專利名稱：一種商品型親和層析柱的制備及使用方式的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域技術(shù)背景通過分子之間的各種理化特性的差異達(dá)到把單一蛋白從組織提取液或蛋白混雜的溶液中純化出來需要經(jīng)歷一系列很復(fù)雜和繁瑣的操作過程，耗費(fèi)時(shí)間長而最終收率卻很低。隨著生化技術(shù)的發(fā)展，出現(xiàn)一種操作簡(jiǎn)便、分離特異性高的分離純化生物大分子的方法——親和層析法。它的原理是利用抗原-抗體之間的特異性識(shí)別和結(jié)合的特性來“一步法”純化目標(biāo)蛋白。它的具體實(shí)施方式
是將能夠識(shí)別和結(jié)合目標(biāo)蛋白的抗體偶聯(lián)到固相樹脂上，常用的樹脂有溴化氰活化的瓊脂糖凝膠，如Sepharose 4B等。當(dāng)使用偶聯(lián)了抗體的樹脂和雜蛋白溶液接觸時(shí)，溶液中只有被抗體特異性地識(shí)別和結(jié)合了的蛋白才會(huì)滯留在樹脂上，經(jīng)過沖洗去除未被結(jié)合的非特異性雜蛋白，最后使用洗脫液解離被抗體結(jié)合的蛋白就可以將與抗體結(jié)合的目標(biāo)蛋白與其它雜蛋白分離。利用此原理和方法可以“一步法”從組織提取液或雜蛋白溶液中分離純化出所需要的目標(biāo)蛋白。利用親和層析來純化生物大分子的優(yōu)點(diǎn)是操作簡(jiǎn)便，特異性高、分離效果好，是一種即省力又省時(shí)的高效分離方法。親和層析技術(shù)現(xiàn)已成為生化實(shí)驗(yàn)室里一種用來分離純化蛋白的常用方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及制備的商品型親和層析柱用填料和成品柱是為了解決從組織提取液或雜蛋白溶液中“一步法”提取人熱休克蛋白(Heatshock protein，簡(jiǎn)稱HSP)。熱休克蛋白是一類同源性極高、序列非常保守的存在于細(xì)胞內(nèi)的家族蛋白，根據(jù)其分子大小和結(jié)構(gòu)特性可分為多個(gè)成員，如HSP-27、HSP-40、HSP-60、HSP-70、HSP-90、HSP-110、主要存在于胞漿內(nèi)，gp96蛋白主要存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)等。它們平時(shí)處于低水平的表達(dá)狀態(tài)，一旦細(xì)胞出現(xiàn)生理性、病理性或環(huán)境的突發(fā)性變化時(shí)HSP的表達(dá)便會(huì)急劇提高，因此熱休克蛋白又被稱為“應(yīng)激蛋白”。HSP通過參與蛋白質(zhì)的結(jié)合、折疊、亞單位的裝配、跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)及抗原遞呈對(duì)細(xì)胞的生長、分化、基因轉(zhuǎn)錄和自我保護(hù)發(fā)揮重要作用。HSP的另一個(gè)重要特性是其具有結(jié)合細(xì)胞內(nèi)變異蛋白質(zhì)和多肽的能力。它們與細(xì)胞內(nèi)變異蛋白、多肽結(jié)合、參與抗原遞呈而其HSP本身并不產(chǎn)生抗原性，因此HSP又被稱為“分子伴侶”。制備出一種能使生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室和臨床醫(yī)學(xué)中心快速、便捷和高效的分離純化出HSP蛋白的親和層析柱用填料或親和層析成品柱在實(shí)際應(yīng)用中有著十分重要的意義。
具體實(shí)施例方式
1.制備親和層析柱用填料購買已活化的瓊脂糖凝膠樹脂，如CNBr-Sepharose 4B。
偶聯(lián)前處理稱取1g CNBr-Sepharose 4B用1mMo/L鹽酸充分浸洗膨脹凝膠樹脂再用偶聯(lián)緩沖液(0.1Mol/L NaHCO3，0.1Mol/L Na2CO3和0.5Mol/LNaCl，pH8.5)洗2次。
偶聯(lián)處理完畢的凝膠樹脂與等體積的偶聯(lián)緩沖液含有10μMol/LHSP-60抗體混合，在室溫下溫和搖動(dòng)混合2小時(shí)后，棄去溶液保留凝膠樹脂。
封閉多余結(jié)合位點(diǎn)向凝膠樹脂中加入0.2Mol/L甘氨酸溶液10ml，室溫下旋轉(zhuǎn)混合1小時(shí)以封閉Sepharose 4B上未與抗體結(jié)合的位點(diǎn)。用偶聯(lián)緩沖液和醋酸鹽緩沖液(0.1Mol/L NaCH2COOH和0.5Mol/L NaCl，pH4.0)交替洗2次，再用100ml 0.15Mol/L PBS緩沖液(pH7.2)輕輕地清洗凝膠樹脂2次。親和樹脂可供上樣做親和反應(yīng)。
防腐處理制備好的親和樹脂如需放置一段時(shí)間，樹脂應(yīng)使用含有1/10000疊氮鈉的PBS浸泡在并瀝去多余的溶液后放入包裝袋或瓶中在4℃中密閉保存。
親和層析柱填料的包裝將與HSP-60偶聯(lián)的瓊脂糖凝膠樹脂每5克封入鋁塑包裝袋內(nèi)封口或裝入棕色的玻璃瓶中用氨基膠塞塞緊并用鋁薄壓蓋密封瓶口。
保存偶聯(lián)好抗體的瓊脂糖凝膠樹脂切勿冷凍，保存在4℃的冰箱內(nèi)，1年之內(nèi)性能穩(wěn)定。
2.制備親和層析柱將5g與抗人HSP-60的抗體偶聯(lián)的瓊脂糖凝膠用100ml 0.15Mol/LPBS緩沖液(pH7.2)浸泡并裝到尺寸適宜的層析柱中，防止柱床內(nèi)含有氣泡。使用0.15Mol/L PBS緩沖液(pH7.2)平衡層析柱。該柱可供親和上樣。
層析柱的保存使用含有1/10000疊氮鈉的防腐PBS緩沖液過柱。保留適當(dāng)防腐液在柱內(nèi)浸泡樹脂并使用薄膜密封層析柱的上下兩端以防止樹脂污染和干燥。將制備好的親和層析柱單獨(dú)裝入鋁塑薄膜或塑料薄膜袋內(nèi)密封之后保存在4℃冰箱內(nèi)，有效期為1年。包裝好的親和層析柱切勿冷凍。
實(shí)施例1親和層析柱的準(zhǔn)備取1包5g已偶聯(lián)HSP-60抗體的Sepharose 4B親和層析柱填料放入有蓋的瓶中，用50ml 0.15Mol/L PBS(pH7.2)PBS緩沖液(簡(jiǎn)稱PBS緩沖液)浸泡清洗后吸出多余的溶液，樹脂可供待進(jìn)行親和反應(yīng)。
組織液的制備從大鼠身上取出腫瘤塊，修去正常組織，將切割成小碎塊的腫瘤組織放入-20℃冰箱中冷凍2小時(shí)后將其置入勻漿器中研磨。向研磨器中逐漸加入20ml預(yù)冷的PBS緩沖液并繼續(xù)研磨。研磨液經(jīng)過冷凍離心機(jī)8000rpm 10分鐘離心后取上清液做親和反應(yīng)。
親和反應(yīng)將離心后的研磨上清液移送到裝有親和層析樹脂填料的瓶中，擰緊瓶蓋防止瓶?jī)?nèi)溶液泄露，將親和樹脂與腫瘤組織研磨液在瓶中混合并放置在搖動(dòng)器或震蕩器上在4℃的環(huán)境中溫和地?fù)u動(dòng)震蕩過夜，達(dá)到使親和樹脂上的抗體與溶液中的抗原充分結(jié)合的目的。
裝柱次日將瓶中的樹脂及溶液全部裝填到干凈的空層析柱中，讓液體流經(jīng)樹脂從層析柱底部流出，待液面剛抵樹脂面時(shí)出再加入PBS緩沖液充分沖洗親和層析柱直至流出液的紫外吸收值OD280＜0.02，達(dá)到將非特異性蛋白沖洗去除的目的。
洗脫親和物用0.1Mol/L的甘氨酸-鹽酸溶液(pH2.4)洗脫親和層析柱中與HSP-60抗體結(jié)合的目標(biāo)蛋白，即HSP-60蛋白。收集的洗脫組分迅速用0.1Mol/L Tris-Cl緩沖液(pH8.0)中和以免蛋白變性。
分離物的鑒定
利用親和層析的方法純化出的HSP-60蛋白可用高效液相色譜(HPLC)或聚丙烯酰氨凝膠電泳(SDS-PAGE)分析洗脫產(chǎn)物的純度，可用紫外分光光度法做蛋白含量的測(cè)定。
柱的再生用10個(gè)柱床體積的0.1Mol/L Tris-HCl含0.5Mol/L NaCl(pH8.5)緩沖液，和pH4.5，0.1mol/L醋酸鈉緩沖液輪流清洗親和層析柱2次，再用PBS緩沖液充分平衡層析柱后可保存在4℃冰箱內(nèi)供下次使用。
親和層析柱經(jīng)過再生后可再次使用，每根親和層析柱可反復(fù)再生使用多次。
實(shí)施例2取用1根已偶聯(lián)HSP-60抗體的Sepherose 4B親和層析柱用0.15Mol/L PBS緩沖液(pH7.2)流洗平衡以供上樣。
樣品的預(yù)處理將含有HSP-60分子的雜蛋白混合液在4℃的環(huán)境中用PBS緩沖液透析過夜。
親和反應(yīng)次日將透析好的雜蛋白溶液加到平衡好了的親和層析柱上，保持流速在0.5ml/min。待樣品流完后用大量PBS流洗親和柱直至流出液的紫外吸收值OD280＜0.02。
洗脫親和物使用0.1Mol/L甘氨酸-HCl(pH2.4)洗脫與樹脂偶聯(lián)抗體結(jié)合的目標(biāo)蛋白，即HSP-60蛋白。收集含有洗脫物的流份并立即在4℃的環(huán)境中對(duì)PBS緩沖液透析過夜。其中換PBS緩沖液1至2次。
鑒定純化產(chǎn)物次日將透析袋內(nèi)的溶液轉(zhuǎn)移到瓶中。利用親和層析的方法分離純化出來的產(chǎn)物可根據(jù)需要進(jìn)行蛋白濃度、純度和活性的測(cè)定。
親和層析柱的再生用10個(gè)柱床體積的0.1Mol/L Tris-HCl含0.5Mol/L NaCl(pH8.5)緩沖液，和pH4.5，0.1mol/L醋酸鈉緩沖液輪流清洗親和層析柱2次，再用pH7.2，0.15mol/L PBS充分平衡層析柱。
貯存使用加入1/萬的疊氮鈉的PBS緩沖液浸泡樹脂并貯存于4℃冰箱內(nèi)。
分離產(chǎn)物鑒定收集分離純化出的HSP-60蛋白可采用SDS-PAGE瓊脂糖凝膠電泳、高效液相色譜(HPLC)、Western Blot、紫外分光等方法檢測(cè)分離出來的蛋白純度和含量。
結(jié)論在雜蛋白溶液中含有低含量的HSP-60蛋白，經(jīng)過親和層析柱的“一步法”提取可將雜蛋白溶液中的HSP-60蛋白特異性地富集分離出來。此制備偶聯(lián)了HSP抗體的親和層析柱的方法將可用于制備商品化的提取HSP蛋白的親和層析柱，達(dá)到有效地從含有少量HSP蛋白的雜蛋白溶液中特異性地分離純化出HSP蛋白的目的。此商品型的HSP親和層析柱可極大地方便和縮短生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室和醫(yī)療單位的使用者分離提取HSP蛋白的程序。
在使用操作時(shí)可按照但不必拘泥于以上的實(shí)驗(yàn)條件和方法進(jìn)行親和層析的樣品預(yù)處理、偶聯(lián)、封閉、上樣、清洗、洗脫等。
可以將可識(shí)別和結(jié)合單一HSP蛋白或多種HSP蛋白的單一或多種單克隆或多克隆抗體偶聯(lián)到樹脂上，如將HSP-70的單克隆抗體和gp96的單克隆抗體混合在一起偶聯(lián)到Sepharose 4B樹脂上。根據(jù)需要使用不同的HSP抗體偶聯(lián)到親和樹脂上可制備成適合各種需要的商品型親和層析柱填料或親和層析柱。
權(quán)利要求
1.制備一種可從雜蛋白溶液中快速、簡(jiǎn)便和特異性地提取出人HSP-60蛋白的親和層析柱所使用的樹脂填料及其成品柱。
2.制備本親和層析柱的樹脂填料可為任何可特異性地識(shí)別和結(jié)合HSP-60蛋白的樹脂。
3.本親和層析柱填料使用的樹脂可以是偶聯(lián)了可識(shí)別和結(jié)合HSP-60蛋白的一種或多種抗體，它們可以是單克隆抗體或多克隆抗體。
4.本親和層析柱填料使用的樹脂可不僅偶聯(lián)了抗人或哺乳類動(dòng)物HSP-60蛋白抗體，還可同時(shí)偶聯(lián)識(shí)別和結(jié)合人或哺乳類動(dòng)物熱休克蛋白家族中其它蛋白的抗體，如HSP-27、HSP-40、HSP-70、HSP-90、HSP-110、gp-96等蛋白的抗體。它們可以是單克隆或多克隆抗體。
5.親和層析柱填料使用的樹脂可以是偶聯(lián)了可識(shí)別和結(jié)合人或哺乳類動(dòng)物熱休克蛋白家族中任意單一的一種或不同的幾種蛋白的抗體，所用抗體可以是單克隆或多克隆抗體。
6.制備完成了的親和樹脂可直接使用不易破損、防干燥、避光的容器或薄膜密封包裝并保存在低溫環(huán)境中，它們將以商品的形式提供給使用者直接填充到柱中，方便他們制備親和層析柱。
7.制備完成了的親和樹脂可填充在底部可阻隔樹脂但溶液可流出的容器中。該容器可為任何材料制成，也可使用注射器的外管、移液管、層析柱等制成。
8.制備而成的親和層析柱應(yīng)使用防潮、避光、不易破損的薄膜或盒子密封包裝以防干燥、污染。包裝好的親和層析柱應(yīng)放置在4℃低溫的環(huán)境中保藏并將以商品的形式直接提供給使用者使用。
全文摘要
本發(fā)明涉及應(yīng)用可特異性地識(shí)別熱休克蛋白的抗體來制備一種商品型親和樹脂和親和層析柱，其目的是為了方便從蛋白混雜的液體中快速、簡(jiǎn)便、高效、特異性地提取出熱休克蛋白(heat shock protein簡(jiǎn)寫HSP)及與熱休克蛋白(HSP)非共價(jià)結(jié)合的多肽抗原分子群所形成的熱休克蛋白－多肽復(fù)合體(heat shock protein peptide complexes簡(jiǎn)稱HSPPC)。
文檔編號(hào)C07K1/00GK1621122SQ200310115050
公開日2005年6月1日 申請(qǐng)日期2003年11月24日 優(yōu)先權(quán)日2003年11月24日
發(fā)明者韓蘇 申請(qǐng)人:北京中天康泰生物科技有限公司