專利名稱：人乳頭瘤病毒型雙價病毒樣顆?；旌系鞍卓乖皹?gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種人乳頭瘤病毒型雙價病毒樣顆粒混合體及該混合體的構(gòu)建方法。
背景技術(shù)：
尖銳濕疣作為性傳播疾病嚴重威脅人類健康，在我國的發(fā)病率已占性傳播性疾病的首位。由于缺乏理想的治療方法，尖銳濕疣的復(fù)發(fā)率高達30％到70％。因此尋求理想的治療和預(yù)防手段應(yīng)成為我國迫在眉睫的大事。在我國宮頸癌發(fā)病率在婦科腫瘤中占第二位，每年新發(fā)病例約13萬。作為發(fā)展中國家的中國，由于臨床脫落細胞篩查不能普及，致使宮頸癌的發(fā)病率仍居高不下。
人乳頭瘤病毒(Human Papillomavirus，HPV)的高危型別HPV16型引起宮頸癌(約50％)；低危型別HPV11型主要引起尖銳濕疣。HPV至今不能人工增殖，其核酸有潛在致癌性，所以研究預(yù)防性基因工程疫苗的意義重大。目的基因的選擇主要為L1基因(具有保守性)，L1蛋白可自組裝成類病毒顆粒(Virus like partic1es，VLPs)，攜帶有與天然病毒相近的抗原表位，可以刺激機體產(chǎn)生保護性中和抗體，可預(yù)防HPV感染。由于HPV型別多，型別間無交叉保護，HPV多價基因工程疫苗可提供多重保護。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種可作為雙價預(yù)防疫苗用以預(yù)防宮頸癌和尖銳濕疣的人乳頭瘤病毒型雙價病毒樣顆?；旌系鞍卓乖皹?gòu)建方法。本發(fā)明的人乳頭瘤病毒型雙價病毒樣顆?；旌系鞍卓乖环N致宮頸癌病毒HPV16的L1抗原和一種尖銳濕疣病毒HPV11的L1抗原，它按照下述方法進行構(gòu)建利用分子生物學(xué)方法從尖銳濕疣組織中克隆HPV11L1基因，將HPV16L1基因與HPV11L1基因雙表達于桿狀病毒昆蟲細胞表達系統(tǒng)，構(gòu)建重組病毒株Bacmid/HPV16-HPV11L1，并使其在桿狀病毒-昆蟲表達系統(tǒng)進行表達。表達產(chǎn)物經(jīng)電鏡證實存在較大量VLP。SDS-PAGE和Western blot分析鑒定了HPV16L1和HPV11L1病毒樣顆粒的表達量及特異性。在免疫小鼠后，小鼠可獲得針對16型和11型兩種型別的乳頭瘤病毒主要衣殼蛋白L1的血清抗體。雙價病毒樣顆?；旌象w的制備為研制同時預(yù)防宮頸癌和尖銳濕疣等多種疾病的HPV16-11型基因工程多價疫苗奠定基礎(chǔ)。通過上述構(gòu)建所得的重組蛋白經(jīng)驗證具有良好的免疫原性和免疫反應(yīng)性，可作為基因工程多價疫苗的候選抗原，用于預(yù)防尖銳濕疣和宮頸癌。
具體實施例方式具體實施方式
一本實施方式的雙價病毒樣顆?；旌系鞍卓乖环N致宮頸癌病毒HPV16的L1抗原和一種尖銳濕疣病毒HPV11的L1抗原。
具體實施例方式
二本實施方式與具體實施方式
一不同的是，它還包含一種載體，所述載體為Bacmid質(zhì)粒。
具體實施例方式
三本實施方式按照下述方法構(gòu)建雙價病毒樣顆?；旌系鞍卓乖梅肿由飳W(xué)方法從尖銳濕疣組織中克隆HPV11L1基因，將HPV16L1基因與HPV11L1基因雙表達于桿狀病毒昆蟲細胞表達系統(tǒng)，構(gòu)建重組病毒株Bacmid/HPV16-HPV11L1。
具體實施例方式
四本實施方式將對本發(fā)明的技術(shù)措施作進一步的說明。
一、重組桿狀病毒轉(zhuǎn)染載體的構(gòu)建、轉(zhuǎn)染和表達用PCR方法從尖銳濕疣組織標本中擴增HPV11L1基因，構(gòu)建pSP73-HPV11L1重組質(zhì)粒，并對HPV11L1基因進行測序；從宮頸癌克隆構(gòu)建的pCR2.1-HPV16L1重組質(zhì)粒中亞克隆HPV16L1基因，構(gòu)建pBluescriptM13-16L1重組質(zhì)粒，并對HPV16L1基因進行測序驗證；再將HPV11L1和HPV16L1基因片段插入重組桿狀病毒轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pFastBacDUAL，構(gòu)建HPV16型和11型L1基因雙價重組桿狀病毒轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pFastBacDUAL-HPV16L1-HPV11L1，然后轉(zhuǎn)染桿狀病毒線狀DNA并用之感染SF-9昆蟲細胞使HPV16L1和HPV11L1基因得到表達。昆蟲細胞Sf9培養(yǎng)3～5天后收獲細胞，經(jīng)離心、超聲破碎和CsCl密度梯度離心后收集1.29g/ml密度帶，并進行透析。
HPV16型和11型L1基因雙價重組桿狀病毒轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pFastBacDUAL-HPV16L1-HPV11L1中，其含有的HPV11L1和HPV16L1的氨基酸序列詳見序列表。
二、制備重組桿狀病毒轉(zhuǎn)移質(zhì)粒和重組Bacmid1、構(gòu)建雙價重組桿狀病毒轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pFastBacDual-HPV16L1-HPV11L1從pSP73-HPV11L1質(zhì)粒酶切取L1基因，從pBluescript M13-16L1取HPV16L1基因；將兩段基因片段分別插入重組桿狀病毒轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pFastBacDUAL，16L1片段插入到Ppolh強啟動子下游，11L1片段插入p10弱啟動子之下，構(gòu)建HPV16型和11型L1基因雙價重組桿狀病毒轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pFastBacDUAL-HPV16L1-HPV11L1，酶切鑒定證實構(gòu)建成功。
2、制備重組Bacmida、位點特異性轉(zhuǎn)座①制備DH10Bac感受態(tài)細菌將提取的pFastBacDUAL-HPV16L1-11L1質(zhì)粒2μl(約5ng)加至新制備的DH10Bac感受態(tài)細胞中，輕彈管底混勻；②冰浴30min，在42℃熱休克45s，冰浴2min，加入900μl SOB液體培養(yǎng)基混勻，置于37℃，以1 50rpm振蕩培養(yǎng)4h；③將菌液以10-1、10-2、10-3梯度稀釋后，各取100μl均勻地涂布已準備的LB平板，同時將DH10Bac感受態(tài)菌涂于無抗生素培養(yǎng)基平板和僅含有氨芐青霉素的培養(yǎng)基平板作為對照，將平板倒置于37℃恒溫箱培養(yǎng)48h(24h之前藍色菌落不容易辨別)，4℃使藍斑充分顯現(xiàn)；b、分離重組Bacmid DNA使用Concert High Purity Plasmid miniPrep System高純度質(zhì)粒純化試劑盒提取Bacmid DNA，將轉(zhuǎn)染重組Bacmid DNA孔的上清吸至離心管中，500g離心5min，將上清轉(zhuǎn)移至新管，標記后儲存于-70℃或4℃，避光保存。
三、病毒的定量和大量制備a、病毒的大量制備①培養(yǎng)sf9昆蟲細胞在直徑35mm的6孔板加入9×105個細胞/孔，細胞處于對數(shù)生長期，97％的存活率；吸出含有抗生素的Grace培養(yǎng)基，加入無抗生素?zé)o血清的空Grace培養(yǎng)基，讓細胞貼壁至少1h(27℃或室溫)；②準備溶液A液吸取5？l重組Bacmid質(zhì)粒DNA加到100μl無抗生素?zé)o血清的Grace培養(yǎng)基；③準備溶液B液將6μl CellFECTIN加到100？l無抗生素?zé)o血清的空Grace培養(yǎng)基，將A液與B液混合，輕輕混勻，室溫孵育30min；④將貼壁細胞在用無抗生素?zé)o血清的Grace培養(yǎng)基洗兩遍，吸出液體，加入800μl空Grace培養(yǎng)基至A、B混合液中，輕輕混勻，加至6孔板的一個孔中，27℃孵育5h；⑤移出轉(zhuǎn)染混合物，向其孔中加入含有血清、兩性霉素、青霉素和鏈霉素的全Grace培養(yǎng)基2ml，27℃培養(yǎng)84h后分別收獲病毒上清和細胞；b、噬斑分析進行病毒液定量①6孔板中每孔加入2ml細胞懸浮液(5～6×105/ml)，細胞在室溫貼壁至少1h；將4％的低熔點瓊脂糖加入等體積的去離子水，配制成2％的低熔點瓊脂糖，置于42℃待用；將2×含有血清的Grace培養(yǎng)基放置于37℃待用；②準備病毒稀釋液分別取150μl病毒液加到1350μl的1×全Grace培養(yǎng)基，混勻后吸取其中150μl液體致第二管培養(yǎng)基，依次做倍量稀釋，得到10-1、10-2等病毒稀釋液，從已貼壁的細胞的每孔中吸出培養(yǎng)液，分別加入稀釋病毒液，做好標記，27℃孵育1h；③從水浴中取出2％的低熔點瓊脂糖，同時從溫箱中取出2×含有血清的Grace培養(yǎng)基，將此兩種物質(zhì)等體積混合；連續(xù)移出六孔板中的病毒液，將上述混勻后的液體在其溫度＜37℃時，以每孔加入2.5ml混合液為準，迅速加至六孔板中；
④待瓊脂糖凝膠在室溫完全凝固后，倒置于27℃恒溫培養(yǎng)箱的濕盒內(nèi)培養(yǎng)7天，第七天可見六孔板上出現(xiàn)乳白或灰色透亮的噬斑，控制孵育時間，直到連續(xù)兩天噬斑無改變；⑤中性紅染色每孔加入0.1％(w/v)中性紅1ml，27℃培養(yǎng)3h；用無菌吸管吸出染料，將6孔板倒置放置于27℃培養(yǎng)箱的濕盒中，孵育3h；噬斑清楚顯現(xiàn)后計數(shù)，計算出pfu/ml；c、擴增病毒，準備大量病毒毒種①MOI值按下列公式進行計算 ②擴增病毒MOI的優(yōu)化用MOI值分別為0.05、0.1、0.2的病毒量感染昆蟲細胞，感染72小時收集細胞培養(yǎng)上清液，做噬斑分析定量各病毒液的滴度，結(jié)果顯示MOI值為0.1時，病毒擴增效果最好；通過三代病毒擴增后得到的四代病毒液滴度為7.5×107 pfu/ml；以此法大量擴增病毒。
四、蛋白的表達與鑒定a、目的蛋白的制備分別以MOI值為10時感染昆蟲細胞，培養(yǎng)76h收獲細胞，離心3000rpm 5min，棄上清，共收集約3.5×109個細胞，將細胞沉淀凍存于-20℃待用；b、超速離心純化VLP1.5×109個細胞用PBS沖洗懸浮，3000g離心10min，將細胞沉淀集中于1個50ml的塑料試管，棄上清；再加入PBS到沉淀的細胞中，至終體積為19ml；超聲波400赫茲強度破碎3次，每次45秒，間歇20秒，將此細胞裂解液緩慢加到等體積的40％蔗糖-PBS墊層上，在4℃、25000rpm(141000g，BACKMAN離心機SW-28轉(zhuǎn)子)條件下離心150min，棄上清，將沉淀中加入27％(w/w)CsCl-PBS，超聲波懸浮；補充27％(w/w)CsCI-PBS致離心管口0.5cm處，在4℃、25000rpm(141000g，Backman離心機SW-28轉(zhuǎn)子)條件下離心20h，用毛細管收集1.29g/ml密度的帶；c、透析蛋白用直徑為1.5cm的透析袋對收集的區(qū)帶進行透析，于4℃在PBS-NaCl(0.5mol/L)的透析液中透析24h，取出透析袋，放入無菌平皿，聚乙二醇8000包埋，吸收水分適量，所獲蛋白經(jīng)核酸蛋白定量儀定量后保存于-70℃待用。
五、表達蛋白的分析a、分子量檢測將重組病毒轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)收獲的細胞用PBS吹懸，移至離心管中，室溫3000g/min離心3min，棄上清，將沉淀加入100μl 1×SDS上樣緩沖液，100℃作用5min，取10μl用于10％的SDS-PAGE，分析蛋白表達情況；b、特異性檢測取10μl于10％的SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，分別用HPV16L1和HPV11L1單克隆抗體檢測其蛋白表達的特異性，HPV11由于其表達量不高，用化學(xué)發(fā)光法進行檢測；在第二部分中進行轉(zhuǎn)膜、封閉和加入第一抗體，第二抗體改變?yōu)槔备^氧化物酶標記的羊抗鼠IgG抗體，1∶10000倍稀釋；按1∶1比例混合底物工作A液和B液，將洗好的轉(zhuǎn)印膜放入含有5ml A+B混合液，室溫孵育5min，將轉(zhuǎn)印膜放到濾紙上吸干殘留液體；在暗室將轉(zhuǎn)印膜放置到X光片上，設(shè)置不同曝光時間，對其進行曝光，將曝光后的X光片上分別通過顯影、定影、洗滌后拍照；c、電鏡檢測VLP形成上述感染的細胞沉淀中取出3×106個細胞約2ml和未感染桿狀病毒的正常昆蟲細胞分別用2.5％的戊二醛4℃固定24小時，PBS充分洗滌，于4℃用1％鋨酸固定2小時；丙酮脫水，每步3分鐘，100％丙酮更換兩次；用丙酮和Epon812以1∶1混合包埋，于室溫下浸泡30min；Epon812包埋，37℃過夜；60℃聚合24h；用LKBIII型超薄切片機切片，撈于銅網(wǎng)上進行1％的醋酸雙氧鈾染、檸檬酸鉛雙染色，沖洗后干燥；在JEM1010透射電鏡上觀察正常細胞陰性對照和桿狀病毒感染所致的細胞病變、重組桿狀病毒的產(chǎn)生情況及VLP在昆蟲細胞內(nèi)存在情況。
六、雙表達HPV11型和16型L1VLP的免疫原性鑒定a、120μl VLP(約含60μg)與90μl PBS混合，加入210μl弗氏完全佐劑，經(jīng)1ml注射器反復(fù)抽吸，形成油包水乳劑，對照組加入200μl PBS與200μl的弗氏完全佐劑同樣進行乳化；b、6～8周BalB/C雌性小鼠8只，18～20g，隨機分成2組，采用腹部皮膚多點注射；實驗組5只，每只注射VLP乳劑70μl，約含10μgVLP，對照組3只，每只注射不含VLP液體70μl，免疫共計3次，分別在第2、4周以同樣劑量進行加強免疫，末次免疫后的14天，引頸處死小鼠，心臟取血，于4℃凝固后，收集VLP抗血清，分裝后-70℃保存；c、免疫血清中抗體檢測采用原核細胞中表達的HPV16型和11型L1蛋白與小鼠血清進行Western blot反應(yīng)。
①將原核表達質(zhì)粒pGEX4T-1-HPV16L1在大腸桿菌BL21/DE3中IPTG誘導(dǎo)后，蛋白進行表達，4.5h收獲細菌，制作Western blot的HPV16L1蛋白的抗原膜；②將pBAD-HPV11L1原核表達質(zhì)粒在TOP10中，經(jīng)L-Arabinose誘導(dǎo)后表達蛋白，4h收獲細菌，用于制作Western blot的HPV11L1蛋白的抗原膜；③上述兩種細菌沉淀中加入SDS加樣緩沖液，每個涌道加入10？l樣品，進行SDS-PAGE電泳及轉(zhuǎn)移蛋白致硝酸纖維膜，4℃封閉過夜；④取免疫后小鼠血清作為第一抗體，按1∶100、1∶200、1∶400和1∶1000倍量稀釋，二抗采用堿性磷酸酶偶聯(lián)的羊抗鼠IgG(1∶5000倍稀釋)，進行Western blot反應(yīng)以驗證血清抗體情況。
序列表<110>哈爾濱醫(yī)科大學(xué)<120>人乳頭瘤病毒型雙價病毒樣顆?；旌系鞍卓乖皹?gòu)建方法<160>2<170>Patent-In 3.1<210>1<211>501<212>氨基酸<213>HPV11L1的氨基酸序列<400>1mwrpsdstvy vpppnpvskv vatdayvkrt nifyhasssr llavghpyys ikkvnktvvp 60kvsgyqyrvf kvvlpdpnkf alpdsslfdp ttqrlvwact glevgrgqpl gvgvsghpll120nkyddvensg gyggnpgqdn rvnvgmdykq tqlcmvgcap plgehwgkgt qcsntsvqng180dcpplelits viqdgdmvdt gfgamnfadl qtnksdvpld icgtvckypd ylqmaadpyg240drlffylrke qmfarhffnr agtvgepvpd dllvkggnnr ssvassiyvh tpsgslvsse300aqlfnkpywl qkaqghnngi cwgnhlfvtv vdttrstnmt lcasvsksat ytnsdykeym360rhveefdlqf ifqlcsitls aevmayihtm npsvledwnf glspppngtl edtyryvqsq420aitcqkptpe kekqdpykdm sfwevnlkek fsseldqfpl grkfllqsgy rgrtsartgi480krpavskpst apkrkrtktk k 501<210>2<211>505<212>氨基酸<213>HPV16L1的氨基酸序列<400>1mslwlpseat vylppvpvsk vvstdeyvar tniyyhagts rllavghpyf pikkpnnnki 60lvpkvsglqy rvfrihlpdp nkfgfpdtsf ynpdtqrlvw acvgvevgrg qplgvgisgh120pllnklddte nasayaanag vdnrecismd ykqtqlclig ckppigehwg kgspctnvav180npgdcpplel intviqdgdm vdtgfgamdf ttlqanksev pldictsick ypdyikmvse240pygdslffyl rreqmfvrhl fnragavgen vpddlyikgs gstanlassn yfptpsgsmv300tsdaqifnkp ywlqraqghn ngicwgnqlf vtvvdttrst nmslcaaist settykntnf360keylrhgeey dlqfifqlck itltadvmty ihsmnstile dwnfglqppp ggtledtyrf420vtsqaiacqk htppapkedp lkkytfwevn lkekfsadld qfplgrkfll qaglkakpkf480tlgkrkatpt tsststtakr kkrkl 50權(quán)利要求
1.人乳頭瘤病毒型雙價病毒樣顆粒混合蛋白抗原，其特征在于它包含一種致宮頸癌病毒HPV16的L1抗原和一種尖銳濕疣病毒HPV11的L1抗原。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的人乳頭瘤病毒型雙價病毒樣顆?；旌系鞍卓乖?，其特征在于HPV11L1基因的氨基酸序列為MWRPSDSTVYVPPPNPVSKVVATDAYVKRTNIFYHASSSRLLAVGHPYYSIKKVNKTVVPKVSGYQYRVFKVVLPDPNKFALPDSSLFDPTTQRLVWACTGLEVGRGQPLGVGVSGHPLLNKYDDVENSGGYGGNPGQDNRVNVGMDYKQTQLCMVGCAPPLGEHWGKGTQCSNTSVQNGDCPPLELITSVIQDGDMVDTGFGAMNFADLQTNKSDVPLDICGTVCKYPDYLQMAADPYGDRLFFYLRKEQMFARHFFNRAGTVGEPVPDDLLVKGGNNRSSVASSIYVHTPSGSLVSSEAQLFNKPYWLQKAQGHNNGICWGNHLFVTVVDTTRSTNMTLCASVSKSATYTNSDYKEYMRHVEEFDLQFIFQLCSITLSAEVMAYIHTMNPSVLEDWNFGLSPPPNGTLEDTYRYVQSQAITCQKPTPEKEKQDPYKDMSFWEVNLKEKFSSELDQFPLGRKFLLQSGYRGRTSARTGIKRPAVSKPSTAPKRKRTKTKK。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的人乳頭瘤病毒型雙價病毒樣顆粒混合蛋白抗原，其特征在于HPV16L1基因的氨基酸序列為MSLWLPSEATVYLPPVPVSKVVSTDEYVARTNIYYHAGTSRLLAVGHPYFPIKKPNNNKILVPKVSGLQYRVFRIHLPDPNKFGFPDTSFYNPDTQRLVWACVGVEVGRGQPLGVGISGHPLLNKLDDTENASAYAANAGVDNRECISMDYKQTQLCLIGCKPPIGEHWGKGSPCTNVAVNPGDCPPLELINTVIQDGDMVDTGFGAMDFTTLQANKSEVPLDICTSICKYPDYIKMVSEPYGDSLFFYLRREQMFVRHLFNRAGAVGENVPDDLYIKGSGSTANLASSNYFPTPSGSMVTSDAQIFNKPYWLQRAQGHNNGICWGNQLFVTVVDTTRSTNMSLCAAISTSETTYKNTNFKEYLRHGEEYDLQFIFQLCKITLTADVMTYIHSMNSTILEDWNFGLQPPPGGTLEDTYRFVTSQAIACQKHTPPAPKEDPLKKYTFWEVNLKEKFSADLDQFPLGRKFLLQAGLKAKPKFTLGKRKATPTTSSTSTTAKRKKRKL。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的人乳頭瘤病毒型雙價病毒樣顆?；旌系鞍卓乖涮卣髟谟谒€包含一種載體，所述載體為Bacmid質(zhì)粒。
5.人乳頭瘤病毒型雙價病毒樣顆粒混合蛋白抗原的構(gòu)建方法，其特征在于它按照下述方法構(gòu)建雙價病毒樣顆粒混合蛋白抗原利用分子生物學(xué)方法從尖銳濕疣組織中克隆HPV11L1基因，和從宮頸癌組織中克隆的HPV16L1基因雙表達于桿狀病毒昆蟲細胞表達系統(tǒng)，構(gòu)建重組病毒株Bacmid/HPV16-HPV11L1。
全文摘要
人乳頭瘤病毒型雙價病毒樣顆粒混合蛋白抗原及構(gòu)建方法，它涉及一種人乳頭瘤病毒型雙價病毒樣顆?；旌象w及該混合體的構(gòu)建方法。本發(fā)明包含一種致宮頸癌病毒HPV16的L1抗原和一種尖銳濕疣病毒HPV11的L1抗原，它按照下述方法構(gòu)建雙價病毒樣顆粒混合蛋白抗原首先利用分子生物學(xué)方法從尖銳濕疣組織中克隆HPV11L1基因；再將從宮頸癌克隆的HPV16L1基因與HPV11L1基因雙表達于桿狀病毒昆蟲細胞表達系統(tǒng)，構(gòu)建重組病毒株Bacmid/HPV16－HPV11L1。通過上述構(gòu)建所得的重組蛋白經(jīng)動物免疫驗證具有良好的免疫原性和免疫反應(yīng)性，可作為基因工程多價疫苗的候選抗原，用于預(yù)防尖銳濕疣和宮頸癌。
文檔編號C07K14/435GK1683010SQ20051000971
公開日2005年10月19日 申請日期2005年2月6日 優(yōu)先權(quán)日2005年2月6日
發(fā)明者谷鴻喜, 莊敏, 魏蘭蘭, 商慶龍, 李迪, 王燕, 張鳳民 申請人:哈爾濱醫(yī)科大學(xué)