專利名稱：血紅素的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及血紅素制備方法的改進(jìn)，具體而言就是對(duì)原料進(jìn)行了加工處理，將血液或紅細(xì)胞用蛋白沉淀劑沉淀制成血粉后，再用酸性丙酮抽提制備血紅素。
背景技術(shù)：
血紅素是一種優(yōu)良的鐵強(qiáng)化劑及抗貧血藥，已被藥理和臨床研究所證實(shí)。它作為補(bǔ)鐵劑可直接被人體吸收，吸收率高達(dá)10％～20％，療效顯著，副作用少。此外，血紅素是制備肝臟機(jī)能改善劑原卟啉二鈉鹽和激光血卟啉診治癌癥藥物的原料，可以作為食品制作中的色素添加劑，應(yīng)用范圍十分廣泛。
通常血紅素是從動(dòng)物全血或其紅細(xì)胞作原料來(lái)分離制備的。文獻(xiàn)報(bào)道有許多方法，諸如冰醋酸法、丙酮法、堿基物---有機(jī)溶劑法，離子交換纖維素法和酶解法等。冰醋酸法是俄國(guó)學(xué)者Schalfeieff最早用于實(shí)驗(yàn)室提取、分離血紅素的一種方法。系利用冰醋酸、氯化鈉和血共熱得血紅素結(jié)晶，在當(dāng)今工業(yè)上仍被采用。但是此法有很多缺點(diǎn)，冰醋酸耗量大，生產(chǎn)成本較高；生產(chǎn)中產(chǎn)生大量溶解在醋酸里的蛋白質(zhì)廢液，回收處理困難，工藝中提取和回收必須用耐腐蝕的裝置；原料應(yīng)新鮮，否則，收率和純度均會(huì)顯著下降。堿基物---有機(jī)溶劑法為日本佐藤治男發(fā)明，系用含有堿基物質(zhì)的有機(jī)溶劑，使血紅蛋白中的血紅素與珠蛋白分解。血紅素呈溶解狀態(tài)，而珠蛋白則以固狀物被沉淀下來(lái)，因此，兩者較易分離開來(lái)。堿基物質(zhì)為二乙氨、二氯醋酸、吡啶等有機(jī)胺、氨、苛性碳酸鈉、苛性堿等金屬氫氧化物。有機(jī)溶劑為甲醇、乙醇、丙醇等低級(jí)醇和丙酮、丁酮等酮類。此法使用大量的堿，也會(huì)造成工業(yè)污染，收率也不高(3～4g/L紅細(xì)胞)。離子交換纖維素法是1983年芬蘭科學(xué)家發(fā)明的，利用羧甲基纖維素(CMC)吸附血紅素加以提取，該法得到的是CMC-血紅素粉，要得到血紅素純品，還需進(jìn)一步精制，成本提高，工藝也變得復(fù)雜。利用各種蛋白酶將血紅蛋白水解成水溶性的氨基酸和多肽，將不溶于水的血紅素分離出來(lái)，也是一種無(wú)化學(xué)污染的好辦法，但是水解時(shí)間長(zhǎng)，所得血紅素也是粗品，仍需精制，生產(chǎn)成本提高。
早期的酸性丙酮提取法制備血紅素，是用酸性丙酮直接提取溶血液，并加入醋酸鈉，使血紅素從提取液中析出，該法存在的問(wèn)題是，若丙酮用量少，雜蛋白去除不凈，用量大則可造成成本高，同時(shí)也給生產(chǎn)帶來(lái)設(shè)備、周期等一系列難題，實(shí)用性大打折扣，所得血紅素純度只有60％左右。目前也有用酸性丙酮提取血粉得高純度血紅素的報(bào)道，但是血粉一般是采用低溫冷凍法，或噴霧干燥法制成，需要特殊設(shè)備，使成本大大提高。目前國(guó)內(nèi)一些廠家的產(chǎn)品因純度不高售價(jià)僅￥6～10/g，純度高的，售價(jià)約￥90/g，而純度高的進(jìn)口同類產(chǎn)品，售價(jià)高達(dá)￥300/g左右。

發(fā)明內(nèi)容
綜合比較以上工藝路線，本發(fā)明提出了采用蛋白沉淀劑沉淀全血或紅細(xì)胞制備血粉，生產(chǎn)周期縮短，設(shè)備要求降低，產(chǎn)品純度高，收率高，成本低，￥3～5/g，適合工業(yè)化生產(chǎn)。
經(jīng)過(guò)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，多種蛋白沉淀劑均有使血紅蛋白及全血蛋白沉淀下來(lái)的效果，本發(fā)明采用的蛋白沉淀劑是下述溶液中的一種1)5％～30％三氯醋酸溶液2)5％～20％磺基水楊酸溶液3)10％～20％單寧酸溶液4)5％～15％磷鎢酸鈉溶液5)0.1mol/L～1.0mol/L BaCl2溶液6)0.8mol/L～1.5mol/L (NH4)2SO4溶液7)0.5mol/L～1.2mol/L CuSO4溶液8)0.1mol/L～1.5mol/L ZnSO4溶液9)0.1mol/L～1.5mol/L Zn(Ac)2溶液10)0.1mol/L～1.5mol/L CaCl2溶液11)0.5mol/L～1.5mol/L Pb(Ac)2溶液12)0.1mol/L～1.5mol/L MgSO4溶液13)丙酮14)95％乙醇-氯仿(1∶2～2∶1)15)60％～100％乙醇
16)60％～100％甲醇17)氯仿18)丙醇蛋白沉淀劑的用量是全血體積的2～3倍，是紅細(xì)胞體積的0.5～1倍。本發(fā)明提供的血紅素制備方法，工藝簡(jiǎn)單，操作容易，生產(chǎn)周期短，設(shè)備要求簡(jiǎn)單，收率及純度高，適合工業(yè)化生產(chǎn)，下面結(jié)合實(shí)例具體說(shuō)明。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1新鮮豬血1000ml，加0.8％檸檬酸三鈉作抗凝劑，檸檬酸三鈉可用少量蒸餾水溶解并事先加入容器中，劇烈攪拌下加入丙酮1500ml，待蛋白沉淀完全后，抽濾。收集沉淀，揮干溶劑后碾碎成粉，加入鹽酸丙酮2000ml，攪拌抽提10min，抽濾，用鹽酸丙酮500ml分次洗滌沉淀至灰白色，合并濾液。濾液用1mol/L NaOH溶液調(diào)pH至6～7，析出沉淀，3000r/min離心10min，取沉淀。沉淀用0.1mol/L NaOH溶液200ml溶解，1mol/L HCl調(diào)pH至酸性，析出大量紫紅色沉淀，3000r/min離心10min，去上清，沉淀用水洗至中性，37℃干燥，得血紅素2.9g，產(chǎn)品純度99.5％。
實(shí)施例2新鮮豬血1000ml，加0.8％檸檬酸三鈉作抗凝劑，檸檬酸三鈉可用少量蒸餾水溶解并事先加入容器中，3000r/min離心15min，傾出上清液，收集紅細(xì)胞，再用0.9％NaCl溶液洗滌紅細(xì)胞2次，得干凈紅細(xì)胞420ml。向紅細(xì)胞中加入等體積的雙蒸水，攪拌30min使溶血，然后加入30％三氯醋酸溶液200ml，攪拌10min，待沉淀完全后，3000r/min離心10min，得血紅蛋白沉淀，加入酸性丙酮(pH＜3)2000ml，攪拌抽提10min，抽濾，沉淀用酸性丙酮洗至灰白色，合并濾液，約2500ml。濾液用1mol/L NaOH溶液調(diào)pH至中性，析出沉淀，3000r/min離心10min，收集沉淀。沉淀用0.1mol/L NaOH溶液200ml溶解，1mol/L HCl調(diào)pH至酸性，析出大量沉淀，3000r/min離心10min，沉淀用水洗至中性，37℃干燥，得血紅素2.8g，產(chǎn)品純度99.8％。
實(shí)施例3新鮮豬血1000ml，加0.8％檸檬酸三鈉作抗凝劑，檸檬酸三鈉可用少量蒸餾水溶解并事先加入容器中，3000r/min離心15min，傾出上清液，收集紅細(xì)胞，再用0.9％NaCl溶液洗滌紅細(xì)胞2次，得干凈紅細(xì)胞440ml，加入丙酮500ml，攪拌10min，待沉淀完全后，3000r/min離心10min，得血紅蛋白沉淀，加入酸性丙酮(pH＜3)2000ml，攪拌抽提10min，抽濾，沉淀用酸性丙酮洗至灰白色，合并濾液，約2500ml。濾液用1mol/L NaOH溶液調(diào)pH至中性，析出沉淀，3000r/min離心10min，收集沉淀，沉淀用0.1mol/L NaOH溶液200ml溶解后，1mol/L HCl調(diào)pH至酸性，析出大量沉淀，3000r/min離心10min，沉淀用水洗至中性，37℃干燥，得血紅素2.8g，產(chǎn)品純度99.7％。
實(shí)施例4新鮮豬血1000ml，加0.8％檸檬酸三鈉作抗凝劑，檸檬酸三鈉可用少量蒸餾水溶解并事先加入容器中，3000r/min離心15min，傾出上清液，收集紅細(xì)胞，再用0.9％NaCl溶液洗滌紅細(xì)胞2次，得干凈紅細(xì)胞420ml。向紅細(xì)胞中加入等體積的雙蒸水，攪拌30min使溶血，然后加入0.5mol/L CuSO4溶液200ml，攪拌10min，待沉淀完全后，3000r/min離心10min，得血紅蛋白沉淀，加入酸性丙酮(pH＜3)2000ml，攪拌抽提10min，抽濾，沉淀用酸性丙酮洗至灰白色，合并濾液，約2500ml。濾液用1mol/L NaOH溶液調(diào)pH至中性，析出沉淀，3000r/min離心10min，收集沉淀。沉淀用0.1mol/L NaOH溶液200ml溶解，1mol/L HCl調(diào)pH至酸性，析出大量沉淀，3000r/min離心10min，沉淀用水洗至中性，37℃干燥，得血紅素2.7g，產(chǎn)品純度99.8％。
實(shí)施例5新鮮豬血1000ml，加0.8％檸檬酸三鈉作抗凝劑，檸檬酸三鈉可用少量蒸餾水溶解并事先加入容器中，劇烈攪拌下加入15％磺基水楊酸溶液1000ml，待蛋白沉淀完全后，抽濾。收集沉淀，揮干溶劑后碾碎成粉，加入鹽酸丙酮2000ml，攪拌抽提10min，抽濾，用鹽酸丙酮500ml分次洗滌沉淀至灰白色，合并濾液。濾液用1mol/L NaOH溶液調(diào)pH至6～7，析出沉淀，3000r/min離心10min，取沉淀。沉淀用0.1mol/L NaOH溶液200ml溶解，1mol/L HCl調(diào)pH至酸性，析出大量紫紅色沉淀，3000r/min離心10min，去上清，沉淀用水洗至中性，37℃干燥，得血紅素2.9g，產(chǎn)品純度99.5％。
血紅素定性測(cè)定1.性狀本法制備所得血紅素，在反射光下呈鋼藍(lán)色粉末狀晶體，顯微鏡下觀察呈紅色針狀晶體，易溶于堿性溶液，如氨水和氫氧化鈉溶液，不溶于鹽酸、70％～80％乙醇、乙醚和水，在水中穩(wěn)定，與對(duì)照品相同。
2.紅外光譜分別取血紅素對(duì)照品和樣品以溴化鉀壓片，紅外光譜掃描，結(jié)果表明，樣品的紅外圖譜和對(duì)照品基本一致。
3.紫外光譜分別稱取血紅素對(duì)照品和樣品適量，配成一定濃度，在波長(zhǎng)300～500nm處掃描。結(jié)果顯示，樣品在385±1nm波長(zhǎng)處有最大吸收，與對(duì)照品相同。
血紅素定量測(cè)定1.繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線精密稱取血紅素對(duì)照品18mg，至100ml容量瓶中，加0.1mol/L NaOH溶液適量使完全溶解后再用0.1mol/L NaOH溶液稀釋至刻度，搖勻。分別精密吸取上述溶液1.0，2.0，3.0，4.0，5.0ml置100ml容量瓶中，用0.1mol/L NaOH溶液稀釋至刻度，搖勻。用溶劑作空白，于波長(zhǎng)385nm處測(cè)定吸光度值，以吸光度A為縱坐標(biāo)，濃度C為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
2.樣品測(cè)定精密稱取血紅素樣品約20mg，置100ml容量瓶中，加0.1mol/L NaOH溶液適量使完全溶解后，再用0.1mol/L NaOH溶液稀釋至刻度，搖勻。精密吸取上述溶液3.0ml置100ml容量瓶中用0.1mol/L NaOH溶液稀釋至刻度，搖勻。用溶劑作空白，于波長(zhǎng)385nm處測(cè)定吸光度值，并計(jì)算含量。
權(quán)利要求
1.一種利用動(dòng)物血液提取血紅素的方法，用酸性丙酮溶液對(duì)動(dòng)物血粉進(jìn)行提取，其特征在于血粉的制備方法是采用在全血或紅細(xì)胞中加入蛋白沉淀劑加以沉淀制備得到的。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是采用的蛋白沉淀劑可以是下述溶液中的一種1)5％～30％三氯醋酸溶液2)5％～20％磺基水楊酸溶液3)10％～20％單寧酸溶液4)5％～15％磷鎢酸鈉溶液5)0.1mol/L～1.0mol/L BaCl2溶液6)0.8mol/L～1.5mol/L (NH4)2SO4溶液7)0.5mol/L～1.2mol/L CuSO4溶液8)0.1mol/L～1.5mol/L ZnSO4溶液9)0.1mol/L～1.5mol/L Zn(Ac)2溶液10)0.1mol/L～1.5mol/L CaCl2溶液11)0.5mol/L～1.5mol/L Pb(Ac)2溶液12)0.1mol/L～1.5mol/L MgSO4溶液13)丙酮14)95％乙醇～氯仿(1∶2～2∶1)15)60％～100％乙醇16)60％～100％甲醇17)氯仿18)丙醇
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是蛋白沉淀劑的用量是全血體積的2～3倍，是紅細(xì)胞體積的0.5～1倍。
全文摘要
本發(fā)明涉及血紅素的提取制備方法，向動(dòng)物全血或其紅細(xì)胞中加入適量蛋白沉淀劑沉淀蛋白，得到血粉，血粉用鹽酸丙酮溶液抽提血紅素，抽提液中加入堿液，調(diào)pH值6～7，析出血紅素固體。利用本工藝生產(chǎn)血紅素，生產(chǎn)周期短，設(shè)備要求簡(jiǎn)單，成本低，適合工業(yè)化生產(chǎn)。
文檔編號(hào)C07F15/00GK1594337SQ20041004004
公開日2005年3月16日 申請(qǐng)日期2004年6月21日 優(yōu)先權(quán)日2004年6月21日
發(fā)明者余蓉, 李曉紅, 李秀玲, 楊繼虞 申請(qǐng)人:四川大學(xué)