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一種膀胱癌相關蛋白及其檢測方法

文檔序號:3552737閱讀:426來源:國知局
專利名稱:一種膀胱癌相關蛋白及其檢測方法
技術領域
本發(fā)明屬生物學和醫(yī)學檢驗領域,涉及一種腫瘤生物標志物及其檢測方法,具體涉及一種膀胱癌相關蛋白及其檢測方法。
背景技術
近年來,隨著基因組學研究和蛋白組學的快速發(fā)展,科學家認識到基因組學的研究需要通過蛋白質水平的研究資料進行補充。有報道,一種研究蛋白質方法(蛋白組模式診斷),采用表面增強激光解析電離飛行時間質譜技術(SELDI-TOF-MS)的蛋白質芯片系統(tǒng)分析蛋白質,該方法克服了傳統(tǒng)蛋白分析的局限性,使之能夠在小量粗提樣品中,對血液尿液等各種體液,細胞或組織的所有蛋白質的質量和功能特性進行快速分析。SELDI是一種基于親和技術的質譜技術,蛋白質與表面被化學修飾過的蛋白芯片選擇性的結合(Ciphergen ProteinChip@Array),而未結合的蛋白質則被緩沖液所沖洗掉,再通過加入能量吸收分子(Energy Absorbing Molecules,EAM)后,送入閱讀機,蛋白質在激光作用下解吸咐和離子化,通過真空飛行管到達檢測器而被檢測到,從而得到蛋白質圖譜。該系統(tǒng)可以檢測到結合在芯片上的所有蛋白質,系統(tǒng)通過測定被分析物分子的“飛行時間”,計算出化合物的質荷比,再通過群體分析找到在兩種條件下的差異蛋白質群。
表面加強激光解吸電離飛行時間質譜技術(SELDI-TOF-MS)的基本組成包括下述四部分(一)SELDI,也是蛋白質芯片(ProteinChip Arrays)的核心技術;(二)飛行時間質譜儀(TOF-MS),也稱為芯片閱讀儀(ProteinChip Reader);(三)蛋白質芯片系統(tǒng)專用軟件(Ciphergen Proteinchip Software);(四)高級樹狀模型分析軟件(Biomarker Patterns Software,),可以根據(jù)研究者的需要選擇不同的參數(shù)配置,處理已經得到的數(shù)以百計的蛋白質的峰形圖譜,尋找出最佳的分析模式。
現(xiàn)今社會腫瘤是人類最大的殺手之一,但人們在面對腫瘤時常常無法做到早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷和早期治療,往往會延誤治療的最佳時機。膀胱癌是常見的惡性腫瘤之一,占全身惡性腫瘤的3%,發(fā)病年齡以50-70歲最為多見,男女之比約為4∶1,居男性泌尿生殖系統(tǒng)腫瘤首位,且極易復發(fā)。在膀胱腫瘤中膀胱癌占極大多數(shù),其中86%以上來源于移行上皮細胞,而未分化癌、鱗癌及腺癌等則少見。長期以來,膀胱癌的診斷缺乏行之有效的方法。尿脫落細胞學和膀胱鏡檢查一直作為泌尿系統(tǒng)疾病,特別是膀胱癌診斷和檢測復發(fā)的金標準。但是尿液脫落細胞學敏感度低,大約只有60%左右,尤其是低級別的腫瘤敏感度則更低,并具有主觀性的干擾,因此,其臨床價值受限。而膀胱鏡檢查具有創(chuàng)傷性,會給病人帶來極大的痛苦。所以尋找早期診斷膀胱癌的無創(chuàng)性、且簡便而有高敏感度、高特異性的新的腫瘤標志物具有重大的臨床意義。

發(fā)明內容
本發(fā)明目的是提供一種高敏感度、高特異性的新的膀胱腫瘤生物標志物及其檢測方法,具體涉及一種膀胱癌相關蛋白及其檢測方法,為膀胱癌的早期診斷提供依據(jù)。
本發(fā)明采用表面加強激光解吸電離飛行時間質譜技術(SELDI-TOF-MS),聯(lián)合應用蛋白質芯片技術和Biomarker Patterns Software軟件建立樹狀分析模式,檢測分析尿液標本中具有差異表達的膀胱癌相關的特異蛋白。
本發(fā)明所述的具有差異表達的膀胱癌相關的特異蛋白,包括下述的一組5種蛋白質,其分子量分別為3891-3901 Da,4972-4982 Da,9633-9643 Da,15098-15108 Da和15504-15514 Da,分別命名為蛋白質HS-BL-1、HS-BL-2、HS-BL-3、HS-BL-4和HS-BL-5。
本發(fā)明方法檢測尿液標本取材方便、無創(chuàng)傷性,所測膀胱癌相關的生物標志物即膀胱癌相關蛋白,敏感度、特異性高,并且可以長期追蹤。
本發(fā)明的技術方案通過下述步驟實現(xiàn)1.標本準備新鮮的尿液標本離心后分裝-80℃保存,備用。
2.相關蛋白質圖譜分析采用美國賽弗吉公司(Ciphergen Biosystems,Inc.)的金屬親和吸附芯片(Immobilized Metal Affinity Capture,IMAC類)。將標本置入美國賽弗吉公司(Ciphergen Biosystems,Inc.)蛋白質生物系統(tǒng)PBS II,用特定參數(shù)組合分析樣品尿液蛋白質組圖譜。
對比分析膀胱癌患者和對照組尿液標本的蛋白質圖譜,結合使用分析軟件Ciphergen ProteinChip Software(Ciphergen Biosystems,Inc.)和樹狀模式分析軟件Biomarker Patterns Software(Ciphergen Biosystems,Inc.)獲得膀胱癌患者與對照組有差異的蛋白質峰。
3.聯(lián)合應用樹狀分析模式作出判斷依據(jù)。
上述方法采用盲法進行篩選試驗,確定判斷標準的靈敏度、特異度指標。
本發(fā)明為一種靈敏度高、特異性強、快速、小樣本高通量的檢測方法,為膀胱癌的早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷和早期治療提供了依據(jù)。本發(fā)明具有較大的實際臨床價值,能有效的對膀胱癌作出早期判斷,可用于臨床檢測或對高危人群的監(jiān)測。本發(fā)明方法經濟合理,每檢測一人標本成本為90元人民幣,明顯降低患者醫(yī)療開支,有利于促進醫(yī)療保險制度的改革。
具體實施例方式
實施例11)制備尿液取3組新鮮尿液標本,分別為臨床病理確診為膀胱癌的患者尿液標本組(46例),泌尿系統(tǒng)其他良性疾病(如前列腺增生、泌尿系統(tǒng)的炎癥、輸尿管結石等疾病)的患者尿液標本組(32例)以及健康志愿者的尿液標本組(40例),后兩組為對照組(共72例),標本離心后分裝-80℃,備用。
2)制備芯片(1)芯片前處理每個加樣點加CuSO4 100Mm(Sigma公司)溶液10μl,放入濕盒10分鐘后,取出甩干。重復操作一次。將芯片放入去離子水試管,振蕩,取出甩干。每個加樣點加10μl的醋酸鈉50mM pH4(Sigma公司)溶液10ml,放入濕盒5分鐘后,取出甩干,放入去離子水試管,振蕩,取出甩干。裝入加樣器,備用。
(2)芯片預平衡每孔加緩沖液PBS含250Mm NaCl(Sigma公司)100μl。放搖床5分鐘后,棄去孔中液,重復操作一次。
(3)加樣采用BCA-100蛋白質定量測定試劑盒檢測尿樣蛋白濃度(上海博彩生物科技有限公司),根據(jù)濃度的不同用加樣緩沖液稀釋尿液樣本,調整至2mg/ml,取稀釋后的尿液100μl上樣,放入4℃搖床,1小時。
(4)洗脫棄去尿液樣品后,每孔加緩沖液(PBS含250Mm NaCl)100μl。放搖床2分鐘后棄孔中液體,重復操作一次。加入去離子水100μl,甩干。
(5)加能量吸收分子(Energy Absorbing Molecules,EAM)取出芯片后,微干,每孔加SPA(Sinapinic acid,Ciphergen公司)0.5μl,所述SPA溶于500ml/L乙晴(Sigma公司)和5ml/L三氟乙酸(Sigma公司),干后重復一次。
3.獲得尿液蛋白質組圖譜將上述芯片放入閱讀機,檢測結合到芯片上的所有蛋白質,得每個加樣點的所有蛋白質圖譜。
調節(jié)設立主要參數(shù)檢測分子量范圍0-50,000道爾頓,激光強度200,檢測敏感度9,檢測點20-80。
4.尿液蛋白質組圖譜分析采用蛋白質芯片系統(tǒng)專用軟件Ciphergen Proteinchip Software(Ciphergen公司)處理已整合的數(shù)據(jù),選擇參數(shù),如調整基線為4(fitting width4),將所有的蛋白質圖譜標準化到相同的總的離子流(total in current),用Biomarker Wizard(Ciphergen Proteinchip Software功能)功能對上述蛋白質圖譜進行檢測,選擇S/N參數(shù)為5;最小峰參數(shù)為5%。結果顯示,經上述蛋白質芯片系統(tǒng)檢測到P<0.05?的蛋白質一百余例。
5.獲得膀胱癌患者尿液差異表達蛋白質峰采用Biomarker Patterns Software樹狀模型分析軟件處理上述蛋白質數(shù)據(jù),選擇特定的參數(shù)配置,建立樹狀分析模式,命名為HS-BL-329。所述參數(shù)設置為母節(jié)點包括至少2例(parent nodes must have at least 2 cases);矢量倍數(shù)交叉驗證12(V-Fold cross-validation 12);方法選擇Gini 1.0(Method Gini 1.0)。
所述樹狀分析模式是根據(jù)蛋白質的存在或缺失或在圖譜上表達量的差異劃分標本組。
通過上述樹狀分析模式分析,得到一組具有差異表達的蛋白質峰,其中包括5個在膀胱癌組和對照組中具有差異表達的蛋白質,聯(lián)合應用其間差異可將膀胱癌組和對照組有效區(qū)分,檢測的靈敏度為84%,特異性為91%。
上述一組5種蛋白質的分子量范圍分別為3891-3901 Da,4972-4982 Da,9633-9643 Da,15098-15108 Da和15504-15514 Da,在樹狀分析模式中分別取平均數(shù)3896 Da,4977 Da,9638 Da,15103 Da和15507 Da來表示,分別命名為蛋白質HS-BL-1、HS-BL-2、HS-BL-3、HS-BL-4和HS-BL-5。
實施例2樹狀分析模式HS-BL-329的盲篩應用采用3組155例尿液標本,其中包括建立Pattern的118例標本以及另外的37例尿液標本。其中膀胱癌患者組61例,其他泌尿系統(tǒng)良性疾病患者組42例,健康志愿者組共53例。所述37例尿液標本中,膀胱癌患者組共14例,其他泌尿系統(tǒng)良性疾病的患者組共10例,健康志愿者組共13例。采用實施例1相同的實驗條件,相同的軟件處理參數(shù),得到的蛋白質圖譜應用HS-BL-329樹狀模型分析軟件進行篩選,結果表明,上述樹狀分析模式檢測155例標本的靈敏度為80.3%,特異性可達到86.3%。并可將所述第2組泌尿系統(tǒng)的其他良性疾病與膀胱癌進行區(qū)分。
上述樹狀分析模式根據(jù)蛋白質的存在或缺失或在圖譜上表達量的差異劃分標本組。附圖6顯示,根據(jù)一個標本蛋白質3896在圖譜上的表達的強度是否≤0.488,將1組標本劃分為2組標本,小于等于強度0.488的標本劃分為左下一組,大于強度0.488的標本劃分為右下一組。上述劃分一直進行下去,直到最終的分組產生。圖中“3896≤0.488”,表示分子量為3896Da的蛋白質在圖譜質的強度是小于等于0.488,回答“是”則繼續(xù)進入分子量為9638Da的蛋白質的比較,回答“否”則繼續(xù)進入分子量為4977Da的蛋白質的比較,以此類推,直至進行到最后的分組。本實施例最終分組6組,其中第1組標本13個,其中腫瘤1個和對照12個,第2組標本19個,其中腫瘤14個和對照5個,第3組標本20個,其中腫瘤19個和對照1個,第4組標本28個,其中腫瘤6個和對照22個,第5組標本6個,其中腫瘤6個和對照0個,第6組標本32個,其中腫瘤0個和對照32個。


圖1是蛋白質HS-BL-1峰形圖其中標記的為該蛋白質的分子量,對照中的表達高于腫瘤的表達。
圖2是蛋白質HS-BL-2峰形圖其中標記的為該蛋白質的分子量,對照中的表達高于腫瘤的表達。
圖3是蛋白質HS-BL-3峰形圖其中標記的為該蛋白質的分子量,腫瘤中的表達高于對照的表達。
圖4是蛋白質HS-BL-4峰形圖其中標記的為該蛋白質的分子量,腫瘤中的表達高于對照的表達。
圖5是蛋白質HS-BL-5峰形圖其中標記的為該蛋白質的分子量,腫瘤中的表達高于對照的表達。
圖6是樹狀分析模式HS-BL-329示意圖其中“3896≤0.488”,表示分子量為3896Da的蛋白質在圖譜質的強度是否小于等于0.488,回答“是”則繼續(xù)進入分子量為9638Da的蛋白質的比較,回答“否”則繼續(xù)進入分子量為4977Da的蛋白質的比較,以此類推,至最后的分組。
N表示每一組中標本的具體的個數(shù)。
N1最終分組第1組,N2最終分組第2組,N3最終分組第3組,N4最終分組第4組,N5最終分組第5組,N6最終分組第6組。
權利要求
1.一種膀胱癌相關蛋白,其特征是所述相關蛋白包括下述的一組5種蛋白質,其分子量分別為3891-3901 Da,4972-4982 Da,9633-9643 Da,15098-15108 Da和15504-15514 Da。
2.按權利要求1所述的膀胱癌相關蛋白,其特征在于所述的一組5種蛋白質分別命名為蛋白質HS-BL-1、HS-BL-2、HS-BL-3、HS-BL-4和HS-BL-5。
3.按權利要求1所述的膀胱癌相關蛋白的檢測方法,其特征在于采用表面加強激光解吸電離飛行時間質譜技術,聯(lián)合應用蛋白質芯片技術和Biomarker PatternsSoftware軟件建立樹狀分析模式,檢測分析尿液標本中具有差異表達的膀胱癌相關的特異蛋白。
4.按權利要求3所述的膀胱癌相關蛋白的檢測方法,其特征在于包括下述步驟,1)標本準備新鮮的尿液標本離心后分裝-80℃保存,備用。2)相關蛋白質圖譜分析蛋白質芯片系統(tǒng)中選擇特定參數(shù)組合獲得尿液標本蛋白質組圖譜。3)聯(lián)合應用樹狀分析模式獲得有差異的蛋白質峰。
5.按權利要求4所述的膀胱癌相關蛋白的檢測方法,其特征在于所述特定參數(shù)組合包括蛋白質圖譜的獲得參數(shù),P<0.05蛋白質圖譜的獲得參數(shù)和膀胱癌相關蛋白質圖譜的獲得參數(shù)。
6.按權利要求5所述的膀胱癌相關蛋白的檢測方法,其特征在于所述特定參數(shù)組合的蛋白質圖譜的獲得參數(shù)是檢測分子量范圍為0-50000道爾頓激光強度為200檢測敏感度為9檢測點為20-80
7.按權利要求5所述的膀胱癌相關蛋白的檢測方法,其特征在于所述特定參數(shù)組合P<0.05蛋白質圖譜的獲得參數(shù)是基線為4蛋白質圖譜標準化相同總離子流S/N為5最小峰為5%
8.按權利要求5所述的膀胱癌相關蛋白的檢測方法,其特征在于所述特定參組合其中膀胱癌相關蛋白質圖譜的獲得參數(shù)為母節(jié)點至少2例,矢量倍數(shù)交叉驗證12,方法選擇Gini 1.0。
9.按權利要求4所述的膀胱癌相關蛋白的檢測方法,其特征在于所述樹狀分析模式是根據(jù)蛋白質的存在或缺失或在圖譜上表達量的差異劃分標本組,命名為HS-BL-329。
10.按權利要求4所述的膀胱癌相關蛋白的檢測方法,其特征在于所述樹狀分析模式分別取所述一組5種蛋白質分子量的平均數(shù)3896 Da,4977 Da,9638 Da,15103Da和15507 Da。
全文摘要
本發(fā)明屬生物學和醫(yī)學檢驗領域,具體涉及一種膀胱癌相關蛋白及其檢測方法。本發(fā)明采用表面加強激光解吸電離飛行時間質譜技術,聯(lián)合應用蛋白質芯片技術和Biomarker Patterns Software軟件建立樹狀分析模式,檢測分析尿液標本中具有差異表達的膀胱癌相關的特異蛋白。本發(fā)明方法檢測尿液標本取材方便、無創(chuàng)傷性,所測膀胱癌相關蛋白靈敏度達84%,特異性達91%,并且可以長期追蹤,用于臨床檢測或對高危人群的監(jiān)測,為膀胱癌的早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷和早期治療提供了依據(jù)。
文檔編號C07K14/435GK1483742SQ0314205
公開日2004年3月24日 申請日期2003年8月4日 優(yōu)先權日2003年8月4日
發(fā)明者呂元, 關明, 劉維薇, 張萬忠, 吳忠, 張元芳, 呂 元 申請人:復旦大學附屬華山醫(yī)院
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