專利名稱：黑乳海參中抗腫瘤化合物nobilisideA及其單乙?；苌锏闹谱鞣椒?br> 技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，是從海洋動(dòng)物黑乳海參中分離到的一種抗腫瘤化合物nobiliside A及其單乙酰化衍生物。
背景技術(shù)：
黑乳海參(Holothuria nobilis Selenka)是一種大量生長(zhǎng)于我國(guó)福建東山到海南島海域的海參綱動(dòng)物，屬海參科海參屬。大型種，體長(zhǎng)一般30cm，寬約6cm，體寬而厚，兩端鈍圓。黑乳海參是重要的食用海參之一，民間也常作為藥用，具有滋補(bǔ)及治療婦女病等功用〔廖玉麟編著，中國(guó)動(dòng)物志，棘皮動(dòng)物門，海參綱[M].北京科學(xué)出版社，1997，121-122〕。但未見有關(guān)從黑乳海參中提取分離到皂苷類成分nobiliside A化合物及其抗腫瘤活性的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明從生長(zhǎng)于中國(guó)福建東山海域的黑乳海參中提取分離到一種皂苷類化合物，命名為nobiliside A，并由其制備nobiliside A單乙?；?，它們的化學(xué)結(jié)構(gòu)通式如下 其中，R表示OH或OAc，當(dāng)R＝OH時(shí)，該化合物為nobiliside A，當(dāng)R＝OAc時(shí)，為nobiliside A單乙酰化物。
本發(fā)明化合物的制備方法如下1.制備nobiliside A
(1)提取將黑乳海參干品粉碎，按常規(guī)用50％～90％乙醇浸泡提取，濃縮提取液，得到流浸膏。將流浸膏均勻分散于水中，依次用石油醚、水飽和正丁醇分別萃取。將正丁醇萃取液濃縮至干，得總皂苷提取物。
(2)分離將上述總皂苷提取物進(jìn)行硅膠柱層析，以氯仿∶甲醇∶水＝8～6.5∶2～3.5∶1混合溶劑洗脫，薄層層析檢測(cè)，收集含有皂苷的流分，再經(jīng)過C18反相柱層析，以甲醇∶水＝5.75∶4.25洗脫，薄層層析檢測(cè)，收集含有nobiliside A的流分，濃縮至干，得到nobiliside A。經(jīng)多種現(xiàn)代光譜分析，特別是綜合應(yīng)用多種先進(jìn)的二維核磁共振波譜的解析，確定了nobiliside A的化學(xué)結(jié)構(gòu)和立體構(gòu)型。
nobiliside A為無(wú)色結(jié)晶性粉末，熔點(diǎn)203～205℃(MeOH-H2O)，分子式C54H87O26SNa；[α]D20-12.3°(c＝0.2，MeOH)，Liebermann-Burchard反應(yīng)和Molish反應(yīng)均呈陽(yáng)性。電噴霧陽(yáng)離子質(zhì)譜ESI-MS+m/z1229[M+Na]+；電噴霧陰離子質(zhì)譜ESI-MS-m/z1183[M-Na]-；高分辨質(zhì)譜HRESI-MS+中準(zhǔn)分子離子峰提供的精確分子量m/z1229.5017[M+Na]+(Calc.Mass 1229.5002)。IR(KBr)cm-13416(羥基)，1740(羰基)，1637(雙鍵)，1256，1070(磺酸基)。13C NMR與1H NMR數(shù)據(jù)見表1。以三氟醋酸水解皂苷后得到組成皂苷糖鏈的單糖，將其制備成糖腈乙酸酯衍生物，進(jìn)行氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析，經(jīng)與標(biāo)準(zhǔn)糖的糖腈乙酸酯衍生物對(duì)照，確定nobiliside A的糖鏈由D-木糖、D-奎諾糖、3-甲氧基-D-葡萄糖組成，比例為1∶2∶1。
2.制備nobiliside A單乙?；锶obiliside A 20mg，加入無(wú)水吡啶3ml溶解，冰浴10min，劇烈攪拌下滴加醋酐1滴，在冰浴條件下再反應(yīng)15min，撤去冰浴，室溫反應(yīng)5h。加入3ml水?dāng)嚢?min后，減壓收干，過2×30cm硅膠色譜柱，以氯仿∶甲醇∶水＝7.8∶2.2∶1混合溶劑洗脫，薄層層析檢測(cè)，收集含有nobiliside A單乙酰化物的流分，回收溶劑至干，得到nobiliside A單乙?；?。
nobiliside A單乙酰化物為無(wú)色無(wú)定型粉末，熔點(diǎn)182℃(MeOH-H2O)，分子式C56H89O27SNa；Liebermann-Burchard反應(yīng)和Molish反應(yīng)均呈陽(yáng)性。電噴霧陽(yáng)離子質(zhì)譜ESI-MS+m/z1271[M+Na]+；電噴霧陰離子質(zhì)譜ESI-MS-m/z1225[M-Na]-；IR(KBr)cm-13416(羥基)，1740(羰基)，1637(雙鍵)，1256，1070(磺酸基)。13C NMR與1HNMR數(shù)據(jù)見表2。以三氟醋酸水解皂苷后得到組成皂苷糖鏈的單糖，將其制備成糖腈乙酸酯衍生物，進(jìn)行氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析，經(jīng)與標(biāo)準(zhǔn)糖的糖腈乙酸酯衍生物對(duì)照，確定nobiliside A單乙?；锏奶擎溣蒁-木糖、D-奎諾糖、3-甲氧基D-葡萄糖組成，比例為1∶2∶1。
表1.nobiliside A苷元和糖鏈部分的13C NMR與1H NMR數(shù)據(jù)

Xyl木糖；Glc葡萄糖；Qui奎諾糖；J偶合常數(shù)表2.nobiliside A單乙酰化物苷元和糖鏈部分的13C NMR與1H NMR數(shù)據(jù)

Xyl木糖；Glc葡萄糖；Qui奎諾糖；J偶合常數(shù)本發(fā)明化合物nobiliside A或nobiliside A單乙?；锝?jīng)體外抗腫瘤活性試驗(yàn)，表明這些化合物有明顯的抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的效果。試驗(yàn)所用的細(xì)胞株為國(guó)際通用的腫瘤細(xì)胞株，即P-388(小鼠淋巴瘤)HL-60(人早幼粒細(xì)胞白血病)A-549(人肺腺癌)SPC-A4(人肺腺癌)MKN-28(人胃腺癌)SGC-7901(人胃腺癌)BEL-7402(人肝癌)HO-8910(人卵巢癌)MDA-MB-435(人乳腺癌)MDA-MB-468(人乳腺癌)HMEC(人微血管內(nèi)皮細(xì)胞)HUVEC(人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞)A-431(人皮膚磷癌細(xì)胞)試驗(yàn)方法為國(guó)際通用的磺酰羅單明B法根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)速率，將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的腫瘤細(xì)胞以90μl/孔接種于96孔培養(yǎng)板，貼壁生長(zhǎng)24小時(shí)再加本發(fā)明化合物樣品10μl/孔。每個(gè)濃度設(shè)3復(fù)孔。并設(shè)相應(yīng)濃度的生理鹽水溶媒對(duì)照及無(wú)細(xì)胞調(diào)零孔。腫瘤細(xì)胞在37℃、5％CO2的條件下培養(yǎng)72小時(shí)，然后傾去培養(yǎng)液，用10％冷TCA固定細(xì)胞，4℃放置1小時(shí)后，用蒸餾水洗滌5次，空氣干燥。最后加入150μl/孔的Tris溶液，酶標(biāo)儀520nm波長(zhǎng)下測(cè)定OD值。試驗(yàn)結(jié)果見表3和表4。
表3.nobiliside A對(duì)腫瘤細(xì)胞株的抑制作用(ID50，μg/ml)

ID50半數(shù)有效抑制濃度表4.nobiliside A單乙酰化物對(duì)腫瘤細(xì)胞株的抑制作用(ID50，μg/ml)

ID50半數(shù)有效抑制濃度從表3和表4可見，nobiliside A和nobiliside A單乙?；飳?duì)各種腫瘤細(xì)胞株的半數(shù)有效抑制濃度(ID50)等于或小于2.76μg/ml，通常ID50＜10μg/ml濃度為有效。上述試驗(yàn)結(jié)果表明，nobiliside A和nobiliside A單乙酰化物對(duì)多種不同的腫瘤細(xì)胞株均有明顯的抑制作用。因而可用于制備抗腫瘤藥物。
本發(fā)明為研制新的抗腫瘤藥物提供了新的先導(dǎo)化合物，對(duì)開發(fā)利用中國(guó)的海洋藥用生物資源具有重要意義。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1nobiliside A的分離制備選擇生長(zhǎng)于中國(guó)福建東山海域的黑乳海參干品7500克，洗滌切碎后分別用5倍重量85％的乙醇依次浸泡提取3次，每次浸泡7天。合并乙醇提取液，減壓回收乙醇，得流浸膏。將流浸膏溶于3倍量的水中，依次用石油醚和水飽和的正丁醇各萃取4次，每次500ml。合并正丁醇萃取液，回收溶劑至近干，70℃水浴蒸干，得黑乳海參正丁醇部位總提取物64克。
將總提取物進(jìn)行硅膠柱層析，以氯仿∶甲醇∶水＝8～6.5∶2～3.5∶1混合溶劑約1500ml洗脫，收集含有皂苷的部分，再進(jìn)行C18反相柱層析，以甲醇∶水＝5.75∶4.25混合溶劑約1500ml洗脫，薄層層析檢測(cè)，收集含有nobiliside A的流分，回收溶劑至近干，70℃水浴蒸干，得到nobiliside A 0.973克。
實(shí)施例2nobiliside A單乙?；锏闹苽淙∩鲜鲋频闷穘obiliside A 20mg，加入無(wú)水吡啶3ml溶解，冰浴10min，劇烈攪拌下滴加醋酐1滴，在冰浴條件下再反應(yīng)15min，撤去冰浴，室溫反應(yīng)5h。加入3ml水?dāng)嚢?min后，減壓收干，過2×30cm硅膠色譜柱，以氯仿∶甲醇∶水＝7.8∶2.2∶1混合溶劑洗脫，薄層層析檢測(cè)，收集含有nobiliside A單乙?；锪鞣?，回收溶劑至近干，70℃水浴蒸干，得到nobiliside A單乙酰化物15.3mg。
權(quán)利要求
1.抗腫瘤化合物nobiliside A及其單乙酰化物，其特征在于化學(xué)結(jié)構(gòu)通式如下 其中，R表示OH或OAc。
2.權(quán)利要求1所述抗腫瘤化合物nobiliside A及其單乙?；锏闹苽浞椒?，其具體步驟如下(1)提取將黑乳海參干品粉碎，按常規(guī)用50％～90％乙醇浸泡提取，濃縮提取液，得到流浸膏；將流浸膏均勻分散于水中，依次用石油醚、水飽和正丁醇分別萃??；將正丁醇萃取液濃縮至干，得總皂苷提取物；(2)分離將上述總皂苷提取物進(jìn)行硅膠柱層析，以氯仿∶甲醇∶水＝8～6.5∶2～3.5∶1混合溶劑洗脫，薄層層析檢測(cè)，收集含有皂苷的流分，再經(jīng)過C18反相柱層析，以甲醇∶水＝5.75∶4.25洗脫，薄層層析檢測(cè)，收集含有nobiliside A的流分，回收溶劑至干，得到nobiliside A；(3)nobiliside A單乙?；锏闹苽淙obiliside A 20mg，加入無(wú)水吡啶3ml溶解，冰浴10min，劇烈攪拌下滴加醋酐1滴，在冰浴條件下再反應(yīng)15min，撤去冰浴，室溫反應(yīng)5h，加入3ml水?dāng)嚢?min后，減壓收干，過2×30cm硅膠色譜柱，以氯仿∶甲醇∶水＝7.8∶2.2∶1混合溶劑洗脫，薄層層析檢測(cè)，收集含有nobiliside A單乙?；锪鞣郑厥杖軇┲粮?，得到nobiliside A單乙酰化物。
3.權(quán)利要求1所述化合物nobiliside A及其單乙酰化物在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體為從黑乳海參中分離的一種抗腫瘤化合物nobilisideA(分子式為C
文檔編號(hào)C07H1/00GK1740185SQ20051002958
公開日2006年3月1日 申請(qǐng)日期2005年9月13日 優(yōu)先權(quán)日2005年9月13日
發(fā)明者易楊華, 丁健, 李玲, 章雄文, 巫軍, 陳奕, 劉寶姝, 田芳 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)