Biology 12(6)553-560，1993)。以外，Transfectam是一種性能穩(wěn)定的并且基本上無細(xì)胞毒性的制劑。然而，在選用COS細(xì)胞系進行DNA轉(zhuǎn)染時，要對達到理想轉(zhuǎn)染的幾個因素加以說明。這些因素包括轉(zhuǎn)染的延續(xù)時間，Transfectam試劑與DNA的比例，DNA的濃度，以及其它稀釋因子如NaCl的體積和離子強度。下面是得到理想轉(zhuǎn)染結(jié)果時的實驗條件。
a)轉(zhuǎn)染的持續(xù)時間用COS細(xì)胞與固定濃度的質(zhì)粒DNA一起培養(yǎng)來研究培養(yǎng)時間。這一研究的目的在于篩選出次最佳培養(yǎng)時間點以用于研究各種測試化合物對SEAP表達的抑制實驗。誘導(dǎo)SEAP表達的時間研究結(jié)果顯示(具體結(jié)果未描述)，SEAP的表達隨時間的延長有一定的增加。這種誘導(dǎo)開始于4小時之內(nèi)，24小時達到最高。在10，12和15小時之間，沒發(fā)現(xiàn)有顯著的區(qū)別。因此，在所有后來藥物篩選的研究中，對SEAP表達的抑制實驗選用12-15小時作為適合的次最佳的DNA轉(zhuǎn)染培養(yǎng)時間。
b)DNA濃度根據(jù)以前使用Transfectam試劑的研究結(jié)果(Loeffler and Behr，Methods in Enzymology 217599-618，1993)，決定DNA在轉(zhuǎn)染中的最佳濃度。對于共轉(zhuǎn)染，如已經(jīng)報道的(Hsu et al.，Science 2541799-1802，1991)，2∶1的比例(非選擇性基因/選擇性基因)被認(rèn)為是最適合的。在Linbro17mm直徑24孔平底培養(yǎng)平板中，非選擇性的質(zhì)粒pBCl2/HIV/SEAP加入的濃度為每孔0.35μg，對Tat功能編碼的質(zhì)粒pBC 12/CMV/t2濃度為每孔0.75μg。
c)Transfectam對DNA的比例和離子強度的確定Transfectam(DOGS)與質(zhì)粒DNA的最佳比例和所用NaCl離子強度是在以前研究基礎(chǔ)上的修改值(Loeffler and Behr，Methods in Enzymology2171799-1802，1993)，其確定如下所示將原濃度為1mg/0.400ml(2.38mg/ml)的Transfectam原液，配在10％(v/v)酒精的蒸餾水中，每一微克所用DNA需要6倍體積(μl)的原液。由以下關(guān)系式?jīng)Q定150mM NaCl的一個適當(dāng)體積，以保證該溶液的最佳離子強度。
NaCl體積(μl)＝Trahsfectam體積(μl)/0.6在選擇了上述最佳反應(yīng)條件后，在標(biāo)準(zhǔn)測定中Tat所誘導(dǎo)出的SEAP水平的結(jié)果如圖2如示。概括地說，在補充加有10％小牛胎血清(FCS)和抗菌素的Isocove修改過的Dulbecco培養(yǎng)基中(IMDM)培養(yǎng)COS細(xì)胞。細(xì)胞以每孔大約1.5×105個細(xì)胞的濃度，接種到17mm直徑Cinbro24孔平底培養(yǎng)平板中，做三組重復(fù)樣品，接種后在37℃，加濕并在95％O25％CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，直到細(xì)胞達到50％融合。次融合細(xì)胞用脂精胺的方法進行轉(zhuǎn)染(Loeffler and Behr，Methods inEnzymology 217599-618，1993)。吸干次融合細(xì)胞的培養(yǎng)基，重新加入300μl新鮮培養(yǎng)基(IMDM加3％FCS)。對COS細(xì)胞進行三種處理的轉(zhuǎn)染。處理1為只加入質(zhì)粒pBC12/HIV/SEAP(0.35μg/孔)，處理2為以0.175μg/孔的濃度加入質(zhì)粒pBC12/CMV/t2(對Tat功能編碼)+pBC12/HIV/SEAP(0.35μg/孔)，處理3為只加入緩沖溶液(無DNA對照樣器)。該培養(yǎng)平板在培養(yǎng)12到15小時之后，加入700μl完全培養(yǎng)基(IMDM含10％FCS)。再培養(yǎng)48小時之后，取250μl該細(xì)胞培養(yǎng)的上清液的等份試樣，并在65℃加熱5分鐘，使細(xì)胞內(nèi)的磷酸酶失去活性(SEAP具熱穩(wěn)定性)。這些樣品在一小型離心機內(nèi)離心2分鐘。并加入100μl 2×SEAP測定緩沖溶液(1.0M二乙醇胺，pH9.8；0.5mM MgCl2；10mM L-亮精氨酸)加入到100ml樣品的等份試樣中。將溶液混合后移入一個96孔平底的培養(yǎng)板中(Corning)。用一多頭滴定器將20μl預(yù)先加熱的底物溶液(120mM硝基苯磷酸鹽溶于1×SEAP測定緩沖溶液)滴加到含有上述反應(yīng)混合液的每一孔中。該培養(yǎng)板在37℃條件下培養(yǎng)60分鐘，每5分鐘用一臺EL340i微盤讀數(shù)儀(Bio-tek Instruments，Inc.)在A405吸收波下讀數(shù)，每次讀數(shù)前自動振動培養(yǎng)盤5秒鐘。象以前所描述的一樣(Berger et al.，Gene 661-10，1988)，吸收度的改變被換算為SEAP的表達水平的mU單位，并對照時間作圖。
實驗結(jié)果表明，在一小時之后，誘導(dǎo)的SEAP水平比較無DNA的對照樣品，或只用非選擇性基團(HIV/SEAP)的誘導(dǎo)水平增加了幾乎65倍。
以檢測為指導(dǎo)的應(yīng)用逆流色譜法分離雜酚油木提取物的活性成份如上所述，應(yīng)用逆流色譜法(CCC)對雜酚油木提取成分進行不同的分級分離及純化，分離得到兩大組分(表1)。用SiO2TLC方法從綠色分離物中分離到6.8mg的被稱為Gr的成份，總收獲率大約是開始植物碎末重量的0.051％。從黃色分離物(Ye)中分離出9.3mg被稱為Lo的成份。
雜酚油木葉和花的提取物對Tat-TRS活性的抑制作用用幾種植物提取物進行SEAP測定試驗發(fā)現(xiàn)，只有從雜酚油木Larrea tridertata葉和花的提取物顯示出對HIV Tat蛋白質(zhì)活性有明顯的抑制作用。如圖3所示，雜酚油木對SEAP的表達有依據(jù)劑量的抑制作用。概括地說，用三組重復(fù)的COS細(xì)胞應(yīng)用上述脂精胺方法，以2∶1的比例轉(zhuǎn)染混合質(zhì)粒pBC12/HIV/SEAP和pBC12/CMV/t2(Tat功能編碼)。轉(zhuǎn)染后，細(xì)胞培養(yǎng)12-15小時。雜酚油木的提取母液(10mg/ml)以10％DMSO無Ca/鎂離子的PBS溶液制備，并用一個Millex-GS 22μm的過濾器(Millipore)進行無菌過濾。將適當(dāng)濃度的雜酚油木的提取液加到已轉(zhuǎn)染DNA的細(xì)胞液中，使樣品中DMSO的最終濃度為0.2％，并將樣品再培養(yǎng)48小時。SEAP測定，從每孔中取250μl COS細(xì)胞培養(yǎng)液的上清液，并在65℃加熱5分鐘，使細(xì)胞內(nèi)的磷酸酶失去活性(SEAP具有熱穩(wěn)定性)。用一小型離心機離心樣品2分鐘。從離心后的樣品中各取出100μl上清液，將100μl2×SEAP測定緩沖溶液(1.0M二乙醇胺，pH9.8；0.5mM MgCl2；10mM L-高亮精氨酸)加入到100μl樣品的等份試樣中。將溶液混合后移入到一個96孔平底的培養(yǎng)平板中(Corning)。用一多頭滴定器將20μl預(yù)先加熱的底物溶液(120mM硝基苯磷酸鹽溶于1×SEAP測定緩沖溶液)滴加到含有上述反應(yīng)混合液的每一孔中。該培養(yǎng)板在37℃下培養(yǎng)60分鐘，每5分鐘用EL340i微盤讀數(shù)儀(Bio-tek Instruments，Inc.)在A405吸收度下讀數(shù)，每次讀數(shù)前儀器會自動振動培養(yǎng)板5秒鐘。在30分鐘時，SEAP表達的抑制百分比計算如下％抑制作用＝100-〔(CT+-C+)/(CT--C-)×100〕其中C-對照樣品(無DNA，無藥物)CT-對照樣品(+DNA，無藥物)C+藥物處理的樣品(無DNA，+藥物)CT+藥物處理的樣品(+DNA，+藥物)如圖3中所看到的，當(dāng)濃度是20μg/ml時，開始出現(xiàn)抑制作用；當(dāng)濃度是600μg/ml時，抑制作用達到最大值。對于這種粗提物質(zhì)，它的EC50(抑制50％時的濃度)估計為110μg/ml。隨著這些活性成份被進一步純化，這種(些)活性成份的活性作用逐漸增加，比較最原始的總的粗提物的21％，經(jīng)分離后的有機相分離物其活性提高了三倍(68％)。
HIV細(xì)胞藥理作用的抑制一種抑制Tat反式激活作用的化合物，應(yīng)該能阻斷HIV的復(fù)制。因而雜酚油木提取物被送到國家癌癥研究所(NCI)，用甲脂溶解測定方法試驗該提取物對HIV細(xì)胞病理機制的抑制作用(Weislow et al.，JNCI 81577-586，1989)。用CEM-SS細(xì)胞(ATCC，Rockuille，MD)與產(chǎn)生HIV的H9細(xì)胞一起培養(yǎng)。HIV病毒侵染寄生CEM-SS細(xì)胞，在一周內(nèi)，病毒在CEM-SS細(xì)胞內(nèi)復(fù)制并殺死多數(shù)細(xì)胞。如果該藥物能抑制HIV的在細(xì)胞內(nèi)的繁殖，那么CEM-SS細(xì)胞就可以避免由于HIV的存在而死亡。四唑翁制劑是由于活細(xì)胞的代謝減弱而得到一種帶顏色的甲脂產(chǎn)物，在450nm的色度計φ可以測量到。
在實驗中，將三組CEM-SS細(xì)胞(5000)加入到96孔微滴定板中。將適當(dāng)濃度的測試化合物加到5％DMSO無鈣/鎂離子的PBS溶液，最終液體體積為100μl。對照樣品中只加化合物的介質(zhì)(PBS)。五分鐘后，將500高度侵染性HIV-I的H9細(xì)胞或正常的H9細(xì)胞加入到己含有適當(dāng)濃度藥物的孔中。該微滴板在37℃，95％O2/5％CO2條件培養(yǎng)6在后，加入50μlXTT與甲硫酸N-甲基吩嗪翁(PMS)的混合物。之后再培養(yǎng)4小時，觀察其顏色的變化(XTT甲脂產(chǎn)物)。將微滴板封好，用一臺微盤讀數(shù)儀在OD450測定樣品，在讀數(shù)之前讀數(shù)儀自動搖動滴板，使孔內(nèi)成份混合均勻。每一數(shù)值代表三次讀數(shù)的平均。在測試化合物存在的條件下，未侵染的細(xì)胞與HIV感染了的細(xì)胞其兩次重復(fù)數(shù)據(jù)的平均值之間沒有顯著差異。相反，感染了HIV的樣品在有測試化合物或沒有測試化合物存在的條件下，兩次重復(fù)數(shù)據(jù)的平均值之間有顯著性差異(P＜0.05)。
上述研究結(jié)果歸納在表2之中，濃度為0.75μg/ml的Gr成份對HIV的抵御為58％(細(xì)胞成活率)，而Gr不存在時，只有15％的細(xì)胞成活。在成份Lo只有0.187μg/ml這么低時，也顯示了對HIV細(xì)胞病理活性的更強抑制。在有HIV侵染的樣品中，成活細(xì)胞是87％，該百分比與沒有加入侵染的HIV對照樣品的結(jié)果(89％)很接近；相反，在沒有成份Lo，侵染HIV存在時，成活細(xì)胞只為14％。所用的這些化合物的濃度，不會對細(xì)胞造成毒害。
表2.在溶解性甲測定法中，雜酚油木提取化合物對HIV-1細(xì)胞病理機制的抑制作用

雜酚油木提取物活性成份的結(jié)構(gòu)說明確定已經(jīng)純化了的從植物提取的活性組分的化學(xué)性質(zhì)，主要采用質(zhì)譜儀和H-與C-的核磁共振(NMR)的方法。發(fā)現(xiàn)成份Lo是四種相關(guān)化合物的混合體(L1，L2，L3和L4)。應(yīng)用氣相色譜(GC)方法，該方法用一個分析用不含換壞的毛細(xì)管并以5％苯甲基硅氧烷(HP-5)交聯(lián)成的柱子，該柱子與一臺質(zhì)譜質(zhì)相連接，對上述混合物的每一峰值進行分離和鑒別。GC研究發(fā)現(xiàn)，第一化合物(L1)占混合成份的6％；第二化合物(L2)占總混合成份的76％(MW＝316)；第三化合物(L3)與L2為異構(gòu)體并占總混合成份的9％(MW＝316)；第四化合物(L4)占總混合成份的9％(MW＝358)。這些化合物從柱子中流出的時間標(biāo)在圖中的蜂值處(圖4)。
組份Gr包括五種化合物。應(yīng)用氣相色譜(GC)方法，該方法以分析用不會損壞的毛細(xì)管交聯(lián)5％苯甲基硅氧烷(HP-5)而成的柱子與一臺質(zhì)譜儀相連接，對上述混合物的每一峰值進行分析和鑒別。該GC研究發(fā)現(xiàn)，十五種化合物中的四種(G1，G2，G3和G4)是木酚素，并與L化合物結(jié)構(gòu)相關(guān)。這些化合物從柱子中流出的時間在圖中的蜂處標(biāo)出(圖5)。
這八種(L1，L2，L3，L4，G1，G2，G3和G4)化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)描述如下L1的成份是C18H22O4，已經(jīng)確認(rèn)出該化合物與以前已知的一化學(xué)品相同，為1，4-雙-(3，4-二羥基苯)-2，3-二甲基丁烷(去甲二氫愈創(chuàng)木酸，NDGA，Merck Index，10th Edition，#6534)。L1的化學(xué)結(jié)構(gòu)式如下 L2由C19H24O4組成，并被確認(rèn)為3-O-甲基-NDGA或1-(3，4-二羥基苯)-4-(3-甲氧基-4-羥基苯)-2，3-二甲基丁烷。3-O-甲基-NDGA結(jié)構(gòu)式如下
L3也含有C19H24O4，并被確認(rèn)為4-0-甲基-NDGA或1-(3，4-二羥基苯)-4-(3-羥基-4-甲氧苯基)-2，3-二甲基丁烷。4-O-甲基-NDGA還被記載為Malachi 45-6或Mal4。4-O-甲基-NDGA結(jié)構(gòu)式如下 L4由C21H26O5組成，并被確認(rèn)為3-O-甲基-4-O-乙酰基-NDGA或1-(3，4-二羥基苯)-4-(3-甲氧基-4-乙酸苯基)-2，3-二甲基丁烷。3-O-甲基-4-O-乙酰基-NDGA結(jié)構(gòu)式如下 G1的分子量為344，由C21H22O4組成，并被確認(rèn)為3，3’，4-三-O-甲基-NDGA或1-(3-羥基-4-甲氧基苯基)-4-(3，H-二甲氧基苯基)-2，3-二甲基丁烷。3，3’，4-三-O-甲基-NDGA結(jié)構(gòu)式如下 G2的分子量是344，由C21H22O4組成，被確認(rèn)為3，4，4’-三-O-甲基-NDGA或1-(3-甲氧基-4-羥基苯)-4-(3，4-二甲氧基苯)-2，3-二甲基丁烷。該3，4，4’-三-O-甲基-NDGA的結(jié)構(gòu)式如下 G3和G4的分子量都是372，由C22H28O5組成。G3是3’，4-二-O-甲基-3-O-乙酰基-NDGA(如G3A)或3，3’-二-O-甲基-4-O-乙?；?NDGA(如G3b)。3’，4-二-O-甲基-3-O-乙酰基-NDGA也被稱作1-(3-甲氧基-4-羥基苯基)-4-(3-乙酰氧基-4-甲氧基苯基)-2，3-二甲基丁烷，其結(jié)構(gòu)式如下G3a 3，3’-二-O-甲基-4-O-乙?；?NDGA也稱作為1-(3-甲氧基-4-羥基苯)-4-(3-甲氧基-4-乙酰氧基苯)-2，3-二甲基丁烷，結(jié)構(gòu)式如下G3b 類似地，G4為4，4’-二-O-甲基-3-O-乙酰基-NDGA(如在G4a中)或3，4’-二-O-甲基-4-O-乙酰基-NDGA(如在G4b中)。4，4’-二-O-3-O-乙?；?NDGA也被稱作為1-(3-羥基-4-甲氧基苯基)-4-(3-乙酰氧基-4-甲氧苯基)-2，3-二甲基丁烷，其結(jié)構(gòu)式如下
G4a 3，4’-二-O-甲基-4-O-乙?；?NDGA也稱作為1-(3-羥基-4-甲氧苯基)-4-(3-甲氧基-4-乙酰氧基苯)-2，3-二甲基丁烷，其結(jié)構(gòu)式如下G4b 除上面所述的分離和純化方法以外，每種所揭示出的NDGA的衍生物也可以應(yīng)用Ikeya等(Chem.Pharm.Bull.27(7)1583-1588，1979)的方法，通過對NDGA甲基化和/或乙?；幕瘜W(xué)合成方法而得到。
大量提純Lo組分以及從Lo組分中提純兩種純化物(L2和L3)對一大批植物材料應(yīng)用大規(guī)模CCC分級分離方法，以得到大量的組份Lo?？偣卜Q取110g植物碎末，先用700ml己醇處理5次，去掉溶于己醇的物質(zhì)(1.17g)。干燥不溶于己醇的物質(zhì)(HI組分)，并用800ml氯仿∶甲醇溶液連續(xù)浸漬三次。這樣總共得到20g提取物(Jex)，并將其與前一批得到的7.6gHI組份合并在一起，因此共得到27.6g植物粗提物。將其分為10g和17.6g兩批做進一步分離。這兩批樣品先分別在己醇∶EtoAc∶MeOH∶0.5％NaCl其比例為6∶4∶5∶5的溶劑系統(tǒng)中過大容量可能橫軸CPC(Shinomiya et al.，J.Chromatogr 644215-229，1993)，其上層(有機層)作為流動相。完全根據(jù)TLC的圖形將所得到的分離物放在一起，從兩次CCC的分離中共確定出四種主要的組份，它們是綠色組分(Gr)(1.12g)，組份Lo(2.87g)，末尾組分(1.78g)，和最后固定相SP(20.84)。所得到整個2.87g的Lo組份用己醇∶EtoAc∶MeOH∶H2O其比例為7∶3∶5∶5的系統(tǒng)在大型三聯(lián)體CPC中進一步分離，水質(zhì)層作為流動相。根據(jù)脫流出的先后順序及TLC圖形，四個分離物分別定為LYI(0.375g)，LYII(0.113g)，LYIII(0.280g)和LYIV(2.80g)。這些分離物以10μg/ml的濃度進行抗Tat-TRS活性的測定。根據(jù)測試的結(jié)果，選擇LYI做進一步提純。
從組份Lo中的LYI分離物中分離純凈的L2和L3化合物采用前面已經(jīng)改善了的條件，如三聯(lián)體CPC用Hex∶CHCl3∶MeOH∶10mMNaCl其比例為1∶4∶4∶2的溶劑系統(tǒng)來進一步較少疏水性的LYI組份。得到經(jīng)NMR和質(zhì)譜儀確定的148mg L3類似物和109.3mg的純凈L2oL3(Malachi 45-6)和L2的結(jié)構(gòu)式前面已有描述。
化合物L(fēng)2和L3都是以前已定名的化學(xué)品1，4-雙-(3，4-二羥基苯)-2，3-二甲基丁烷(去甲二氫愈創(chuàng)木酸，NDGA，MerckIndex，10th Edition，#6534)的衍生物。MDGA的結(jié)構(gòu)式與前所述L1的結(jié)構(gòu)式相同，如下 NDGA和它的衍生物的抗-HIV活性(Tat調(diào)控HIV反激活的抑制作用)以前不為人知。NDGA和其衍生物Malachi 45-6(Mal4)的抗-HIV反式激活作用的活性比較見圖6所示。概括地說，用上面已經(jīng)描述過的脂精胺方法對兩組重復(fù)的亞融合態(tài)的COS細(xì)胞，分別同時轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pBC12/HIV/SEAP和pBC12/CMB/t2(Tat功能編碼)。然后培養(yǎng)轉(zhuǎn)染細(xì)胞12到15小時。先將所要測試的化合物溶解到10％DMSO/無鈣-鎂離子的PBS溶液中，再將其以適當(dāng)?shù)臐舛燃拥揭艳D(zhuǎn)染了的細(xì)胞中，使DMSO的最終濃度為0.2％。樣品培養(yǎng)48小時之后，每一樣品取250μl的細(xì)胞培養(yǎng)上清液，用圖3中的標(biāo)準(zhǔn)測定曲線進行SEAP分析。在30分鐘時SEAP表達抑制百分率的計算方法如下％抑制作用＝100-〔(CT+-C+)/(CT--C-)×100〕其中C-對照樣品(無DNA，無藥物)
CT-對照樣品(+DNA，無藥品)C+藥物處理樣品(無DNA，+藥物)CT+藥物處理樣品(+DNA，+藥物)圖中每一點代表兩組數(shù)據(jù)的平均值。Mal4和NDGA其濃度分別是8μg/ml(25μM)和6μg/ml(20μM)，它們的EC50值之間沒有顯著性差異。EC50是指在未處理的對照細(xì)胞中，Tat調(diào)控的HIV反式激活作用降低到50％時，所測試的化合物的抑制濃度。
比較Mal4和NDGA所產(chǎn)生的HIV反式激活作用的抑制見表3。
表3天然化合物Mal4和NDGA對HIV啟動子活性的反式激活作用的抑制

化合物NDGA和Mal4如圖6所示測定。對照樣品做四次重復(fù)。30分鐘后的抑制百分比和OD405值是C-對照樣品(無DNA，無藥物)0.091CT-對照樣品(+DNA，無藥物)0.805圖7所示的是Mal4處理CEM-SS細(xì)胞后，作為衡量細(xì)胞成活的XTT甲脂產(chǎn)物的數(shù)量。圖中的每一點表示經(jīng)過連續(xù)Mal4稀釋的感染或未感染HIV的CEM-SS靶細(xì)胞(104/M孔)。EC50表示Mal4的濃度(如13.4μM)將感染培養(yǎng)物的XTT甲脂產(chǎn)生量增加(即保護)到未感染、未處理的培養(yǎng)細(xì)胞的50％的Mal4的濃度(例如，13.4μM)。IC50表示將未感染的培養(yǎng)細(xì)胞的XTT甲脂產(chǎn)量降低到未處理、未感染的對照細(xì)胞的50％的Mal4抑制或毒性濃度(例如，325μM，估計值)。未處理的感染對照細(xì)胞的XTT甲脂產(chǎn)量是未處理的未感染對照細(xì)胞的9％。對HIV-1細(xì)胞致病作用的溶解性甲脂檢測按照Weislow et al.，JNCI 81577-586，1989所述的程序進行。
雖然本發(fā)明已經(jīng)按照現(xiàn)在認(rèn)為是最佳和最實際的方案進行了描述，但應(yīng)該理解的是本發(fā)明并不應(yīng)該僅限于這些實例，與此相反，不離開本發(fā)明的實質(zhì)和附屬的權(quán)利要求書的范圍的其它變型和修飾都是本發(fā)明所包含的。
因此，應(yīng)該理解的是在不脫離權(quán)利要求書所限定的本發(fā)明的創(chuàng)新方面的前提下，可以有眾多的NDGA衍生物的變型，以及對Tat反式激活的抑制方法。
權(quán)利要求
1.結(jié)構(gòu)式如下的化合物
2.結(jié)構(gòu)式如下的化合物
3.結(jié)構(gòu)式如下的化合物
4.結(jié)構(gòu)式如下的化合物
5.結(jié)構(gòu)式如下的化合物
6.結(jié)構(gòu)式如下的化合物
7.結(jié)構(gòu)式如下的化合物
8.結(jié)構(gòu)式如下的化合物
9.一種在細(xì)胞中抑制慣病毒的Tat反式激活作用的方法，包括下列步驟a)將雜酚油木Larrea tridentata的提取物用于細(xì)胞，其中所述的提取物選自于氣相色譜圖譜如圖4中所示的提取物，和氣相色譜圖譜圖5中所示的提取物；和b)使該提取物在細(xì)胞內(nèi)抑制慢病毒的Tat反式激活作用。
10.一種在細(xì)胞中抑制慢病毒Tat反式激活作用的方法，包括下列步驟a)將具有下述結(jié)構(gòu)的一種化合物用于細(xì)胞 ；和b)使該化合物抑制慢病毒在細(xì)胞中的Tat反式激活作用。
11.一種在細(xì)胞中抑制慢病毒Tat反式激活作用的方法，包括下列步驟a)將具有下述結(jié)構(gòu)式的化合物用于細(xì)胞 其中R1、R2、R3和R4分別選自HO-，CH3O-和CH3(C＝O)O-，并且R1、R2、R3和R4不能同時是HO-；和b)使該化合物抑制細(xì)胞內(nèi)慢病毒的Tat反式激活作用。
12.根據(jù)權(quán)利要求11的方法，其中R1、R2和R3均為HO-且R4是CH3O-，該化合物結(jié)構(gòu)式如下
13.根據(jù)權(quán)利要求11的方法，其中R1，R2和R4均為HO-且R3是CH3O-，該化合物結(jié)構(gòu)式如下
14.根據(jù)權(quán)利要求11的方法，其中R1和R2是HO-，R3是CH3(C＝O)O-且R4是CH3O-，該化合物結(jié)構(gòu)式如下
15.根據(jù)權(quán)利要求11的方法，其中R1、R3和R4均為CH3O-且R2是HO-，該化合物的結(jié)構(gòu)式如下
16.根據(jù)權(quán)利要求11的方法，其中R1是HO-且R2、R3和R4均為CH3O-，該化合物的結(jié)構(gòu)式如下
17.根據(jù)權(quán)利要求11的方法，其中R1和R3是CH3O，R2是HO-且R4是CH3(C＝O)O-，該化合物的結(jié)構(gòu)式如下
18.根據(jù)權(quán)利要求11的方法，其中R1和R4是CH3O-，R2是HO-且R3是CH3(C＝O)O-，該化合物的結(jié)構(gòu)式如下
19.根據(jù)權(quán)利要求11的方法，其中R1是HO-，R2和R4是CH3O-且R4是CH3(C＝O)O-，該化合物的結(jié)構(gòu)式如下
20.根據(jù)權(quán)利要求11的方法，其中R1是HO-，R2和R4是CH3O-和R3是CH3(C-0)O-，該化合物的結(jié)構(gòu)式如下
全文摘要
本發(fā)明揭示了從雜酚油木Larrea tridentata分離、純化及鑒別具有結(jié)構(gòu)式(I)的一組化合物。在結(jié)構(gòu)式中，R
文檔編號C07C69/035GK1762951SQ20051007433
公開日2006年4月26日 申請日期1995年9月22日 優(yōu)先權(quán)日1994年9月30日
發(fā)明者R·C·黃, J·N·格納布里 申請人:約翰斯.霍普金斯大學(xué)