專利名稱：用于治療間變性甲狀腺癌的4－(4－甲基哌嗪－1－基甲基)－n－[4－甲基－3－基)嘧啶 ...的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及4-(4-甲基哌嗪-1-基甲基)-N-[4-甲基-3-(4-(吡啶-3-基)嘧啶-2-基氨基)苯基]-苯甲酰胺(下文稱為“化合物I”)或其可藥用鹽在制備用于治療間變性甲狀腺癌(anaplastic thyroid cancer)的藥物中的用途，涉及化合物I或其可藥用鹽在治療間變性甲狀腺癌中的用途，涉及治療患有間變性甲狀腺癌的包括哺乳動物在內的溫血動物、尤其是人的方法，該方法通過向需要這種治療的所述動物施用有效劑量的化合物I或其可藥用鹽來進行治療。
甲狀腺濾泡細胞衍生的癌在病理學上被分為分化(乳頭狀和濾泡狀)癌和未分化(間變性)癌。分化癌具有較好的預后，然而間變性甲狀腺癌非常具有攻擊性并且極端致命，治療應答差。據報道，在間變性癌中腫瘤抑制基因p53突變的發(fā)生率為70-85％，而在分化癌中發(fā)生率為0-9％。因此，p53基因突變被認為是與甲狀腺癌發(fā)生中的分化喪失相關的晚期遺傳學事件并且是造成該類癌的高度攻擊性性質的分子改變之一。
化合物具有式(I)的結構 化合物I游離堿及其可接受的鹽在歐洲專利申請0564409中公開。
化合物I的可藥用鹽是可藥用的酸加成鹽，如例如與無機酸如鹽酸、硫酸或磷酸的酸加成鹽，或者與適宜的有機羧酸或磺酸的酸加成鹽，所述的有機羧酸或磺酸是例如脂肪族一元或二元羧酸，如三氟乙酸、乙酸、丙酸、乙醇酸、琥珀酸、馬來酸、富馬酸、羥基馬來酸、蘋果酸、酒石酸、檸檬酸或草酸；或者氨基酸如精氨酸或賴氨酸；芳族羧酸，如苯甲酸、2-苯氧基-苯甲酸、2-乙氧基-苯甲酸、水楊酸、4-氨基水楊酸；芳族-脂肪族羧酸，如扁桃酸或肉桂酸；雜芳族羧酸，如煙酸或異煙酸；脂肪族磺酸，如甲磺酸、乙磺酸或2-羥基乙磺酸，或者芳族磺酸，例如苯磺酸、對甲苯磺酸或奈-2-磺酸。
下文中被稱為“鹽I”的化合物I甲磺酸鹽以及化合物I甲磺酸鹽的α和β晶形在1999年1月公布的國際專利申請WO 99/03854中公開。
現已令人驚奇地發(fā)現鹽I可用作治療間變性甲狀腺癌、尤其是含有突變p53的間變性甲狀腺癌的治療劑。
因此，本發(fā)明涉及治療患有間變性甲狀腺癌的溫血動物的方法，該方法包括向需要這種治療的所述動物施用抗間變性甲狀腺癌、尤其是含有突變p53的間變性甲狀腺癌治療有效量的鹽I。
本發(fā)明涉及向患有間變性甲狀腺癌、尤其是含有突變p53的間變性甲狀腺癌的人類對象施用式I的4-(4-甲基哌嗪-1-基甲基)-N-[4-甲基-3-(4-(吡啶-3-基)嘧啶-2-基氨基)苯基]-苯甲酰胺的酸加成鹽且優(yōu)選單甲磺酸鹽的方法。
術語“治療”包括將鹽I施用于需要這種治療的溫血動物，目的是治愈腫瘤或在腫瘤消退和延緩疾病惡化方面具有效果。
此處所用的術語“延緩惡化”意指腫瘤生長或者通常地，疾病惡化至少被該治療減緩或阻遏并且所述患者比未治療或用安慰劑治療的患者顯示出更高的存活率。
本發(fā)明的藥物組合物可以用本身已知的方法制備，并且是那些適于經腸如口服或直腸和經胃腸外施用于包括人在內的溫血動物的組合物，其包含治療有效量的至少一種單獨的或與一種或多種可藥用載體、尤其是適于經腸或經胃腸外應用的可藥用載體組合的藥理學活性成分。本發(fā)明的劑型的優(yōu)選施用途徑是口服。
相關領域的技術人員完全能夠選擇相關的試驗模型以證明此處所提及的對間變性甲狀腺癌的有益作用。所述化合物的藥理學活性可以例如用下述實施例、通過體外試驗和在裸鼠或轉基因小鼠中進行的體內試驗或在適宜的臨床研究中被證明。適宜的臨床研究為例如在患有間變性甲狀腺癌的患者中進行的開放標記、非隨機、劑量遞增研究。在這些研究中可以例如通過每6周評價癌的大小或通過適宜的血清腫瘤標志物或通過閃爍造影術腫瘤檢測、用與活性成分相匹配的安慰劑所達到的功效為對照來測定治療的功效。
鹽I的有效劑量可根據所用的具體化合物或藥物組合物、施用方式、所治療的甲狀腺癌的類型或所治療的甲狀腺癌的嚴重性而改變。根據包括患者的腎功能和肝功能在內的許多其它因素選擇劑量方案。普通技術的內科醫(yī)生、臨床醫(yī)生或獸醫(yī)可容易地確定和開具預防、逆轉和阻止病癥惡化所需的化合物的有效量。
根據種屬、年齡、個體狀況、施用方式和所討論的臨床狀況，對體重約70kg的溫血動物施用鹽I的有效劑量，例如相當于約10-1000mg活性化合物(游離堿)、優(yōu)選50-600mg、尤其是100至400mg的日劑量。對于患有間變性甲狀腺癌、尤其是含有突變p53的間變性甲狀腺癌的成年患者，可推薦每天200或400mg的起始劑量。在對治療應答進行評價后對于應答不充分的患者，可安全地考慮劑量遞增，只要患者從治療中受益并且沒有限制性毒性即可以對其進行治療。
本發(fā)明還涉及向患有間變性甲狀腺癌、尤其是含有突變p53的間變性甲狀腺癌的人類對象施用化合物I或其可藥用鹽的方法，該方法包括將藥學有效量的化合物I或其可藥用鹽施用于人類對象，例如每天施用一次，例如，施用時間超過3個月。本發(fā)明尤其涉及其中對成年人施用的日劑量為50至600mg、優(yōu)選100至400mg的所述方法。
實施例1鹽I誘導間變性甲狀腺癌細胞的S-G2過渡細胞停滯1)鹽I對細胞生長的抑制作用細胞生長測定法-實驗1細胞培養(yǎng)制備檢測不到或含突變型p53的人間變性或未分化甲狀腺癌細胞系，即FRO和ARO以及含野生型p53基因的分化乳頭狀甲狀腺癌細胞系(KCT-1)。1F3細胞系是將野生型p53基因導入FRO的穩(wěn)定轉化體。將這些細胞系在添加了5％熱滅活胎牛血清(FBS；Life Technologies，Inc.)的RPMI 1640培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)并在含5％CO2的加濕氣氛中于37℃下保持。為了分析鹽I的作用，將細胞于0.1％二甲亞砜(DMSO)或被DMSO稀釋的鹽I(終濃度0.1％)存在下進行溫育。將細胞以1×103個細胞/孔的密度接種在96孔微量滴定板中(n＝5)。一天后(第1天)，將細胞用1、10或50μM鹽I或在100μl新鮮培養(yǎng)基中的0.1％DMSO進行處理。溫育48小時后用細胞計數試劑盒(Wako)測量每孔中的細胞數。該實驗進行至少3次。
如下用細胞計數器檢查細胞生長曲線。將細胞以0.5或0.8×105個細胞/孔的密度接種在6-孔培養(yǎng)板中(n＝5)。一天后(第1天)，將細胞于10μM鹽I或0.1％DMSO存在下進行溫育。在第2、3、4和5天對細胞數計數。該實驗進行至少3次。
結果用濃度為0至50μM的鹽I處理48小時后，用細胞計數試劑盒(Wako)對細胞數進行定量。表中的數值表示5個獨立實驗的平均值。
表I在50μM鹽I的濃度下所有細胞系均死亡。然而，在低于50μM時，檢測不到(FRO)或含突變型p53(ARO)的細胞系顯示出鹽I劑量依賴方式的生長抑制，但野生型p53(KTC-1)細胞系并非如此。
為期5天的細胞生長曲線顯示與對照細胞相比，用10μM鹽I處理的FRO和ARO細胞的細胞生長時間依賴性減少。鹽I不改變KTC-1和IF3細胞的細胞生長(未給出數據)。
細胞生長測定法-實驗2使用分別檢測不到和在密碼子273中含突變型p53(Fagin等，J.Clin.Invest.1993，91179-184)的人間變性甲狀腺癌細胞系FRO和ARO。人乳頭狀癌細胞系NPA在密碼子223和226中具有p53突變(Fagin等，J.Clin.Invest.1993，91179-184)，而TPC-1和KTC-1乳頭狀甲狀腺癌細胞系的p53是野生型的(Kurebayashi等，J.Clin.Endocrinol.Metab.2000，852889-96)。用表達野生型p53的載體進行的穩(wěn)定轉染被用于由FRO細胞產生1F3細胞系(Zeki等，Int.J.Cancer，1998，75391-5)。將細胞在添加了5％FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基中、于37℃下、在含5％CO2的加濕氣氛中進行培養(yǎng)。如以前(Kawabe等，J.Clin.Endocrinol.Metab.，1989，681174-83)所述建立原代人甲狀腺細胞培養(yǎng)物并將其保持在添加了3％胎牛血清和青霉素-鏈霉素的F12營養(yǎng)物混合物和DMEM的2∶1混合物中(所有試劑均來自Invitrogen Life Technologies，Paisley，英國)。
將細胞以1×103個細胞/孔的密度接種在96孔微量滴定板中。一天后(第一天)，將細胞用1、5、10、20或50μM的用DMSO稀釋的鹽I或在100μl新鮮培養(yǎng)基中的0.1％DMSO處理(每個藥物濃度6孔)。溫育72小時后用細胞計數試劑盒(Wako)測量每孔中的細胞數。r＝0.5時用線性插值法估算IC50值，其被定義為導致細胞生長減少50％的鹽I的濃度。如下使用細胞計數器檢查細胞生長的動力學將細胞以0.5或0.1×105個細胞/孔的密度接種在12孔培養(yǎng)板中。1天后(第1天)，對它們給予含10μM鹽I或0.1％DMSO的培養(yǎng)基并在第2、3、4和5天進行計數。兩個實驗均進行至少3次。
表2鹽I對人甲狀腺癌細胞系生長的影響。鹽I對生長速度的影響的IC50。
通過標準WST-測定法測定鹽I對5種甲狀腺癌細胞系和對人甲狀腺細胞(thyrocyte)原代培養(yǎng)物的影響。如表2中所示，p53突變的細胞系FRO、ARO和NPA的IC50顯著低于野生型p53細胞系TPC-1和KTC-1以及原代甲狀腺細胞(PT)的IC50。鹽I選擇性地抑制間變性甲狀腺細胞系的生長。數據表示至少三次獨立的實驗；每個值組合了6個孔的結果。*，將對照和處理進行比較P＜0.05。
2)c-Abl、PDGF受體和c-kit的表達鹽I抑制c-Abl、PDGF受體和c-kit的酪氨酸激酶活性。由甲狀腺癌細胞系提取的總RNA的反轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)表明在FRO和ARO細胞中不表達PDGF受體和c-kit(未給出數據)，然而所有細胞系(ARO、FRO、TPC、KTC、NPA和PT)均表達c-Abl mRNA。
3)鹽I對S-G2過渡的抑制作用將分會合細胞與10μM鹽I或0.1％DMSO一起溫育48小時。為了進行流式細胞儀分析，將細胞用70％乙醇固定并用PBS洗滌。在室溫下與RNase A(0.1mg/ml)一起預溫育后，將細胞用PI(25μg/ml)染色。使用FACScan流式細胞儀(Becton Dickinson，Mountain View，CA)測量熒光。該實驗進行至少3次。
表3鹽I對甲狀腺癌細胞系中細胞周期的影響。將細胞僅用0.1％DMSO或用10μM鹽I處理48小時并通過流式細胞儀分析細胞周期的分布(結果以處于G2、S和G2-M期的細胞的百分數表示)。
細胞周期的FACS分析表明鹽I處理延長了FRO細胞的S期(43％對54％)并縮短了G2-M期(25％對15％)，但在KTC-1細胞或1F3細胞中沒有觀察到改變。該結果表明鹽I誘導FRO細胞中S-G2過渡細胞停滯。FACS細胞周期分析表明用鹽I處理使ARO細胞系中處于G2/M期的細胞比例增加了2倍以上(9.28％對3.78％)，并增加了FRO中處于S期的細胞數量(54％對43％)。在TPC-1、KTC-1和1F3細胞中沒有觀察到這些改變。在這些細胞系中，處于G1期的細胞比例有增加趨勢。然而，在用鹽I處理的培養(yǎng)物中沒有觀察到生長抑制。因此，用鹽I處理在ARO和FRO細胞中分別導致G2/M-和S-期停滯，并且這可能是這些細胞系中所觀察到的生長抑制的原因。在任何細胞系中用藥物處理48小時后凋亡分數(亞-G1)未顯著增加。此外，處理48小時后在DNA梯帶分析中未檢測到DNA斷裂(未給出數據)。
4)蛋白質印跡分析鹽I對甲狀腺癌細胞系中細胞周期調節(jié)蛋白的影響將細胞用10μM鹽I處理0、12、24、48小時，在RIPA緩沖液中制備細胞裂解物并通過SDS-PAGE(40μg蛋白/泳道)分離。將印跡轉移至硝酸纖維素膜(Pall Corporation，Ann Arbor，MI，美國)上后用適宜的抗體進行探測。用β-肌動蛋白作為加樣對照。所用的抗體是抗-p21wafl(Ab-1，Calbiochem，Darmstardt，德國)、抗-p27(F-8，Santa Cruz Biotechnology，Santa Cruz，CA，美國)、抗-細胞周期蛋白A(C88020，BD Biosciences，Boston，MA，美國)、抗-細胞周期蛋白B1(C23420，BD Biosciences)、抗-CDK1/Cdc2(C12720，BD Biosciences)、抗-細胞周期蛋白D3(C28620，BDBiosciences)、抗-磷酸基-c-ABL(Tyr245，Cell Signaling Technology，Beverly，MA，美國)、抗-c-Abl(24-11，Santa Cruz Biotechnology)、抗-c-KIT(C-14，Santa Cruz Biotechnology)、抗-PDGFRα(C-20，Santa Cruz Biotechnol-ogy)、抗-PDGFRβ(P-20，Santa Cruz Biotechnology)、抗-ERK1/2(CellSignalling Technology)、抗-p-ERK(Cell Signalling Technology)和抗-肌動蛋白(C-11，Santa Cruz Biotechnology)。用增強化學發(fā)光試劑盒(ECL，Amersham Life Sciences，Buckinghamshire，英國)進行檢測。蛋白質印跡實驗進行至少2次。
結果蛋白質印跡分析檢測到在間變性甲狀腺癌細胞系FRO和ARO中以及在p53-突變的乳頭狀癌細胞系NAP中有高水平的c-Abl蛋白(未給出數據)。在這些細胞系中沒有檢測到相應于其它鹽I敏感性酪氨酸激酶的蛋白條帶。由于p53狀態(tài)可能對c-Abl蛋白的水平具有一定影響，因此還測量了1F3細胞中c-Abl的表達水平。1F3細胞含有比FRO細胞少但比正常甲狀腺細胞多的c-Abl。細胞周期蛋白依賴性激酶(CDK)抑制劑p21cip1和p27kip1可以阻斷細胞周期中S向G2以及G1向S期過渡中的CDK活性。暴露于鹽I12小時后，FRO細胞中p21cip1的表達顯著增加，但在ARO、KTC-1和1F3細胞中不變。分別暴露24和48小時后，ARO和FRO細胞中p27kip1的表達增加。CDK的活性部分取決于細胞周期蛋白亞基的相對豐度和CDK抑制劑的存在。在細胞周期蛋白和CDK中，細胞周期蛋白A、B和CDC2與由G2向M期的發(fā)展有關。鹽I處理24小時降低了ARO和FRO細胞系中細胞周期蛋白A、B1和CDC2的水平以及ARO細胞中細胞周期蛋白D3的水平，但在KTC-1和1F3中沒有影響。在相同條件下，β-肌動蛋白的水平未受顯著影響。
5)體外激酶測定c-Abl的磷酸化和MAPK激酶活性用所述的抗體從細胞裂解物中免疫沉淀出Abl。如以前(Dorey等，Oncogene，2000，568075-84)所述進行體外激酶測定。使用磷光顯像儀(PhosphorImager，Molecular Dynamics，Inc.，Sunnyvale，CA，美國)對放射標記的GST-Crk進行定量。將細胞用各種劑量的鹽I處理12小時，用抗體對細胞提取物進行蛋白質印跡以分析磷酸化c-Abl和總c-Abl。通過用32P-ATP的體外激酶測定以GST-Crk作為底物測定c-Abl活性。對于MAPK激酶活性，將細胞在含有0.1％DMSO或10μM鹽I的無血清培養(yǎng)基中溫育2小時。用20％FCS刺激8分鐘，收集細胞裂解物并進行SDS-PAGE，用抗ERK1/2的抗體和ERK1/2的磷酸化形式進行蛋白質印跡。所有實驗均進行兩次并得到相似結果。
結果在正常條件下培養(yǎng)的ARO和FRO細胞具有高水平的c-Abl和其Try245磷酸化形式，該磷酸化形式與c-Abl激酶活性的顯著活化相關(未給出數據)。在所檢測的時間間隔中，濃度不超過50μM的鹽I不明顯影響這些細胞系中c-Abl蛋白的水平。然而，連續(xù)處理12小時確實減少c-Abl的賴氨酸磷酸化。由于用鹽I處理ARO和FRO導致的c-Abl激酶活性抑制與c-Abl磷酸化水平相關，所述的激酶活性抑制用GST-Crk融合蛋白進行測定。相反，在wt-p53細胞系(1F3和KTC-1)中，鹽I誘導c-Abl的積累，并且不降低磷酸基-c-Abl水平。鹽I處理wt-p53甲狀腺細胞系后引起c-Abl積累的機理有待進一步闡明。對胞外信號如生長因子的通常應答是促分裂原活化蛋白(MAP)激酶級聯的活化。為了確定鹽I是否抑制所研究的細胞系中表達的受體酪氨酸激酶活性，測定在對血清刺激應答中鹽I對ERK1/2磷酸化的影響。刺激增加了饑餓KTC-1細胞中p-ERK1/2的水平，但鹽I對其磷酸化沒有影響。血清刺激不顯著調節(jié)間變性甲狀腺癌細胞系ARO和FRO中ERK1/2激酶的活性，并且鹽I不影響p-ERK1/2的水平。另外，向培養(yǎng)基中添加PDGF-BB、PDGFRα和-Rβ配體不改變MAP激酶活性，并且在ARO和FRO細胞中PDGFRβ不被鹽I處理所影響(未給出數據)。這些結果表明c-Abl可能是本實驗中所用的間變性癌細胞系中有活性的唯一的鹽I靶標激酶。
6)c-Abl和p53的免疫組織學分析將存檔的固定組織切片用于免疫組織學研究得到了長崎(Nagasaki)大學醫(yī)院倫理委員會的批準。由每個個體獲得知情同意書。如以前(Hermann等，Int.J.Cancer 2001，92805-11)所述進行免疫組織化學。簡言之，將福爾馬林固定的石蠟包埋組織的4μm切片脫蠟、熱抗原解掩蔽(0.01mol/l檸檬酸鹽緩沖液，pH6.0)，并在室溫下暴露于第一抗體1小時。使用以下抗體鼠單克隆抗-p53抗體、克隆DO-7(DAKO，Copenhagen，丹麥，1∶100稀釋)和鼠單克隆抗-c-Abl抗體(24-11，Santa Cruz Biotechnology，1∶200稀釋)。結合的抗體用生物素標記的第二羊抗小鼠IgG/IgM F(ab)2抗血清和過氧化物酶標記的鏈霉抗生物素(Jackson Immuno ResearchLaboratories，West Grove，PA，美國)顯現。由兩個獨立的觀察人員檢查載玻片，該觀察人員不了解所研究病例的病理學或臨床數據。為了評價p53染色，評價4個高倍鏡視野(×400)的陽性染色腫瘤細胞百分數。如以前在Hermann等，Int.J.Cancer 2001，92805-11中所述，含＞10％染色細胞的腫瘤被確定為“強陽性”，含≤10％染色細胞的腫瘤被確定為“弱陽性”。根據以前報導的標準(Yanagawa等，Oral Oncol.2000，3689-94)，用視覺分級系統對c-Abl免疫染色進行半定量，在該視覺分級系統中染色強度被分為等級0、1+、2+或3+。為了簡化c-Abl水平與甲狀腺癌的組織學特征的相關性，將這些組進一步分為“弱陽性”(0級、1+級)和“強陽性”(2+級、3+級)組。
結果為了得到關于不同類型的人甲狀腺腫瘤中c-Abl和p53表達的更多信息，對不同類型的手術切除腫瘤中的這些蛋白進行免疫組織化學染色(未給出數據)。在5/6(83％)的間變性癌中檢測到c-Abl(綜合核和胞質免疫染色)的高表達，而在濾泡狀和乳頭狀癌中觀察到顯著更小的比例2/9(22％)和1/8(12％)，p＝0.041和p＝0.026，費歇耳恰當檢驗(表4)。在腫瘤損傷周圍的正常組織中以及在腺瘤性甲狀腺腫情況下，觀察到低水平的c-Abl表達。在所有間變性癌(6/6)中均檢測到核p53染色圖，而僅在小部分濾泡狀和乳頭狀癌中檢測到核p53染色圖分別為1/9和1/9；p＝0.0014和p＝0.005(費歇耳恰當檢驗)。所檢查的良性甲狀腺損傷(甲狀腺腫)中僅1/10(10％)顯示出弱的核p53表達。因此，免疫組織化學發(fā)現與在p53-突變的間變性甲狀腺癌細胞系中觀察到的c-Abl蛋白的過量表達一致。
表4在間變性、濾泡狀和乳頭狀癌以及腺瘤性甲狀腺腫中用免疫組織化學檢測c-Abl和p53。對于c-Abl將切片用蘇木精復染色，對于p53用甲基綠復染色。注意染色方式c-Abl核/胞質，p53核(AC中)(未給出數據)。
7)鹽I對FRO細胞的體內作用小鼠異種移植模型所有小鼠均在長崎大學(長崎，日本)動物設施中喂養(yǎng)，并且該研究中所述的所有動物實驗均按照長崎大學醫(yī)學院的《實驗動物照管和使用指南》中所規(guī)定的原則和步驟進行。將混懸在RPMI 1640中的5百萬個FRO細胞皮下注射至8周齡雌性BalB/c nu/nu小鼠(Charles-River Japan，東京，日本)的肋腹。用測徑器每隔一天測量腫瘤大小并根據以下公式計算腫瘤體積a2×b×0.4，其中a是最小直徑，b是與a垂直的直徑。腫瘤達到至少100mm3后，將小鼠隨機分為實驗組或對照組，每組5只動物。將在無菌水中的鹽I溶液以50mg/kg的日劑量每天進行腹膜內注射，注射2周。對照組小鼠接受純水注射。監(jiān)測每只動物的體重、進食行為和運動活力作為綜合健康指標。
統計分析除非特別說明，否則數據以平均值±SD給出。分別使用“學生”t-檢驗和Mann Whitney U檢驗比較兩組間參數和非參數數據。認為p值＜0.05是統計學顯著的。
結果為了檢測鹽I對甲狀腺間變性癌的可能體內抗腫瘤作用，將FRO細胞植入無胸腺小鼠，并腹膜內注射鹽I或賦形劑(H2O)。如表5中所示，在連續(xù)14天中每天一次施用50mg/kg鹽I產生強的抗腫瘤效果。暴露于鹽I的小鼠的體重和生理活動未受顯著影響。
表5在植入無胸腺小鼠的FRO細胞中鹽I的抗腫瘤效果。將每組動物(n＝5)用腹膜內注射鹽I或安慰劑(H2O)進行處理。該表顯示了實驗組和對照組中以mm3表示的腫瘤生長動力學。*，將對照組和實驗組進行比較P＜0.05。
本發(fā)明中表明特異酪氨酸激酶抑制劑、即鹽I是抗含有突變p53的未分化甲狀腺癌的潛在抗癌藥。用鹽I處理在p53缺失的FRO、ARO和NPA細胞系中誘導顯著的生長抑制，但在含野生型p53的KTC-1和TPC-1中不誘導顯著的生長抑制。類似地，鹽I對用野生型p53穩(wěn)定轉染的FRO細胞沒有作用，因此證明鹽I的效果依賴于p53狀態(tài)。在p53-突變的間變性癌細胞系ARO和FRO中，在臨床可達到的濃度下觀察到細胞抑制作用(IC50分別為5.9和7.8μM)。這些IC50值低于NPA細胞(IC5016μM)和其它乳頭狀瘤細胞系中的IC50值。本研究集中于間變性癌細胞。流式細胞術顯示鹽I的生長抑制作用是由于使這些細胞系中的G2/M期或S晚期停滯。
鹽I的細胞抑制作用已經不僅在CML中、而且在以PDGFR活性增加為特征的小細胞肺癌中以及在顯示出強c-KIT酪氨酸激酶活化的胃腸基質瘤中被證明。
PT-PCR分析顯示在所有細胞系中均存在c-Abl mRNA。PDGFRα、PDGFRβ和c-KIT的表達在間質性細胞系中檢測不到或非常低，并且在其它細胞系中顯示出各種模式。用蛋白質印跡發(fā)現在間質性甲狀腺癌細胞系ARO和FRO中c-Abl的水平與原代甲狀腺細胞和乳頭狀癌細胞系相比顯著更高。在p53-突變的乳頭狀癌細胞系NPA中，c-Abl水平也高于wt-p53乳頭狀癌細胞系TPC-1和KTC-1中的水平。此外，wt-p53穩(wěn)定轉染至間變性甲狀腺癌細胞系FRO中減少了c-Abl蛋白的表達。與這些體外數據一致的是，免疫組織化學研究顯示在大部分p53強陽性的間變性癌病例中觀察到高水平的c-Abl陽性免疫染色。這些數據表明p53狀態(tài)可影響甲狀腺癌細胞中c-Alb蛋白的水平。
為了闡明鹽I抑制細胞生長的機理，觀察了其對c-Abl和ERK1/2、MAP激酶的磷酸化狀態(tài)的影響。鹽I以劑量依賴和時間依賴方式抑制ARO和FRO中的c-Abl激酶活性，但不能降低wt-p53細胞系中磷酸基-c-Abl水平。在所試驗的任何一種細胞系中MAP激酶活性均不被鹽I所抑制。因此，間變性癌細胞中藥物誘導的生長抑制不由“受體型酪氨酸激酶-ras-MAPK”途徑介導，而是與c-Abl激酶的抑制相關。
在鹽I處理的FRO細胞中細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑p21cip1和p27kip1的表達增加并且細胞周期蛋白A和B1的表達減少。在另一種間變性癌細胞系ARO中觀察到p27kip1、細胞周期蛋白A和B1的類似變化以及細胞周期蛋白D3的表達減少，但在KTC-1和1F3 wt-p53細胞中未觀察到。因此，用鹽I處理誘導p53-缺失的甲狀腺細胞系中S晚期或G2/M期過渡的停滯。值得注意的是p21cip1過量表達與包括p53缺失/突變的T98G細胞在內的一些其它模型系統中的S-期停滯相關(Potapova等，J.Biol.Chem.2000，27524767-75)。與我們的發(fā)現一致的是，暴露于鹽I增加過量表達BCR/ABL的喪失IL-3的祖-B(pro-B)細胞系BaF3-p210中p27kip1的mRNA和蛋白質水平(Parada等，J.Biol.Chem.2001，27623572-80)。因此，似乎表明鹽I對c-ABL激酶活性的抑制可通過改變細胞周期調節(jié)劑的表達/活性而導致細胞生長抑制。鹽I如何上調p21cip1和p27kip1的一個可能解釋如下c-ABL激酶可以磷酸化PKC-δ，導致c-Jun NH2末端激酶(JNK)活性增加(Sun等，J.Biol.Chem.2000，2757470-3)。我們最近的工作還表明在ARO細胞中，胞內信號轉導級聯PKC-δ-MKK7-JNK被活化(Mitsutake等，Oncogene，2001，20989-96)，并且JNK特異性反義寡核苷酸已經顯示出與p21cip1誘導一起誘導S-期停滯。因此，鹽I對c-ABL-PKC-δ-MKK7-JNK級聯的抑制可能是造成p53-突變的甲狀腺癌細胞系生長抑制的原因?？傊?，我們的結果證明c-Abl在p53突變/缺失的間變性甲狀腺癌細胞系中被過量表達，并且鹽I對c-Abl活性的選擇性抑制在這些細胞中具有明顯的細胞抑制作用。另外，鹽I有效地抑制植入免疫受損小鼠中的FRO細胞的體內生長而無明顯副作用。因此，鹽I的用途是人間變性甲狀腺癌的潛在抗癌治療方法。
實施例2含4-(4-甲基-1-哌嗪-1-基甲基)-N-[4-甲基-3-[[4-(3-吡啶基)-2-嘧啶基]氨基]苯基]-苯甲酰胺甲磺酸鹽，β-晶形的膠囊劑用以下組合物制備含有相當于100mg化合物I(游離堿)的119.5mg鹽I作為活性物質的膠囊劑組合物鹽I 119.5mg纖維素MK GR 92mg交聯聚維酮XL 15mgAerosil 200 2mg硬脂酸鎂1.5mg230mg通過混合各組分并將混合物填充入1號硬明膠膠囊中制備該膠囊劑。
實施例3含4-(4-甲基-1-哌嗪-1-基甲基)-N-[4-甲基-3-[[4-(3-吡啶基)-2-嘧啶基]氨基]苯基]-苯甲酰胺甲磺酸鹽，β-晶形的膠囊劑用以下組合物制備含有相當于100mg化合物I(游離堿)的119.5mg鹽I作為活性物質的膠囊劑組合物活性物質 119.5mg微晶纖維素 200mgPVPPXL 15mgAerosil 2mg硬脂酸鎂1.5mg338.0mg
通過混合各組分并將混合物填充入1號硬明膠膠囊中制備該膠囊劑。
實施例4鹽I用于治療難治的進行性甲狀腺癌的臨床研究方案A-研究對象-入組標準1)患有有轉移性損傷的甲狀腺癌且體能狀況為0至2(見下表)；并且原則上，具有暗示為自乳頭狀或濾泡狀癌向未分化癌轉化的疾病臨床惡化，該惡化對其它治療不應答或不可能應答。
2)年齡20至80歲。
3)開始治療前具有可通過CT/MRI成象和腫瘤標志物(甲狀腺球蛋白)評價的損傷。
4)具有一定程度的心臟、肺和腎功能，并且無嚴重出血傾向；即原則上滿足以下標準a)超聲心動描記術顯示射血分數＞50％，進入研究前一年內無缺血性心臟病史。
b)無論是否存在肺轉移，血氣分析中pO2＞60mmHg。
c)無論是否存在肝轉移，血清膽紅素＜2mg/dL。
d)血清肌酸酐＜2mg/dL。
e)白細胞≥2000/mm3，且血小板≥50000/mm3。
f)PT＞50％，APTT＜50秒，Fbg＞100mg/dL，且FDP＜20μg/mL。
5)無難以控制的活動性感染。
6)同意參加該研究并遞交填寫好的知情同意書。
體能狀況(PS)(由SWOG制定)
這些標準是體能狀況的指標。當局部活動受限時，進行臨床評價。
B-研究方法該臨床研究是I/II期臨床研究的一部分，其性質是探索性的。
1.治療方案鹽I以相當于400mg化合物I的劑量每天飯后施用一次。如果有效并且不產生副作用或僅有輕微的可接受的副作用，則繼續(xù)鹽I治療達最長6個月。當發(fā)生任何輕微副作用時，根據副作用的程度將劑量減少至200mg，每天一次。治療2個月時，評價鹽I的有效性并作出之后的治療決定(繼續(xù)治療、劑量增加、中斷治療等)。原則上，當腫瘤大小減半時，劑量增加至高達800mg/天并繼續(xù)治療達最長6個月。如果治療2個月時腫瘤大小更大，或如果腫瘤大小保持不變但優(yōu)選與腫瘤相關的癥狀的任何進一步改善，可能時考慮進行放射治療和鹽I治療的組合治療。原則上不允許伴隨使用抗癌藥?？梢园殡S使用減輕其它病癥或癥狀的藥物并小心它們的副作用。
2.有效性評價在治療1、2、3、4、5和6個月時基于(1)通過生理學發(fā)現和腫瘤一致性變化確定的病癥的改善；(2)通過成象確定的腫瘤大??；和(3)腫瘤標志物的變化來評價鹽I的有效性。
評價項目(1)對象的背景要素醫(yī)療記錄號、身份證號、姓和名的首字母、性別、出生日期、身高、體重；并發(fā)癥、既往疾病、目前疾病、既往治療、家族史；(2)化合物I的劑量；(3)依從性和伴隨用藥記錄；(4)主觀癥狀和客觀發(fā)現；(5)血壓和脈搏率；(6)血液學(紅細胞、白細胞、血小板、分類WBC)每月兩次；(7)生物化學(肝功能、腎功能、血糖、LDH、CPK)每月兩次；(8)腫瘤標志物(甲狀腺球蛋白)每月一次；(9)腫瘤所在部位、腫瘤大小和CT或MRI成象顯示的浸潤程度每兩月一次；(10)X線胸透(正面)每兩月一次；(11)與腫瘤相關的癥狀檢查；(12)尿分析。
C-初步結果第一個患者在2002年12月進入臨床研究。開始鹽I治療而無任何其它治療。與前一年中腫瘤的快速生長和侵害相比，腫瘤已停止生長3個月。
權利要求
1.式I的4-(4-甲基哌嗪-1-基甲基)-N-[4-甲基-3-(4-(吡啶-3-基)嘧啶-2-基氨基)苯基]-苯甲酰胺或其可藥用鹽在制備治療間變性甲狀腺癌的藥物中的用途
2.式I的4-(4-甲基哌嗪-1-基甲基)-N-[4-甲基-3-(4-(吡啶-3-基)嘧啶-2-基氨基)苯基]-苯甲酰胺或其可藥用鹽在治療間變性甲狀腺癌中的用途。
3.治療患有間變性甲狀腺癌的人的方法，該方法包括向需要這種治療的所述的人施用抗所述疾病有效劑量的4-(4-甲基哌嗪-1-基甲基)-N-[4-甲基-3-(4-(吡啶-3-基)嘧啶-2-基氨基)苯基]-苯甲酰胺或其可藥用鹽。
4.權利要求3的方法，其中向成年人施用日劑量為50至600mg的4-(4-甲基哌嗪-1-基甲基)-N-[4-甲基-3-(4-(吡啶-3-基)嘧啶-2-基氨基)苯基]-苯甲酰胺。
5.權利要求3的方法，其中施用式I的4-(4-甲基哌嗪-1-基甲基)-N-[4-甲基-3-(4-(吡啶-3-基)嘧啶-2-基氨基)苯基]-苯甲酰胺的單甲磺酸鹽。
6.權利要求3的方法，其包括向人類對象施用藥學有效量的式I的4-(4-甲基哌嗪-1-基甲基)-N-[4-甲基-3-(4-(吡啶-3-基)嘧啶-2-基氨基)苯基]-苯甲酰胺或其可藥用鹽，每天施用一次，施用時間超過3個月。
7.權利要求1至6中任一項的用途或方法，其中式I的4-(4-甲基哌嗪-1-基甲基)-N-[4-甲基-3-(4-(吡啶-3-基)嘧啶-2-基氨基)苯基]-苯甲酰胺是其甲磺酸鹽形式且是β晶形。
8.權利要求1至7中任一項的用途或方法，其中間變性甲狀腺癌含有突變的p53。
全文摘要
本發(fā)明涉及式(I)的4－(4－甲基哌嗪－1－基甲基)－N－[4－甲基－3－(4－(吡啶－3－基)嘧啶－2－基氨基)苯基]－苯甲酰胺或其可藥用鹽在制備治療間變性甲狀腺癌的藥物中的用途。
文檔編號C07D401/04GK1671389SQ03817375
公開日2005年9月21日 申請日期2003年5月23日 優(yōu)先權日2002年7月24日
發(fā)明者大津留晶, 阿列克謝·波德柴克, 津田哲, 山下俊一 申請人:諾瓦提斯公司, 大津留晶, 阿列克謝·波德柴克, 津田哲, 山下俊一