專利名稱：Flt4(VEGFR-3)作為靶用于腫瘤成像和抗腫瘤治療的制作方法
本申請是一份繼續(xù)申請，它要求申請日為1998年10月9日的美國專利申請系列號09/169,079；現(xiàn)在是美國專利號6,107,046的申請日為1997年7月28日的美國專利申請系列號08/901,710；現(xiàn)在是美國專利號5,776,755的申請日為1994年11月14日的美國專利申請系列號08/340,011；現(xiàn)在放棄的申請日為1994年6月9日的美國專利申請系列號08/257,754的優(yōu)先權(quán)；后兩份申請又是現(xiàn)在放棄的申請日為1992年10月9日的美國專利申請系列號07/959,951的部分繼續(xù)申請。本文引用所有這些申請以其整體作為參考。
本發(fā)明的領(lǐng)域本發(fā)明一般涉及受體基因，特別是受體酪氨酸激酶的基因，其插入重組DNA載體，和在宿主微生物菌株和宿主真核細(xì)胞中生產(chǎn)所得蛋白質(zhì)。更具體的說，本發(fā)明涉及Flt4，一種受體酪氨酸激酶；涉及編碼Flt4的核苷酸序列；涉及編碼Flt4的DNAs及其基因產(chǎn)物的生產(chǎn)方法；涉及特異性地識別(雜交)編碼該受體的核酸的核酸探針；涉及特異性地識別該受體的抗體；和涉及使用該探針和抗體及其它Flt4結(jié)合化合物的方法，例如，用于鑒定動(dòng)物和人體組織中的淋巴管和毛細(xì)血管后微靜脈(HEV)，和增進(jìn)或防止表達(dá)Flt4的細(xì)胞在病理學(xué)條件下的生長。
背景負(fù)責(zé)分化細(xì)胞和組織的發(fā)育，維持和修復(fù)的細(xì)胞行為大部分受到通過生長因子和相似配體及其受體傳導(dǎo)的細(xì)胞間信號調(diào)節(jié)。受體位于效應(yīng)細(xì)胞的細(xì)胞表面且它們結(jié)合被認(rèn)為是生長因子以及其它激素樣配體的肽或者多肽。該相互作用的結(jié)果是在效應(yīng)細(xì)胞中的迅速生物化學(xué)變化，以及細(xì)胞基因表達(dá)的迅速和長期再調(diào)整。與各種細(xì)胞表面相聯(lián)的一些受體可結(jié)合特定生長因子。
酪氨酸磷酸化是跨質(zhì)膜信號傳導(dǎo)的一種關(guān)鍵方式。一些酪氨酸激酶基因編碼諸如表皮生長因子(EGF)，胰島素，胰島素樣生長因子-I(IGF-I)，血小板衍生生長因子(PDGF-A和-B)和成纖維細(xì)胞生長因子(FGFs)的多肽生長因子和激素的跨膜受體[Heldin等，Cell Regulation，1555-566(1990)；Ullrich等，Cell，61243-54(1990)]。一些造血生長因子的受體是酪氨酸激酶；它們包括c-fms，即集落刺激因子1受體[Sherr等，Cell，41665-676(1985)]和c-kit，即前造血生長因子受體[Huang等，Cell，63225-33(1990)]。
這些受體的區(qū)別在于其特異性和親和力。一般來說，受體酪氨酸激酶是糖蛋白，它由能夠結(jié)合特定生長因子的胞外域，通常是該蛋白質(zhì)的α-螺旋部分的跨膜結(jié)構(gòu)域，近膜結(jié)構(gòu)域(在此該受體可受到例如，蛋白質(zhì)磷酸化的調(diào)節(jié))，酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域(它是該受體的酶組件)，和在許多受體中與酪氨酸激酶底物的識別和結(jié)合相關(guān)的羧基末端尾組成。
在一些受體酪氨酸激酶中，可選擇的剪接加工和可選擇的多聚腺苷化能夠從相同基因產(chǎn)生一些不同的多肽。它們可以含有或者不含上面列舉的各種結(jié)構(gòu)域。因此，一些胞外域可作為細(xì)胞分泌的分離蛋白被表達(dá)且該受體的一些形式可缺少酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域且僅含有通過跨膜結(jié)構(gòu)域插入質(zhì)膜的胞外域加上一個(gè)短羧基末端尾。
血管系統(tǒng)的生理學(xué)，胚胎血管發(fā)生和血管生成，血液凝固，傷口愈合和再生，以及一些疾病都與血管內(nèi)層的血管內(nèi)皮相關(guān)。血管樹的形成通過血管生成發(fā)生，且根據(jù)一些理論，淋巴系統(tǒng)的形成在動(dòng)脈和靜脈形成后短期內(nèi)通過從靜脈萌發(fā)開始。參見Sabin，F(xiàn).R.，Am.J.Anat.，943(1909)；和van derPutte，S.C.J，Adv.Anat.Embryol.Cell Biol.，513(1975)。
胎兒階段后，除了與新脈管形成相關(guān)的血管生成期間外，內(nèi)皮細(xì)胞增殖非常緩慢。生長因子刺激的血管生成通過特異性內(nèi)皮細(xì)胞表面受體酪氨酸激酶發(fā)揮其效力。
在受體酪氨酸激酶的配體中，血小板衍生生長因子(PDGF)已經(jīng)表明在雞尿囊絨膜中具有血管生成性，盡管較弱。轉(zhuǎn)化生長因子α(TGFα)是由一些腫瘤細(xì)胞類型和由巨噬細(xì)胞分泌的一種血管生成因子。肝細(xì)胞生長因子(HGF)，即c-met原癌基因編碼的受體的配體，也具有較強(qiáng)的血管生成性，在培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞中誘導(dǎo)與TGFα相似的反應(yīng)。
證據(jù)表明存在主要負(fù)責(zé)刺激內(nèi)皮細(xì)胞生長，分化，以及某些分化功能的內(nèi)皮細(xì)胞特異性生長因子和受體。研究最廣泛的生長因子是血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)，即PDGF家族的一個(gè)成員。血管內(nèi)皮生長因子是二硫鍵連接的23kDa亞基的二聚體糖蛋白，由于其對內(nèi)皮細(xì)胞的促有絲分裂活性及其誘導(dǎo)血管通透性的能力而被發(fā)現(xiàn)(因此其替代名稱是血管通透性因子)。VEGF的其它報(bào)導(dǎo)的效力包括轉(zhuǎn)移細(xì)胞內(nèi)Ca2+，誘導(dǎo)纖溶酶原激活物和纖溶酶原激活物抑制劑-1的合成，刺激內(nèi)皮細(xì)胞中的己糖運(yùn)輸，和促進(jìn)單核細(xì)胞的體外遷移。由不同mRNA剪接變異體編碼的4種VEGF同種型表現(xiàn)出同樣能夠刺激內(nèi)皮細(xì)胞的有絲分裂。VEGF的121和165氨基酸同種型以可溶性形式分泌，而189和206氨基酸殘基的同種型保持與細(xì)胞表面相聯(lián)且具有較強(qiáng)的肝素親和力。對于有關(guān)胎盤生長因子的可溶性非肝素結(jié)合形式和肝素結(jié)合形式也已有描述(PlGF；分別是131和152個(gè)氨基酸)，它在胎盤，滋養(yǎng)層腫瘤，和培養(yǎng)的人內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)。
VEGF的表達(dá)方式表明其與正常血管系統(tǒng)的發(fā)育和維持及腫瘤血管生成相關(guān)。鼠發(fā)育期間，整個(gè)交配后7.5天的內(nèi)胚層表達(dá)VEGF且神經(jīng)外胚層室在毛細(xì)向內(nèi)生長階段產(chǎn)生VEGF。在鵪鶉發(fā)育的第二天，卵黃囊的血管化區(qū)域以及整個(gè)胚胎表現(xiàn)出表達(dá)VEGF。另外，在成年小鼠中靠近簾式內(nèi)皮膜的上皮細(xì)胞顯示出持續(xù)的VEGF表達(dá)，表明了在該特定內(nèi)皮表型和功能的維持中的作用。
已經(jīng)鑒定了VEGF的兩個(gè)高親和性受體，即VEGFR-1/Flt1(fms-樣酪氨酸激酶-1)和VEGFR-2/Kdr/Flk-1(含有激酶插入結(jié)構(gòu)域的受體/胎兒肝臟激酶-1)。這些受體屬于PDGF-受體家族。然而，VEGF受體在其胞外域中具有7個(gè)免疫球蛋白樣環(huán)(相對于PDGF家族其它成員中的5個(gè))和較長的激酶插入片斷。VEGF受體的表達(dá)主要發(fā)生在血管內(nèi)皮細(xì)胞中，盡管也有一些存在于單核細(xì)胞和黑素瘤細(xì)胞系中。已報(bào)導(dǎo)只有內(nèi)皮細(xì)胞與VEGF反應(yīng)會增殖，且不同來源的內(nèi)皮細(xì)胞表現(xiàn)出不同的反應(yīng)。因此，通過VEGFR-1和VEGFR-2介導(dǎo)的信號似乎是細(xì)胞類型特異性的。
VEGFR-1和VEGFR-2以高親和性結(jié)合VEGF165(Kd分別為大約20pM和200pM)。Flk-1受體也顯示出與VEGF反應(yīng)進(jìn)行自身磷酸化，但是Flt1的磷酸化幾乎不可檢測。VEGFR-2介導(dǎo)的信號引起形態(tài)學(xué)的顯著改變，肌動(dòng)蛋白的再組織和過度表達(dá)該受體的豬主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞的膜起皺。在這些細(xì)胞中，VEGFR-2也介導(dǎo)配體誘導(dǎo)的趨化性和促有絲分裂性；而VEGFR-1轉(zhuǎn)染的細(xì)胞缺乏對VEGF的促有絲分裂反應(yīng)。相反，VEGF對表達(dá)VEGFR-1的大鼠竇狀隙內(nèi)皮細(xì)胞具有較強(qiáng)的生長刺激效應(yīng)。磷蛋白與VEGFR-1和VEGFR-2的共沉淀不同，表明不同信號分子與受體特異性細(xì)胞內(nèi)序列相互作用。
在原位雜交試驗(yàn)中，在卵黃囊和胚內(nèi)中胚層(估計(jì)為交配后(p.c.)7.5天的胚胎，內(nèi)皮從它產(chǎn)生)中，且后來在推定的成血管細(xì)胞，心內(nèi)膜和大血管及小血管內(nèi)皮(交配后12.5天)中發(fā)現(xiàn)小鼠VEGFR-2mRNA的表達(dá)。在血管芽和胚胎及出生后早期的大腦的分支血管增生的內(nèi)皮細(xì)胞中豐富的VEGFR-2mRNA和成年大腦中表達(dá)減少表明VEGFR-2是血管發(fā)生和血管生成的主要調(diào)節(jié)劑。VEGFR-1的表達(dá)同樣與小鼠胚胎中的早期血管形成和與愈合皮膚傷口中的新脈管形成相關(guān)。然而，在成年器官中檢測到高水平的VEGFR-1表達(dá)，表明VEGFR-1在不涉及細(xì)胞生長的成熟血管的靜止內(nèi)皮中起作用。從原腸胚形成開始的中胚層中觀察到VEGFR-2的鳥類同系物，而VEGFR-1同系物首先在共表達(dá)內(nèi)皮標(biāo)記的細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)。在體外的鵪鶉外胚層培養(yǎng)物中，這些細(xì)胞的血管發(fā)生性分化所需的FGF-2上調(diào)VEGFR-2的表達(dá)。發(fā)現(xiàn)兩種VEGF受體的表達(dá)在發(fā)育晚期變得更有限。在人類胎兒組織中，VEGFR-1和VEGFR-2表現(xiàn)出重疊的，但略有不同的表達(dá)方式。這些資料表明VEGF及其受體以旁分泌方式起作用，以調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞的分化和組織的新脈管形成。
最近已表明VEGF是內(nèi)皮細(xì)胞生長和血管生成的低氧癥誘導(dǎo)型刺激物，且使用特異性單克隆抗體抑制VEGF活性顯示出減小實(shí)驗(yàn)?zāi)[瘤的生長及其血管的密度。[Ferrara等，Endocrine Reviews，184-25(1997)；Shibuya等，Adv.Cancer Res.，67281-316(1995)；Kim等，Nature，362841-844(1993)]。
大小超過幾立方毫米的實(shí)體瘤的生長依賴于血管供給，使得血管生成成為抗癌治療的具有吸引力的靶。用內(nèi)源性血管生成抑制劑或包括制管張素，纖溶酶原的片斷，和內(nèi)抑制素，膠原蛋白18的片斷的“抑制素”報(bào)道了令人鼓舞的結(jié)果。[O′Reilly等，Cell，79315-328(1994)；O′Reilly等，Cell，88277-85(1997)。]。正常情況下兩種因子均由原發(fā)性腫瘤產(chǎn)生且保持轉(zhuǎn)移休眠。全身性施用任一抑制素也顯示出誘導(dǎo)并維持動(dòng)物模型中原發(fā)性腫瘤的休眠。受體和通過抑制素的信號傳導(dǎo)，以及激活它們的蛋白酶有待鑒定。對于在癌癥和其它病理學(xué)疾病狀態(tài)的治療中控制血管生成的其它治療性分子的需求仍然存在。
已表明原發(fā)性乳腺癌表達(dá)一些血管生成性多肽，其中VEGF最豐富。[參見，例如，Relf等，Cancer Res.，57963-969(1997)]。在侵入性和非侵入性導(dǎo)管(原位)乳腺癌中，腫瘤細(xì)胞含有高水平的VEGF mRNA。[Brown等，Hum.Pathol.，2686-91(1995)]。鄰近原位癌的內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)VEGFR-1和VEGFR-2 mRNA。VEGF及其受體負(fù)責(zé)惡性乳房腫瘤的血管生成性進(jìn)展，因?yàn)樵谝恍┆?dú)立的研究中，發(fā)現(xiàn)腫瘤血管密度與該疾病的預(yù)后之間相關(guān)。[Weidner等，J.Natl.Cancer Inst.，841875-1887(1992)]。存在對于乳腺癌和乳腺癌相關(guān)的血管生成的其它標(biāo)記的需求，以便改進(jìn)診斷和篩選，和用作治療性干涉的靶子。
淋巴系統(tǒng)的主要功能是提供組織的液體回流和轉(zhuǎn)運(yùn)許多血管外物質(zhì)回血液。另外，在化膿過程期間，淋巴細(xì)胞離開血液，通過淋巴器官和其它組織遷移，并進(jìn)入淋巴管中，通過胸導(dǎo)管返回血液。特化的小靜脈，即毛細(xì)血管后微靜脈(HEVs)，再次結(jié)合淋巴細(xì)胞并引起其外滲入組織。因此，淋巴管，且特別是淋巴結(jié)在免疫學(xué)和在不同腫瘤的轉(zhuǎn)移發(fā)展中起重要作用。
自20世紀(jì)開始以來，關(guān)于淋巴系統(tǒng)的胚胎起源提出了三個(gè)不同的理論。然而，淋巴管難以鑒定，因?yàn)闆]有可用于它們的已知的特異性標(biāo)記。
淋巴管最普遍借助于淋巴造影術(shù)進(jìn)行研究。在淋巴造影術(shù)中，將X-射線造影劑直接注射進(jìn)淋巴管中。該造影劑沿淋巴系統(tǒng)的輸出導(dǎo)液管分布。造影劑在淋巴結(jié)集中，在此停留達(dá)半年，在此時(shí)間期間的X-射線分析允許追蹤淋巴結(jié)的大小和結(jié)構(gòu)。該診斷法在患有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移瘤和淋巴惡性腫瘤，例如淋巴瘤的癌癥患者中尤其重要。然而，本領(lǐng)域仍然需要改進(jìn)的材料和方法用于淋巴組織造影。
本發(fā)明小結(jié)本發(fā)明闡述了一種位于5號染色體上的新的受體酪氨酸激酶基因，鑒定為來自人白血病細(xì)胞的一種未知的酪氨酸激酶-同源性PCR-cDNA片斷[Aprelikova等，Cancer Res.，52.746-748(1992)]。該基因及其編碼的蛋白質(zhì)稱為Flt4。該縮寫來自短語fms-樣酪氨酸激酶4。
Flt4是在結(jié)構(gòu)上與VEGFR-1和VEGFR-2基因產(chǎn)物密切相關(guān)的受體酪氨酸激酶。由于該相似性和隨后發(fā)現(xiàn)的在這三個(gè)受體的配體之間的相似性，F(xiàn)lt4受體也稱為VEGFR-3。名稱Flt4和VEGFR-3在本文中可交換使用。盡管這三個(gè)受體之間具有相似性，但是Flt4的成熟形式與VEGFRs的區(qū)別在于它在胞外域被蛋白酶剪切成兩個(gè)二硫鍵連接的125/120kD和75kD的多肽。Flt4基因編碼4.5和5.8kb的mRNAs，表現(xiàn)出可選擇的3’外顯子且分別編碼190kD和195kD的多肽。
進(jìn)一步的區(qū)別證據(jù)是VEGF不表現(xiàn)出與Flt4的特異性結(jié)合且不誘導(dǎo)其自身磷酸化。
在組織研究中Flt4，F(xiàn)lt1，和KDR/Flk-1受體mRNA信號的比較表現(xiàn)出重疊的，但不同的表達(dá)方式。Kaipainen等，J.Exp.Med.，1782077(1993)。Flt4基因表達(dá)似乎比VEGFR-1或VEGFR-2的表達(dá)更有限。Flt4的表達(dá)在頭間充質(zhì)成血管細(xì)胞，主靜脈和在交配后8.5天的小鼠胚胎尿囊的胚外中通過原位雜交首次變得可檢測。在交配后12.5天的胚胎中，在發(fā)育中的靜脈和推定的淋巴管內(nèi)皮上觀察到Flt4信號，而動(dòng)脈內(nèi)皮呈現(xiàn)陰性。在發(fā)育晚期期間，F(xiàn)lt4 mRNA變得局限在發(fā)育的淋巴管中。在成人組織中只在淋巴管內(nèi)皮和一些毛細(xì)血管后微靜脈中表達(dá)Flt4 mRNA且在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌的淋巴竇中和在淋巴管瘤中出現(xiàn)表達(dá)增加。該結(jié)果支持淋巴管的靜脈起源的理論。
從人紅白血病細(xì)胞系中克隆的Flt4受體酪氨酸激酶cDNA的蛋白質(zhì)產(chǎn)物是N-糖基化的且在其胞外域中含有7個(gè)免疫球蛋白樣環(huán)。Flt4的胞質(zhì)酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域與Flt1和KDR的相應(yīng)結(jié)構(gòu)域在氨基酸水平上有大約80％的相同性且與血小板衍生生長因子，集落刺激因子-1，干細(xì)胞因子的受體，和Flt3受體有大約60％的相同性。參見Pajusola等，Cancer Res.，525738(1992)。
本發(fā)明提供了用于Flt4蛋白質(zhì)及其肽片斷生產(chǎn)和用于從其它來源回收相關(guān)基因的編碼Flt4受體酪氨酸激酶的分離的多核苷酸(例如，確定結(jié)構(gòu)的DNA或RNA片斷)。
本發(fā)明提供了能被插入微生物或真核細(xì)胞中且能夠表達(dá)該編碼蛋白的含有編碼Flt4受體酪氨酸激酶或相關(guān)蛋白的異源性片斷的重組DNA載體。
本發(fā)明提供了能夠產(chǎn)生有用量的Flt4受體酪氨酸激酶和來自許多物種的功能相似的蛋白質(zhì)的真核細(xì)胞。
本發(fā)明提供了可在實(shí)室合成或者通過微生物生產(chǎn)的肽，該肽模擬天然Flt4受體酪氨酸激酶蛋白的活性。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及抑制Flt4受體酪氨酸激酶蛋白的活性的肽。
特別優(yōu)選的肽選自由如下肽組成的組中(a)Flt4-短鏈形式，具有SEQ.IDNOs.1和2中所示的核苷酸和推定的氨基酸序列；和(b)在其羧基末端具有不同的核苷酸和相應(yīng)的氨基酸殘基的第二種形式，即Flt4-長鏈形式，具有SEQ.ID NOs.3和4所示的核苷酸和推定的氨基酸序列。Flt4長鏈形式具有1363個(gè)氨基酸殘基的長度。
DNA和RNA分子，重組DNA載體，和包含編碼上述任一蛋白質(zhì)或肽的核苷酸序列的修飾微生物或真核細(xì)胞也是本發(fā)明的一部分。具體地說，含有如下兩個(gè)DNA序列的全部或部分的序列，互補(bǔ)DNA或RNA序列，或相應(yīng)的RNA序列是特別優(yōu)選的(a)諸如SEQ ID NO1的DNA序列，編碼Flt4-短鏈形式[SEQ ID NO2]，和(b)諸如SEQ ID NO3的DNA序列，編碼SEQID NO1的核苷酸3913-4416改變的Flt4，即編碼Flt4-長鏈形式[SEQ ID NO4]。
還提供了含有較長序列之片段的DNA和RNA分子用于實(shí)施涉及通過遺傳工程技術(shù)生產(chǎn)該肽和生產(chǎn)寡核苷酸探針的本發(fā)明的優(yōu)選方面。
由于本文鑒定了編碼Flt4蛋白的DNA序列，因此可通過例如，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)或者使用商業(yè)上可得到的設(shè)備通過化學(xué)合成生產(chǎn)編碼Flt4蛋白的DNA，之后使用重組DNA技術(shù)的已知技術(shù)將該基因插入任一許多可得到的DNA載體中。另外，自動(dòng)設(shè)備也可得到，使得直接合成本文公開的任一肽容易實(shí)現(xiàn)。
本發(fā)明還涉及Flt4肽和其它構(gòu)建體，且涉及Flt4作為淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞的特異性標(biāo)記的用途。
在一個(gè)具體實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及識別Flt4的核酸探針和抗體，特別是單克隆抗體，和含有該抗體的組合物。
另外在一個(gè)具體實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及監(jiān)測組織樣品和生物體中淋巴管的方法。提供描述淋巴組織，且特別是淋巴管狀態(tài)(發(fā)炎，感染，損傷，生長，等)的臨床檢測方法，和提供檢測淋巴管，且從而檢測生物體中的淋巴血管化的方法也是本發(fā)明的一個(gè)目的。
本發(fā)明的另一目的是提供特異性識別Flt4受體蛋白或其各種表位的單克隆抗體。使用這些單克隆抗體用于檢測和測量組織，且特別是淋巴組織中Flt4受體的量的診斷目的也是本發(fā)明的一個(gè)目的。在抗-Flt4抗體的上下文中，術(shù)語“特異性識別Flt4”，“特異性結(jié)合Flt4”，“Flt4特異性的”等是指抗體相對于包括VEGFR-2/Kdr/Flk-1和VEGFR-1/Flt1的其它內(nèi)皮細(xì)胞表面受體優(yōu)先與Flt4結(jié)合(免疫反應(yīng))。因此，對Flt4特異性的抗-Flt4抗體或其它Flt4結(jié)合化合物可用于按照本文所述的本發(fā)明的方法鑒定和/或標(biāo)記組織或生物學(xué)樣品中的Flt4(例如，醫(yī)學(xué)造影，檢測，篩選，或定向療法)，因?yàn)樗鼈兏静荒芙Y(jié)合其它抗原的表位，或者僅以明顯低于其Flt4結(jié)合親和力的親和力結(jié)合其它抗原以至于在這些實(shí)際背景中不明顯。
本發(fā)明的另一方面涉及測定細(xì)胞樣品中存在Flt4-受體的方法，包括步驟(a)將細(xì)胞樣品與本發(fā)明的抗體，特別是單克隆抗體接觸；和(b)檢測所述的單克隆抗體與Flt4受體的結(jié)合。從下文的詳細(xì)描述顯而易見的是，有關(guān)組織樣品中Flt4受體的存在，數(shù)量，密度，和位置方面的信息與疾病狀態(tài)的類型和嚴(yán)重性具有診斷和預(yù)后相關(guān)性；且如果需要將基于抗-Flt4的治療方案特異性地只適應(yīng)于患有特征在于在腫瘤或在圍繞，服務(wù)或供給腫瘤的血管或淋巴管和組織中表達(dá)Flt4的疾病的那些患者時(shí)具有治療相關(guān)性。因此篩選Flt4受體的存在可構(gòu)成治療方案的第一步，和/或療程期間的監(jiān)測步驟。
本發(fā)明還涉及在淋巴血管化和炎癥，感染和免疫學(xué)情況中調(diào)節(jié)(例如，拮抗或增強(qiáng))Flt4功能的方法。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，該方法包括通過提供足夠量的Flt4-結(jié)合化合物以抑制參與該反應(yīng)，特別是其中Flt4的功能與諸如轉(zhuǎn)移癌，淋巴瘤，炎癥(慢性或急性的)，感染和免疫學(xué)疾病的疾病相關(guān)的Flt4內(nèi)皮細(xì)胞位點(diǎn)來抑制Flt-4介導(dǎo)的淋巴血管化。由于許多腫瘤通過淋巴管轉(zhuǎn)移，因此涉及抑制Flt4配體和Flt4之間相互作用的療法預(yù)期具有廣闊的應(yīng)用，可作為抗癌治療方案的一部分用于抑制腫瘤轉(zhuǎn)移。
本發(fā)明還涉及特異性Flt4-刺激配體和單克隆抗體及其刺激淋巴管內(nèi)皮的用途，和從對該配體的研究中得到的在需要時(shí)，例如在與Flt4功能相關(guān)的各種疾病狀態(tài)中抑制Flt4功能的片段和肽以及抗體。
本發(fā)明提供了Flt4受體酪氨酸激酶的配體的細(xì)胞系來源。使用這些細(xì)胞的條件培養(yǎng)基，可通過使用本領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)方法純化和克隆Flt4配體。使用該條件培養(yǎng)基或純化的配體，可獲得用于Flt4配體和二聚體化抑制劑以及Flt4信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑的試驗(yàn)系統(tǒng)，它允許鑒定和制備該抑制劑。
在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，PC-3細(xì)胞系的條件培養(yǎng)基包含能夠刺激Flt4受體并調(diào)節(jié)某些內(nèi)皮細(xì)胞的生長和分化以及分化功能的蛋白質(zhì)或其片段。Flt4配體或其肽或衍生物用于調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞生長，分化及其分化功能并用于產(chǎn)生該配體的興奮劑和拮抗劑。具體地說，F(xiàn)lt4配體用于調(diào)節(jié)淋巴管內(nèi)皮。然而，當(dāng)從重組來源純化或生產(chǎn)時(shí)，F(xiàn)lt4配體也可刺激相關(guān)的KDR/Flk-1受體。
Flt4-刺激配體的鑒定使得測定該配體的抑制劑或Flt4功能的抑制劑直接成為可能?？蓪⒃撘种苿┖唵蔚丶尤牒蠪lt4配體的條件培養(yǎng)基中，且如果它們抑制自身磷酸化，則它們起Flt4信號抑制劑的作用。例如，可測定重組或合成肽(包括但不限于Flt4胞外域的片段)對Flt4-配體相互作用或Flt4二聚體化的抑制。這種推定的Flt4抑制劑和另外的抗Flt4配體的抗體，抑制Flt4受體-配體相互作用的肽或其它化合物，以及與編碼Flt4配體的mRNA序列互補(bǔ)的反義寡核苷酸可用于調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞和用于治療與內(nèi)皮細(xì)胞功能相關(guān)的疾病。
稱為VEGF-C的Flt4配體的詳細(xì)鑒定在申請日為1998年2月2日且作為國際公開號WO 98/33917公開的PCT專利申請?zhí)朠CT/US98/01973中；在申請日為1996年8月1日且作為國際公開號WO 97/05250公開的PCT專利申請PCT/FI96/00427中；和在其中要求優(yōu)先權(quán)所依賴的美國專利申請優(yōu)先權(quán)文件中提供，所有這些文獻(xiàn)在本文中引用以供參考。前體-VEGF-C原的推定氨基酸序列在本文中以SEQ ID NO21描述。
稱為VEGF-D的第二個(gè)Flt4配體的詳細(xì)描述在Achen等，Proc.Nat′l Acad.Sci.U.S.A.，95(2)548-553(1998)，和在Genbank登錄號AJ000185中提供，本文引用該兩篇文獻(xiàn)以供參考。前體-VEGF-D原的推定氨基酸序列在本文中以SEQ ID NO22描述。
本發(fā)明還涉及治療患有以細(xì)胞中表達(dá)Flt4酪氨酸激酶(Flt4)為特征的疾病的哺乳動(dòng)物生物體的方法，包括給哺乳動(dòng)物生物體施用一種組合物的步驟，該組合物包含有效抑制Flt4配體蛋白與生物體細(xì)胞中表達(dá)的Flt4的結(jié)合的化合物，從而抑制Flt4功能。該疾病可以是上文已經(jīng)提及的疾病，例如以不希望的淋巴血管化為特征的疾病。另外，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在與至少一些乳腺癌，和可能的其它癌癥相關(guān)的血管系統(tǒng)中也出現(xiàn)Flt4表達(dá)(即，表達(dá)水平大大超出相應(yīng)正常(健康)組織的血管系統(tǒng)中幾乎不可檢測或者不可檢測的表達(dá)水平)。因此，在優(yōu)選的實(shí)施方案中，該細(xì)胞包含內(nèi)皮細(xì)胞(淋巴管或血管的內(nèi)皮細(xì)胞)。在另一實(shí)施方案中，該細(xì)胞包含腫瘤細(xì)胞，例如表達(dá)Flt4的某些淋巴瘤。特別包含人類的治療。
“有效抑制Flt4配體蛋白質(zhì)與生物細(xì)胞中表達(dá)的Flt4的結(jié)合的化合物”是指抑制可從PC-3條件培養(yǎng)基分離的本文描述為血管內(nèi)皮生長因子C的Flt4配體的結(jié)合的任何化合物。預(yù)期該化合物也有效抑制血管內(nèi)皮生長因子D與Flt4的結(jié)合。舉例性的化合物包括下列多肽(a)含有抗-Flt4抗體的抗原結(jié)合片段的多肽；(b)含有可溶性Flt4片段的多肽(例如，胞外域片段)，其中該片段和多肽能夠與Flt4配體結(jié)合；(c)含有脊椎動(dòng)物血管內(nèi)皮生長因子C(VEGF-C)多肽的片段或類似物的多肽，其中該多肽和片段或類似物結(jié)合，但不能激活在天然宿主細(xì)胞(即在其表面表達(dá)天然Flt4蛋白質(zhì)的生物細(xì)胞)上表達(dá)的Flt4；和(d)含有脊椎動(dòng)物血管內(nèi)皮生長因子D(VEGF-D)多肽的片段或類似物的多肽，其中該多肽和片段或類似物結(jié)合，但不能激活在天然宿主細(xì)胞上表達(dá)的Flt4。使用例如，VEGF-C和重組表達(dá)的Flt4以標(biāo)準(zhǔn)體外篩選試驗(yàn)可鑒定的小分子抑制劑也是可預(yù)期的。含有抗-Flt4抗體的抗原結(jié)合片段的多肽是非常優(yōu)選的。該多肽包括，例如特異性結(jié)合Flt4的多克隆和單克隆抗體；該抗體的片段；嵌合和人源化抗體；特異性結(jié)合Flt4且也特異性結(jié)合另一抗原的雙特異性抗體等等。結(jié)合循環(huán)Flt4配體且從而抑制該配體與Flt4的結(jié)合的化合物的用途也是可預(yù)期的。該化合物包括抗-VEGF-C或抗-VEGF-D抗體或者包含其抗原結(jié)合片段的多肽。在相關(guān)變化形式中，本發(fā)明包含中斷下游細(xì)胞內(nèi)Flt4信號傳導(dǎo)，從而抑制Flt4功能的治療方法。
在一個(gè)優(yōu)選的變化中，該化合物還含有一個(gè)在本文別處描述的檢測標(biāo)記，或者細(xì)胞毒性劑。舉例性的細(xì)胞毒性劑包括植物毒素(例如，蓖麻毒蛋白，皂草素)，細(xì)菌或真菌毒素，放射性同位素(例如，211-砹，212-鉍，90-釔，131-碘，99m-锝，和本文所述的其它元素)，抗-代謝藥物(例如，氨甲蝶呤，5-氟脫氧尿苷)，烷基化試劑(例如，苯丁酸氮芥)，抗有絲分裂劑(例如，長春花生物堿)，和DNA插入劑(例如，阿霉素)。其它舉例性的試劑包括化合物或應(yīng)用于細(xì)胞時(shí)誘導(dǎo)DNA損傷的處理。該試劑和因素包括誘導(dǎo)DNA損傷的輻射和波，例如-照射，X-射線，紫外照射，微波，電子發(fā)射等。也描述為“化療劑”的各種化合物起誘導(dǎo)DNA損傷的作用，其全部打算用于本文公開的結(jié)合治療方法中。預(yù)期可使用的化療劑包括，例如，阿霉素，5-氟尿嘧啶(5FU)，表鬼臼毒素吡喃葡糖苷(VP-16)，喜樹堿，放線菌素-D，絲裂霉素C，順式鉑氨(CDDP)和甚至是過氧化氫。本發(fā)明還包含一種或多種DNA損傷劑的組合使用，不論是以輻射為基礎(chǔ)還是實(shí)際化合物，例如使用X-射線與順式鉑氨或者使用順式鉑氨與表鬼臼毒素吡喃葡糖苷。還有其它試劑為阿霉素(也稱為阿霉素doxorubicin)，VP-16(也稱為表鬼臼毒素吡喃葡糖苷)等，柔紅霉素(插入DNA中，抑制DNA-介導(dǎo)的RNA聚合酶且抑制DNA合成)；絲裂霉素(也稱為突變霉素和/或絲裂霉素-C)；放線菌素D；長春新堿和環(huán)磷酰胺；博萊霉素；VP16(表鬼臼毒素吡喃葡糖苷)；腫瘤壞死因子[TNF]；紫杉醇；苯丙氨酸氮芥；環(huán)磷酰胺，苯丁酸氮芥。本發(fā)明的肽的給藥可在其它試劑處理之前或者之后間隔幾分鐘到幾周進(jìn)行。在其它試劑和表達(dá)構(gòu)建體分別給藥的實(shí)施方案中，一般應(yīng)確保每次給藥時(shí)間之間的重要時(shí)間期限不期滿，以便該試劑和以肽為基礎(chǔ)的治療劑仍然能夠發(fā)揮優(yōu)勢結(jié)合效應(yīng)。在這種情況下，預(yù)期可在互相之間大約12-24小時(shí)之內(nèi)施用兩種用藥程式，更優(yōu)選在互相之間大約6-12小時(shí)之內(nèi)，最優(yōu)選僅大約12小時(shí)的延遲時(shí)間。在一些情況下，為了治療有效需要延長時(shí)間期限，盡管在各次給藥之間過去了幾天(2，3，4，5，6或7)到幾周(1，2，3，4，5，6，7或8)。特別包含用一種或兩種試劑的重復(fù)治療。
同樣，為了改良用藥，該組合物優(yōu)選還包含藥用上可接受的稀釋劑，佐劑，或載體介質(zhì)。
正如本文所作的詳細(xì)說明，F(xiàn)lt4的表達(dá)盡管大量局限于健康成人的淋巴管內(nèi)皮，但是在圍繞至少某些腫瘤的血管系統(tǒng)中已鑒定到Flt4的表達(dá)。因此，本發(fā)明還包括治療患有以血管內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)Flt4酪氨酸激酶(Flt4)為特征的腫瘤疾病的哺乳動(dòng)物生物體的方法，包括步驟給需要該治療的哺乳動(dòng)物生物體施用一種組合物，該組合物包含一種有效抑制Flt4配體蛋白質(zhì)與生物體血管內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)的Flt4的結(jié)合的化合物，從而抑制Flt4-介導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞的增生。特別包含治療選自癌(例如，乳腺癌)，鱗狀細(xì)胞癌，淋巴瘤，黑素瘤，和肉瘤的腫瘤疾病。然而，本文詳細(xì)描述的篩選技術(shù)可鑒定以血管內(nèi)皮細(xì)胞中Flt4表達(dá)為特征的其它腫瘤將是顯而易見的，該腫瘤是對本文所述的抗-Flt4治療方案敏感的候選腫瘤。特別包含治療以血管內(nèi)皮細(xì)胞中Flt4的表達(dá)為特征的乳腺癌。以血管內(nèi)皮細(xì)胞中Flt4酪氨酸激酶的表達(dá)為特征的腫瘤疾病是指與健康組織的血管中正常觀察到的不可檢測或者幾乎不可檢測的水平相比其中的Flt4在血管系統(tǒng)中以高得多的水平可鑒定的疾病，正如本文的例證。
化合物的治療有效量可使用本領(lǐng)域公認(rèn)的劑量增大和劑量反應(yīng)試驗(yàn)根據(jù)經(jīng)驗(yàn)確定。用于腫瘤治療的治療有效量是指有效減小腫瘤生長的量，或者有效停止腫瘤生長的量，或者有效縮小或完全消除腫瘤的量，且對于接受癌癥治療的患者無不可接受的副作用水平。如果該化合物包含抗體或其它多肽，特別包含的劑量級別為每千克體重0.1至100mg抗體，且更優(yōu)選1至10mg/kg。對于一般表現(xiàn)出較長的循環(huán)半壽期的人源化抗體，特別包含以從每天到每隔1月范圍的間隔給藥，更優(yōu)選以每周的間隔，或者每隔1周，或者每隔3周的間隔給藥。監(jiān)測治療的進(jìn)展，病人的副作用，和循環(huán)抗體水平將為最佳給藥方案提供進(jìn)一步的指導(dǎo)。來自以其它抗體為基礎(chǔ)的癌癥治療(例如，抗-HER2，抗-EGF受體)的公開的和正在進(jìn)行的臨床試驗(yàn)的數(shù)據(jù)也提供了有用的給藥方案指導(dǎo)。
對于本文所述的治療方法，優(yōu)選的化合物包括含有抗-Flt4抗體的抗原結(jié)合片斷的多肽，含有可溶性Flt4胞外域片斷的多肽。人的和人源化的抗-Flt4抗體是非常優(yōu)選的。非常優(yōu)選的Flt4胞外域片斷含有Flt4胞外域的配體結(jié)合部分。例如，含有Flt4胞外域的前3個(gè)免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域的可溶性片斷是非常優(yōu)選的。僅結(jié)合Flt4配體，或者與其它肽(例如VEGFR-1或VEGFR-2的免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域)融合時(shí)的更小片斷也是可預(yù)期的。同樣，可預(yù)料到提高可溶性和/或穩(wěn)定性，血清半壽期，或其它特征以提高治療效力的改良。例如，可預(yù)料到含有Flt4胞外域和免疫球蛋白Fc肽(特別是IgG1 Fc同種型)之間的融合以提高可溶性和血清半壽期的多肽。[Compare Achen等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，95548-553(1998)]。
本發(fā)明的治療方法可預(yù)期的優(yōu)勢在于這樣的事實(shí)，即在健康組織的血管系統(tǒng)中一般不以任何明顯的水平表達(dá)Flt4。在一個(gè)非常優(yōu)選的實(shí)施方案中，治療性化合物包含雙特異性抗體，或其片斷，其中該抗體或片斷特異性地結(jié)合Flt4且特異性地結(jié)合血管內(nèi)皮標(biāo)記抗原?！把軆?nèi)皮標(biāo)記抗原”是指在增生的血管內(nèi)皮細(xì)胞上表達(dá)，且優(yōu)選不在淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞上表達(dá)的任何細(xì)胞表面抗原。舉例性的血管內(nèi)皮標(biāo)記包括PAL-E[deWaal等，Am.J.Pathol.，1501951-1957(1994)]，VEGFR-1和VEGFR-2[Ferrara等，Endocrine Reviews，184-25(1997)]，Tie[Partanen等，Mol.Cell.Biol.，121698-1707(1992)]，endoglin[美國專利號5,776,427，在本文中引用以其整體作為參考]，和von Willebrandt因子。雙特異性抗體預(yù)期優(yōu)選定位于表達(dá)Flt4和血管內(nèi)皮標(biāo)記的腫瘤相關(guān)性血管系統(tǒng)上。在一個(gè)非常優(yōu)選的實(shí)施方案中，該化合物還包含用于殺死腫瘤細(xì)胞和/或殺死供給腫瘤細(xì)胞的血管系統(tǒng)的與雙特異性抗體偶連的抗腫瘤劑或細(xì)胞毒性劑。舉例性的試劑包括上文所述的那些試劑，也包括刺激宿主中針對該腫瘤的免疫反應(yīng)的治療性蛋白，例如抑制素，細(xì)胞因子，趨化因子等。
在替代的實(shí)施方案中，該化合物包含識別由Flt4/Flt4配體復(fù)合物(例如，由與VEGF-C或VEGF-D結(jié)合的Flt4組成的復(fù)合物)組成的一個(gè)(或多個(gè))表位的抗體(或雙特異性抗體)。
與具有抑制血管生成因子的潛力的廣譜試劑偶連或者共同給藥的治療性化合物也是可預(yù)期的。該試劑包括，例如，可結(jié)合肝素抑制血管生成因子的肝素結(jié)合藥物(例如戊聚糖和蘇拉明類似物)；抑制內(nèi)皮細(xì)胞生長和遷移的化學(xué)試劑，例如煙曲霉素類似物。目前研究的其它試劑包括Marimastat(BritishBiotech，Annapolis MD；指示非小細(xì)胞肺癌，小細(xì)胞肺癌和乳腺癌)；AG3340(Agouron，LaJolla，CA；用于多形成膠質(zhì)細(xì)胞瘤)；COL-3(Collagenex，Newtown PA；用于腦腫瘤)；Neovastat(Aetema，Quebec，Canada；用于腎癌和非小細(xì)胞肺癌)；BMS-275291(Bristol-Myers Squibb，Wallingford CT；用于轉(zhuǎn)移性非小細(xì)胞肺癌)；Thalidomide(Celgen；用于黑素瘤，頭和頸癌，卵巢癌，轉(zhuǎn)移性前列腺癌，和卡波西肉瘤；復(fù)發(fā)性或轉(zhuǎn)移性結(jié)腸直腸癌(含有佐劑)；婦科肉瘤，肝癌，多發(fā)性骨髓瘤；CLL，復(fù)發(fā)性或進(jìn)行性腦癌，多發(fā)性骨髓瘤，非小細(xì)胞肺癌，非轉(zhuǎn)移性前列腺癌，頑固多發(fā)性骨髓瘤，和腎癌)；Squalamine(Magainin Pharmaceuticals Plymouth Meeting，PA；非小細(xì)胞癌和卵巢癌)；Endostatin(EntreMEd，Rockville，MD；用于實(shí)體瘤)；SU5416(Sugen，San Francisco，CA；復(fù)發(fā)性頭和頸癌，晚期實(shí)體瘤，IIIB或IV期乳腺癌；復(fù)發(fā)性或進(jìn)行性腦癌(小兒)；卵巢癌，AML；神經(jīng)膠質(zhì)瘤，晚期惡性腫瘤，晚期結(jié)腸直腸癌，von-Hippel Lindau疾病，晚期軟組織癌；前列腺癌，結(jié)腸直腸癌，轉(zhuǎn)移性黑素瘤，多發(fā)性骨髓瘤，惡性間皮瘤；轉(zhuǎn)移性腎癌，晚期或復(fù)發(fā)性頭和頸癌，轉(zhuǎn)移性結(jié)腸直腸癌)；SU6668(Sugen San Francisco，CA；晚期腫瘤)；干擾素-α；抗-VEGF抗體(國家癌癥研究所，Bethesda MD；Genentech SanFranscisco，CA；頑固性實(shí)體瘤；轉(zhuǎn)移性腎細(xì)胞癌，未治療的晚期結(jié)腸直腸癌)；EMD121974(Merck KCgaA，Darmstadt，Germany；HIV相關(guān)性卡波西肉瘤，進(jìn)行性或復(fù)發(fā)性退行性神經(jīng)膠質(zhì)瘤)；白介素12(Genetics Institute，Cambridge，MA；卡波西肉瘤)和IM862(Cytran，Kirkland，WA；卵巢癌，未治療的結(jié)腸和直腸起源的轉(zhuǎn)移癌和卡波西肉瘤)。
也可預(yù)期抗-Flt4化合物與前藥的偶連可通過抗-Flt4化合物靶向腫瘤血管并隨后在腫瘤生長的位置被定向激活(例如，通過照射)。使用該前藥的策略具有最小化該藥物對表達(dá)Flt4的健康淋巴管的副作用的預(yù)期優(yōu)勢。
同樣，本發(fā)明包括治療患有以在血管內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)Flt4酪氨酸激酶(Flt4)為特征的腫瘤疾病的哺乳動(dòng)物生物體的方法，包括步驟鑒定患有以在血管內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)Flt4為特征的腫瘤疾病狀態(tài)的哺乳動(dòng)物生物體，和給需要該治療的哺乳動(dòng)物生物體施用一種組合物，該組合物包含一種有效抑制Flt4配體蛋白質(zhì)與生物體血管內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)的Flt4結(jié)合的化合物，從而抑制Flt4-介導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞的增生。
本發(fā)明還提供了篩選存在Flt4受體酪氨酸激酶蛋白(Flt4)的生物學(xué)樣品的方法，包括步驟(a)將懷疑含有Flt4的生物學(xué)樣品與含有Flt4結(jié)合化合物的組合物在該化合物可與該生物學(xué)樣品中的Flt4結(jié)合的條件下接觸；(b)在可去掉該樣品中未與Flt4結(jié)合的Flt4結(jié)合化合物的條件下洗滌該生物學(xué)樣品；和(c)通過檢測洗滌步驟后的樣品中與Flt4受體酪氨酸激酶結(jié)合的Flt4結(jié)合化合物篩選存在Flt4的樣品。優(yōu)選的是，該化合物含有選自如下組成的組中的多肽(a)含有抗-Flt4抗體的抗原結(jié)合片斷的多肽；和(b)含有Flt4配體或Flt4結(jié)合片斷或其類似物的多肽。特異性結(jié)合Flt4，且還含有檢測標(biāo)記的抗體是非常優(yōu)選的。
本發(fā)明還涉及造影懷疑含有表達(dá)Flt4受體酪氨酸激酶蛋白質(zhì)(Flt4)之細(xì)胞的脊椎動(dòng)物組織的方法，包含步驟(a)用含有Flt4結(jié)合化合物的組合物接觸脊椎動(dòng)物組織；和(b)通過檢測與該組織結(jié)合的Flt4結(jié)合化合物造影組織。優(yōu)選的是，該組織是人組織，且該方法還包含在接觸步驟后和造影步驟前，在可從組織中去掉未結(jié)合該組織中Flt4的Flt4化合物的條件下洗滌該組織的步驟。
在有關(guān)變化中，本發(fā)明提供了造影脊椎動(dòng)物生物體組織中的腫瘤的方法，包括步驟(a)將懷疑含有腫瘤的脊椎動(dòng)物組織與含有Flt4結(jié)合化合物的組合物接觸；(b)檢測與所述組織中的細(xì)胞結(jié)合的Flt4結(jié)合化合物；和(c)通過鑒定Flt4結(jié)合化合物結(jié)合的血管內(nèi)皮細(xì)胞造影實(shí)體瘤，其中表達(dá)Flt4的血管與組織中腫瘤的存在和位置相關(guān)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，該方法還包含用特異性結(jié)合在淋巴管內(nèi)皮中基本上不存在的血管內(nèi)皮標(biāo)記(例如，PAL-E，VEGFR-1，VEGFR-2)的第二化合物(例如抗體)接觸該組織；和檢測與該組織中的細(xì)胞結(jié)合的第二化合物的步驟；其中該造影步驟包括鑒定用Flt4結(jié)合化合物和第二化合物標(biāo)記的血管，且其中用Flt4結(jié)合化合物和第二化合物標(biāo)記的血管與組織中腫瘤的存在和位置相關(guān)?？深A(yù)料到使用第二化合物可幫助醫(yī)師更迅速地區(qū)分表達(dá)Flt4的血管與在其表面表達(dá)Flt4的正常淋巴管。
本發(fā)明還涉及篩選腫瘤疾病狀態(tài)的方法，包括步驟(a)用含有特異性結(jié)合Flt4受體酪氨酸激酶的抗體或抗體片斷的組合物接觸懷疑具有腫瘤疾病狀態(tài)的哺乳動(dòng)物生物體的組織；(b)檢測與哺乳動(dòng)物生物體中的細(xì)胞結(jié)合的抗體或抗體片斷；和(c)從與哺乳動(dòng)物生物體的細(xì)胞結(jié)合的抗體的數(shù)量或分布篩選腫瘤疾病。如本文所述，在至少一些腫瘤的血管系統(tǒng)中強(qiáng)烈染色Flt4(它在血管系統(tǒng)中通常是不可檢測的或者幾乎不可檢測的)。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，在篩選步驟中，與血管內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)合的抗體或抗體片斷的檢測與腫瘤疾病的存在相關(guān)。在該方法中，應(yīng)明白“檢測”是指按本文所述以比相應(yīng)正常(健康)組織中存在的幾乎不可檢測或者不可檢測的水平明顯更高的水平進(jìn)行的檢測。通過與用健康生物體的組織進(jìn)行的對照進(jìn)行比較可證實(shí)該差別表達(dá)。特別包含篩選哺乳動(dòng)物組織的腫瘤。如上所述，通過給所述的哺乳動(dòng)物施用特異性結(jié)合血管內(nèi)皮標(biāo)記的第二化合物可進(jìn)一步幫助該方法的實(shí)施，其中該檢測步驟包含檢測與新血管內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)合的所述第一和第二化合物。
從前面所述也可預(yù)料到用于本發(fā)明方法中的所述各種化合物也打算作為本發(fā)明的方面。該化合物包括例如，抗-Flt4抗體和上文所述的雙特異性抗體。同樣，本文所述的任何化合物(單獨(dú)或者結(jié)合)在制備用于本文所述的治療或診斷或造影目的的藥物中的用途也打算作為本發(fā)明的一個(gè)方面。該藥物還可包含藥用上可接受的稀釋劑，佐劑，載體等。
同樣，本發(fā)明包括以有利于其用于實(shí)施本發(fā)明的方法的方式包裝的含有本發(fā)明的化合物或組合物的試劑盒。在最簡單的實(shí)施方案中，該試劑盒包括在諸如密封的瓶或管的容器中包裝的，帶有粘貼于容器上或包含在包裝中的描述該化合物或組合物在實(shí)施本發(fā)明方法中的使用的標(biāo)簽的本發(fā)明的化合物或組合物。優(yōu)選的是，該化合物或組合物以單位劑量形式包裝。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明的試劑盒包含與在血管內(nèi)皮細(xì)胞表面表達(dá)但在淋巴管內(nèi)皮中基本上不存在的標(biāo)記(抗原)結(jié)合的第二化合物一起包裝的Flt4結(jié)合化合物。
另外，在肽或多肽用于造影或治療，和/或使用抗體將在細(xì)胞表面的Flt4蛋白表達(dá)用作檢測，篩選，造影等的靶的情況中描述了本發(fā)明的許多方面。諸如含有配體結(jié)合性可溶Flt4片斷的多肽的蛋白治療劑的治療性遞送也可用基因治療的材料和方法完成。例如，將含有編碼目的治療肽的多核苷酸的裸露DNA構(gòu)建體或基因治療表達(dá)載體構(gòu)建體傳遞給需要該治療的哺乳動(dòng)物受試者。優(yōu)選的是，該構(gòu)建體含有與編碼該治療肽的序列可操作地相連的啟動(dòng)子或其它表達(dá)調(diào)控序列以啟動(dòng)該治療肽在體內(nèi)的表達(dá)。在一種變化中，該核酸包裹在脂質(zhì)體中。在另一變化中，該核酸是諸如逆轉(zhuǎn)錄病毒，腺病毒，腺伴隨病毒，痘苗病毒，皰疹病毒的病毒載體，或者開發(fā)用于哺乳動(dòng)物基因治療方案的其它載體。舉例性的治療方法包括給患者施用含有基因治療構(gòu)建體的藥用組合物的步驟，或者離體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染細(xì)胞并將轉(zhuǎn)化細(xì)胞導(dǎo)入患者的步驟。同樣，檢測細(xì)胞或組織的Flt4表達(dá)可使用在Northern雜交或在原位雜交試驗(yàn)中與Flt4 mRNA序列特異性雜交的多核苷酸探針；或者通過進(jìn)行定量PCR或測量樣品中的Flt4 mRNA的其它技術(shù)進(jìn)行。
本發(fā)明的其它特征和變化對本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言從包括詳細(xì)描述的本申請的整體內(nèi)容將是顯而易見的，且所有這些特征打算作為本發(fā)明的方面。同樣，本文描述的本發(fā)明的特征可再組合進(jìn)也打算作為本發(fā)明的方面的其它實(shí)施方案中，而不管該特征的組合是否作為本發(fā)明的方面或?qū)嵤┓桨冈谏衔谋痪唧w提及。另外，只有在本文中作為本發(fā)明的關(guān)鍵被描述的該限定特征可照此被考慮；不含在本文中未作為關(guān)鍵被描述的限定特征的本發(fā)明的變化打算作為本發(fā)明的方面。
除了前面所述，作為另一方面，本發(fā)明包括以任何方式比上文具體提及的變化范圍更窄的本發(fā)明的所有實(shí)施方案。盡管申請人發(fā)明了所附權(quán)利要求書的全部范圍，但是所附權(quán)利要求書并不打算將他人的現(xiàn)有技術(shù)成果包含在其范圍內(nèi)。因此，在專利局或其它實(shí)體或個(gè)人提醒申請人在某權(quán)利要求的范圍內(nèi)包含法定現(xiàn)有技術(shù)的情況時(shí)，申請人保留按適用的專利法行使修改權(quán)利的權(quán)利以重新限定該權(quán)利要求的主題實(shí)體以便明確排除該權(quán)利要求范圍中的該法定現(xiàn)有技術(shù)或法定現(xiàn)有技術(shù)的顯而易見的變化。以該所附權(quán)利要求書限定的本發(fā)明的變化也打算作為本發(fā)明的方面。
附圖的簡要描述

圖1A是Flt4 cDNA克隆結(jié)構(gòu)的圖解描述；圖1B是Northern雜交凝膠的照片復(fù)印件；圖2A-F提供了Flt4的結(jié)構(gòu)特征的圖解描述和與Flt1酪氨酸激酶序列的比較；圖3A是克隆J.1.1和I.1.1的cDNA插入片斷3’端的圖解描述；圖3B是用反義RNA探針與Flt4 RNA的長鏈和短鏈形式雜交的放射自顯影照片的復(fù)印件；圖3C是用反義RNA探針與Flt4 RNA的長鏈和短鏈形式雜交的放射自顯影照片的復(fù)印件；圖4是顯示來自不同物種的DNA樣品中Flt4序列的雜交分析的凝膠照片復(fù)印件；圖5A-5H顯示了在管內(nèi)癌中表達(dá)VEGFR-3的血管的免疫組織化學(xué)鑒定。在相鄰切片(圖5A，B)中，VEGFR-3和PAL-E圍繞充滿癌細(xì)胞的導(dǎo)管裝飾成相似形式的“項(xiàng)鏈”血管(箭頭)。比較了染色VEGFR-3(圖5C)，層粘連蛋白(圖5D)，膠原蛋白XVIII(圖5E)和SMA(圖5F)的另一組相鄰切片。雙染色PAL-E和VEGFR-3(圖5G)并與僅染色VEGFR-3的相鄰切片(圖5H)進(jìn)行比較。與病變導(dǎo)管相鄰的血管為雙陽性(箭頭)，而VEGFR-3陽性血管存在于導(dǎo)管間的基質(zhì)中離病變導(dǎo)管近距離處(箭頭)。注意基底層在雙染色操作中為PAL-E陽性。放大倍數(shù)圖5A，B為400倍。圖5C，D，E，F(xiàn)為320倍。圖5E，F(xiàn)為480倍。
詳細(xì)描述下面描述了稱為Flt4的新受體酪氨酸激酶的克隆，測序和表達(dá)。Flt4基因定位于5q35染色體區(qū)域上，其中許多生長因子和生長因子受體位于該區(qū)域。Flt4的胞外域由包括12個(gè)潛在的糖基化位點(diǎn)的7個(gè)免疫球蛋白樣環(huán)組成。根據(jù)結(jié)構(gòu)相似性，F(xiàn)lt4和以前已知的Flt1和KDR/FLK1受體組成一個(gè)III型酪氨酸激酶的亞家族。Flt4基因表達(dá)為5.8kb和4.5kb的mRNAs，發(fā)現(xiàn)其區(qū)別在于它們的3’端序列且在HEL和DAMI白血病細(xì)胞中差別表達(dá)。
Wilm′s腫瘤細(xì)胞系，成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤細(xì)胞系，和未分化的畸胎癌細(xì)胞系表達(dá)Flt4；而分化的畸胎癌細(xì)胞為陰性。大多數(shù)胎兒組織也表達(dá)Flt4 mRNA，其中脾，腦中間帶和肺顯示出最高水平。在成人組織中，以表達(dá)依次下降的順序在胎盤，肺，腎，心臟和肝臟中發(fā)現(xiàn)最高的表達(dá)水平。在原位雜交中，F(xiàn)lt4放射自顯影顆粒點(diǎn)綴在胎兒肺的內(nèi)皮細(xì)胞上。胎兒組織中Flt4的免疫組織化學(xué)染色證實(shí)了內(nèi)皮細(xì)胞的染色。與Flt1和KDR比較Flt4的表達(dá)方式在18周大的人胎兒組織中區(qū)別極大。參見Kaipainen等，J.Exp.Med.，1782077(1993)。
按實(shí)施例4和11所述已產(chǎn)生了含有Flt4 cDNA的表達(dá)載體并在COS和NIH3T3細(xì)胞中表達(dá)。
本發(fā)明的Flt4 DNAs和多肽可用于純化Flt4配體，和調(diào)節(jié)各種器官中內(nèi)皮細(xì)胞的生長和分化?？勺C實(shí)它們在某些疾病的診斷/治療中也是有價(jià)值的。
在下面的描述中，在重組DNA(rDNA)技術(shù)中使用的許多術(shù)語是廣泛使用的。為了提供對說明書和權(quán)利要求書，包括對該術(shù)語給定的范圍的清楚和一致的理解，提供了下列定義。
基因.含有RNA聚合酶模板的DNA序列。從基因轉(zhuǎn)錄的RNA可編碼或者不編碼蛋白質(zhì)。編碼蛋白質(zhì)的RNA稱為信使RNA(mRNA)，且在真核生物中，它由RNA聚合酶II轉(zhuǎn)錄。然而，構(gòu)建含有可轉(zhuǎn)錄RNA序列的RNA聚合酶II模板的基因也是已知的，該模板具有與特定mRNA互補(bǔ)的序列，但一般不翻譯。該基因構(gòu)建體本文稱為“反義RNA基因”且該RNA轉(zhuǎn)錄子稱為“反義RNA”。反義RNA一般不能翻譯，因?yàn)樵诜戳xRNA序列中存在翻譯終止密碼子。
“互補(bǔ)DNA”或“cDNA”基因包括通過逆轉(zhuǎn)錄不含插入序列(內(nèi)含子)的mRNA合成的重組基因。
克隆載體.它是一種質(zhì)粒或噬菌體DNA或其它DNA序列，能在宿主細(xì)胞中自主復(fù)制，且其特征在于有一個(gè)或少數(shù)核酸內(nèi)切酶識別位點(diǎn)，可在該位點(diǎn)以可確定的方式切割該DNA序列而不喪失該載體的基本生物學(xué)功能，且可將DNA剪接進(jìn)該位點(diǎn)以便使其復(fù)制和克隆。該克隆載體可進(jìn)一步含有適用于鑒定該克隆載體轉(zhuǎn)化的細(xì)胞的標(biāo)記。例如，該標(biāo)記可以是四環(huán)素抗性或氨芐青霉素抗性。術(shù)語“載體”有時(shí)用于表示“克隆載體”。
表達(dá)載體.它是相似于克隆載體且在轉(zhuǎn)化進(jìn)宿主后能夠表達(dá)克隆進(jìn)其中的基因的載體?？寺〉幕蛲ǔＶ糜谥T如啟動(dòng)子序列的某些調(diào)控序列的控制下(即，可操作地相連)。表達(dá)調(diào)控序列可根據(jù)該載體設(shè)計(jì)成在原核還是在真核宿主中表達(dá)可操作相連的基因而變化，且還可含有轉(zhuǎn)錄元件，例如增強(qiáng)子元件，終止序列，組織特異性元件，和/或翻譯起始和終止位點(diǎn)。
本發(fā)明涉及重組Flt4蛋白質(zhì)(短鏈和長鏈形式)的表達(dá)和這些蛋白質(zhì)的功能衍生物。
功能衍生物.Flt4蛋白的“功能衍生物”是具有生物學(xué)活性(功能或者結(jié)構(gòu))基本上相似于非重組Flt4蛋白的生物學(xué)活性的蛋白質(zhì)。Flt4蛋白的功能衍生物可含有或者不含諸如共價(jià)連接的糖類的翻譯后修飾，這取決于該修飾對特定功能的效果的必要性。術(shù)語“功能衍生物”打算包括一種分子的“片斷”，“變異體”，“類似物”，和“化學(xué)衍生物”。
如本文所用，一個(gè)分子含有一般不是該分子的一部分的其它化學(xué)半分子時(shí)稱為是另一分子的“化學(xué)衍生物”。該半分子可提高該分子的可溶性，吸收率，生物學(xué)半壽期等。作為替代，該半分子可降低該分子的毒性和消除或減弱該分子的任一不良副作用等。能介導(dǎo)該效果的半分子在Remington′sPharmaceutical Sciences(1980)中公開。將該半分子偶連到某分子上的方法是本領(lǐng)域熟知的。
片斷.諸如Flt4蛋白的分子的“片斷”是指該分子的任一部分，例如肽核心區(qū)，或肽核心區(qū)的變異體。
變異體.諸如Flt4蛋白的分子的“變異體”是指在結(jié)構(gòu)和生物學(xué)活性上基本上相似于整個(gè)分子或其片斷的分子。因此，只要兩個(gè)分子具有相似活性，即使一個(gè)分子的組成或二級，三級，或四級結(jié)構(gòu)與在另一個(gè)中所發(fā)現(xiàn)的不同，或者即使氨基酸殘基的序列不同，它們?nèi)匀豢烧J(rèn)為是本文所用的術(shù)語變異體。
類似物.Flt4蛋白或遺傳序列的“類似物”是指在功能上基本上相似于Flt4蛋白或本文的遺傳序列的蛋白質(zhì)或遺傳序列。
優(yōu)選實(shí)施方案的描述本發(fā)明涉及申請人所稱的“Flt4”，酪氨酸激酶的受體，編碼Flt4的核酸分子(例如，cDNAs，基因組DNAs，RNAs，反義RNAs，等)，從Flt4基因序列及其產(chǎn)物生產(chǎn)Flt4肽或Flt4蛋白質(zhì)，重組Flt4表達(dá)載體，F(xiàn)lt4的類似物和衍生物，以及Flt4和相關(guān)蛋白質(zhì)的診斷和/或治療用途，F(xiàn)lt4配體，F(xiàn)lt4拮抗劑和抗-Flt4抗體。
重組Flt4的生產(chǎn)通過在合適的宿主細(xì)胞中克隆和表達(dá)編碼Flt4的序列或其功能等價(jià)物可生產(chǎn)有生物學(xué)活性的Flt4。
使用重組DNA技術(shù)生產(chǎn)Flt4可分成一步一步的方法進(jìn)行描述(1)分離或產(chǎn)生所需Flt4的編碼序列(基因)；(2)構(gòu)建能夠指導(dǎo)所需Flt4合成的表達(dá)載體；(3)轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化能夠復(fù)制和表達(dá)Flt4基因和/或加工該基因產(chǎn)物以產(chǎn)生所需Flt4的合適宿主細(xì)胞；和(4)鑒定和純化所需的Flt4產(chǎn)物。
Flt4基因的分離或產(chǎn)生Flt4或其功能等價(jià)物的核苷酸編碼序列可用于構(gòu)建能指導(dǎo)所需Flt4產(chǎn)物表達(dá)的重組表達(dá)載體。在本發(fā)明的該方法的實(shí)施中，本文所述的核苷酸序列，或其片斷或功能等價(jià)物可用于產(chǎn)生能指導(dǎo)重組Flt4產(chǎn)物在合適宿主細(xì)胞中表達(dá)的重組分子。編碼Flt4的核苷酸序列可從產(chǎn)生Flt4-樣活性和/或表達(dá)編碼Flt4的mRNA的各種細(xì)胞來源獲得。申請人鑒定了許多Flt4的合適人細(xì)胞來源，包括人胎盤，白血病細(xì)胞和某些腫瘤細(xì)胞系。
從該細(xì)胞來源分離和純化的RNA通過cDNA克隆或者通過基因組克隆可獲得編碼Flt4的序列。例如，F(xiàn)lt4序列可使用本領(lǐng)域熟知的技術(shù)從cDNA或基因組DNA材料通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增?？寺〉腸DNA或基因組文庫可使用本領(lǐng)域熟知的技術(shù)制備且可用與Flt4基因的任一部分基本上互補(bǔ)的核苷酸探針篩選特定的Flt4 DNAs?？蛇x擇全長克隆，即含有所需Flt4的完整編碼區(qū)的那些克隆用于構(gòu)建表達(dá)載體。作為選擇，可使用本領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)通過化學(xué)合成全部或部分合成編碼Flt4的DNAs。由于核苷酸編碼序列的遺傳簡并性，編碼基本上相同或功能上等價(jià)的氨基酸序列的其它DNA序列可用于實(shí)施本發(fā)明的方法。這種Flt4核苷酸序列的改變包括不同核苷酸的缺失，添加或取代，導(dǎo)致該序列編碼相同或功能上等價(jià)的基因產(chǎn)物。該基因產(chǎn)物可在序列內(nèi)含有導(dǎo)致沉默改變的氨基酸殘基的缺失，添加或取代，從而產(chǎn)生有生物學(xué)活性的產(chǎn)物。該氨基酸取代可根據(jù)所涉及的殘基的極性，電荷，可溶性，疏水性，親水性和/或兩親性特性的相似性進(jìn)行。例如，帶負(fù)電荷的氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸；帶正電荷的氨基酸包括賴氨酸和精氨酸；具有相似親水性值的不帶電荷的極性頭部基團(tuán)或非極性頭部基團(tuán)的氨基酸包括下列氨基酸亮氨酸，異亮氨酸，纈氨酸；甘氨酸，丙氨酸；天冬酰胺，谷氨酰胺；絲氨酸，蘇氨酸；苯丙氨酸，酪氨酸。
Flt4表達(dá)載體的構(gòu)建使用該信息，提供了能以合理數(shù)量提供Flt4受體酪氨酸激酶的各種重組DNA載體。編碼具有本文鑒定的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)特征的合成蛋白質(zhì)以及其它來源的同一家族的蛋白質(zhì)的有關(guān)結(jié)構(gòu)的其它重組DNA載體可使用重組DNA技術(shù)的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)從Flt4受體酪氨酸激酶cDNA產(chǎn)生。作為該技術(shù)的一個(gè)例子產(chǎn)生了表達(dá)Flt4受體酪氨酸激酶的轉(zhuǎn)化子(見實(shí)施例3和4)?？墒褂眯掳l(fā)現(xiàn)的序列和結(jié)構(gòu)信息，通過轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞以制備Flt4受體酪氨酸激酶及其各種結(jié)構(gòu)域用于生物學(xué)目的。
表達(dá)Flt4基因產(chǎn)物的轉(zhuǎn)染子或轉(zhuǎn)化子的鑒定含有重組編碼序列且表達(dá)具有生物學(xué)活性的成熟產(chǎn)物的宿主細(xì)胞可通過至少4個(gè)普通方法鑒定(a)DNA-DNA，DNA-RNA或RNA-反義RNA雜交；(b)含有或不含“標(biāo)記”基因功能；(c)通過測量Flt4 mRNA轉(zhuǎn)錄子在宿主細(xì)胞中的表達(dá)評估轉(zhuǎn)錄水平；和(d)通過免疫測定法且最終通過其生物學(xué)活性的測量檢測成熟基因產(chǎn)物。
在第一種方法中，使用含有與Flt4編碼序列同源的核苷酸序列的探針通過DNA-DNA雜交可檢測插入表達(dá)載體中的Flt4編碼序列的存在。
在第二種方法中，可根據(jù)是否存在某些“標(biāo)記”基因功能(例如，胸苷激酶活性，抗生素抗性，氨甲蝶呤抗性，轉(zhuǎn)化表型，在桿狀病毒中的包函體形成，等)鑒定和選擇重組表達(dá)載體/宿主系統(tǒng)。例如，如果Flt4編碼序列插入載體的標(biāo)記基因序列內(nèi)，可通過缺乏標(biāo)記基因功能鑒定含有該編碼序列的重組子。作為選擇，可將標(biāo)記基因與Flt4序列串連置于用于控制Flt4編碼序列表達(dá)的相同或不同啟動(dòng)子的控制下。響應(yīng)誘導(dǎo)或選擇表達(dá)該標(biāo)記表明表達(dá)Flt4編碼序列。
在第三種方法中，F(xiàn)lt4編碼區(qū)的轉(zhuǎn)錄活性可通過雜交試驗(yàn)評估。例如，可分離多聚腺苷化RNA并使用與Flt4編碼序列或其特定部分同源的探針通過Northern印跡進(jìn)行分析。作為選擇，可提取宿主細(xì)胞的總核酸并測定與該探針的雜交。
在第四種方法中，F(xiàn)lt4的表達(dá)可通過免疫學(xué)評估，例如，通過Western印跡，諸如放射免疫沉淀，酶聯(lián)免疫測定等的免疫測定法評估。然而，表達(dá)系統(tǒng)成功的最終檢驗(yàn)包含檢測有生物學(xué)活性的Flt4基因產(chǎn)物。如果該宿主細(xì)胞分泌該基因產(chǎn)物，可測定從培養(yǎng)轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞獲得的無細(xì)胞培養(yǎng)基的Flt4活性。如果該基因產(chǎn)物不分泌，可測定細(xì)胞溶胞產(chǎn)物的該活性。在每種情況下，可使用測量與Flt4結(jié)合的配體或Flt4的其它生物學(xué)活性的測定法。
Flt4的衍生物，類似物和肽與Flt4相關(guān)的衍生物，類似物和肽的生產(chǎn)和使用也是可預(yù)料到的且在本發(fā)明的范圍內(nèi)。根據(jù)具體應(yīng)用，與天然Flt4相比可增強(qiáng)或減小該衍生物，類似物，或肽的生物學(xué)活性。本發(fā)明與Flt4相關(guān)的衍生物，類似物和肽可通過本領(lǐng)域已知的各種方法產(chǎn)生。在遺傳和蛋白質(zhì)水平上的方法和操作也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。可使用本領(lǐng)域標(biāo)準(zhǔn)化的肽合成法獲得Flt4肽。在蛋白質(zhì)水平上，可使用許多化學(xué)修飾法通過本領(lǐng)域已知的技術(shù)產(chǎn)生Flt4-樣衍生物，類似物，或肽，該技術(shù)包括但不限于內(nèi)肽酶(例如，溴化氰，胰蛋白酶，胰凝乳蛋白酶，V8蛋白酶等)或外肽酶的特異性化學(xué)裂解，乙?；柞；?，氧化等。
優(yōu)選的衍生物，類似物，和肽是那些保留Flt4配體結(jié)合活性的衍生物，類似物，和肽。結(jié)合Flt4配體但不轉(zhuǎn)導(dǎo)與其反應(yīng)的信號的那些衍生物，類似物和肽用作Flt4抑制劑。結(jié)合Flt4配體且通過例如，包含細(xì)胞內(nèi)Flt4自身磷酸化的過程轉(zhuǎn)導(dǎo)與其反應(yīng)的信號的那些衍生物，類似物和肽可與天然Flt4以相同的方式使用。用于該結(jié)合和/或自身磷酸化試驗(yàn)的優(yōu)選Flt4配體是含有按本文所述可從PC-3條件培養(yǎng)基分離的大約23kd多肽的配體。命名為血管內(nèi)皮生長因子-C(VEGF-C)的該配體在申請日為1996年8月1日且作為國際公開WO 97/05250公開的PCT專利申請PCT/FI96/00427中，和在其中要求優(yōu)先權(quán)所依據(jù)的美國專利申請優(yōu)先權(quán)文件中已被詳細(xì)鑒定，本文引用所有這些文獻(xiàn)以其整體作為參考。
抗-Flt4抗體識別Flt4或有關(guān)蛋白的多克隆和單克隆抗體的生產(chǎn)也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
可使用本領(lǐng)域已知的各種方法生產(chǎn)抗Flt4表位的多克隆抗體。為了生產(chǎn)抗體，通過注射Flt4或合成Flt4肽可免疫各種宿主動(dòng)物(包括但不限于兔，小鼠，大鼠等)。可使用各種佐劑增強(qiáng)免疫反應(yīng)，依賴于宿主物種，佐劑包括但不限于Freund′s(完全和不完全)佐劑，諸如氫氧化鋁的礦物膠，諸如溶血卵磷脂，多聚醇，聚陰離子，油乳化劑，匙孔帽貝血藍(lán)蛋白，二硝基酚的表面活性物質(zhì)，和諸如BCG(卡介苗)和Corynebacterium parvum的潛在有用的人佐劑。
抗Flt4表位的單克隆抗體可通過使用為在培養(yǎng)物中通過傳代細(xì)胞系生產(chǎn)抗體分子而提供的任一技術(shù)制備。這些技術(shù)包括但不限于最初由Kohler等，Nature，256495-497(1975)描述的雜交瘤技術(shù)，和最近的人B-細(xì)胞雜交瘤技術(shù)[Kosbor等，Immunology Today，472(1983)]和EBV-雜交瘤技術(shù)[Cole等，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy，Alan R Liss，Inc.，第77-96頁(1985)]?？笷lt4的抗體也可從克隆的免疫球蛋白cDNAs在細(xì)菌中生產(chǎn)。使用重組噬菌體抗體系統(tǒng)，可在細(xì)菌培養(yǎng)物中迅速生產(chǎn)和選擇抗體且可遺傳改造其結(jié)構(gòu)。
含有該分子獨(dú)特型的抗體片斷可通過已知技術(shù)產(chǎn)生。例如，該片斷包括但不限于通過胃蛋白酶消化抗體分子產(chǎn)生的F(ab′)2片斷；通過還原F(ab′)2片斷的二硫鍵產(chǎn)生的Fab′片斷，和通過用木瓜蛋白酶和還原劑處理抗體分子產(chǎn)生的兩個(gè)Fab片斷。
抗Flt4的抗體在Flt4多肽的親和純化中和在Flt4生物合成，代謝和功能的解釋中可用于成熟Flt4和Flt4前體和亞組分形式的定性和定量檢測。Flt4酪氨酸激酶活性的檢測可用作生成和放大該試驗(yàn)中的Flt4特異性信號的酶手段?？笷lt4抗體也可用作診斷和治療劑。
Flt4，編碼Flt4的核酸分子和抗-Flt4的抗體的用途申請人預(yù)期本發(fā)明的組合物具有各種廣泛的用途，包括Flt4，F(xiàn)lt4類似物和衍生物，編碼Flt4的核酸分子，反義核酸分子和抗-Flt4抗體的診斷和/或治療用途。
編碼Flt4的核酸分子或其片斷可用作檢測和定量編碼Flt4的mRNAs的探針。利用核酸探針檢測含有全部或部分已知基因序列的序列的試驗(yàn)是本領(lǐng)域熟知的。Flt4 mRNA的水平可表示出現(xiàn)和/或存在瘤形成以及其它人類疾病的發(fā)作和/或進(jìn)行。因此，能檢測和定量Flt4 mRNA的試驗(yàn)提供了有價(jià)值的診斷工具。
反義Flt4 RNA分子在治療上用于抑制編碼Flt4的mRNAs的翻譯，其中治療目的包含需要除去存在的Flt4或者下調(diào)其水平。例如，F(xiàn)lt4反義RNA在治療Flt4與病因相關(guān)，例如由于其過度表達(dá)的疾病中可用作Flt4拮抗劑。
另外，F(xiàn)lt4反義RNAs在解釋Flt4的功能機(jī)制中有用。編碼Flt4的核酸分子可用于按本申請中的單獨(dú)描述生產(chǎn)重組Flt4蛋白和相關(guān)分子。
抗-Flt4抗體可用于診斷和定量各種情況中的Flt4。例如，抗Flt4各種結(jié)構(gòu)域的抗體可用作Flt4免疫測定或Flt4免疫組織化學(xué)評估的基礎(chǔ)。Flt4的酪氨酸激酶活性可用于這些試驗(yàn)中作為酶放大反應(yīng)以產(chǎn)生Flt4信號?？?Flt4抗體也可用于研究細(xì)胞表面的Flt4量。
可生產(chǎn)起Flt4配體興奮劑或拮抗劑作用的抗體，從而使得調(diào)節(jié)Flt4的活性成為可能。另外，可通過合成方法或者從隨機(jī)寡核苷酸通過重組方法產(chǎn)生隨機(jī)肽并借助于Flt4胞外域選擇表現(xiàn)出與Flt4受體特異性結(jié)合的肽。也可使用本領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)方法使用Flt4胞外域從噬菌體展示文庫選擇該肽片斷。該肽可具有對抗或拮抗活性。Flt4抗體也可與各種化合物偶連后提供有價(jià)值的診斷工具用于體內(nèi)造影表達(dá)Flt4的細(xì)胞和組織或者腫瘤。
抗Flt4的單克隆抗體可共價(jià)或者非共價(jià)偶連到合適的超磁性，順磁性，電子密集性，聲波發(fā)生性或放射性試劑上以產(chǎn)生定向造影劑?？捎玫鞍姿饣蚧瘜W(xué)處理產(chǎn)生的抗體片斷或者通過使用單克隆抗體的表位結(jié)合域產(chǎn)生的分子代替完整抗體。然后可將該造影劑用作人體X-射線，磁共振，聲波圖或閃爍圖造影的造影劑用于診斷目的。
Flt4的分子生物學(xué)Flt4 cDNA克隆的完整序列在SEQ ID NOs1和3中描述，依賴于兩者擇一的剪接，伸展長度為4195個(gè)或4795個(gè)核苷酸且含有1298個(gè)或1363個(gè)氨基酸的開放閱讀框。核苷酸和推定的Flt4氨基酸序列(短鏈形式)在SEQ IDNOs1和2中表示。圖2顯示了Flt4氨基酸序列與Flt1酪氨酸激酶氨基酸序列的比較。參見Shibuya等，Oncogene，55 19-524(1990)。
大部分是疏水氨基酸的推定信號肽序列在起始子甲硫氨酸之后。圍繞相應(yīng)ATG的序列與共有翻譯起動(dòng)序列一致[Kozak，Nucl.Acids Res.，158125-8135(1987)]。兩個(gè)Flt4多肽的推定胞外部分均是775個(gè)氨基酸長且含有12個(gè)潛在的天冬酰胺連接的糖基化(NXS/T)位點(diǎn)。它還含有表現(xiàn)出對于免疫球蛋白超家族成員的蛋白質(zhì)所述的間隔方式的一些氨基酸殘基[Williams等，Annu.Rev.Immunol.，6381-405(1988)]。它有12個(gè)半胱氨酸殘基且可組織成7個(gè)免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域。如圖2所示，鑒定了大致如下的7個(gè)免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域Ig-I(SEQ ID NO1，位置158-364；SEQ ID NO2，氨基酸47-115)；Ig-II(SEQ ID NO1，位置479-649；SEQ ID NO2，氨基酸154-210)；Ig-III(SEQ ID NO1，位置761-961；SEQ ID NO2，氨基酸248-314)；Ig-IV(SEQ ID NO1，位置1070-1228；SEQ ID NO2，氨基酸351-403)；Ig-V(SEQ ID NO1，位置1340-1633；SEQ ID NO2，氨基酸441-538)；Ig-VI(SEQ ID NO1，位置1739-1990；SEQ ID NO2，氨基酸574-657)；和Ig-VII(SEQ ID NO1，位置2102-2275；SEQ ID NO2，氨基酸695-752)。推定的Ig-樣結(jié)構(gòu)域IV缺少半胱氨酸殘基。圖2還顯示了Flt1胞外域(SEQ.ID No.5)，它是與Flt4最近的人類同源物。從該附圖可見Ig-樣區(qū)域的半胱氨酸殘基對比和極相似的組成。
Flt4的胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域通過23個(gè)疏水氨基酸殘基的推定跨膜區(qū)與胞外部分分開。該序列在胞質(zhì)側(cè)的側(cè)翼是一個(gè)堿性區(qū)域，認(rèn)為它是跨膜與胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域之間的連接點(diǎn)。酪氨酸激酶同源性結(jié)構(gòu)域在殘基843處開始且包含一個(gè)ATP-結(jié)合口袋和在Y1068處與c-src的Y416同源的推定自身磷酸化位點(diǎn)(圖2)。Flt4的酪氨酸激酶催化結(jié)構(gòu)域由一個(gè)大部分疏水且顯示出與Flt1無同源性的65個(gè)氨基酸的序列(氨基酸944-1008)分成兩個(gè)亞結(jié)構(gòu)域。與Flt1不同，F(xiàn)lt4在其激酶插入片斷中不含酪氨酸殘基。
Flt4 mRNA的第二種形式具有編碼Flt4蛋白長鏈形式的擇一3’端。
在圖3A-C中，表示了通過擇一的剪接產(chǎn)生Flt4 mRNA的短鏈和長鏈形式。圖3A顯示了克隆J.1.1和I.1.1的cDNA插入片斷3’端的結(jié)構(gòu)示意圖。表示了克隆J.1.1的TAG終止密碼子以及多聚腺苷化位點(diǎn)(poly A)。克隆I.1.1與克隆J.1.1的區(qū)別在于陰影片斷(分別是Flt4 mRNA的長鏈和短鏈形式)。TAA和polyA表示克隆I.1.1的終止密碼子和多聚腺苷化位點(diǎn)。另外，表示了EcoRI和Aval的限制性核酸內(nèi)切酶的裂解位點(diǎn)。用于cRNA保護(hù)分析的克隆I.1.1的256bp EcoRl-AvaI插入片斷在下面表示。陰影最重的片斷表示用于體外轉(zhuǎn)錄反義鏈的線型化有義RNA模板上的多接頭序列。還顯示了RNAse保護(hù)分析后保護(hù)片斷的結(jié)構(gòu)示意圖。圖3B和3C顯示了256bp35S-標(biāo)記的反義RNA探針的放射自顯影圖，且211和124bp的消化片斷表示從所示細(xì)胞系(Tera-2是畸胎癌細(xì)胞系，這里用視黃酸(RA)處理10天或不處理進(jìn)行分析)通過多聚腺苷化RNA保護(hù)的Flt4 RNA的短鏈和長鏈形式。陰性對照泳道表示了用轉(zhuǎn)移RNA保護(hù)的結(jié)果。注意到Tera-2細(xì)胞分化期間Flt4mRNAs的減量調(diào)節(jié)。克隆13的Tera-2細(xì)胞由Dr.C.F.Graham(英國牛津大學(xué)動(dòng)物學(xué)系)提供。傳代18-40代的細(xì)胞用于該試驗(yàn)。細(xì)胞在補(bǔ)充了10％胎牛血清和抗生素的Eagle′s極限必需培養(yǎng)基(MEM)中維持。為了誘導(dǎo)分化，將細(xì)胞以1.5×103個(gè)細(xì)胞/cm2的密度涂布在明膠覆蓋的組織培養(yǎng)級平皿上。第二天向培養(yǎng)基中加入2×10-6M的RA。在RA存在下培養(yǎng)細(xì)胞達(dá)10天。
圖3A-C中所示的結(jié)果表示了由擇一的剪接產(chǎn)生的這兩個(gè)Flt4(短鏈和長鏈)形式的羧基末端的產(chǎn)生。
根據(jù)其推定的氨基酸序列，F(xiàn)lt4屬于III型RTKs。更具體的說，F(xiàn)lt4屬于RTKs超家族，在其胞外部分含有7個(gè)Ig-環(huán)，因此它與含有5個(gè)Ig-環(huán)的III型RTKs的其它成員不同。Flt4與從人基因組DNA文庫作為v-ros-相關(guān)性DNA克隆的FLT家族的原型受體，即Flt1[Shibuya等，Oncogene，5519-524(1990)]和從小鼠肝臟造血干細(xì)胞富集區(qū)克隆的小鼠FLK1受體[Matthews等，Cell，651143-1152(1991)；Matthews等，Proc.Natl.Acad. Sci.USA，889026-9030(1991)]具有最近的同源性。Flt4的胞外域與人Flt1和小鼠FLK1分別顯示出33％和37％的氨基酸序列相同性。Flt1和FLK1與Flt4一樣在諸如肺，心臟和腎的各種正常組織中廣泛表達(dá)。另外，最近鑒定的人內(nèi)皮細(xì)胞受體酪氨酸激酶KDR[Terman等，Oncogene，61677-1683(1991)]與Flt4和Flt1家族成員表現(xiàn)出顯著的同源性。從可得到的序列資料可計(jì)算出KDR與Flt4在酪氨酸激酶(TK)結(jié)構(gòu)域具有81％的相同性。另外，KDR的胞外域也具有7個(gè)Ig-環(huán)結(jié)構(gòu)且其TK1和TK2結(jié)構(gòu)域與小鼠FLK1受體的相應(yīng)結(jié)構(gòu)域具有95％和97％的相同性。這表明KDR是小鼠FLK1的人類同源物。
盡管Flt4 TK結(jié)構(gòu)域與Flt1和FLK1/KDR的TK結(jié)構(gòu)域具有大約80％的相同性，但是它與III型RTK的其它受體的TK結(jié)構(gòu)域僅具有大約60％的相同性。由于這些其它受體在胞外區(qū)還僅具有5個(gè)Ig-樣結(jié)構(gòu)域，因此可將Flt4，F(xiàn)lt1和FLK1/KDR分類進(jìn)III型RTKs內(nèi)的一個(gè)獨(dú)立的FLT亞家族中。
在PDGFRs，c-fms和c-kit的激酶插入片斷中位于序列D/E-D/E-y-M/V-P/D/E-M[Cantley，等，Cell，64281-302(1991)](SEQ.ID NO.6)中的酪氨酸殘基是自身磷酸化位點(diǎn)，當(dāng)磷酸化時(shí)，它結(jié)合磷脂酰肌醇3’-激酶(PI-3K)的SH2結(jié)構(gòu)域[Reedijk等，EMBO J.，111365-1372(1992)]。令人感興趣的是，與這些III型RTKs不同，F(xiàn)LT亞家族的成員或Flt3/FLK2受體不含該共有基序。
8個(gè)人III型RTK基因聚集在3個(gè)不同染色體上。4號染色體上含有c-kit，PDGFR-α和KDR基因[Yarden等，EMBO J.，63341-3351(1987)；Stenman等，Genes，Chromosomes，Cancer，1155-158(1989)；Terman等，Oncogene，61677-1683(1991)]。Flt1和Flt3基因位于染色體13q12上[Satoh等，Jpn.J.Cancer Res.，78772-775(1987)；Rosnet等，Genomics，9380-385(1991)]，而Flt4位于5號染色體的q35帶上[Aprelikova等，Cancer Res.，52746-748(1992)]；靠近fms和PDGFR-β基因[Warrington等，Genomics，11701-708(1991)]。在白血病細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)5號染色體的長臂上包含易位。在患有頑固貧血癥和大紅細(xì)胞癥的患者骨髓細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)5號染色體的長臂部分缺失[VanDen Berghe等，Nature，251437-439(1974)]。在一些其它骨髓增生性疾病，例如具有過量胚細(xì)胞的頑固性貧血癥[Swolin等，Blood，58986-993(1981)]，原因不明的骨髓組織轉(zhuǎn)化[Whang-Peng等，Leuk.Res.，241-48(1978)]，慢性骨髓白血病[Tomiyasu等，Cancer Genet.Cytogenet.，2309-315(1980)]，真性紅細(xì)胞增多癥[Van Den Berghe等，Cancer Genet.Cytogenet.，1157-162(1979)]和原發(fā)性血小板增多[Nowell等，Cancer，422254-2260(1978)]中發(fā)現(xiàn)畸形5q染色體。
關(guān)于Flt4 mRNA表達(dá)的發(fā)現(xiàn)表明其蛋白質(zhì)產(chǎn)物對于某些白血病細(xì)胞是特征性的。已表明存在一些在成巨核細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞之間共有的鑒別抗原，一個(gè)例子是血小板糖蛋白IIIa[Ylanne等，Blood，721478-1486(1988)；Kieffer等，Blood，721209-1215(1988)；Berridge等，Blood，6676-85(1985)]。另外，某些內(nèi)皮細(xì)胞，例如胎兒時(shí)期肺和腎的內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)Flt4。
為了進(jìn)一步了解發(fā)育期間Flt4的作用，克隆了小鼠Flt4的部分cDNAs。在原位雜交中使用這些探針分析了小鼠發(fā)育期間Flt4 mRNA的表達(dá)。確定了在血管發(fā)生和淋巴系統(tǒng)的血管生成期間表達(dá)Flt4。在正常和病理成人組織中也證實(shí)了這些發(fā)現(xiàn)的相關(guān)性，因?yàn)樵谡：筒±韺W(xué)條件下在成人組織的淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞中，以及在一些毛細(xì)血管后微靜脈(HEVs)中都發(fā)現(xiàn)了Flt4。
小鼠Flt4 cDNA片段的克隆顯示了其推定的氨基酸序列與相應(yīng)的人序列幾乎相同(在研究的兩個(gè)片段中有大約96％的氨基酸相同性)。小鼠Flt4cDNA相同性的進(jìn)一步證據(jù)從Northern雜交試驗(yàn)獲得，其中來自兩物種的探針都從小鼠組織產(chǎn)生典型的5.8kb mRNA信號。對從成年小鼠各種組織分離的RNA進(jìn)行的分析表明在肝，肺，心，脾和腎中表達(dá)Flt4，在腦和睪丸中沒有或有極少的雜交。這種表達(dá)方式類似于由Galland等，Oncogene，81233(1993)早期報(bào)道的方式。Rnase保護(hù)的結(jié)果表明在小鼠發(fā)育期間從交配后8.5天的胚胎開始需要Flt4基因，且相對表達(dá)水平似乎十分穩(wěn)定。
對于原位雜交，選擇編碼胞外域序列的小鼠Flt4 cDNA的兩個(gè)片段。這樣允許清楚地區(qū)分相關(guān)FLK-1的雜交模式與Flt1受體模式，F(xiàn)lt1與Flt4在胞外區(qū)僅顯示出極低程度的序列相同性。參見Millauer等，Cell，72835(1993)；Yamaguchi等，Development，118489(1993)；Peters等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，908915(1993)；Finnerty等，Oncogene，82293(1993)。
與FLK-1，F(xiàn)lt1，Tie和Tek內(nèi)皮受體酪氨酸激酶基因相似，F(xiàn)lt4在交配后(p.c.)7.5天的胚胎中不表達(dá)。在交配后8.5天的胚胎中，有強(qiáng)烈的Flt4信號位于尿囊，頭間充質(zhì)的成血管細(xì)胞，背主動(dòng)脈，和主靜脈中。在心內(nèi)膜中可見微弱的信號。相反，卵黃囊的成血管細(xì)胞為陰性，與FLK-1和Flt1，Tie和Tek不同。參見Korhonen等，Oncogene，8395(1993)；和Peters等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，908915(1993)。Flt4的表達(dá)局限于靜脈系統(tǒng)在11.5天的小鼠胚胎樣品中甚至更清楚，而Tie mRNA還在動(dòng)脈中表達(dá)。在交配后12.5天的胚胎中，F(xiàn)lt4信號點(diǎn)綴發(fā)育中的靜脈和推定的淋巴管內(nèi)皮，但與內(nèi)皮Tie受體酪氨酸激酶不同，動(dòng)脈內(nèi)皮為陰性。在發(fā)育的晚期，F(xiàn)lt4 mRNA變得局限在無血細(xì)胞的血管叢，該血管叢代表發(fā)育中的淋巴管。在成人組織中只有淋巴管內(nèi)皮和一些毛細(xì)血管后微靜脈表達(dá)Flt4 mRNA。在淋巴竇和毛細(xì)血管后微靜脈，轉(zhuǎn)移性淋巴結(jié)，和在淋巴管瘤中出現(xiàn)表達(dá)增強(qiáng)。
由于解釋來自小鼠胚胎的資料存在困難，因此研究了人內(nèi)皮，因?yàn)槿祟惖牧馨拖到y(tǒng)更明確。另外，可在細(xì)胞培養(yǎng)物中研究從各種內(nèi)皮建立的細(xì)胞以觀察在體外條件下是否保持Flt4表達(dá)的特異性。已知內(nèi)皮細(xì)胞系在體外培養(yǎng)時(shí)喪失分化特征。因此，不能不預(yù)期它們?yōu)镕lt4 mRNA陰性。培養(yǎng)的主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞也不含F(xiàn)lt4 mRNA。然而，從微血管系統(tǒng)和從股靜脈和臍靜脈生長的人內(nèi)皮細(xì)胞中可獲得信號。因此，在細(xì)胞培養(yǎng)物中保留了至少一些Flt4表達(dá)特異性。
成人組織的原位雜交分析證實(shí)了在發(fā)育中的小鼠胚胎中觀察到的Flt4局限于淋巴系統(tǒng)的結(jié)果。在淋巴管內(nèi)皮和在人淋巴結(jié)竇中可見Flt4的表達(dá)。令人感興趣的是，具有立方內(nèi)皮，顯示出運(yùn)輸白細(xì)胞到淋巴結(jié)功能的一些HEVs也呈Flt4-陽性。另外，平行雜交分析表明與正常淋巴結(jié)相比在轉(zhuǎn)移癌的這些結(jié)構(gòu)中Flt4 mRNA水平增強(qiáng)。在淋巴管瘤中Flt4也極顯著，淋巴管瘤是由結(jié)締組織基質(zhì)和生長的有內(nèi)皮襯里的淋巴導(dǎo)管組成的良性腫瘤。Flt4mRNA局限在這些腫瘤的淋巴管內(nèi)皮上且在其動(dòng)脈，靜脈和毛細(xì)血管中不存在。在人肺中，淋巴管結(jié)構(gòu)是鑒定的唯一Flt4-陽性管。
上述結(jié)果表明Flt4是成人組織中的淋巴管和一些毛細(xì)血管后微靜脈的新標(biāo)記。該結(jié)果也支持了關(guān)于淋巴管的靜脈起源的理論。Flt4作為一種生長因子受體可參與這些血管的分化和功能。Flt4通過Flt4的配體，即VEGF-C介導(dǎo)的生物學(xué)效應(yīng)的詳細(xì)鑒定在申請日為1996年8月1日且作為國際公開號WO97/05250被公開的PCT專利申請PCT/FI96/00427中提供。
這些結(jié)果與根據(jù)本發(fā)明的Flt4-結(jié)合化合物結(jié)合允許選擇性地標(biāo)記淋巴管內(nèi)皮，特別是通過使用與放射性，電子密集性或其它可見的報(bào)道物質(zhì)偶連的本發(fā)明的抗體進(jìn)行標(biāo)記?？蓪⒑蠪lt4受體內(nèi)化誘導(dǎo)型單克隆抗體或配體的物質(zhì)注射進(jìn)淋巴系統(tǒng)，從而將預(yù)定的分子轉(zhuǎn)運(yùn)到淋巴管內(nèi)皮。也可使用根據(jù)本發(fā)明的Flt4-結(jié)合化合物檢測毛細(xì)血管后微靜脈，特別是表達(dá)Flt4受體的水平增強(qiáng)的活化HEVs。根據(jù)我們的了解，目前還沒有這樣的特異性標(biāo)記可用于淋巴管內(nèi)皮。
基因治療本發(fā)明還涉及基因治療方法。具體地說，可將癌癥細(xì)胞的血管系統(tǒng)或者癌細(xì)胞本身與能夠給該細(xì)胞的血管系統(tǒng)提供諸如本發(fā)明的可溶性VEGFR-3片段的治療肽的表達(dá)構(gòu)建體以達(dá)到治療效果的方式接觸。該治療效果可以是，例如，在腫瘤血管系統(tǒng)中抑制VEGFR-3，抑制血管生成，抑制淋巴管生成，消除，消退或者抑制腫瘤生長，誘導(dǎo)腫瘤或甚至腫瘤細(xì)胞本身的血管或淋巴管系統(tǒng)的編程性細(xì)胞死亡。
對于這些實(shí)施方案，舉例性的表達(dá)構(gòu)建體包含病毒或從病毒基因組產(chǎn)生的改造構(gòu)建體。該表達(dá)構(gòu)建體一般包含編碼待表達(dá)的基因的核酸且還含有在給藥到其上的細(xì)胞中引起該基因表達(dá)的其它調(diào)控區(qū)。該調(diào)控區(qū)包括，例如，啟動(dòng)子，增強(qiáng)子，多聚腺苷化信號等。
現(xiàn)在普遍認(rèn)識到可使用各種病毒載體將DNA導(dǎo)入細(xì)胞中。在該實(shí)施方案中，包括含有目的基因的病毒載體的表達(dá)構(gòu)建體可以是腺病毒(參見例如，美國專利號5,824,544；美國專利號5,707,618；美國專利號5,693,509；美國專利號5,670,488；美國專利號5,585,362；分別在本文中引用以供參考)，逆轉(zhuǎn)錄病毒(參見例如，美國專利號5,888,502；美國專利號5,830,725；美國專利號5,770,414；美國專利號5,686,278；美國專利號4,861,719，分別在本文中引用以供參考)，腺伴隨病毒(參見例如，美國專利號5,474,935；美國專利號5,139,941；美國專利號5,622,856；美國專利號5,658,776；美國專利號5,773,289；美國專利號5,789,390；美國專利號5,834,441；美國專利號5,863,541；美國專利號5,851,521；美國專利號5,252,479，分別在本文中引用以供參考)，腺病毒-腺伴隨病毒雜合體(參見例如，美國專利號5,856,152，本文引用以供參考)或痘苗病毒或皰疹病毒(參見例如，美國專利號5,879,934；美國專利號5,849,571；美國專利號5,830,727；美國專利號5,661,033；美國專利號5,328,688，分別在本文中引用以供參考)載體。
在其它實(shí)施方案中，包含非病毒傳遞。它們包括磷酸鈣沉淀(Graham和Van Der Eb，Virology，52456-467，1973；Chen和Okayama，Mol.Cell Biol.，72745-2752，1987；Rippe等，Mol.Cell Biol.，10689-695，1990)，DEAE-葡聚糖(Gopal，Mol.Cell Biol.，51188-1190，1985)，電穿孔(Tur-Kaspa等，Mol.CellBiol.，6716-718，1986；Potter等，Proc.Nat.Acad.Sci.USA，817161-7165，1984)，直接顯微注射(Harland和Weintraub，J.Cell Biol.，1011094-1099，1985)，DNA-裝載的脂質(zhì)體(Nicolau和Sene，Biochim.Biophys.Acta，721185-190，1982；Fraley等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，763348-3352，1979；Felgner，Sci Am.276(6)102-6，1997；Felgner，Hum Gene Ther.7(15)1791-3，1996)，細(xì)胞超聲處理(Fechheimer等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，848463-8467，1987)，使用高速微粒的基因轟擊(Yang等，Proc.Natl.Acad.SciUSA，879568-9572，1990)，和受體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染(Wu和Wu，J.Biol.Chem.，2624429-4432，1987；Wu和Wu，Biochemistry，27887-892，1988；Wu和Wu，Adv.Drug Delivery Rev.，12159-167，1993)。
在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案中，表達(dá)構(gòu)建體(或甚至上述的肽)可包埋在脂質(zhì)體中。脂質(zhì)體是以磷脂雙層膜和內(nèi)部的水介質(zhì)為特征的囊狀結(jié)構(gòu)。多層脂質(zhì)體具有被水介質(zhì)分開的多個(gè)脂層。它們在將磷脂懸浮于過量水溶液中時(shí)自發(fā)形成。脂類成份在形成密閉結(jié)構(gòu)前進(jìn)行自我重排并在脂雙層之間包埋水和溶解的溶質(zhì)(Ghosh和Bachhawat，見Liver diseases，targeted diagnosisand therapy using specific receptors and ligands，Wu G，Wu C編，紐約MarcelDekker，第87-104頁，1991)。將DNA加入陽離子脂質(zhì)體中引起從脂質(zhì)體向光學(xué)雙折射的液晶壓縮球體的拓?fù)鋵W(xué)轉(zhuǎn)變(Radler等，Science，275(5301)810-4，1997)。這些DNA-脂類復(fù)合物是用于基因治療和傳遞的潛在非病毒載體。
脂質(zhì)體介導(dǎo)的核酸傳遞和外源性DNA的體外表達(dá)已經(jīng)非常成功。本發(fā)明還包含涉及“脂轉(zhuǎn)染”技術(shù)的各種商業(yè)方法。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，該脂質(zhì)體可與血凝病毒(HVJ)復(fù)合。已經(jīng)表明這樣有利于與細(xì)胞膜的融合且促進(jìn)脂質(zhì)體包裹的DNA進(jìn)入細(xì)胞(Kaneda等，Science，243375-378，1989)。在其它實(shí)施方案中，脂質(zhì)體可與核內(nèi)非組蛋白的染色體蛋白質(zhì)(HMG-1)復(fù)合或連接使用(Kato等，J.Biol.Chem.，2663361-3364，1991)。在另一實(shí)施方案中，該脂質(zhì)體可與HVJ和HMG-1兩者復(fù)合或連接使用。鑒于該表達(dá)構(gòu)建體已經(jīng)成功用于體外和體內(nèi)轉(zhuǎn)移和表達(dá)核酸，因此它們可適用于本發(fā)明。
可用于將編碼治療基因的核酸傳遞進(jìn)細(xì)胞的其它載體傳遞系統(tǒng)包括受體介導(dǎo)的傳遞載體。它們利用了在幾乎所有的真核細(xì)胞中通過受體介導(dǎo)的胞吞選擇性攝取大分子。由于各種受體的細(xì)胞類型特異性分布，該傳遞可具有高度特異性(Wu和Wu，1993，出處同上)。
受體介導(dǎo)的基因定向載體一般由兩種成份組成細(xì)胞受體特異性配體和DNA結(jié)合試劑。一些配體已被用于受體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移。最廣泛鑒定的配體是脫唾液酸血清類粘蛋白(ASOR)(Wu和Wu，1987，出處同上)和轉(zhuǎn)鐵蛋白(Wagner等，Proc.Nat′l.Acad Sci.USA，87(9)3410-3414，1990)。最近，識別與ASOR相同的受體的合成新生糖蛋白已被用作基因傳遞載體(Ferkol等，F(xiàn)ASEB J.，71081-1091，1993；Perales等，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA 914086-4090，1994)且表皮生長因子(EGF)也被用于將基因傳遞給鱗狀癌細(xì)胞(Myers，EPO 0273085)。
在其它實(shí)施方案中，傳遞載體可包含配體和脂質(zhì)體。例如，Nicolau等(Methods Enzymol.，149157-176，1987)采用乳糖苷神經(jīng)酰胺，半乳糖末端的脫唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂摻入脂質(zhì)體中并觀察到胰島素基因的肝細(xì)胞吸收增加。因此，可行的是通過含有或不含脂質(zhì)體的各種受體-配體系統(tǒng)也可將編碼治療基因的核酸特異性地傳遞進(jìn)特定細(xì)胞類型中。
在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，表達(dá)構(gòu)建體可簡單地由裸露的重組DNA或質(zhì)粒組成。構(gòu)建體的轉(zhuǎn)移可通過上文提及的物理或化學(xué)穿透細(xì)胞膜的任一方法進(jìn)行。它特別適用于體外轉(zhuǎn)移，然而，它也可適合于體內(nèi)使用。Dubensky等(Proc.Nat.Acad.Sci.USA，817529-7533，1984)成功地將CaPO4沉淀形式的多瘤病毒DNA注射進(jìn)成年和新生小鼠的肝臟和脾，證實(shí)了活躍的病毒復(fù)制和急性感染。Benvenisty和Neshif(Proc.Nat.Acad.Sci.USA，839551-9555，1986)也證實(shí)了直接腹膜內(nèi)注射CaPO4沉淀的質(zhì)粒導(dǎo)致轉(zhuǎn)染基因的表達(dá)。
用于將裸露的DNA表達(dá)構(gòu)建體轉(zhuǎn)移進(jìn)細(xì)胞的本發(fā)明的另一實(shí)施方案可包含粒子轟擊。該方法依賴于將DNA包裹的微粒加速到允許它們穿透細(xì)胞膜并進(jìn)入細(xì)胞而不殺死它們的高速度的能力(Klein等，Nature，32770-73，1987)。已經(jīng)開發(fā)了一些用于加速小粒子的裝置。一種該裝置依賴于高壓放電產(chǎn)生電流，該電流再提供動(dòng)力(Yang等，Proc.Natl.Acad.Sci USA，879568-9572，1990)。所用的微粒由諸如鎢或金珠的生物學(xué)惰性物質(zhì)組成。
本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知如何將基因傳遞應(yīng)用到體內(nèi)和離體情況中。對于病毒載體，一般會制備病毒載體原種。依賴于病毒的類型和可達(dá)到的效價(jià)，可給患者傳遞1×104，1×105，1×106，1×107，1×108，1×109，1×1010，1×1011或1×1012個(gè)感染性顆粒。對于脂質(zhì)體或其它非病毒配制品通過比較相對吸收效率可推斷出相似的數(shù)值。作為藥用上可接受的組合物的配制品在下文中描述。
可考慮各種傳遞途徑用于各種腫瘤類型。下面關(guān)于傳遞途徑的部分包含廣泛列舉的可能途徑。對于幾乎任何腫瘤，可考慮全身性傳遞。這證實(shí)對于攻擊微觀的或轉(zhuǎn)移性癌癥特別重要。如果可鑒定分散的腫瘤塊，可采用各種直接的，局部性和區(qū)域性方法。例如，可用表達(dá)載體或蛋白質(zhì)直接注射腫瘤。在切除術(shù)之前，期間或之后可處理腫瘤基底層。切除術(shù)之后，一般通過在手術(shù)后的位置留下的導(dǎo)管傳遞該載體?？衫媚[瘤血管系統(tǒng)通過注射支持靜脈或動(dòng)脈將該載體導(dǎo)入腫瘤中。也可利用更末梢的血管供給途徑。
在一個(gè)不同的實(shí)施方案中，可考慮離體基因治療。在離體實(shí)施方案中，取出患者的細(xì)胞并在體外維持至少一段時(shí)間。在該時(shí)間期間，傳遞該治療，隨后將該細(xì)胞再導(dǎo)入患者；優(yōu)選的是，已殺死了樣品中的任何腫瘤細(xì)胞。
提供下列實(shí)施例僅用于舉例說明本發(fā)明且不以任何方式限制其范圍。
實(shí)施例1
編碼Flt4的cDNA克隆的分離和鑒定材料和方法寡聚-dT引物產(chǎn)生的在噬菌體λgtl 1[由費(fèi)城兒童醫(yī)院，PA的MortimerPoncz博士惠贈；Poncz等，Blood，69219-223(1987)]中的人HEL細(xì)胞cDNA文庫用從相同文庫PCR擴(kuò)增的cDNA片段進(jìn)行篩選[Aprelikova等，CancerRes.，52746-748(1992)]。鑒定陽性噬斑并按[Sambrook等，MolecularCloning-A Laboratory Manual，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版，(1989)]所述純化。噬菌體λ的cDNA插入片段作為EcoRI片段被分離并亞克隆進(jìn)GEM3Zf(+)質(zhì)粒(Promega)中。分離完整的Flt4蛋白編碼區(qū)。使用雙脫氧鏈終止法用根據(jù)獲得的序列設(shè)計(jì)的寡核苷酸引物測序從HEL-文庫分離的3個(gè)重疊克隆(圖1所示)。在兩條鏈上測序cDNAs的所有部分。使用GCG軟件包程序[Devereux等，Nucleic Acids Res.，12387-395(1984)和Apple MacIntosh的Prosite程序]進(jìn)行序列分析。
圖1A顯示了分析的Flt4 cDNA克隆的結(jié)構(gòu)示意圖。箭頭表示用于探測圖1B所示的Northern印跡的亞克隆限制性片段(其大小以kb表示)。E＝EcoRI位點(diǎn)，S＝SphI位點(diǎn)。圖1B顯示了用圖1A所示的探針對DAMI和HEL白血病細(xì)胞RNAs的Northern雜交分析。
結(jié)果從HEL細(xì)胞cDNA文庫通過PCR克隆方法分離的210bp長的Flt4 cDNA片段用作分子探針以篩選寡聚-dT-引物產(chǎn)生的人紅白血病細(xì)胞cDNA文庫。
對克隆的核苷酸序列分析揭示了一個(gè)1298個(gè)氨基酸(aa)殘基的開放閱讀框(SEQ ID NO2，圖2)。圖中標(biāo)記的翻譯起始子甲硫氨酸被典型的共有序列包圍[Kozak，Nucleic Acids Res.，12857-872(1984)]且隨后是用于轉(zhuǎn)移進(jìn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的信號序列特征性的疏水氨基酸序列。
將Flt4的胞外域排列成7個(gè)免疫球蛋白樣環(huán)(圖2)。該圖還顯示了Flt4與Flt1的比較，它們含有非常相似的結(jié)構(gòu)。Flt1的氨基酸序列作為SEQ.IDNO5提供。
氨基酸殘基775-798形成疏水鏈序列，它很可能作為該受體的跨膜結(jié)構(gòu)域起作用，疏水鏈后面是一些堿性殘基，位于該多肽推定的胞質(zhì)一側(cè)上。近膜結(jié)構(gòu)域有44個(gè)殘基的長度，在842位氨基酸的酪氨酸激酶序列同源性的開始處之前。由于在65個(gè)氨基酸的激酶插入序列上同源性中斷，因此該同源性首先在該受體的羧基末端尾的1175位氨基酸處喪失。在氨基酸序列數(shù)據(jù)庫(Swissprot和NBRF)中對有關(guān)酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域的檢索鑒定了在催化性酪氨酸激酶區(qū)分別具有大約80％和60％同源性的Flt1和PDGFRB酪氨酸激酶。
實(shí)施例2抗-Flt4抗血清的制備將編碼Flt4短鏈形式的推定C-末端的657個(gè)堿基對的EcoRI片段克隆進(jìn)pGEX-1λT細(xì)菌表達(dá)載體(Pharmacia)中含有谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶編碼區(qū)的閱讀框中以便在大腸桿菌中產(chǎn)生GST-Flt4融合蛋白。在細(xì)菌中生產(chǎn)所得的融合蛋白并通過谷胱甘肽親和色譜法按照廠商的指導(dǎo)進(jìn)行部分純化。使用該蛋白質(zhì)免疫家兔以便產(chǎn)生抗Flt4的多克隆抗體。使用第三次加強(qiáng)免疫后的抗血清。
實(shí)施例3Flt4在COS細(xì)胞中的表達(dá)材料和方法將全長Flt4蛋白的編碼序列(從3個(gè)克隆組合，圖1)插入SVpoly哺乳動(dòng)物表達(dá)載體[Stacey等，Nucleic Acids Res.，182829(1990)]的HindIII-BamHI位點(diǎn)構(gòu)建SV14-2。將該表達(dá)載體(SV-FLT4短鏈和SV-FLT4長鏈，含有各自形式的Flt4 cDNA)通過DEAE-葡聚糖轉(zhuǎn)染法[McCutchanetal.，J.Natl.Cancer Inst.，41.351-357(1968)]導(dǎo)入COS細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染2天后，用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌細(xì)胞并刮擦進(jìn)免疫沉淀緩沖液(10mM Tris pH7.5，50mMNaCl，0.5％脫氧膽酸鈉，0.5％ Nonidet P40，0.1％SDS，0.1TIU/ml抑肽酶)中。超聲處理溶胞產(chǎn)物，在10,000xg下離心15分鐘并與3ml抗血清在冰上溫育過夜。加入蛋白A瓊脂糖(Pharmacia)并在旋轉(zhuǎn)條件下繼續(xù)溫育30分鐘。沉淀物用免疫沉淀緩沖液洗滌4次，用PBS洗滌一次且在SDS-PAGE分析前用水洗滌一次。
結(jié)果通過將全長Flt4短鏈和長鏈蛋白的編碼區(qū)克隆進(jìn)pSVpoly表達(dá)載體的HindIII-BamHI位點(diǎn)并將這些表達(dá)載體轉(zhuǎn)染進(jìn)COS細(xì)胞檢驗(yàn)Flt4 cDNA序列的預(yù)期結(jié)構(gòu)。這兩個(gè)構(gòu)建體產(chǎn)生的蛋白質(zhì)區(qū)別在于其C-末端長鏈形式含有額外的65個(gè)氨基酸。轉(zhuǎn)染2天后，裂解細(xì)胞并使用針對含有預(yù)期Flt4蛋白短鏈形式的40個(gè)羧基末端氨基酸殘基(即，F(xiàn)lt4的短鏈和長鏈形式共有的部分)的GST-Flt4融合蛋白產(chǎn)生的抗體進(jìn)行免疫沉淀。通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析免疫沉淀的多肽。免疫前的血清沒有顯示出任何特異性帶，而Flt4-特異性抗體識別大約170和190KD的兩條帶。這兩條帶代表Flt4蛋白的不同糖基化形式。
實(shí)施例4Flt4在NIH3T3細(xì)胞中的表達(dá)材料和方法將全長Flt4 cDNA(短鏈形式)亞克隆進(jìn)含有莫洛尼鼠類白血病毒長末端重復(fù)啟動(dòng)子的LTRpoly載體(參見Makela，等，Gene，118293-294(1992)，公開了質(zhì)粒載體pLTRpoly，具有ATCC保藏號77109和GeneBank登錄號X60280)中。該LTR-FLT4表達(dá)載體與pSV2neo標(biāo)記質(zhì)粒用于共轉(zhuǎn)染NIH3T3細(xì)胞，分析G418抗性克隆的Flt4表達(dá)。
對于Western免疫印跡分析，將一個(gè)匯合的大平板上的細(xì)胞在2.5％SDS，125mM Tris，pH6.5中裂解。細(xì)胞溶胞產(chǎn)物在SDS-PAGE上電泳并電印跡到硝酸纖維素膜上。用針對Flt4羧基末端肽產(chǎn)生的抗血清溫育膜，并使用辣根過氧化物酶偶連的豬抗兔抗血清(Dako)和ECL試劑(Amersham)觀察結(jié)合的抗體。對于代謝標(biāo)記，用100μCi/ml35S-甲硫氨酸標(biāo)記培養(yǎng)物1小時(shí)。標(biāo)記后，洗滌細(xì)胞兩次并在其生長培養(yǎng)基中培養(yǎng)1或2小時(shí)，裂解，用抗-Flt4抗體免疫沉淀，并通過SDS-PAGE和自動(dòng)熒光術(shù)分析。
結(jié)果在Flt4短鏈形式轉(zhuǎn)染的NIH3T3細(xì)胞中可檢測到170和190KD的多肽，但在僅用pSV2neo轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中沒有。除了這兩條帶外，在產(chǎn)生Flt4的克隆中觀察到大約120Kd的主要帶。代謝標(biāo)記和脈沖追蹤實(shí)驗(yàn)表明作為Flt4多肽短鏈形式的翻譯后加工的結(jié)果產(chǎn)生該蛋白質(zhì)。
實(shí)施例5Flt4基因座的染色體定位由于已經(jīng)觀察到一些III型受體基因的聚集，因此測定Flt4的染色體定位具有重大意義。因此，分析了嚙齒類-人雜交細(xì)胞，表明Flt4與人5號染色體連鎖。
使用攜帶部分5號染色體的雜交細(xì)胞確定了Flt4基因位于5q33-＞5qter區(qū)。通過濾膜雜交檢驗(yàn)這些雜交細(xì)胞中Flt4基因座的存在。Flt4-陽性雜交細(xì)胞共有的且在Flt4-陰性雜交細(xì)胞中不存在的5號染色體區(qū)域是5q33.1-qter。因此在雜交細(xì)胞中人染色體5q33-qter與Flt4序列的存在相關(guān)。該區(qū)域定位結(jié)果表明Flt4基因座與CSF1R/血-小板衍生生長因子受體-β(PDGFRB)基因座以及與β-腎上腺素能受體(ADRBR)基因座遠(yuǎn)端聚集(telomeric)，因?yàn)檫@些基因座均存在于Flt4陰性的雜交細(xì)胞GB13中。
實(shí)施例6Flt4 mRNA在腫瘤細(xì)胞系和內(nèi)皮細(xì)胞中的表達(dá)用于本試驗(yàn)的白血病細(xì)胞系(K562)在一些以前的文獻(xiàn)中已有報(bào)導(dǎo)；[Lozzio等，Blood，45321-334(1975)]，HL-60[Collins等，Nature，270347-349(1977)]，HEL[Martin等，Science，2161233-1235(1982)]，DAMI[Greenberg等，Blood，721968-1977(1988)]，MOLT-4[Minowada等，J.Natl.Cancer Inst.，49891-895(1972)]，Jurkat[Schwenk等，Blut，31299-306(1975)]，U937[Sundstrom等，Int.J.Cancer，17565-577(1976)]，KG-1[Koeffler等，Science，2001153-1154(1978)]，JOK-1[Andersson等，1982，見R.F.Revoltella(編)，Expression of Differentiated Functions in Cancer Cells，239-245，Raven Press，紐約]和ML-2[Gahmberg等，1985，見L.C.Anderson，等(編)，Gene Expression During Normal and Malignant Differentiation，107-123，Academic Press，London]。還分析了從美國典型培養(yǎng)物保藏中心獲得的下列腫瘤細(xì)胞系JEG-3，絨毛膜癌；A204，橫紋肌肉瘤；SK-NEP-1，腎胚細(xì)胞瘤；BT-474，乳腺癌；Y79，成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤。白血病細(xì)胞在含有10％胎牛血清(FCS)和抗生素的RPMI中生長。Dami細(xì)胞在含有10％馬血清的Iscove′s改良的DMEM中培養(yǎng)。通過融合第一代人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞與A549肺癌細(xì)胞獲得的永久內(nèi)皮雜交細(xì)胞系(EAhy926)[Edgell等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，503734-3737(1983)]在含有10％FCS和抗生素的DMEM-HAT培養(yǎng)基中培養(yǎng)。
按[Sambrook等，見上文]所述從該細(xì)胞系提取Poly(A)+RNA。5μg的Poly(A)+RNA樣品在含有甲醛的瓊脂糖凝膠中電泳并使用標(biāo)準(zhǔn)條件印跡[Sambrook等，見上文]。Flt4 cDNA克隆的插入片斷通過隨機(jī)引物方法標(biāo)記并與該印跡雜交。雜交在50％甲酰胺，5x Denhardt′s溶液(100x Denhardt′s溶液是Ficoll，聚乙烯吡咯烷酮和牛血清白蛋白各2％)，5x SSPE(3M NaCl，200mM NaH2PO4·H2O，20mM EDTA，pH7.0)，0.1％SDS(十二烷基磺酸鈉)，和0.1mg/ml超聲處理的鮭精DNA中42℃下18-24小時(shí)。濾膜在1x SSC(150mMNaCl，15mM檸檬酸鈉，pH7.0)，0.1％ SDS中65℃下洗滌并用柯達(dá)XAR-5膠片曝光。
用從8個(gè)白血病細(xì)胞系(HEL，K562，DAMI，U937，MOLT4，HL60，Jurkat，和KG-1)和內(nèi)皮雜交細(xì)胞系(EAhy926)提取的poly(A)+RNA進(jìn)行Northern分析。用GAPDH探針進(jìn)行的雜交用作內(nèi)部對照用于上樣等量的RNA進(jìn)行分析。只有HEL紅白血病細(xì)胞，和DAMI成巨核細(xì)胞白血病細(xì)胞表達(dá)5.8kb和4.5kb的Flt4 mRNA。K562紅白血病，Jurkat和MOLT-4 T-細(xì)胞白血病，以及HL-60前髓細(xì)胞白血病，U937單核細(xì)胞白血病，和KG-1髓細(xì)胞樣白血病細(xì)胞為Flt4 mRNA陰性。
用從5個(gè)腫瘤細(xì)胞系(JEG-3，A-204，SK-NEP-1，BT-474，和Y79)和兩個(gè)上述白血病細(xì)胞系(JOK-1，MOLT4)提取的poly(A)+RNA進(jìn)行Northern分析。標(biāo)記的S2.5 cDNA克隆(見圖1)用作雜交探針。用β-肌動(dòng)蛋白探針進(jìn)行的雜交用作內(nèi)部對照用于上樣等量的RNA進(jìn)行分析。只有SK-NEP-1nefroblastoma和Y79成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤細(xì)胞觀察到含有Flt4轉(zhuǎn)錄子。
用載體(-)或視黃酸(+)處理10天后分析Tera-2畸胎癌細(xì)胞以誘導(dǎo)神經(jīng)元分化[Thompson等，J.Cell Sci.，7237-64(1984)]。在對從該細(xì)胞分離的poly(A)+RNA進(jìn)行的Northern印跡分析中，發(fā)現(xiàn)未分化的細(xì)胞表達(dá)5.8kb和4.7kb的Flt4 mRNAs，但在分化10天后，在Northern印跡和雜交中檢測不到Flt4 mRNA。這些結(jié)果表明在這些細(xì)胞的分化期間減量調(diào)節(jié)Flt4。
在未分化的和TPA-分化的HEL細(xì)胞中也分析了Flt4 mRNA的表達(dá)。HEL和DAMI細(xì)胞系都具有雙重成紅細(xì)胞/成巨核細(xì)胞表型且可通過用腫瘤促進(jìn)劑12-O-十四烷酰佛波醇-13-乙酸酯(TPA)處理誘導(dǎo)成巨核細(xì)胞標(biāo)記的進(jìn)一步表達(dá)。我們分析了在其分化期間在這些細(xì)胞中是否刺激Flt4的表達(dá)。用TPA或用于溶解它的DMSO處理2天后分析HEL細(xì)胞。剝離Flt4信號后，用Rb-1和β-肌動(dòng)蛋白cDNAs探測該濾膜以證實(shí)泳道的均等上樣。根據(jù)放射自顯影的光密度計(jì)掃描分析和相對于GAPDH基因的組成型表達(dá)的標(biāo)準(zhǔn)化(normalization)，測定了在TPA誘導(dǎo)的HEL細(xì)胞中，當(dāng)該細(xì)胞進(jìn)行成巨核細(xì)胞分化時(shí)Flt4 mRNA水平增加大約3.4倍。
實(shí)施例7胎兒肺中的Flt4表達(dá)在原位雜交中在芬蘭中央醫(yī)院大學(xué)和Turku大學(xué)的聯(lián)合倫理委員會的許可下獲得了15周年齡的人胎兒肺組織。該樣品在4℃下在10％的福爾馬林中固定18小時(shí)，脫水，包埋于蠟中，并切成6μm的切片。使用SP6和T7聚合酶和[35S]-UTP從線形化質(zhì)粒DNA中產(chǎn)生206和157個(gè)堿基(反義和有義)的RNA探針。按照Wilkinson等，Development，99493-500(1987)；Wilkinson，Cell，5079-88(1987)所述對切片進(jìn)行原位雜交，使用下列改良1)在石蠟包埋前使用二甲苯代替甲苯；2)切成6μm的切片，放在用2％3-氨丙基-三乙氧基甲硅烷(Sigma)預(yù)處理的載玻片表面的二乙基焦碳酸酯處理的水層上；3)省去對該探針的堿性水解；4)雜交混合物含有60％的去離子甲酰胺；5)高度嚴(yán)格條件洗滌是在含有50mM DTT和1x SSC的溶液中在65℃下80分鐘；6)該切片用NTB-2乳劑(Kodak)覆蓋且在4℃下儲存。曝光14天后，載玻片在柯達(dá)D-19顯影劑中顯影2.5分鐘并用Unifix(柯達(dá))固定5分鐘。切片用溶于水中的蘇木精染色。
在使用反義探針的雜交試驗(yàn)中，主要在15周年齡的胎兒肺的某些內(nèi)皮細(xì)胞中觀察到Flt4 mRNA。用有義鏈探針和用RNAse A-處理的切片進(jìn)行的對照雜交中未產(chǎn)生超出背景的信號。
對于免疫過氧化物酶染色，使用1∶100稀釋的抗-Flt4抗體，過氧化物酶偶連的豬抗-兔抗體和本領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)方法。用免疫前的血清或免疫原封閉的血清的對照染色未產(chǎn)生信號。分析了17周年齡的人胎兒肺組織，結(jié)果與原位雜交實(shí)驗(yàn)中的那些mRNA一致某些肺大血管的內(nèi)皮用兔抗-Flt4抗血清染色為陽性。
實(shí)施例8在非人哺乳動(dòng)物物種中鑒定Flt4基因在圖4中，顯示了在不同物種DNA中檢查Flt4序列存在的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。為了揭示Flt4基因在進(jìn)化中的保守程度，將2.5kb的cDNA片斷(見圖1)與從不同動(dòng)物和酵母中純化且用EcoRI消化的基因組DNAs雜交。該雜交溶液包含50％的甲酰胺，5x Denhardt′s溶液(100x Denhadt′s溶液是Ficoll，聚乙烯吡咯烷酮和牛血清白蛋白各2％)，5x磷酸鈉鹽溶液-EDTA(3M NaCl，200mM NaH2PO4-H2O，20mM EDTA，pH7.0)，0.1％十二烷基磺酸鈉，和0.1mg/ml超聲處理的鮭精DNA。在42℃下進(jìn)行雜交24小時(shí)。濾膜在1x標(biāo)準(zhǔn)檸檬酸鹽溶液(150mM NaCl，15mM檸檬酸鈉，pH7.0)和0.1％十二烷基磺酸鈉中65℃下洗滌且用柯達(dá)XAR-5膠片曝光。在猴，大鼠，小鼠，狗，奶牛，兔，和雞DNAs中發(fā)現(xiàn)了特異性帶，但酵母DNA未產(chǎn)生信號。從鵪鶉中已經(jīng)分離出Flt4 cDNA。參見Eichmann等，Gene，174(1)3-8(1996年9月26日)和Genbank登錄號X83287。
實(shí)施例9Flt4基因在成人組織中的表達(dá)使用心臟，腦，胎盤，肺，肝臟，骨骼肌，腎和胰腺組織的2μgpoly(A)+RNA(Multiple Tissue Northern Blot，Clontech Inc.)通過與Flt4 cDNA探針雜交分析成人組織中的Flt4 mRNA表達(dá)。用組成型表達(dá)的基因的探針進(jìn)行的對照雜交顯示出泳道均勻上樣。
各種人組織的poly(A)+RNA與Flt4 cDNA片斷的雜交顯示出在胎盤，肺，心臟和腎中有5.8和4.5kb遷移率的mRNA帶和6.2kb的微弱標(biāo)記帶。在肝臟和骨骼肌中可見微弱的mRNA帶，而胰腺和腦中即使含有Flt4 RNA，也似乎含量極少。
實(shí)施例10人胎兒組織中的Flt4表達(dá)為了檢查人胎兒組織中的Flt4 mRNA表達(dá)，將含有來自16-19周人胎兒的下列組織的總RNA的Northern印跡與1.9kb Flt4 cDNA片斷(見圖1)雜交且所得的放射自顯影用光密度計(jì)掃描。從相應(yīng)的溴化乙錠(EtBr)染色凝膠的紫外照片估計(jì)RNA的量對該結(jié)果進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。下列符號表示依次遞增的mRNA水平-，+，++，+++。
表1胎兒組織mRNA腦腦膜 +皮層板++中間帶+++室管膜區(qū) +小腦 ++脈絡(luò)叢+肝臟 +胰腺 +小腸 -心臟 +肺+++腎++腎上腺++皮膚 ++脾臟 +++胸腺 -人胎兒組織的分析表明除了胸腺和小腸外均含有Flt4轉(zhuǎn)錄子。在肺和脾臟中發(fā)現(xiàn)最高的表達(dá)水平。
實(shí)施例11Flt4表達(dá)載體全長Flt4 cDNA(短鏈形式)通過如下方式產(chǎn)生a)將SphI-裂解的Flt4 PCR片斷[使用引物寡核苷酸5′-ACATGCATGCCACCATGCAGCGGGGCGCCGCGCTGTGCCTGCGACTGTGGCTCTGCCTGGGACTCCTGGA-3′(SEQ.IDNO.7)(正向)和5′-ACATGCATGCCCCGCCGGTCATCC-3′(反向)(SEQ.IDNO.8)從S2.5kb克隆(見圖1)擴(kuò)增]連接到S2.5kb片斷的5’端，使用兩個(gè)SphI位點(diǎn)亞克隆進(jìn)pSP73載體(Promega)；b)將用寡核苷酸引物5′-CGGAATTCCCCATGACCCCAAC-3′(SEQ.ID NO.9)(正向)和5′-CCATCGATGGATCCTACCTG AAGCCGCTTTCTT-3′(SEQ.ID NO.10)(反向)從0.6kb EcoRI片斷(見圖1)擴(kuò)增的含有最后138個(gè)堿基的PCR片斷使用EcoRI和BamHI位點(diǎn)連接到構(gòu)建體a)的3’端；c)在構(gòu)建體b)的EcoRI位點(diǎn)連接1.2kb的EcoRI片斷；d)將所得的全長HindIII-BamHI片斷連接進(jìn)HindIII-BamHI裂解的SV-poly表達(dá)載體[Stacey等，Nucl.Acids Res.，182829(1990)]中。
實(shí)施例12Flt4配體的鑒定在不含胎牛血清(FBS)的F12培養(yǎng)基中培養(yǎng)7天的PC-3前列腺癌細(xì)胞系(ATCC CRL 1435)中得到的條件培養(yǎng)基通過以16,000xg離心20分鐘澄清并篩選誘導(dǎo)Flt4酪氨酸磷酸化的能力。
將重組表達(dá)Flt4的NIH3T3-細(xì)胞(見實(shí)施例13)再接種到5cm直徑的細(xì)胞培養(yǎng)皿上并在含有10％胎牛血清和抗生素的Dulbecco′s改良極限必需培養(yǎng)基(DMEM)中生長至匯合。匯合細(xì)胞在磷酸鹽緩沖液(PBS)中洗滌兩次并在DMEM/0.2％牛血清白蛋白中饑餓過夜。為了進(jìn)行刺激，用1ml條件培養(yǎng)基代替饑餓培養(yǎng)基且細(xì)胞在37℃下培養(yǎng)5分鐘。
用PC-3條件培養(yǎng)基刺激后，將含有該細(xì)胞的培養(yǎng)板放在冰上并用含有100mM NaVO4的Tris-HCl，pH7.4，150mM NaCl洗滌兩次。從培養(yǎng)皿上去掉該洗滌溶液并在含有抑肽酶，1mM PMSF和1mM NaVO4的RIPA緩沖液[10mM Tris-HCl pH7.5，50mM NaCl，0.5％脫氧膽酸鈉，0.5％ Nonidet P40，0.1％十二烷基磺酸鈉(SDS)]中裂解該細(xì)胞，超聲處理該溶胞產(chǎn)物10秒兩次。然后以16,000xg離心該溶胞產(chǎn)物30分鐘，將上清轉(zhuǎn)移到新試管中并用于免疫沉淀。
抗Flt4 C-末端的多克隆抗體(上文所述)可用于免疫沉淀。將細(xì)胞溶胞產(chǎn)物的上清用2至4μl兔多克隆抗-Flt4抗血清在冰上溫育2小時(shí)。加入大約30μl50％(vol/vol)的蛋白質(zhì)A-Sepharose(Pharmacia)的PBS溶液，在+4℃旋轉(zhuǎn)條件下繼續(xù)溫育45分鐘。用RIPA緩沖液洗滌免疫沉淀3次并用PBS洗滌一次。然后在7.5％凝膠中對免疫沉淀進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)并印跡到硝酸纖維素膜上。用單克隆抗磷酸酪氨酸抗體(anti-P-Tyr)(1∶2000稀釋的PT-66 Sigma，cat.P-3300)溫育Western印跡，接著用過氧化物酶偶連的兔抗小鼠抗體(1∶1000稀釋，Dako，cat.P 161)使用化學(xué)發(fā)光檢測系統(tǒng)(Amersham)進(jìn)行檢測。在有些情況下，在50℃的100mM 2-巰基乙醇，2％ SDS，62.5mM Tris-HCl pH6.7中偶爾攪拌的條件下剝離印跡30分鐘以清除以前的信號并用抗-Flt4抗體(1∶1000稀釋)再染色，接著用過氧化物酶偶連的豬抗兔抗體(1∶1000稀釋，Dako，P217)染色。作為Flt4的酪氨酸磷酸化的陽性對照，使用以100mM酪氨酰磷酸酶抑制劑過釩酸鈉(PerVO4)處理20分鐘的表達(dá)Flt4的NIH3T3細(xì)胞的抗-Flt4免疫沉淀。通過向細(xì)胞培養(yǎng)基中加入100mM(終濃度)的正釩酸鈉和2mM(終濃度)的過氧化氫并在37℃下5％CO2中培養(yǎng)細(xì)胞20分鐘進(jìn)行細(xì)胞的過釩酸鈉處理。該操作導(dǎo)致產(chǎn)生釩酸鹽的過氧化形式(氧釩基氫過氧化物)，它是活細(xì)胞中蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酶的非常有效的抑制劑。
PC-3細(xì)胞的條件培養(yǎng)基刺激120kD多肽的酪氨酸磷酸化，該多肽與Flt4的酪氨酸磷酸化的加工后的成熟形式共同遷移。用抗-Flt4抗體再染色印跡后可證實(shí)該共同遷移。
為了證實(shí)120kD多肽不是該條件培養(yǎng)基的非特異性成份，通過SDS-PAGE分離15ml的條件培養(yǎng)基，印跡到硝化纖維素上，并用anti-P-Tyr抗體染色印跡。檢測到一些多肽，但它們中沒有一個(gè)與Flt4共同遷移，表明120kD帶確實(shí)是從刺激細(xì)胞免疫沉淀的酪氨酸磷酸化蛋白。通過用肝素瓊脂糖CL-6B(Pharmacia)在室溫下預(yù)處理2小時(shí)的PC-3條件培養(yǎng)基的刺激分析(泳道3)表明Flt4配體不與肝素結(jié)合。
非條件培養(yǎng)基不誘導(dǎo)Flt4自身磷酸化。另外，未轉(zhuǎn)染的NIH3T3細(xì)胞和用FGFR-4轉(zhuǎn)染的NIH3T3細(xì)胞用來自PC-3細(xì)胞的條件培養(yǎng)基刺激時(shí)都沒有表現(xiàn)出120KD多肽的酪氨酸磷酸化。當(dāng)使用Centricon-10濃縮器(Amicon)將PC-3條件培養(yǎng)基濃縮4倍時(shí)刺激活性大量增加。另外，濃縮后獲得的流走液含有分子量不超過10,000(＜10,000)的蛋白質(zhì)，不能刺激Flt4的磷酸化。用50ml偶連到CNBr-活化的瓊脂糖上的Flt4胞外域(Flt4EC-6xHis，見下文)(1mg/ml)按廠商的指導(dǎo)預(yù)處理PC-3細(xì)胞的濃縮條件培養(yǎng)基完全消除Flt4的酪氨酸磷酸化。用瓊脂糖CL-4B同樣預(yù)處理該條件培養(yǎng)基不影響其刺激活性。
這些數(shù)據(jù)證實(shí)PC-3細(xì)胞產(chǎn)生Flt4的可溶性配體。上述實(shí)驗(yàn)證實(shí)了該配體與重組Flt4 EC結(jié)構(gòu)域結(jié)合。因此，可使用重組Flt4 EC結(jié)構(gòu)域在親和色譜中純化該配體。純化的蛋白質(zhì)可在SDS-PAGE中電泳，印跡到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上并通過本領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)方法可測定其氨基末端序列。另外，可將純化的配體消化成肽用于其氨基末端序列的測定。從該純化的蛋白質(zhì)獲得的肽序列用于合成編碼該序列的寡核苷酸的混合物?？煞派湫詷?biāo)記該寡核苷酸及其互補(bǔ)DNA鏈配對物并用于篩選從PC-3細(xì)胞制備的cDNA文庫以獲得編碼該配體的cDNA，這些都通過本領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行(Wen等，Cell 69559-572(1992))。作為選擇，該寡核苷酸及其配對物可用作聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)中的引物以便使用從PC-3細(xì)胞RNA制備的cDNA作模板擴(kuò)增編碼該配體的序列。該cDNA合成和PCR(RT-PCR)的方法是本領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)方法(Innis等，1990，PCR protocols，Academic Press；McPherson，M.J.等，1991，PCR，a practical approach，IRL Press；Partanen等，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，878913-8917(1990))。另一選擇是通過使用克隆進(jìn)真核表達(dá)載體(例如，使用提供的Invitrogen Librarian克隆試劑盒和載體，例如pcDNA I或pcDNA III)的cDNAs并用Flt4-堿性磷酸酶(Cheng和Flanagan，Cell，79157-168，(1994))，F(xiàn)lt4-免疫球蛋白(Flt4-Ig)(Lyman等，Cell，751157-1167(1993))，或相似的親和試劑通過本領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)方法篩選轉(zhuǎn)染進(jìn)例如，COS細(xì)胞的該文庫從PC-3細(xì)胞克隆Flt4配體。
實(shí)施例13細(xì)胞系和轉(zhuǎn)染NIH3T3細(xì)胞和293-EBNA細(xì)胞(Invitrogen)在含有10％ FCS的DMEM中培養(yǎng)。為了穩(wěn)定表達(dá)，用LTR-FLT41載體與pSV-neo載體(見上文實(shí)施例4)一起通過使用DOTAP轉(zhuǎn)染試劑(Boehringer-Mannheim)的脂轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染NIH3T3細(xì)胞，其中Flt4 cDNA在莫洛尼鼠類白血病毒LTR啟動(dòng)子的控制下表達(dá)。COS-1細(xì)胞通過DEAE葡聚糖方法(McClutchan和Pagano，J.Natl.Cancer Inst.，41351-35(1968))轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染細(xì)胞在500mg/ml新霉素中選擇。
實(shí)施例14Flt4融合蛋白的構(gòu)建和表達(dá)pVTBac-FLT4EC-6xHis融合構(gòu)建體。編碼Flt4的cDNA末端修飾如下編碼胞外域(EC)的Flt4 cDNA序列3’端使用寡核苷酸5′-CTGGAGTCGACTTGGCGGACT-3′(SEQ ID NO13，SalI位點(diǎn)下劃線，含有相應(yīng)于SEQ ID NO1的核苷酸2184-2204的序列)和編碼用于結(jié)合Ni-NTA柱(Qiagen，Hilden，Germany)的6個(gè)組氨酸殘基和接著的終止密碼子的5′CGCGGATCCCTAGTGATGGTGATGGTGATGTCTACCTTCGATCATGCTGCCCTTATCCTC-3′(SEQ ID NO14，BamHI位點(diǎn)下劃線，含有與SEQ ID NO1的核苷酸2341-2324互補(bǔ)的序列)進(jìn)行擴(kuò)增。該擴(kuò)增的片斷用SalI和BamHI消化并作為SalI-BamHI片斷連接進(jìn)LTR-FLT41載體(見實(shí)施例4)，代替含有編碼Flt4跨膜和胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域的序列的單一SalI-BamHI片斷。
無Flt4信號序列編碼區(qū)的Flt4 cDNA 5’端使用寡核苷酸5′-CCCAAGCTTGGATCCAAGTGGCTACTCCATGACC-3′(SEQ ID NO11，HindIII和BamHI位點(diǎn)下劃線，含有相應(yīng)于SEQ ID NO1的核苷酸86-103的序列)和5′-GTTGCCTGTGATGTGCACCA-3′(SEQ ID NO12，含有與SEQ ID NO1的核苷酸700-681互補(bǔ)的序列)通過PCR擴(kuò)增。該擴(kuò)增片斷(含有SEQ ID NO1的核苷酸86-700)用HindIII和SphI消化(相應(yīng)于SEQ ID NO1的核苷酸588-593的SphI位點(diǎn)在Flt4 cDNA的擴(kuò)增區(qū)內(nèi))。
所得的HindIII-SphI片斷用于代替剛在上文所述的修飾的LTR-FLT41載體中的HindIII-SphI片斷(HindIII位點(diǎn)在Flt4插入片斷與該載體的pLTRpoly部分的接頭5’端，SphI位點(diǎn)在Flt4 cDNA中且相應(yīng)于SEQ ID NO1的核苷酸588-593)。然后所得的Flt4EC-6xHis插入片斷作為BamHI片斷連接進(jìn)pVTBac質(zhì)粒的BamHI位點(diǎn)(Tessier等，Gene 98177-183(1991))。該構(gòu)建體與桿狀病毒基因組DNA一起通過脂轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染進(jìn)SF-9細(xì)胞。產(chǎn)生重組病毒并用于感染High-Five細(xì)胞(Invitrogen)。
Flt4-AP融合構(gòu)建體。編碼Flt4 EC結(jié)構(gòu)域的序列的3’端使用寡核苷酸5′-CTGGAGTCGACTTGGCGGACT-3′(SEQ ID NO15)和5′-CGGGATCCCTCCATGCTGCCCTTATCCT-3′(SEQ ID NO16)進(jìn)行擴(kuò)增并作為SalI-BamHI片斷連接進(jìn)LTR-FLT41載體，代替編碼跨膜和胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域的序列。然后所得的插入片斷作為HindIII-BamHI片斷連接進(jìn)質(zhì)粒APtag-1的HindIII-BglII位點(diǎn)，位于堿性磷酸酶編碼區(qū)的閱讀框中(Flanagan和Leder，1990，Cell63，185-194)。用該Flt4-AP構(gòu)建體和pSV2neo(Southern和Berg，J.Mol.Appl.Genet.1327-341(1982))通過使用DOTAP轉(zhuǎn)染試劑(Boehringer)的脂轉(zhuǎn)染法共轉(zhuǎn)染NIH3T3細(xì)胞并在500mg/ml新霉素存在下選擇轉(zhuǎn)染細(xì)胞。通過染色堿性磷酸酶活性的比色反應(yīng)檢測生產(chǎn)進(jìn)該培養(yǎng)基中的重組蛋白(Cheng和Flanagan，Cell 79.157-168(1994))。
Flt4-Ig構(gòu)建體。編碼Flt4-免疫球蛋白嵌合體的重組DNA構(gòu)建如下。編碼Flt4的cDNA 5’端，包括編碼信號序列的Flt4核苷酸使用引物5′-GGCAAGCTTGAATTCGCCACCATGCA GCGGGGCGCC-3′(SEQ ID NO17)和5′-GTTGCCTGTGAT GTGCACCA-3′(SEQ ID NO18)通過PCR進(jìn)行擴(kuò)增并作為HindIII-SphI片斷連接進(jìn)LTR-FLT41載體。Flt4 EC-編碼序列的3’端使用寡核苷酸5′-CTGGAGTCGACTTGGCGGACT-3′(SEQ ID NO19)和5′-CGCGGATCCAAGCTTACTTACCTTCCATGCT GCCCTTATCCTCG-3′(SEQ ID NO20)進(jìn)行擴(kuò)增并作為SalI-BamHI片斷連接進(jìn)LTR-FLT41載體代替編碼跨膜和胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域的序列。含有剪接供體位點(diǎn)的該Flt4 EC插入片斷首先連接進(jìn)含有編碼人免疫球蛋白重鏈鉸鏈的外顯子和恒定區(qū)外顯子的pHγCE2(Karjalainen，K.，TIBTECH，9109-113(1991))中。然后將含有Flt4-Ig嵌合體的EcoRI-BamHI插入片斷通過本領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)方法(Klenow)鈍端化并連接進(jìn)pREP7(Invitrogen)的鈍端化HindIII位點(diǎn)中。將該構(gòu)建體通過磷酸鈣沉淀法轉(zhuǎn)染進(jìn)293-EBNA細(xì)胞中且該條件培養(yǎng)基用于通過蛋白質(zhì)A-瓊脂糖親和色譜法分離Flt4-Ig蛋白質(zhì)。
實(shí)施例15-17Flt4配體的純化和測序在血清耗盡條件下由PC-3細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞培養(yǎng)物上清使用Centriprep過濾筒濃縮30-50倍并上樣到固定Flt4胞外域的柱子上。使用可供選擇的構(gòu)建體和方法制備兩種親和性基質(zhì)。在第一種情況下，F(xiàn)lt4EC-6xHis融合蛋白與CNBr-活化的瓊脂糖4B(Pharmacia)交聯(lián)，在第二種情況下，F(xiàn)lt4-Ig融合蛋白與蛋白質(zhì)A瓊脂糖使用二甲基庚二酸(dimethylpimelidate)偶連(Schneider等，1982，J.Biol.Chem.25710766-10769)。從親和柱上洗脫的物質(zhì)使用離子交換和反相高壓色譜法和SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)一步純化。檢驗(yàn)色譜餾分刺激Flt4的酪氨酸磷酸化的能力。微量測序純化的生物學(xué)活性配體蛋白并根據(jù)獲得的氨基酸序列制備簡并寡核苷酸用于從例如，PC-3細(xì)胞分離的poly(A)+RNA產(chǎn)生的cDNA文庫中分離和克隆編碼該配體的cDNA。
命名為血管內(nèi)皮生長因子C(VEGF-C)的Flt4配體的詳細(xì)鑒定，以及天然人，非人哺乳動(dòng)物，和鳥類編碼VEGF-C的多核苷酸序列，和VEGF-C變異體和類似物在1998年2月2日申請的國際專利申請?zhí)朠CT/US98/01973(作為國際公開號WO 98/33917于1998年8月6日公開)；Joukov等，J.Biol.Chem.，273(12)6599-6602(1998)；Joukov等，EMBO J.，16(13)3898-3911(1997)；和在1996年8月1日申請的國際專利申請?zhí)朠CT/FI96/00427(作為國際公開號WO 97/05250公開)中提供，本文引用所有這些文獻(xiàn)以其整體作為參考。正如其中的詳細(xì)說明，人VEGF-C開始作為419個(gè)氨基酸的prepro-VEGF-C多肽在人細(xì)胞中產(chǎn)生。人prepro-VEGF-C的氨基酸序列在SEQ ID NO21中提供，且編碼人VEGF-C的cDNA根據(jù)布達(dá)佩斯條約保藏在美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)，10801 University Blvd.，Manassas，VA 20110-2209(USA)(保藏日期為1995年7月24日且ATCC保藏號為97231)。其它物種的VEGF-C序列也有報(bào)導(dǎo)。例如，見Genbank登錄號MMU73620(Mus musculus)；和CCY15837(Coturnix coturnix)，本文引用以供參考。
prepro-VEGF-C多肽在多個(gè)階段中加工以產(chǎn)生大約21-23KD(通過在還原條件下的SDS-PAGE估計(jì))的成熟且最有活性的VEGF-C多肽。該加工包括裂解信號肽(SEQ ID NO21，殘基1-31)；裂解羧基末端肽(大約相應(yīng)于SEQID NO21的氨基酸228-419且具有Balbiani環(huán)3蛋白質(zhì)(BR3P)序列的間隔半胱氨酸殘基痕跡的模式[Dignam等，Gene，88133-40(1990)；Paulsson等，J.Mol.Biol.，211331-49(1990)])以產(chǎn)生大約29KD的部分加工形式；裂解(明顯在細(xì)胞外)氨基末端肽(大約相應(yīng)于SEQ ID NO21的氨基酸32-103)以產(chǎn)生大約21-23kD的完全加工后的成熟形式。實(shí)驗(yàn)證據(jù)證實(shí)VEGF-C的部分加工后的形式(例如，29kD的形式)能結(jié)合Flt4(VEGFR-3)受體，而與VEGFR-2的高親和力結(jié)合僅與VEGF-C的完全加工后形式發(fā)生。似乎VEGF-C多肽天然相聯(lián)成非二硫化鍵連接的二聚體。
另外，已證實(shí)SEQ ID NO2的氨基酸103-227對于維持VEGF-C的功能不都是關(guān)鍵性的。由SEQ ID NO2的氨基酸113-213(且不含殘基103-112和214-227)組成的多肽保留結(jié)合和刺激VEGF-C受體的能力，預(yù)期跨越從大約殘基131到大約殘基211的多肽將保留VEGF-C的生物學(xué)活性。已表明在156位置的半胱氨酸殘基對于VEGFR-2的結(jié)合能力是重要的。然而，VEGF-CΔC156多肽(即，由于缺失或取代而缺少該半胱氨酸的類似物)仍是VEGFR-3的有效激活劑。SEQ ID NO2中165位置的半胱氨酸對于結(jié)合任一受體是必需的，而在83或137位置缺少半胱氨酸的類似物與天然VEGF-C競爭結(jié)合兩種受體并刺激兩種受體。
人VEGF-C與來自其它物種的VEGF-C的序列對比(使用任一普遍接受的序列對比算法進(jìn)行)顯示了可導(dǎo)入修飾(例如，插入，取代，和/或缺失)而不破壞VEGF-C的生物學(xué)活性的其它殘基。在對比排列的兩個(gè)或多個(gè)物種的VEGF-C多肽上具有不同的氨基酸，特別是具有不同化學(xué)特性的側(cè)鏈的不同氨基酸的任一位置很可能是容許修飾而同時(shí)不消除功能的位置。人，鼠和鵪鶉VEGF-C的一個(gè)舉例性的序列對比在PCT/US98/01973的圖5中提供。
除了上述因素外，應(yīng)明白可對野生型VEGF-C序列進(jìn)行無數(shù)的保守氨基酸取代，這樣，特別是如果該取代的數(shù)目較小時(shí)，很可能導(dǎo)致多肽保留VEGF-C的生物學(xué)活性?！氨Ｊ匕被崛〈笔侵赣镁哂邢嗨苹瘜W(xué)特性的側(cè)鏈的氨基酸進(jìn)行的氨基酸取代。進(jìn)行保守取代的相似氨基酸包括具有酸性側(cè)鏈(谷氨酸，天冬氨酸)；堿性側(cè)鏈(精氨酸，賴氨酸，組氨酸)；極性酰胺側(cè)鏈(谷氨酰胺，天冬酰胺)；疏水脂肪族側(cè)鏈(亮氨酸，異亮氨酸，纈氨酸，丙氨酸，甘氨酸)；芳香側(cè)鏈(苯丙氨酸，色氨酸，酪氨酸)；小側(cè)鏈(甘氨酸，丙氨酸，絲氨酸，蘇氨酸，甲硫氨酸)；或脂肪族羥基側(cè)鏈(絲氨酸，蘇氨酸)的那些氨基酸。也包含不破壞VEGF-C生物學(xué)活性的一個(gè)或幾個(gè)內(nèi)部氨基酸的添加或缺失。
從前面所述可預(yù)期許多VEGF-C多肽和變異體以高親和力結(jié)合Flt4(VEGFR-3)，因此它們可在涉及使用Flt4結(jié)合化合物造影或篩選組織樣品的本發(fā)明方面中用作Flt4結(jié)合化合物。特別有利的是含有減小或消除VEGFR-2結(jié)合親和性以便所得的多肽對VEGFR-3結(jié)合特異性增加的改變的VEGF-C形式。如上所述，該改變包括Cys156的缺失或取代，它基本上消除了VEGFR-3結(jié)合親和性，或者破壞天然prepro-VEGF-C蛋白酶解加工位點(diǎn)的氨基酸序列改變(因?yàn)橥耆庸ず蟮腣EGF-C具有最高的VEGFR-2親和性)。另外，修飾成保留Flt4結(jié)合親和性但不能激活Flt4自身磷酸化的VEGF-C分子在本文所述的治療方法中是有用的Flt4拮抗劑。從上述教導(dǎo)顯而易見的還有本文所述的Flt4配體可用于測定法中作為一種另外的標(biāo)記以便證實(shí)人Flt4等位基因變異體的身份，和證實(shí)與本文教導(dǎo)的Flt4序列具有同源性的非人基因序列(參見，例如，實(shí)施例8和圖4)事實(shí)上是Flt4的非人相應(yīng)物。prepro-VEGF-C推定的氨基酸序列在本文中以SEQ ID NO21提供。
命名為血管內(nèi)皮生長因子D(VEGF-D)的第二種Flt4配體的詳細(xì)描述，以及編碼VEGF-D的人多核苷酸序列，和VEGF-D變異體和類似物在申請日為1997年8月21日且作為國際公開號WO 98/07832于1998年2月26日公開的國際專利申請?zhí)朠CT/US97/14696；和Achen，等，Proc.Nat′l Acad.Scu.U.S.A.，95(2)548-553(1998)中提供，也在本文中引用以供參考。正如其中的詳細(xì)說明，人VEGF-D首先作為354個(gè)氨基酸的prepro-VEGF-D多肽在人細(xì)胞中產(chǎn)生。prepro-VEGF-D的cDNA和推定的氨基酸序列在本文中以SEQ ID NO22描述。來自其它物種的VEGF-D序列也有報(bào)導(dǎo)。參見例如，Genbank登錄號D89628(Mus musculus)；和AF014827(Rattus norvegicus)，本文引用以供參考。
prepro-VEGF-D多肽具有21個(gè)氨基酸的推定信號肽且以與prepro-VEGF-C的加工類似的方式明顯通過蛋白酶解加工。缺少SEQ ID NO22的殘基1-92和202-354的“重組成熟”VEGF-D保留激活受體VEGFR-2和VEGFR-3的能力，且似乎作為非共價(jià)相連的二聚體締合。VEGF-D多肽作為本發(fā)明的Flt4結(jié)合化合物的用途與上文對VEGF-C所述類似。同樣，預(yù)期對VEGF-D的類似改變(除去VEGF同源性結(jié)構(gòu)域中8個(gè)保守半胱氨酸的第二個(gè)，即Cys136，或除去蛋白酶解加工位點(diǎn))將導(dǎo)致多肽的VEGFR-2結(jié)合親和性降低或消失，從而增加Flt4的特異性。修飾成保留Flt4結(jié)合親和性但不能激活Flt4自身磷酸化的VEGF-D分子在本文所述的治療方法中是有用的Flt4拮抗劑。
實(shí)施例18小鼠Flt4 cDNA探針的克隆來自129SV小鼠的λFlXII基因組文庫(Stratagene)的大約106個(gè)噬斑用覆蓋胞外域的上述S2.5人Flt4受體cDNA片斷進(jìn)行篩選。也參見Pajusola等，Cancer Res.，525738(1992)。從陽性噬斑亞克隆2.5kb的BamHI片斷并從兩端測序。從該亞克隆，使用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增一個(gè)覆蓋小鼠Flt4cDNA序列的核苷酸1745-2049的外顯子片斷并克隆進(jìn)pBluescript KSII+/-載體(Stratagene)。參見Finnerty等，Oncogene，82293(1993)。
同樣克隆覆蓋核苷酸1-192的第二個(gè)片斷。
實(shí)施例19小鼠組織中Flt4 mRNA的分析按照Chomczynski等，Anal.Biochem.，162156(1987)所述從發(fā)育中的胚胎(交配后8-18天和年齡為1天的小鼠)中分離總RNA。來自交配后8天的胚胎樣品也包括胎盤。
對于Rnase保護(hù)分析，使用[32P]-UTP和用于反義方向的T7聚合酶從實(shí)施例18獲得的線型化鼠類Flt4質(zhì)粒產(chǎn)生RNA探針。所用的β-肌動(dòng)蛋白探針相應(yīng)于公開的小鼠β-肌動(dòng)蛋白序列的核苷酸1188-1279。參見Tokunaga，等，Nucleic.Acid.Res.，142829(1986)。在6％聚丙烯酰胺/7M尿素凝膠中純化后，將標(biāo)記的轉(zhuǎn)錄子與30μg總RNA在52℃下雜交過夜。未雜交的RNA用RNase A(10 U/ml)和T1(1mg/ml)在37℃，pH 7.5下消化1小時(shí)。Rnases通過蛋白酶K在37℃下消化15分鐘滅活且該樣品在6％聚丙烯酰胺/7M尿素凝膠中分析。
在本實(shí)驗(yàn)中分析的Flt4的表達(dá)模式表明從肺，肝臟，心，腎，骨骼肌和脾中獲得了極微弱的mRNA信號，而睪丸和腦明顯沒有特異性信號。通過Rnase保護(hù)試驗(yàn)對在小鼠發(fā)育的不同時(shí)期中收集的一系列RNAs的分析表明在從交配后第8天到新出生的小鼠的整個(gè)胚胎發(fā)生中表達(dá)Flt4 mRNA，且信號強(qiáng)度無大的變化。
實(shí)施例20在小鼠胚胎中對Flt4的原位雜交為了更好地將Flt4轉(zhuǎn)錄子定位到細(xì)胞和組織上，將交配后7.5天和8.5天的小鼠胚胎切片與標(biāo)記的Flt4 RNAs雜交。小鼠胚胎從CBA與NMRI小鼠的交配產(chǎn)生。通過頸脫位處死懷孕的小鼠且立即冷凍胚胎或者通過磷酸鹽緩沖液轉(zhuǎn)移進(jìn)4％低聚甲醛中。胚胎和分離的小鼠器官在4℃下固定18小時(shí)，脫水，包埋于石蠟中，并切成6μm的切片。
192個(gè)和305個(gè)核苷酸的RNA探針(反義和有義)(見實(shí)施例18)使用[35S]-UTP從線形化質(zhì)粒產(chǎn)生。對切片的原位雜交按照Wilkinson等，Development，99493(1987)；和Wilkinson等，Cell，5079(1987)所述進(jìn)行，本文引用它們以供參考，并采用下列改良1)在石蠟包埋前使用二甲苯代替甲苯；2)切成6μm的切片，放在用2％3-三乙氧基甲硅烷基丙胺預(yù)處理的載玻片表面的二乙基焦碳酸酯處理的水層上；3)省去對該探針的堿性水解；和4)高度嚴(yán)格洗滌是在含有30mM DTT和1x SSC的溶液中在65℃下80分鐘。該切片用NTB-2乳劑(Kodak)覆蓋且在4℃下儲存。載玻片曝光14天，顯影，并用蘇木精染色。用有義鏈進(jìn)行的對照雜交和RNAse A-處理的切片中未產(chǎn)生超出背景的特異性信號。
在交配后7.5天的小鼠胚胎中未檢測到Flt4 mRNA表達(dá)，但在發(fā)育的第8.5天在發(fā)育中的主動(dòng)脈中檢測到明亮的信號。相反，發(fā)育中的卵黃囊為Flt4-陰性。在胚外組織中，在尿囊中顯著表達(dá)Flt4，而發(fā)育中的卵黃囊血島為陰性。另一方面，頭間充質(zhì)的成血管細(xì)胞為強(qiáng)烈的Flt4-陽性。在發(fā)育中的胎盤中，首先在外周靜脈竇中可見Flt4信號。在交配后9.5天的胎盤中，靜脈竇內(nèi)皮和與Reichert′s膜部分融合的巨細(xì)胞表達(dá)Flt4 mRNA。
因此，盡管在最早的內(nèi)皮細(xì)胞前體，即成血管細(xì)胞中Flt4的表達(dá)非常顯著，但是似乎僅局限于交配后8.5天的胚胎的某些血管中。已知在發(fā)育中的小鼠胚胎的所有內(nèi)皮細(xì)胞中都表達(dá)Tie受體，因此為這些細(xì)胞提供了一個(gè)標(biāo)記。參見Korhonen，等，Oncogene，8395(1993)；和Korhonen等，Blood.802548-2555(1992)。顯然，與Tie探針相反，F(xiàn)lt4探針與交配后11.5天的胚胎的動(dòng)脈內(nèi)皮，例如與發(fā)育中的背主動(dòng)脈或頸動(dòng)脈內(nèi)皮雜交極弱。相反，F(xiàn)lt4信號在發(fā)育中的靜脈中更顯著得多。例如，在圍繞發(fā)育中的后腎的靜脈中檢測到Flt4信號，而Tie探針主要識別后腎內(nèi)的毛細(xì)血管。
觀察到Flt4 mRNA分布在交配后12.5天的小鼠胚胎的一些區(qū)域，特別是在腋區(qū)的擴(kuò)張血管中特別顯著。在頸區(qū)的中部矢狀切片中可見相似的Flt4-陽性血管結(jié)構(gòu)(數(shù)據(jù)未顯示)。表達(dá)Flt4的血管的血管叢樣方式出現(xiàn)在眶周區(qū)和圍繞發(fā)育中的脊椎。另外，位于發(fā)育中的皮膚正下方，有明顯的Flt4-陽性血管網(wǎng)。在包括發(fā)育中的大腦的一些區(qū)域獲得了較弱的毛細(xì)血管信號。在頸區(qū)小血管中，在發(fā)育中的鼻口部的小血管中和在發(fā)育中的舌基部以及在尾區(qū)也可檢測到Flt4 mRNA。另外，肝臟為點(diǎn)狀方式的Flt4 mRNA強(qiáng)陽性。
在進(jìn)一步的發(fā)育期間，F(xiàn)lt4 mRNA似乎變得更局限于胚胎的某些血管。交配后14.5天的胚胎恰好表現(xiàn)出這種限制表達(dá)方式。在該胚胎的中間矢狀切片中，在其前面部分沿發(fā)育中的脊柱觀察到最顯著的Flt4信號。認(rèn)為該信號來源于胸導(dǎo)管的內(nèi)皮細(xì)胞，胸導(dǎo)管是在該發(fā)育時(shí)期形成的最大淋巴管。相反，背主動(dòng)脈和下腔靜脈為陰性。腸系膜區(qū)擴(kuò)張的血管也是Flt4強(qiáng)陽性。另外，與交配后12.5天的胚胎一樣，沿眶周，下顎，以及頸區(qū)的解剖學(xué)邊界的血管網(wǎng)含有Flt4陽性內(nèi)皮。在圍心腔和在全部皮下組織中存在相似結(jié)構(gòu)。顯然，與Flt4-陰性血管相反，所有Flt4-陽性血管在其腔內(nèi)沒有血細(xì)胞。這些表達(dá)方式表明Flt4變得局限于該發(fā)育時(shí)期的淋巴管內(nèi)皮。我們觀察到Flt4表達(dá)的另一位點(diǎn)在發(fā)育中的骨髓竇狀隙中。
也分析了交配后16.5天的胚胎胸腔上部的橫切面與Flt4探針的雜交。進(jìn)行蘇木精-曙紅染色以觀察該區(qū)域的不同血管類型。它們包括頸動(dòng)脈和頭臂動(dòng)脈，靜脈腔，和胸導(dǎo)管，其中胸導(dǎo)管較小且沒有圍繞的肌肉和結(jié)締組織。在更高放大倍數(shù)下觀察到胸導(dǎo)管以及附近的小血管的內(nèi)皮細(xì)胞與Flt4探針雜交。
實(shí)施例21在培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞中分析Flt4 mRNA實(shí)施例20中所述的原位雜交結(jié)果表明在靜脈內(nèi)皮細(xì)胞及后來在淋巴管和一些靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)Flt4，但在動(dòng)脈內(nèi)皮中不表達(dá)。為了確定在體外是否維持該調(diào)控，我們使用Northern印跡和雜交分析研究了培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞。
從人主動(dòng)脈，股靜脈，臍靜脈，和從包皮微血管分離內(nèi)皮細(xì)胞，培養(yǎng)并按本領(lǐng)域以前所述鑒定。參見Van Hinsberg等，Arteriosclerosis，7389(1987)；和Van Hinsberg，等，Thromb.Haemostas，57148(1987)。在5至8代(分裂比率為1∶3)后達(dá)到匯合密度時(shí)將它們用于分離多聚腺苷化RNA。
內(nèi)皮細(xì)胞系EA hy926(Edgell等，Proc.Natl.Acad.Sci.，803734-3737(1983))，BCE(Folkman等，Proc.Natl.Acad.Sci.，765217-5221(1979))和LEII(Schreiber等，Proc.Natl.Acad.Sci.，826138(1985))不表達(dá)Flt4。然而，培養(yǎng)的人微血管，靜脈和臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞為Flt4-特異性5.8和4.5kb mRNAs陽性，而主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞為陰性。相反，另一內(nèi)皮受體酪氨酸激酶基因Tie作為4.4kb mRNA在所有試驗(yàn)的內(nèi)皮細(xì)胞類型中都表達(dá)。
實(shí)施例22成人組織中的Flt4 mRNA實(shí)施例20中獲得的結(jié)果表明Flt4 mRNA變得大部分局限于發(fā)育期間的淋巴管內(nèi)皮。由于該發(fā)現(xiàn)在人體中的潛在意義，我們還使用人Flt4探針研究了在成人組織中Flt4的表達(dá)。所用的人Flt4探針是覆蓋cDNA堿基對1-595(SEQ ID NO1)的EcoRI-SphI片斷。也參見Pajusola等，Cancer Res.，525738(1992)。Von Willebrand因子探針是覆蓋堿基對1-2334的EcoRI-HindIII片斷。Bonthron，等，Nucleic Acids Res.，1417125(1986)。
我們使用常規(guī)固定的材料進(jìn)行了組織病理學(xué)診斷。正常肺組織從患有表皮樣癌的左側(cè)下肺葉切除術(shù)獲得。腸系膜和腸系膜淋巴結(jié)從患有結(jié)腸腺癌的患者獲得。鄰近唾液腺的正常淋巴結(jié)由于其異常大小而被摘除。來自兩個(gè)病人的扁桃體和兩個(gè)闌尾無診斷改變。研究的兩個(gè)淋巴管肌瘤和三個(gè)膽囊淋巴管瘤具有相似的結(jié)果。
對于人體組織，用10％福爾馬林固定的常規(guī)樣品用于組織病理學(xué)診斷，正常的原位雜交法正好產(chǎn)生背景，而微波處理代替蛋白酶K能夠特異性雜交。Shi，等，J.Biol.Chem.，2665774(1991)；Catoretti，等，J.of Pathol.，168357(1992)。
在腸系膜，肺和闌尾淋巴管內(nèi)皮中產(chǎn)生Flt4信號，而靜脈，動(dòng)脈和毛細(xì)血管為陰性。為了研究Flt4是否在HEVs中表達(dá)，研究了扁桃體。事實(shí)上，在扁桃體中，在一些HEVs中檢測到Flt4-特異性放射自顯影顆粒。
實(shí)施例23分析正常和轉(zhuǎn)移性淋巴結(jié)和淋巴管瘤中的Flt4 mRNA分析了部分人腸系膜淋巴結(jié)(見實(shí)施例22)的Flt4表達(dá)。在淋巴竇和輸入及輸出淋巴管中觀察到Flt4表達(dá)。在含有腺癌轉(zhuǎn)移瘤的淋巴結(jié)中觀察到相同的方式。在正常和轉(zhuǎn)移性淋巴結(jié)的一些HEVs中也呈陽性。與所有血管中vonWillebrandt因子的原位信號相比顯而易見的是在膽囊淋巴管瘤中Flt4的表達(dá)是淋巴管內(nèi)皮特有的。
與這些結(jié)果一致，在皮膚淋巴管瘤(一種以推測的淋巴管內(nèi)皮增生為特征的罕見疾病)的內(nèi)皮中對Flt4的免疫染色呈強(qiáng)陽性。參見Lymboussaki等，Am.J.Pathol.，153(2)395-403(1998年8月)，本文引用以其整體作為參考。
另外，對Flt4的免疫染色在卡波西肉瘤皮膚結(jié)狀病灶組織樣品內(nèi)鑒定到紡錘形細(xì)胞。參見Jussila等，Cancer Res.，581599-1604(1998年4月)。鑒于Flt4的明顯淋巴管特異性，可認(rèn)為這些結(jié)果與卡波西肉瘤中某些細(xì)胞具有淋巴管內(nèi)皮起源的觀點(diǎn)一致。參見，例如，Beckstead等，Am J.Pathol.，119294-300(1985)；和Dictor等，Am J.Pathol.，130411-417(1988)。
實(shí)施例24Flt4定位于胎兒內(nèi)皮細(xì)胞正如實(shí)施例2所述，編碼短鏈形式的40個(gè)羧基末端氨基酸的Flt4 cDNA片斷作為657bp的EcoRI片斷克隆進(jìn)pGEX-1λT細(xì)菌表達(dá)載體(Pharmacia)的谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶編碼區(qū)的閱讀框內(nèi)。在大腸桿菌中生產(chǎn)所得的GST-Flt4融合蛋白并使用谷胱甘肽-瓊脂糖4B柱通過親和色譜法純化。凍干純化的蛋白，溶于PBS中，與Freund′s佐劑混合，并用于免疫兔。使用第三次加強(qiáng)免疫后的抗血清。
從用前列腺素誘導(dǎo)的合法流產(chǎn)獲得17和20周大的人胎兒組織。本研究由郝爾辛基大學(xué)中心醫(yī)院的倫理委員會批準(zhǔn)。從胎兒足長度估計(jì)妊娠年齡。將胎兒組織包埋于Tissue-Tek(Miles)中，立即冷凍，并儲存在-70℃。
抗-Flt4抗血清與GST-瓊脂糖柱交叉吸附以去掉抗-GST-抗體并然后通過GST-Flt4親和色譜法純化。用丙酮固定一些6μm厚的恒冷箱組織切片并用在甲醇中的0.3％H2O2處理30分鐘以抑制內(nèi)源性過氧化物酶活性。洗滌后，用5％正常豬血清溫育該切片。然后用抗Flt4抗體溫育切片并洗滌。用過氧化物酶偶連的豬抗兔IgG隨后通過使用0.2％3，3-二氨基聯(lián)苯胺(Amersham)作底物染色過氧化物酶活性檢測結(jié)合的抗體。切片在Meyer′s蘇木精中復(fù)染。
人胎兒腸系膜的抗-Flt4免疫過氧化物酶染色表明在一些血管的內(nèi)皮上存在Flt4蛋白，而用抗原封閉的抗-Flt4抗體和免疫前的血清進(jìn)行的對照染色為陰性。為了進(jìn)行比較，用抗因子VIII-相關(guān)性抗原的抗血清染色切片，該抗原是血管內(nèi)皮細(xì)胞特有的。在不含紅血細(xì)胞的血管內(nèi)皮細(xì)胞中觀察到對Flt4的免疫過氧化物酶染色，而血管為陰性。無紅血細(xì)胞的血管很可能是淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞；該血管在腸系膜中特別常見。抗因子VIII相關(guān)性抗原的抗體染色所有血管中的內(nèi)皮細(xì)胞。
實(shí)施例25抗Flt4單克隆抗體的生產(chǎn)融合I通過在High-Five細(xì)胞中表達(dá)Flt4EC-6xHis-pVTBac質(zhì)粒構(gòu)建體(實(shí)施例14)生產(chǎn)重組Flt4胞外域蛋白。使用Ni-NTA親和色譜法按照廠商的指導(dǎo)(Qiagen)結(jié)合并洗脫重組Flt4胞外域的COOH-末端編碼的6xHis標(biāo)記從感染的High-Five細(xì)胞的培養(yǎng)基純化Flt4胞外域(Flt4EC)。
通過腹膜內(nèi)注射用Freund′s完全佐劑乳化的純化重組產(chǎn)生的Flt4胞外域蛋白(150μg/只小鼠)免疫4月齡Balb/c雄性小鼠。以3到4周的間隔給予150μg的加強(qiáng)注射且在另一3周間隔后給予最后加強(qiáng)(10μg Flt4 EC溶于PBS中，腹膜內(nèi)給藥)。最后加強(qiáng)劑量4天后，處死小鼠且將小鼠脾淋巴細(xì)胞與SP 2/0漿細(xì)胞瘤細(xì)胞分別以2∶1的比率融合。
在96-孔培養(yǎng)板(NUNC)中在含有20％胎牛血清和HAT添加劑(次黃嘌呤-氨基蝶呤-胸苷；GIBCO，043-01060H；稀釋50倍)的Ex-Cell 320培養(yǎng)基(SERALAB)中收獲融合細(xì)胞。細(xì)胞在+37℃下，5％ CO2的空氣中培養(yǎng)。10天后，將添加了HAT的培養(yǎng)基更換成補(bǔ)充了HT的細(xì)胞培養(yǎng)基(GIBCO；043-01065H，稀釋50倍)。HT培養(yǎng)基與HAT培養(yǎng)基相同，但缺少氨基蝶呤。
在3周時(shí)，通過下面實(shí)施例26所述的抗原特異性ImmunoFluoroMetric試驗(yàn)(IFMA)測定特異性抗體的產(chǎn)量。按Staszewski等，Yale Journal of Biologyand Medicine，57865-868(1984)所述的有限稀釋法克隆該主克隆。將陽性克隆傳代到24-孔組織培養(yǎng)板(NUNC)上，再克隆，并按相同方法再檢驗(yàn)。通過熒光激活細(xì)胞分類術(shù)(FACS)檢測陽性克隆。
除了一個(gè)克隆產(chǎn)生很可能屬于IgA型的Ig外，穩(wěn)定克隆分泌的免疫球蛋白屬于IgG1類型。使用針對小鼠亞類的大鼠單克隆抗體作為IFMA中的生物素偶連物(SEROTEC)測定單克隆抗體的亞類。
使用Balb/c小鼠在腹水中產(chǎn)生單克隆抗體。將上述雜交瘤腹膜內(nèi)注射進(jìn)用降植烷(2，6，10，14-四甲基十五烷98％，ALDRICH-CHEMIE D7924Steinheim，Cat.No.T 2，280-2)預(yù)處理動(dòng)物后的小鼠中。在雜交瘤細(xì)胞前大約兩周注射0.5ml降植烷(i.v.)。注射的細(xì)胞量是每只小鼠大約7.5到9×106個(gè)。注射雜交瘤后10至14天收集腹水。
融合II通過用Freund′s完全佐劑乳化的重組產(chǎn)生的Flt4胞外域蛋白(20μg/只小鼠)腹膜內(nèi)注射免疫兩個(gè)月大的Balb/c小鼠(雌性)。以3到4周的間隔給予20μg的加強(qiáng)注射且在另一3周間隔后給予最后加強(qiáng)(10μg Flt4溶于PBS中，i.v.給藥)。最后加強(qiáng)給藥4天后，處死小鼠且將小鼠脾淋巴細(xì)胞與SP 2/0漿細(xì)胞瘤分別以2∶1的比率融合。
在96-孔培養(yǎng)板(FALCON)中在含有20％胎牛血清和HAT添加劑(次黃嘌呤-氨基蝶呤-胸苷；GIBCO BRL 21060-017；稀釋1∶50倍)的OptiMEM 1(含有Glutamax，1，51985-026，GIBCO BRL)中收獲融合細(xì)胞。細(xì)胞在37℃下，5％CO2的空氣中培養(yǎng)。10天后，將添加了HAT的培養(yǎng)基更換成補(bǔ)充了HT的細(xì)胞培養(yǎng)基(GIBCO BRL；41065-012，稀釋1∶50倍)。
在3周時(shí)，通過下面實(shí)施例26所述的抗原特異性ImmunoFluoroMetric試驗(yàn)(IFMA)測定特異性抗體的產(chǎn)量。按Staszewski等，(1984)所述的有限稀釋法克隆該主克隆。將陽性克隆傳代到24-孔組織培養(yǎng)板(FALCON)上，再克隆，并按相同方法再檢驗(yàn)。通過FACS檢測陽性克隆。
2E11和6B2克隆分泌屬于IgG1型的免疫球蛋白，2B12克隆產(chǎn)生屬于亞類IgM的Ig。使用抗小鼠亞類重鏈的大鼠單克隆抗體作為IFMA中的生物素偶連物(SEROTEC)測定小鼠亞類IgG1且使用小鼠單克隆抗體同種型分類試劑盒(Dipstick Format)(19663-0 12，Life Technologies Inc.)測定小鼠亞類IgM。
實(shí)施例26抗Flt4單克隆抗體的特異性純化的，重組Flt4胞外域-6xHis融合產(chǎn)物(按實(shí)施例14和25所述生產(chǎn))按Mukkala等，Anal.Biochem，176(2)319-325(1989)所述用銪標(biāo)記，并采用如下改良將過量250倍摩爾數(shù)的異硫氰酸DTTA-Eu(N1螯合物，WALLAC，F(xiàn)inland)加入Flt4溶液(0.5mg/ml溶于PBS)中且通過加入0.5M碳酸鈉緩沖液，pH9.8將pH調(diào)節(jié)到大約9。在+4℃下進(jìn)行標(biāo)記過夜。使用以TSA緩沖液(50mM Tris-HCl，pH7.8，含有0.15M NaCl)作洗脫劑的PD-10(PHARMACIA，Sweden)去掉未結(jié)合標(biāo)記。
純化后，將1mg/ml牛血清白蛋白(BSA)加入標(biāo)記的Flt4中且標(biāo)記物在+4℃下儲存。通過測量該熒光與已知EuCl3標(biāo)準(zhǔn)的比率(Hemmila等，Anal.Biochem.，137335-343(1984))測定為，每個(gè)Flt4分子摻入的銪離子的平均數(shù)目為1.9。
使用兔抗小鼠Ig(Z 259，DAKOPATTS)覆蓋的微量滴定條孔(NUNC，polysorb)，使用夾心式免疫熒光測定試驗(yàn)篩選實(shí)施例25中產(chǎn)生的抗體。通過Platewash 1296-024(WALLAC)用DELFIA洗滌溶液將預(yù)覆蓋的孔洗滌一次。DELFIA測定緩沖液用作細(xì)胞物培養(yǎng)上清和脾切除的小鼠血清的稀釋緩沖液(以1∶1000至1∶100,000的稀釋度)，其中脾切除的小鼠血清用作初步篩選試驗(yàn)的陽性對照。
通過在Plateshake搖床(1296-001，WALLAC)上搖動(dòng)5分鐘開始在+4℃下過夜溫育(或者在室溫下溫育2小時(shí))，接著按上文所述用洗滌溶液洗滌4次。
在100μl測定緩沖液中以1∶500的稀釋度加入銪標(biāo)記的Flt4。在Plateshake搖床上5分鐘和在室溫下溫育1小時(shí)后，按上文所述洗滌滴定條。
以200μl/孔加入增強(qiáng)溶液(DELFIA)。然后在Plateshake搖床上搖動(dòng)平板5分鐘，通過ARCUS-1230(WALLAC)10-15分鐘測量熒光的強(qiáng)度。(Lovgren等，見Collins W.P.(編)Alternative Immunoassays，John Wiley & Sons Ltd.(1985)，第203-216頁)。DELFIA結(jié)果表明試驗(yàn)的所有單克隆抗體結(jié)合Flt4 EC抗原。選擇與Flt4反應(yīng)的單克隆抗體(和產(chǎn)生該抗體的雜交瘤)用于進(jìn)一步篩選。
所得的單克隆抗體用于雙抗體免疫熒光染色表達(dá)LTR-FLT41構(gòu)建體的NIH3T3細(xì)胞和新霉素抗性轉(zhuǎn)染的NIH3T3細(xì)胞。使用EDTA從培養(yǎng)板分離該細(xì)胞，染色，并在熒光激活細(xì)胞分選儀(FACS)上分析。FACS分析的結(jié)果以所示單克隆抗體染色陽性的細(xì)胞百分?jǐn)?shù)提供(見下文表2)。
a)LTR轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的FACS結(jié)果b)NEO細(xì)胞的FACS結(jié)果(對照)LTR-FLT41-轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的FACS結(jié)果表明該抗體有效識別Flt4-表達(dá)細(xì)胞。同一抗體對新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶轉(zhuǎn)染的NIH3T3細(xì)胞僅產(chǎn)生背景染色。因此，該抗體特異性識別細(xì)胞表面的Flt4酪氨酸激酶。
發(fā)現(xiàn)命名為抗-Flt4雜交瘤9D9F9的一個(gè)克隆穩(wěn)定分泌通過IFMA測定為屬于免疫球蛋白類型IgG1的單克隆抗體。雜交瘤9D9F9于1995年3月23日保藏在德國微生物和細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心，人和動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物和病毒部，Mascheroder Weg lb，3300 Braunschweig，Germany，且給定保藏號為ACC2210。
融合II抗體還使用了上述銪標(biāo)記的Flt4胞外域蛋白篩選實(shí)施例25所述的融合II抗體。使用兔抗小鼠Ig(Z 259，DAKO)覆蓋的微量滴定孔(Nunc，Polysorb)，使用Flt4-特異性IFMA篩選該抗體。通過使用DELFIA Plate洗滌用洗滌溶液(Wallac)洗滌預(yù)覆蓋的孔一次。
DELFIA試驗(yàn)緩沖液用作細(xì)胞培養(yǎng)物上清(在初步篩選中稀釋度為1∶2)和脾切除的小鼠血清(稀釋度從1∶1000到1∶100,000)的稀釋緩沖液，其中脾切除的小鼠血清用作陽性對照。作為標(biāo)準(zhǔn)，使用濃度在1.0ng/ml和250ng/ml之間的純化抗-Flt4 9D9F9(小鼠亞類IgG1)。樣品首先在Plateshake搖床上室溫下?lián)u動(dòng)5分鐘，然后在+4℃下溫育大約18小時(shí)。首先洗滌支架4次，然后加入Eu-標(biāo)記的Flt4(1∶2000，在100μl測定緩沖液中)，最后在室溫下溫育支架1小時(shí)。按所述方法洗滌后，加入增強(qiáng)溶液(200μl/孔，Wallac)，并在Plateshake搖床上搖動(dòng)支架5分鐘。通過ARCUS-1230(Wallac)測量熒光強(qiáng)度。選擇與Flt4反應(yīng)的單克隆抗體在采用表達(dá)Flt4的NIH3T3細(xì)胞的雙抗體免疫熒光染色測定法中按上文所述進(jìn)一步篩選。
所得的融合II的抗Flt4單克隆抗體和相應(yīng)的FACS分析結(jié)果(表示為用所示單克隆抗體染色陽性的細(xì)胞百分?jǐn)?shù))在表3中總結(jié)。
使用親和純化的抗-Flt4 9D9F9制備用于定量抗-Flt4抗體的標(biāo)準(zhǔn)曲線。線型范圍達(dá)到從1.0ng/ml到250ng/ml。
在表面表達(dá)全長Flt4的用pLTRFLT41構(gòu)建體共轉(zhuǎn)染的NIH3T3細(xì)胞的溶胞產(chǎn)物在6.5％SDS-PAGE上電泳，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝化纖維素硝酸鹽膜(0.45μm，SCHLEICHER & SCHUELL)上且用含單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)物上清(1∶10，在含有甲醇4％，SDS 0.04％的50mM TRIS-40mM甘氨酸緩沖液中)免疫印跡。使用與HRP-偶連的兔抗小鼠Ig(P161，DAKO，在含有150mM鹽水，5％奶粉的20mM TRIS緩沖液，pH7.5中1∶1000稀釋)和ECL(增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光，AMERSHAM)溫育檢測單克隆抗體的特異性。％a
a)LTR轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的FACS結(jié)果b)NEO細(xì)胞的FACS結(jié)果(對照)c)基于親和純化的抗-FLT 9D9F9抗體用作標(biāo)準(zhǔn)定量的Mab產(chǎn)量NF在FACS中不起作用WB成功用于Western免疫印跡實(shí)施例27使用抗-Flt4抗體鑒定在細(xì)胞溶胞產(chǎn)物中和在人組織淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)的Flt4前面實(shí)施例所述的雜交瘤9D9生產(chǎn)的單克隆抗體用于免疫沉淀和Western印跡HEL細(xì)胞的溶胞產(chǎn)物。正如實(shí)施例6的報(bào)道，以前在HEL細(xì)胞中觀察到Flt4 mRNA的表達(dá)。大約2×107個(gè)培養(yǎng)的HEL細(xì)胞在實(shí)施例11限定的RIPA緩沖液中裂解并用大約2微克的9D9抗體(按實(shí)施例11對多克隆抗體所述)免疫沉淀。對于Western分析，通過SDS-PAGE(6％凝膠)電泳免疫沉淀并電印跡到硝酸纖維素膜上。使用1微克/ml 9D9抗體的稀釋液在免疫沉淀的Western印跡分析中檢測相應(yīng)于Flt4多肽的175kD和125kD的多肽帶。
使用9D9單克隆抗體和堿性磷酸酶ABC-AP試劑盒(Dako)進(jìn)行人皮膚組織的免疫染色。簡單地說，含有6μm成人皮膚樣品的載玻片在室溫(RT)下干燥30分鐘，用冷丙酮固定10分鐘，然后用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌一次5分鐘。然后將樣品在RT下用2％馬血清溫育30分鐘并在PBS中洗滌3次5分鐘。
對于免疫染色，將樣品與9D9第一抗體在室溫下溫育1小時(shí)并用PBS洗滌3次5分鐘。洗滌后，樣品與生物素標(biāo)記的兔抗小鼠第二抗體在室溫下溫育30分鐘，并再用PBS洗滌3次5分鐘。
通過用ABC-AP復(fù)合物在室溫下溫育樣品30分鐘，用PBS洗滌3次，用AP-底物(Sigma Fast Red TR/Naphtol AS-MX(Cat.No.F-4648))室溫下溫育15分針，并用水漂洗可檢測結(jié)合的抗體。然后用Mayer′s蘇木精復(fù)染樣品30秒并用水漂洗。使用水封固并蓋上蓋玻片，在顯微鏡下分析該樣品。觀察這些人皮膚切片中淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞的9D9抗體染色。血管內(nèi)皮顯示出極弱的染色或無染色。進(jìn)一步的分析用于證實(shí)淋巴管內(nèi)皮的明顯特異性。參見Lymboussaki等，Am.J.Pathol.，153(2)395-403(1998年8月)；和Jussila等，Cancer Res.，581599-1604(1998年4月)，本文引用這兩篇文獻(xiàn)以其整體作為參考。
這些結(jié)果還證實(shí)了Flt4作為淋巴管內(nèi)皮的有用標(biāo)記的用途和抗-Flt4抗體用于鑒定和觀察組織樣品在這些細(xì)胞中表達(dá)的Flt4的用途。
實(shí)施例28VEGF-C/VEGFR-3信號途徑在乳腺癌血管生成中的增量調(diào)節(jié)上面的實(shí)施例證實(shí)了Flt4(VEGFR-3)用作正常組織淋巴管內(nèi)皮的特異性抗原標(biāo)記。下列方法還證實(shí)了VEGFR-3用作抗原標(biāo)記(例如，用于診斷和篩選)和作為惡性乳腺腫瘤的治療靶。與組織學(xué)上正常的乳腺組織相比在侵襲性乳腺癌中發(fā)現(xiàn)VEGFR-3陽性血管大量增多(P＜0.0001)。
材料和方法新鮮冷凍的乳腺組織樣品從郝爾辛基大學(xué)病理學(xué)系的病例中取回。樣品由導(dǎo)管癌(n＝6)，小葉癌(n＝6)，管內(nèi)癌(n＝8)，纖維腺瘤(n＝4)，和組織學(xué)正常的乳腺組織(n＝12)組成。所有樣品在手術(shù)切除后立即在液氮中冷凍，并存儲在-70℃。
抗人Flt4(VEGFR-3)的小鼠單克隆抗體(Mabs)基本上按前面實(shí)施例，例如實(shí)施例25所述生產(chǎn)。VEGFR-3胞外域蛋白(VEGFR-3EC)通過在昆蟲細(xì)胞中的重組桿狀病毒表達(dá)，從培養(yǎng)基中純化。然后使用標(biāo)準(zhǔn)方法生產(chǎn)抗VEGFR-3EC的小鼠單克隆抗體且通過蛋白質(zhì)A親和色譜法從雜交瘤腹水液或Tecnomouse培養(yǎng)物上清純化該免疫球蛋白餾分。
空氣干燥5μm的組織樣品冷凍切片并在冷丙酮中固定10分鐘。切片在磷酸鹽緩沖液(PBS)中再水合并在5％正常馬血清中室溫下溫育30分鐘。然后在潮濕大氣中室溫下用Mabs 9D9F9(實(shí)施例26)以1.0μg/ml的濃度溫育切片2小時(shí)。還研究了抗VEGFR-3EC不同表位的其它抗-VEGFR-3 Mab；克隆2E11D11(實(shí)施例26)和7B8F9(基本上按實(shí)施例26所述制備)分別以9.5和8.5μg/ml的濃度使用。隨后在生物素標(biāo)記的抗小鼠血清中溫育30分鐘，接著使用Vectastain Elite Mouse IgG ABC試劑盒的試劑(Vector laboratories，Burlingame，USA)溫育60分鐘。用3-氨基-9-乙基咔唑(AEC，Sigma，St.Louis，USA)顯色過氧化物酶活性10分鐘。最后，用蘇木精染色切片20秒。通過省去第一抗體，或者通過使用相同同種型的無關(guān)第一抗體進(jìn)行陰性對照。使用純化的桿狀病毒免疫原封閉9D9抗體的結(jié)合作為另一陰性對照。在這些實(shí)驗(yàn)中，抗體與在PBS中過量10倍摩爾數(shù)的VEGFR-3EC蛋白質(zhì)溫育過夜。在+4℃下以4000rpm離心4分鐘后，小心收集上清，然后用作第一抗體。與用抗-VEGFR-3抗體染色的切片鄰近的5μm冷凍切片用于免疫染色血管內(nèi)皮標(biāo)記PAL-E(0.15μg/ml，Monosan，Uden，荷蘭)，層粘連蛋白(1∶4000稀釋的克隆LAM-89上清，Sigma，St Louis，MO)，膠原蛋白XVIII(1.9μg/ml)，α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(SMA，0.5μg/ml，克隆1A4，Sigma)，VEGFR-1(1∶200稀釋的克隆19上清)或VEGFR-2(1∶100稀釋)。
染色程序后對所有樣品進(jìn)行病理學(xué)檢查。按照Gasparini和Harris.[Gasparini G，和Harris A，J Clin.Oncol.，13765-782(1995)]推薦的指導(dǎo)從PAL-E染色的載玻片[de Waal等，Am.J.Pathol.，1501951-1957(1997)]獲得血管密度。以相同的方式試驗(yàn)VEGFR-3陽性血管的密度。首先在低放大倍數(shù)下瀏覽載玻片，然后通過在最高血管密度的區(qū)域(“血管熱點(diǎn)”)或在具有最高VEGFR-3陽性血管密度的區(qū)域計(jì)數(shù)每個(gè)400x放大倍數(shù)的高倍視野(hpf)中染色血管的數(shù)目來估計(jì)腫瘤內(nèi)的血管密度。每張載玻片最少計(jì)數(shù)5個(gè)視野，隨后平均3個(gè)最高的計(jì)數(shù)。
在兩個(gè)管內(nèi)癌中進(jìn)行雙染色以區(qū)分淋巴管和血管的免疫組織化學(xué)染色。丙酮固定的5μm冷凍切片與抗-PAL-E抗體溫育1小時(shí)，與生物素標(biāo)記的馬抗小鼠抗體(Vectastain Elite Mouse IgG ABC試劑盒，Vector laboratories，Burlingame，USA)溫育30分鐘，與ABC-過氧化物酶(Vectastain，1∶100)溫育45分鐘，最后用AEC顯色10分鐘。對于第二步，用抗-VEGFR-3抗體溫育切片1小時(shí)(0.14μg/ml)，接著用生物素標(biāo)記的抗小鼠抗體溫育30分鐘(1∶200稀釋的克隆上清)，ABC-過氧化物酶溫育30分鐘(1∶100)，含有0.01％過氧化物的生物素標(biāo)記的酪胺(tyramin)溶液(1∶2.000)溫育5分鐘，ABC-堿性磷酸酶(1∶100)溫育20分鐘，并用堅(jiān)牢藍(lán)(Sigma，St.Louis，USA)按照以前文獻(xiàn)中所述的ISH信號增強(qiáng)方法顯色20分鐘。[Kerstens等，J.Histochem.Cytochem.，43347-352(1995)]。與雙染色切片相鄰的冷凍切片(5μm)按上文所述僅用VEGFR-3抗體也進(jìn)行了免疫染色。
在兔中針對相應(yīng)于文獻(xiàn)中所述的成熟分泌的人血管內(nèi)皮生長因子C(VEGF-C)N-末端氨基酸殘基2-18的合成肽(VEGF-C的prepro-VEGF-C多肽的殘基104-120)生產(chǎn)多克隆抗體。[Joukov等，EMBO J.，163898-3911(1997)，本文引用以其整體以供參考]。使用與環(huán)氧活化的瓊脂糖-6B柱偶連的免疫原性多肽親和純化該抗血清并使用以表達(dá)VEGF-C或?qū)φ咋?半乳糖苷酶的腺病毒載體感染的細(xì)胞試驗(yàn)VEGF-C的特異性染色。
選擇8個(gè)管內(nèi)癌和用于分析VEGFR-3的所有侵襲性癌進(jìn)一步分析VEGF-C的表達(dá)?？諝飧稍锱c用抗-VEGFR-3抗體染色的切片相鄰的5微米冷凍切片并在冷丙酮中固定10分鐘。該切片在PBS中再水合并在5％正常山羊血清中溫育30分鐘，然后在潮濕的空氣中室溫下用在PBS中1∶200稀釋的兔抗人VEGF-C多克隆抗體溫育2小時(shí)。隨后在生物素標(biāo)記的抗兔血清中溫育30分鐘，接著使用Vectastain Elite Rabbit IgG ABC試劑盒的試劑(Vector laboratories，Burlingame，USA)溫育60分鐘。該切片按上文所述進(jìn)一步處理。作為陰性對照，使用純化的免疫原封閉VEGF-C抗體的結(jié)合。在這些實(shí)驗(yàn)中，VEGF-C抗體與在PBS中過量10倍摩爾數(shù)的VEGF-C蛋白質(zhì)溫育過夜。在+4℃下以4000rpm離心4分鐘后，小心收集上清并用于免疫染色。
通過用相應(yīng)于人XVIII型膠原蛋白N-末端NC1結(jié)構(gòu)域共有區(qū)域的重組多肽QH48.18[Saarela等，Matrix Biology，16319-28(1998)]免疫小鼠由DiaBor Ltd.(Oulu，F(xiàn)inland)產(chǎn)生抗人XVIII型膠原蛋白的單克隆抗體。通過ELISA試驗(yàn)和使用多肽QH48.18的Western分析且還通過對冷凍人組織切片的免疫熒光染色篩選該克隆。雜交瘤克隆的篩選產(chǎn)生了3個(gè)單克隆抗體，在提及的所有三個(gè)試驗(yàn)(ELISA，Western，免疫熒光染色)中均為陽性。具有最強(qiáng)信號的一個(gè)抗體，DB 144-N2用于隨后的實(shí)驗(yàn)中。它產(chǎn)生與多克隆抗-all hu(XVIII)相同的染色方式(例如，在成人皮膚和腎樣品中)。
結(jié)果A.在組織學(xué)正常的乳腺組織和在良性纖維腺瘤中的VEGFR-3在正常乳腺組織中VEGFR-3的免疫組織化學(xué)染色表明在管間基質(zhì)的毛細(xì)血管中表現(xiàn)出極弱的染色。這些血管不形成任一特異性方式，但是分散在各處的基質(zhì)中。在正常乳腺組織樣品中VEGFR-3陽性血管的密度范圍為每個(gè)hpf從6到17個(gè)，中值為9(n＝12)。大多數(shù)該血管為血管內(nèi)皮標(biāo)記PAL-E和基底層成份膠原蛋白XVIII強(qiáng)染色，表明VEGFR-3在正常乳腺組織的血管中弱表達(dá)。然而，清楚染色VEGFR-3的基質(zhì)中的一些薄血管為PAL-E陰性和XVIII型膠原蛋白弱陽性，表明它們是淋巴管。在良性纖維腺瘤中也同樣發(fā)現(xiàn)了VEGFR-3陽性血管，而其密度(每個(gè)hpf中值為8條血管；范圍為3-19；n＝4)與組織學(xué)正常的乳腺組織(中值8相對于9；P＞0.1，Mann-Whitney檢驗(yàn))沒有區(qū)別。
B.管內(nèi)癌中的VEGFR-3陽性血管在管內(nèi)癌中，觀察到不同方式的強(qiáng)染色VEGFR-3陽性血管。該血管圍繞病變導(dǎo)管形成弓形結(jié)構(gòu)(圖5A)。在相鄰切片的血管內(nèi)皮標(biāo)記PAL-E的染色(圖5B)中也觀察到該“項(xiàng)鏈”形式，表明在毛細(xì)血管內(nèi)皮中VEGFR-3表達(dá)增強(qiáng)。為了更明確地區(qū)分血管和淋巴管和搜尋血管壁中存在的平滑肌細(xì)胞和外膜細(xì)胞，使用抗平滑肌α-肌動(dòng)蛋白(SMA)和基底層成份層粘連蛋白和XVIII型膠原蛋白的抗體進(jìn)行進(jìn)一步染色。根據(jù)該染色，靠近管內(nèi)癌的小血管同時(shí)表達(dá)VEGFR-3和基底層蛋白，但SMA染色更弱，表明它們在血管壁中被外膜細(xì)胞/平滑肌細(xì)胞不完全覆蓋(圖5C-5F中的黑色箭頭)。相反，與管內(nèi)病灶有一些距離的更大血管一般是VEGFR-3陰性，而對層粘連蛋白，膠原蛋白XVIII和SMA為陽性(紅色箭頭)。另外，發(fā)現(xiàn)了VEGFR-3陽性，但對基底層蛋白層粘連蛋白和XVIII型膠原蛋白僅極弱染色且對SMA根本不染色的血管(綠色箭頭)。認(rèn)為它們代表淋巴管。
C.血管和淋巴管的差別雙染色選擇兩個(gè)管內(nèi)癌用于免疫組織化學(xué)雙染色操作以便更清楚地區(qū)分淋巴管與血管。[參見de Waal等，Am.J.Pathol.，1501951-1957(1997)]。使用該方法，將VEGFR-3陽性血管染成藍(lán)色，而PAL-E陽性血管和基底層染成棕色。兩種試驗(yàn)的樣品都表現(xiàn)出相似的染色方式腫瘤充滿導(dǎo)管內(nèi)層的血管主要為PAL E陽性(圖5G和5H中的箭頭)而在管間基質(zhì)中相距短距離的推測為淋巴管的VEGFR-3陽性血管為PAL E陰性(圖5G和5H中的黑色箭頭)。為了排除由于可能的雙染色人為現(xiàn)象造成的錯(cuò)誤判斷，用抗-VEGFR-3單獨(dú)染色相鄰的5μm切片。該染色證實(shí)了一些PAL-E陽性血管也是VEGFR-3陽性。
D.管內(nèi)癌細(xì)胞中的VEGF-C，VEGFR-1，和VEGFR-2及其相鄰血管中的受體抗人VEGF-C的多克隆親和純化抗體用于染色8個(gè)管內(nèi)癌樣品。所有試驗(yàn)的樣品含有至少一些VEGF-C，但是在染色強(qiáng)度和表達(dá)方式上觀察到相當(dāng)大的不均一性。在一些情況下，大多數(shù)癌細(xì)胞為VEGF-C強(qiáng)陽性，而在其它情況下，只有一些癌細(xì)胞產(chǎn)生染色信號。相反，在圍繞病變導(dǎo)管的正常組織中觀察到極少或者沒有染色，盡管在未病變的正常導(dǎo)管上皮中也獲得了微弱的信號。抗原封閉實(shí)驗(yàn)表明VEGF-C染色是特異性的。其它VEGF-C受體，VEGFR-2，以及其它VEGF受體(VEGFR-1)都在鄰近管內(nèi)癌細(xì)胞的相同“項(xiàng)鏈”血管中表達(dá)。
E.VEGFR-3陽性血管和侵襲性乳腺癌中的VEGF-C強(qiáng)染色的VEGFR-3陽性血管也存在于試驗(yàn)的所有侵襲性導(dǎo)管癌和小葉癌中。VEGFR-3陽性血管似乎不形成任何特異性的分布方式；大多數(shù)這種血管也與PAL-E抗原發(fā)生免疫反應(yīng)。在侵襲性乳腺癌中腫瘤內(nèi)VEGFR-3陽性血管密度(中值為21，范圍為每個(gè)hpf有9-56個(gè)血管；n＝12)與正常乳腺組織相比(中值21比9；P＜0.0001，Mann-Whitney檢驗(yàn))顯著提高。有時(shí)，可觀察到癌細(xì)胞侵入VEGFR-3陽性淋巴管中。
在試驗(yàn)的侵襲性癌(n＝12)中VEGF-C的免疫染色差異極大。一些癌細(xì)胞為VEGF-C強(qiáng)陽性，而其它染色極弱，或者在一些情況下觀察不到染色。與管內(nèi)癌一樣，在這些切片的結(jié)締組織中觀察到極少染色或無染色。
上述數(shù)據(jù)揭示了似乎主要是大多數(shù)成人組織中淋巴管內(nèi)皮標(biāo)記的VEGFR-3也在正常乳腺組織的毛細(xì)血管內(nèi)皮中極弱表達(dá)。更有意義的是，在管內(nèi)癌中，在充滿腫瘤的導(dǎo)管內(nèi)層檢測到“項(xiàng)鏈”形式的強(qiáng)染色VEGFR-3陽性血管。這些血管中大多數(shù)表達(dá)血管內(nèi)皮標(biāo)記PAL-E和基底層成份層粘連蛋白和膠原蛋白XVIH，但是比位于離腫瘤細(xì)胞更遠(yuǎn)的血管明顯具有更少的外膜細(xì)胞/平滑肌細(xì)胞，正如使用抗SMA的抗體染色所示。這些特征表明“項(xiàng)鏈”血管正在進(jìn)行血管生成。離病變導(dǎo)管一段距離的第二組血管為VEGFR-3陽性，但對基底層成份為極弱的陽性且為PAL-E陰性，表明它們是淋巴管。這些血管也缺少SMA-陽性外膜細(xì)胞成份。另外在侵襲性乳腺癌中，PAL-E陽性血管增量調(diào)節(jié)VEGFR-3，盡管所見的血管形式在圍繞腫瘤細(xì)胞的結(jié)締組織基質(zhì)中更隨機(jī)地組織。該結(jié)果表明與腫瘤生長相關(guān)的血管生成期間在乳腺癌中增量調(diào)節(jié)VEGFR-3表達(dá)。在原位癌中發(fā)現(xiàn)的VEGFR-3陽性血管的數(shù)目大量提高與這樣的假說一致，即癌細(xì)胞產(chǎn)生可激活緊靠癌細(xì)胞附近的血管生長的因子。
由于VEGF-C以高親和性結(jié)合VEGFR-3和VEGFR-2，且由于管內(nèi)癌和侵襲性癌細(xì)胞通常為VEGF-C蛋白染色陽性，因此該生長因子是癌癥中VEGFR-3和VEGFR2陽性血管的候選生長因子。這些資料與另一研究一致，其中35個(gè)隨機(jī)惡性侵襲性腫瘤(包括乳腺癌，鱗狀細(xì)胞癌，淋巴瘤，黑素瘤，和肉瘤)幾乎一半在Northern印跡分析中含有VEGF-C mRNA。[參見Salven等，Am.R Pathol.，153(1)103-108(1998年7月)，本文引用以其整體作為參考]?？傊?，本文報(bào)道的數(shù)據(jù)提供了用可抑制VEGFR-3和/或VEGFR-2的VEGF-C介導(dǎo)性刺激的試劑治療乳腺癌且可能還有其它非淋巴癌的指征。預(yù)期的抑制劑包括抗-VEGF-C抗體；抗-VEGFR-3抗體；抗-VEGFR-2抗體；與VEGFR-3和VEGFR-2或VEGFR-1之一結(jié)合的雙特異性抗體；結(jié)合循環(huán)VEGF-C的VEGFR-3的可溶性胞外域片段；結(jié)合VEGFR-3和/或VEGFR-2且抑制該受體活化的VEGF-C片段和類似物；結(jié)合VEGFR-3和/或VEGFR-2且與合適的治療劑偶連的VEGF-C多肽，片段，和類似物；VEGFR-3酪氨酸激酶抑制劑；和結(jié)合并抑制這些受體的小分子。另外，由于VEGF-D結(jié)合VEGFR-3和VEGFR-2，預(yù)期抗-VEGF-D抗體和抑制性VEGF-D片段和類似物是合適的抑制劑。人或人源化抗體及其片段對于選擇抗體試劑用于人體治療的情況是優(yōu)選的。另外，作為本發(fā)明的另一方面，可預(yù)期使用任一上述試劑評估體外或體內(nèi)的哺乳動(dòng)物組織用于，例如診斷目的和篩查惡性腫瘤和惡性腫瘤的擴(kuò)散。
對于任一上述試劑，預(yù)期可通過附著一個(gè)可檢測的標(biāo)記，包括但不限于放射性同位素(例如，14C，133I和125I)，發(fā)色團(tuán)(例如，熒光素，藻膽蛋白質(zhì)；四乙基羅丹明；產(chǎn)生用于通過熒光，吸光度，可見色，或凝集作用檢測的熒光或有色產(chǎn)物，產(chǎn)生用于通過電子顯微鏡檢術(shù)檢測的電子密集產(chǎn)物的酶)；或諸如鐵蛋白的電子密集分子，過氧化物酶，或金粒進(jìn)一步改良該試劑用于診斷和篩查。同樣，可通過與諸如植物，動(dòng)物，微生物或真菌來源的毒素的具有抗腫瘤特性的分子；放射性同位素；藥物，酶；和/或細(xì)胞因子及其它治療蛋白連接(例如，偶連)或共同給藥進(jìn)一步改良該試劑用于治療目的。(參見，例如，Pietersz & McKenzie，“治療癌癥的抗體偶連物”，Immunological Reviews，12957-80(1992)，本文引用以供參考。
實(shí)施例29作為人體治療劑給藥的抗-Flt4抗體A.抗-Flt4單克隆抗體的人源化在本文中，例如在實(shí)施例28中報(bào)道的Flt4的生物學(xué)表明了抑制配體介導(dǎo)的Flt4受體信號傳導(dǎo)的Flt4抑制劑(拮抗劑)的治療用途。Flt4-中和抗體包含用作Flt4拮抗劑的一類治療劑。下面的方法用于提高作為人體治療劑的抗-Flt4單克隆抗體的實(shí)用性，通過“人源化”單克隆抗體以提高其血清半壽期并導(dǎo)致它們在人類宿主中具有較小的免疫原性(即，防止對非人抗-Flt4抗體的人抗體反應(yīng))。
人源化的原理在文獻(xiàn)中已有描述且通過抗體蛋白的模塊組裝實(shí)現(xiàn)。為了最小化結(jié)合補(bǔ)體的可能性，優(yōu)選IgG4同種型的人源化抗體。
例如，通過產(chǎn)生含有諸如本文所述的抗-Flt4單克隆抗體的非人目的抗體蛋白的可變區(qū)與人抗體分子恒定區(qū)的嵌合抗體達(dá)到人源化水平。(參見，例如，Morrison和Oi，Adv.Immunol.，4465-92(1989))。Flt4中和抗-Flt4抗體的可變區(qū)從B-細(xì)胞雜交瘤的基因組DNA或者從目的雜交瘤分離的mRNA產(chǎn)生的cDNA中克隆。將V區(qū)基因片段與編碼人抗體恒定區(qū)的外顯子連接，且所得的構(gòu)建體在合適的哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞(例如，骨髓瘤或CHO細(xì)胞)中表達(dá)。
為了實(shí)現(xiàn)更高水平的人源化，僅將編碼非人單克隆抗體基因的抗原結(jié)合互補(bǔ)性決定區(qū)(“CDR”)的那部分可變區(qū)基因片段克隆進(jìn)人抗體序列中。[參見，例如，Jones等，Nature，321522-525(1986)；Riechmann等，Nature，332323-327(1988)；Verhoeyen等，Science，2391534-36(1988)；和Tempest等，BiolTechnology，9266-71(1991)]。如有必要，將圍繞CDR3區(qū)的人抗體的β-折疊結(jié)構(gòu)也修飾成更接近反映原始單克隆抗體的抗原結(jié)合區(qū)的三維結(jié)構(gòu)。(參見，Kettleborough等，Protein Engin.，4773-783(1991)；和Foote等，J.Mol.Biol.，224487-499(1992))。
在另一替代方法中，通過例如，定點(diǎn)誘變改變非人抗體的選定表面殘基，同時(shí)保留非人抗體的所有內(nèi)部和接觸殘基可人源化非人目的單克隆抗體的表面。參見Padlan，Molecular Immunol.，28(4/5)489-98(1991)。
采用上述方法使用Flt4-中和抗-Flt4單克隆抗體和產(chǎn)生它們的雜交瘤，例如抗體9D9F9，以產(chǎn)生人源化的Flt4-中和抗體用作治療或減輕其中Flt4表達(dá)有害的病癥。
B.來自噬菌體展示的人Flt4-中和抗體通過噬菌體展示技術(shù)產(chǎn)生人Flt4-中和抗體，例如按Aujame等，HumanAntibodies，8(4)155-168(1997)；Hoogenboom，TIBTECH，1562-70(1997)；和Rader等，Curr.Opin.Biotechnol.，8503-508(1997)所述，引用所有這些文獻(xiàn)以供參考。例如，F(xiàn)ab片斷形式或連接的單鏈Fv片斷的抗體可變區(qū)與絲狀噬菌體次要外殼蛋白pIII融合。該融合蛋白的表達(dá)及其摻入成熟噬菌體外殼產(chǎn)生在其表面存在抗體且含有編碼該抗體的遺傳材料的噬菌體顆粒。含有該構(gòu)建體的噬菌體文庫在細(xì)菌中表達(dá)，且使用標(biāo)記的或固定的Flt4作為抗原探針淘選(篩選)該文庫的Flt4-特異性噬菌體抗體。
C.來自轉(zhuǎn)基因小鼠的人Flt4-中和抗體基本上按Bruggemann和Neuberger，Immunol.Today，17(8)391-97(1996)，和Bruggemann和Taussig，Curr.Opin Biotechnol.，8455-58(1997)所述在轉(zhuǎn)基因小鼠中產(chǎn)生人Flt4-中和抗體。使用常規(guī)免疫方法用Flt4組合物免疫在種系結(jié)構(gòu)中攜帶人V-基因片斷且在其淋巴組織中表達(dá)該轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因小鼠。使用常規(guī)方法用來自免疫小鼠的B細(xì)胞產(chǎn)生雜交瘤并進(jìn)行篩選以鑒定分泌抗-Flt4人抗體的雜交瘤(例如，如上所述)。
D.雙特異性抗體產(chǎn)生特異性結(jié)合Flt4且特異性結(jié)合與病理學(xué)和/或治療相關(guān)的其它抗原的雙特異性抗體，分離，并使用已在文獻(xiàn)中描述的標(biāo)準(zhǔn)方法檢驗(yàn)。參見，例如Pluckthun & Pack，Immunotechnology，383-105(1997)；Carter等，J.Hematotherapy，4463-470(1995)；Renner & Pfreundschuh，ImmunologicalReviews，1995，第145期，第179-209頁；Pfreundschuh的美國專利號5,643,759；Segal等，J.Hematotherapy，4377-382(1995)；Segal等，Immunobiology，185390-402(1992)；和Bolhuis等，Cancer Immunol.Immunother.，341-8(1991)，本文引用所有這些文獻(xiàn)以其整體作為參考。
實(shí)施例30證實(shí)抗-Flt4療法對于癌癥治療的效果的動(dòng)物模型預(yù)期任何癌癥治療可接受的動(dòng)物可用于證實(shí)抗-Flt4療法對于癌癥治療的效果。使用標(biāo)準(zhǔn)劑量-反應(yīng)試驗(yàn)證實(shí)乳腺癌治療效果的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ桶ㄔ赥ekmal和Durgam，Cancer Lett.，118(1)21-28(1997)；Moshakis等，Br.J.Cancer，43575-580(1981)；和Williams等，J.Nat.Cancer Inst.，66147-155(1981)中所述的那些模型。除了鼠類模型外，還包含狗和豬模型，因?yàn)橹辽倌承┛?人Flt4抗體(例如，9D9抗體)也識別來自狗和豬的Flt4。監(jiān)測腫瘤大小和副作用以證實(shí)相對于對照的治療效果。
實(shí)施例31可溶性FLT4抑制VEGF-C介導(dǎo)的腫瘤生長和轉(zhuǎn)移為了進(jìn)一步證實(shí)VEGF-C在腫瘤發(fā)生中的體內(nèi)作用，將過量表達(dá)重組VEGF-C的MCF-7人乳腺癌細(xì)胞同位移植進(jìn)SCID小鼠。VEGF-C的過量表達(dá)增進(jìn)腫瘤生長，但與VEGF-A的過量表達(dá)不同，它對腫瘤血管生成的影響很小。另一方面，VEGF-C強(qiáng)烈促進(jìn)與腫瘤相關(guān)的淋巴管的生長，該淋巴管在腫瘤周圍，通常有腫瘤細(xì)胞滲入。VEGF-C的這些效果可被可溶性VEGFR-3融合蛋白抑制。這些數(shù)據(jù)表明VEGF-C可增量調(diào)節(jié)腫瘤生長和/或通過淋巴管的轉(zhuǎn)移，且可通過抑制VEGF-C與其受體之間的相互作用來抑制這些效果。具體地說，可使用可溶性VEGFR-3/Flt4抑制該相互作用。
材料和方法A.質(zhì)粒表達(dá)載體的制備將編碼人VEGF-C或VEGF165的cDNAs導(dǎo)入pEBS7質(zhì)粒(Peterson和Legerski，Gene，107279-84，1991)中。使用相同載體表達(dá)含有與人免疫球蛋白γ鏈的Fc-結(jié)構(gòu)域融合的VEGFR-3前3個(gè)免疫球蛋白同源結(jié)構(gòu)域的可溶性受體嵌合體VEGFR-3-Ig，和在相似構(gòu)建體中含有VEGFR-1前5個(gè)Ig同源結(jié)構(gòu)域的VEGFR-1-Ig(Achen，等，Proc NatlAcadSci USA，95548-53，1998)。
B.轉(zhuǎn)染細(xì)胞的產(chǎn)生和分析通過電穿孔用質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染人MCF-7乳腺癌細(xì)胞系的MCF-7S 1亞克隆并按以前所述(Egeblad和Jaattela，Int J Cancer，86617-25，2000)選擇和培養(yǎng)穩(wěn)定的細(xì)胞集落。在補(bǔ)充了100μCi/ml[35S]-甲硫氨酸和[35S]-半胱氨酸(Redivue Pro-Mix，Amersham Pharmacia Biotech)的無甲硫氨酸和半胱氨酸的MEM(Gibco)中代謝標(biāo)記該細(xì)胞。使用抗VEGF-C抗體從該條件培養(yǎng)基中免疫沉淀該標(biāo)記的生長因子(Joukov，等，EMBO J，163898-911，1997)或VEGF(MAB293，R & D Systems)。使用蛋白質(zhì)A瓊脂糖(AmershamPharmacia Biotech)沉淀該免疫復(fù)合物和VEGFR-Ig融合蛋白，在0.5％ BSA，0.02％ Tween 20的PBS中洗滌兩次并在PBS中洗滌一次，在還原條件下在SDS-PAGE中分析。
C.細(xì)胞增生和腫瘤發(fā)生試驗(yàn)將細(xì)胞(20,000個(gè)/孔)在24孔板中一式四份涂板，1，4，6，或8天后在平行板上胰酶消化并使用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)。4和6天后提供新鮮培養(yǎng)基。對于腫瘤發(fā)生試驗(yàn)，通過胰酶作用收獲亞匯合培養(yǎng)物，洗滌兩次并將PBS中的107個(gè)細(xì)胞接種進(jìn)切除卵巢的SCID小鼠第二(腋窩)乳腺的脂肪墊中，該小鼠攜帶含有0.72mg 17β-雌二醇(Innovative Research of America)的皮下60天緩釋型藥丸。卵巢切除和藥丸移植在腫瘤細(xì)胞接種前4-8天進(jìn)行。以盲試方式每周兩次測量腫瘤的長度和寬度，腫瘤體積計(jì)算為長度×寬度×深度X0.5，假定腫瘤為半橢圓體且深度與寬度相同(Benz等，Breast Cancer ResTreat，2485-95，1993)。
D.血管的組織學(xué)和定量切除腫瘤，在4％多聚甲醛(pH7.0)中固定24小時(shí)，并包埋于石蠟中。按照公開的方法(Partanen等，Cancer，862406-12，1999)用抗PECAM-1(Pharmingen)，VEGFR-3(Kubo等，Blood，96546-553，2000)或PCNA(Zymed Laboratories)的單克隆抗體或抗LYVE-1(Banerji等，J CellBiol，144789-801，1999)，VEGF-C(Joukov等，EMBO J，163898-911，1997)或?qū)诱尺B蛋白的多克隆抗體免疫染色切片(7μm)。從切片中最高血管密度(血管熱點(diǎn))的3個(gè)區(qū)域(60x放大倍數(shù))測定PECAM-1陽性血管數(shù)目的平均值。使用盲試腫瘤樣品進(jìn)行所有組織學(xué)分析。
E.可溶性VEGFR-3的腺病毒表達(dá)和伊文思藍(lán)排出試驗(yàn)將編碼VEGFR-3-Ig融合蛋白的cDNA亞克隆進(jìn)pAdBglII質(zhì)粒并按以前所述(Laitinen等，Hum Gene Ther.，91481-6，1998)產(chǎn)生腺病毒。在腫瘤細(xì)胞接種前3小時(shí)將VEGFR-3-Ig或LacZ對照(Laitinen等，Hum Gene Ther.，91481-6，1998)腺病毒以109pfu/只小鼠靜脈內(nèi)注射進(jìn)SCID小鼠中。3周后，麻醉每組中的四只小鼠，切開腹部皮膚并將幾微升PBS中的3％伊文思藍(lán)染料(Sigma)注射進(jìn)腫瘤中。肉眼觀察腫瘤中染料的排出。
結(jié)果A.VEGF-C或VEGFR-3-Ig的表達(dá)不影響體外的MCF-7細(xì)胞生長如上所述用編碼全長人VEGF-C或可溶性VEGFR-3融合蛋白(VEGFR-3-Ig)的表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染MCF-7人乳腺癌細(xì)胞并選擇穩(wěn)定的細(xì)胞集落。為進(jìn)行比較，在相同細(xì)胞中表達(dá)人VEGF165或VEGFR-1-Ig。使用免疫沉淀法分析這些細(xì)胞的條件培養(yǎng)基的有效產(chǎn)量和該蛋白質(zhì)的分泌。在還原條件下在PAGE中分析來自代謝標(biāo)記的MCF-7細(xì)胞的VEGF-C，VEGF或可溶性受體蛋白的免疫沉淀。
該研究揭示了VEGF-C，VEGF，可溶性VEGFR-3融合蛋白或可溶性VEGFR-1融合蛋白的過量表達(dá)不影響MCF-7乳腺癌細(xì)胞的體外增生。當(dāng)將該細(xì)胞接種進(jìn)24孔平板并使用血球計(jì)數(shù)器測量其生長時(shí)，發(fā)現(xiàn)不影響轉(zhuǎn)染細(xì)胞的生長率。
B.VEGF-C 增′進(jìn)腫瘤生長而不影響腫瘤血管生成為了測定VEGF-C的體外效力，將MCF-7細(xì)胞集落植入切除卵巢的SCID小鼠的乳腺脂肪墊中，該小鼠攜帶緩釋雌激素藥丸以提供支持MCF-7腫瘤生長所需的恒定激素水平。
VEGF-C的過量表達(dá)顯著增加腫瘤生長(VEGF-C545mm3±110mm3，對照268mm3±69mm3，在第13天，n＝8，p＜0.0001，學(xué)生t-檢驗(yàn))。然而，VEGF-C的過量表達(dá)對腫瘤生長的影響比VEGF-A的顯著性低得多(VEGF-A1136mm3±339mm3，對照189mm3±57mm3，在第15天，n＝6，p＜0.0001，學(xué)生t-檢驗(yàn))。通過分別混合VEGF-C或VEGF過量表達(dá)的MCF-7細(xì)胞與表達(dá)可溶性VEGFR-3或VEGFR-1融合蛋白的細(xì)胞可抵消增加的腫瘤生長。另外，發(fā)現(xiàn)通過靜脈內(nèi)注射重組腺病毒在肝臟中表達(dá)的循環(huán)可溶性VEGFR-3-Ig也抑制VEGF-C過量表達(dá)的腫瘤生長的增加。
為了研究VEGF-C對腫瘤血管生成的影響，染色腫瘤切片的PECAM-1，它是一種主要在血管中表達(dá)且在淋巴管中微弱表達(dá)的內(nèi)皮抗原。腫瘤中PECAM-1陽性血管的定量揭示了VEGF-C的過量表達(dá)對腫瘤血管的密度具有極小的影響(VEGF-C腫瘤為40.2±12.2個(gè)血管/個(gè)顯微鏡視野，n＝18且對照腫瘤為36.6±11.6，n＝23，三個(gè)不同實(shí)驗(yàn)的平均值)。相反，VEGF-A的過量表達(dá)使得血管密度增加大約兩倍。
C.VEGF-C的過量表達(dá)與淋巴管形成和腫瘤細(xì)胞的內(nèi)部淋巴管生長相關(guān)通過免疫染色淋巴管特異性標(biāo)記LYVE-1分析VEGF-C對腫瘤相關(guān)的淋巴管的影響(Banerji等，J Cell Biol，144789-801，1999)。該標(biāo)記揭示了在VEGF-C過量表達(dá)的腫瘤周圍淋巴管高度增生。在許多LYVE-1日性內(nèi)皮細(xì)胞中檢測到增生的細(xì)胞核抗原(PCNA)，表明這些淋巴管活躍增生。通過VEGFR-3染色且缺乏基底層成份層粘連蛋白染色鑒定淋巴管結(jié)構(gòu)。在一些VEGF-C過度表達(dá)的腫瘤內(nèi)部也存在薄淋巴管。
腫瘤外周的淋巴管通常被VEGF-C陽性腫瘤細(xì)胞滲入。截然相反的是，VEGF過度表達(dá)和對照腫瘤不含或者僅含少量淋巴管。
D.循環(huán)可溶性VEGFR-3融合蛋白抑制VEGF-C誘導(dǎo)的淋巴管生成在人乳腺癌中，使用centinel node方法跟蹤淋巴排出和轉(zhuǎn)移癌擴(kuò)散(作為綜述，參見Parker等，Radiol Clin North Am，38809-23,2000)。為了跟蹤MCF-7腫瘤的淋巴排出，將伊文思藍(lán)染料注射進(jìn)用VEGFR-3-Ig或?qū)φ障俨《靖腥镜男∈笾械腣EGF-C過量表達(dá)或?qū)φ漳[瘤中。對照實(shí)驗(yàn)表明用VEGFR-3-Ig腺病毒感染培養(yǎng)的人胚胎腎細(xì)胞導(dǎo)致大量分泌可溶性VEGFR-3-Ig融合蛋白且靜脈內(nèi)感染小鼠導(dǎo)致血清中VEGFR-3-Ig融合蛋白的高系統(tǒng)水平。將伊文思藍(lán)染料注射進(jìn)腫瘤導(dǎo)致淋巴管染色而血管不染色，且揭示了與對照腫瘤相比圍繞VEGF-C過量表達(dá)的腫瘤的擴(kuò)張的淋巴管的數(shù)目增加。大多數(shù)擴(kuò)張的淋巴管在用VEGFR-3-Ig腺病毒處理的小鼠的VEGF-C過量表達(dá)的腫瘤中不存在。
上述數(shù)據(jù)證實(shí)了在MCF-7乳房腫瘤中VEGF-C過量表達(dá)強(qiáng)烈且特異性地誘導(dǎo)腫瘤相關(guān)的淋巴管生長，但對腫瘤血管生成無重大影響。另外，證實(shí)了VEGF-C-介導(dǎo)的腫瘤生長增加和腫瘤相關(guān)性淋巴管形成受到可溶性VEGFR-3融合蛋白(即，一種選擇用于抑制對表達(dá)VEGFR-3的內(nèi)皮細(xì)胞的VEGF-C-介導(dǎo)的刺激的試劑)的抑制。
由于缺乏特異性標(biāo)記，過去難以確定腫瘤是主動(dòng)誘導(dǎo)淋巴管形成還是僅僅通過過度生長包圍已有的淋巴管且由于腫瘤內(nèi)的高間隙液壓而壓迫它們。最近來自各種實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷臄?shù)據(jù)表明存在后一種情況(Leu等，Cancer Res，604324-7,2000；Stohrer等，Cancer Res，604251-5，2000)。這里首次表明VEGF-C的過度表達(dá)可誘導(dǎo)與實(shí)驗(yàn)?zāi)[瘤相關(guān)的淋巴管生長。VEGF-C誘導(dǎo)的腫瘤外周的淋巴管高度增生且大多數(shù)充滿腫瘤細(xì)胞，而腫瘤內(nèi)的淋巴管是扁平的且沒有腔。與正常成人組織中的淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞不同，與MCF-7腫瘤相關(guān)的淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞活躍增生。因此，似乎大多數(shù)腫瘤外周和腫瘤內(nèi)部的淋巴管可通過已有淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞的增生產(chǎn)生。
通過淋巴進(jìn)入局部淋巴結(jié)的癌擴(kuò)散在臨床使用中長期作為一種重要的預(yù)后指標(biāo)。本實(shí)施例中證實(shí)的與VEGF-C過量表達(dá)的腫瘤相關(guān)的擴(kuò)張淋巴管內(nèi)部腫瘤細(xì)胞的生長非常類似于人乳腺癌中與轉(zhuǎn)移瘤擴(kuò)散進(jìn)淋巴結(jié)且存活率低相關(guān)的腫瘤外周的淋巴侵入(Lauria等，Cancer，761772-8，1995)。因此，本文報(bào)導(dǎo)的數(shù)據(jù)提供了VEGF-C表達(dá)促進(jìn)通過淋巴系統(tǒng)的腫瘤轉(zhuǎn)移的證據(jù)。因此，鑒于實(shí)施例28和其它數(shù)據(jù)表明在許多類型的實(shí)體瘤血管中VEGFR-3受到增量調(diào)節(jié)(Valtola等，Am J Pathol，1541381-90，1999；Partanen等，Cancer，862406-12，1999；Kubo等，Blood，96546-553，2000)，本實(shí)施例證實(shí)了實(shí)現(xiàn)VEGF-C過量表達(dá)的腫瘤模型大都有淋巴管生成。
正如VEGFR-3融合蛋白抑制VEGF-C過量表達(dá)的腫瘤生長的能力所示，VEGF-C對腫瘤生長的影響不僅僅是由于細(xì)胞集落之間的變異。通過將伊文思藍(lán)染料注射進(jìn)腫瘤，證實(shí)了大型排出淋巴管數(shù)目的增加與VEGF-C過量表達(dá)的腫瘤相關(guān)。很可能功能性淋巴管的數(shù)目越多導(dǎo)致淋巴排出越好，因此間隙壓力越低且VEGF-C過量表達(dá)的腫瘤中血液灌注增強(qiáng)。無論是VEGF-C/D-VEGFR-3介導(dǎo)進(jìn)行性腫瘤通過血管發(fā)生的淋巴管生成達(dá)到特定的腫瘤進(jìn)程，還是兩者都有，本發(fā)明的治療方法將抑制這些進(jìn)程。
最后，上述結(jié)果表明腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生的VEGF-C可誘導(dǎo)腫瘤周圍的淋巴管生長，從而促進(jìn)癌的淋巴內(nèi)擴(kuò)散。該數(shù)據(jù)表明通過，例如采用可溶性VEGFR-3蛋白的基因療法抑制腫瘤相關(guān)的淋巴管生成是抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的有價(jià)值的方法。
實(shí)施例32
在表達(dá)可溶性VEGFR-3/FLT4的小鼠中抑制淋巴管生成前面的實(shí)施例證實(shí)了VEGF-C增加體內(nèi)腫瘤生長且該腫瘤生長的促進(jìn)與淋巴管相關(guān)。VEGF-C的這些效果受到可溶性VEGFR-3融合蛋白的抑制。本實(shí)施例提供了可溶性VEGFR-3是VEGF-C/VEGF-D信號傳導(dǎo)的有效抑制劑的進(jìn)一步證據(jù)，當(dāng)在轉(zhuǎn)基因小鼠的皮膚中表達(dá)時(shí)，它抑制淋巴管生成且誘導(dǎo)已經(jīng)形成的淋巴管退化而血管系統(tǒng)保持完整。
更具體的說，本實(shí)施例表明由與免疫球蛋白(Ig)γ-鏈的Fc區(qū)連接的VEGFR-3胞外部分的配體結(jié)合部分組成的嵌合蛋白(VEGFR-3-Ig)中和VEGF-C和VEGF-D的活性且在小鼠表皮中在角蛋白-14(K14)啟動(dòng)子控制下表達(dá)時(shí)抑制皮膚淋巴管系統(tǒng)的形成。由于在這些小鼠中血管網(wǎng)絡(luò)保持正常，因此該抑制對于淋巴管似乎是特異性的。VEGFR-3-Ig誘導(dǎo)胚胎發(fā)育期間淋巴管的退化，表明該受體的連續(xù)信號對于淋巴管系統(tǒng)的維持是必需的。
材料和方法A.VEGF-C，VEGF-D和VEGFR-Ig融合蛋白的生產(chǎn)人VEGF-C的成熟形式如上文實(shí)施例31和Joukov等，(EMBO J.163898-3911，1997)所述。VEGF-D從R&D Systems(Minneapolis，Minnesota)獲得。由與人IgGI Fc區(qū)融合的人VEGFRs的配體結(jié)合區(qū)組成的VEGFR-1-Ig和VEGFR-3-Ig蛋白在果蠅屬S2細(xì)胞(Invitrogen，Carlsbad，California)中生產(chǎn)。
B.VEGFR-3生物測定將表達(dá)VEGFR-3/EpoR嵌合體的Ba/F3細(xì)胞(Achen，Eur.J Biochem.267，2505-2515，2000)以15,000個(gè)細(xì)胞/孔一式三份接種在補(bǔ)充了100ng/ml的VEGF-C和所示濃度的VEGFR-Ig蛋白的96-孔微量滴定平板上。48小時(shí)后，通過加入MTT(3-(4，5-二甲基噻唑-2-yl)-2，5-二苯基溴化四氮唑(Sigma)，0.5mg/ml)測定細(xì)胞活力，接著再培養(yǎng)2小時(shí)，加入等體積的細(xì)胞溶胞產(chǎn)物溶液(10％SDS，10nM HCl)并在37℃下培養(yǎng)過夜。在540nm下測量吸光度。
C.轉(zhuǎn)基因小鼠的產(chǎn)生使用PCR擴(kuò)增編碼人VEGFR-3 Ig-同源性結(jié)構(gòu)域1-3的序列。用于該目的的引物是5′-TACAAAGCTTTTCGCCACCATGCAG-3′(SEQ ID NO23)和5’-IACAGGATCCI℃ATGCACAATGACCTC-3′(SEQ ID NO24)。
將該P(yáng)CR產(chǎn)物克隆進(jìn)plg-plus載體(Ingenius，R & D Systems)的含有人IgGI Fc尾的閱讀框中。然后將VEGFR-3-Ig構(gòu)建體轉(zhuǎn)移進(jìn)人角蛋白-14啟動(dòng)子表達(dá)載體中。將該表達(dá)盒片斷注射進(jìn)FVB/NIH和DBAxBalbC雜交品種的受精的小鼠卵母細(xì)胞中產(chǎn)生7個(gè)品系的K14-VEGFR-3-Ig小鼠。分析轉(zhuǎn)基因表達(dá)且從表達(dá)轉(zhuǎn)基因的所有3個(gè)建立品系按下文所述證實(shí)其表型。
D.轉(zhuǎn)基因表達(dá)的分析對于northern印跡，對在1％瓊脂糖中的從皮膚提取的10μg總RNA進(jìn)行電泳，轉(zhuǎn)移到尼龍膜(Nytran)上，用相應(yīng)的[32P]-標(biāo)記的cDNA探針進(jìn)行雜交且通過放射自顯影法曝光。對于western印跡，將皮膚活組織勻漿進(jìn)補(bǔ)充了1mM PMSF，1mU/ml抑蛋白酶肽，1mM Na3VO4和10μg/ml亮抑蛋白酶肽的裂解緩沖液(20mM Tris，pH7.6，1mM EDTA，50mM NaCl，50mM NaF，1％ Triton-X100)中。從1mg總蛋白中沉淀Ig-融合蛋白并在SDS-PAGE中分離，轉(zhuǎn)移到硝化纖維素上并使用辣根過氧化物酶偶連的兔抗人IgG抗體(DAKO，Carpinteria，California)和增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光檢測系統(tǒng)進(jìn)行檢測。
E.免疫組織化學(xué)和TUNEL染色用抗小鼠VEGFR-3的大鼠單克隆抗體(Kubo等，Blood 96546-553，2000)或CD31/PECAM-1(PharMingen，San Diego，California)，抗小鼠LYVE-1的兔多克隆抗體(Banerji等，J Cell Biol，144789-801，1999)，或生物素標(biāo)記的抗人IgG Fc區(qū)的小鼠單克隆抗體(Zymed，San Diego，California)染色來自4％多聚甲醛(PFA)固定的組織的石蠟切片(5μm)。對于TUNEL染色，使用原位細(xì)胞死亡檢測試劑盒(熒光素；Roche，Indianapolis，IN)進(jìn)行DNA片斷的檢測。
F.血管和淋巴管的觀察為了觀察血管(Thurston等，Science 286，2511-2514(1999))，通過股靜脈注射(IV)100μl 1mg/ml生物素標(biāo)記的番茄(Lycopersicon esculentum)凝集素(Sigma)且使其循環(huán)2分鐘。通過用PBS中的1％ PFA/0.5％戊二醛灌注固定后，通過ABC-3，3′-二氨基聯(lián)苯胺過氧化物酶反應(yīng)觀察結(jié)合的凝集素。然后通過β-半乳糖苷酶底物X-Gal(Sigma，St.Louis，MO)染色VEGFR-3+/LacZ小鼠中的淋巴管。為了觀察功能性淋巴管，將伊文思藍(lán)染料(5mg/ml；Sigma，St.Louis，MO)注射進(jìn)下肢爪墊或者將TRITC-葡聚糖(Sigma，8mg/ml)注射進(jìn)耳朵或尾巴并分別通過光學(xué)或熒光顯微鏡分析淋巴管。
G.血清中VEGFR-3-Ig蛋白的檢測用抗人IgG(Zymed，2μg/ml溶于PBS中)或人VEGFR-3(克隆7B8，4μg/ml)的小鼠抗體覆蓋ELISA平板(Nunc Maxisorp，Copenhagen，Denmark)。將小鼠血清稀釋進(jìn)溫育緩沖液(5mg/ml BSA，0.05％ Tween 20溶于PBS中)并使其在室溫下結(jié)合2小時(shí)。然后在加入小鼠抗人IgG1(Zymed，1∶500)前1小時(shí)用溫育緩沖液洗滌平板3次。然后在孔中溫育與堿性磷酸酶偶連的鏈霉菌抗生物素蛋白(Zymed，1∶5000)30分鐘，接著加入底物(1mg/ml對硝基苯磷酸溶于0.1M二乙醇胺，pH10.3中)且在405nm下閱讀吸光度。
H.磁共振成像使用連接到9.4 T垂直磁體(Oxford Instruments，Oxford，UK)上的s.m.i.s.控制臺(Surrey Medical Imaging Systems，Guildford，UK)獲得MRI數(shù)據(jù)。使用單環(huán)表面線圈(直徑為35mm)用于信號傳輸和檢測。T2-加權(quán)的(TR2000ms，TE 40ms，4次掃描/行)多切片自旋-回波順序使用的FOV為25.6mm2(矩陣大小256×128)且切片厚度橫向?yàn)?.3mm。集中在1.2ppm的飽和脈沖用于減少T2-圖像中的脂肪信號。使用在自旋-回波順序(TR 2000ms，TE 40ms)中沿切片軸的單極擴(kuò)散梯度(b-值≈800s/mm2)獲得擴(kuò)散加權(quán)的MRI，通過將MRI數(shù)據(jù)擬合成b-值的單指數(shù)函數(shù)計(jì)算水表面擴(kuò)散系數(shù)(ADC)。
結(jié)果A.可溶性VEGFR-3抑制VEGF-C-介導(dǎo)的體外信號傳導(dǎo)為了抑制通過VEGFR-3的VEGF-C信號傳導(dǎo)，采用由VEGFR-3的前3個(gè)Ig-同源結(jié)構(gòu)域和IgG Fc結(jié)構(gòu)域組成的融合蛋白。VEGFR-3-Ig以與全長胞外域相同的效率結(jié)合VEGF-C和VEGF-D并抑制VEGF-C-誘導(dǎo)的VEGFR-3磷酸化及隨后在表達(dá)VEGFR-3的內(nèi)皮細(xì)胞中p42/p44促分裂原活化的蛋白激酶(MAPK)激活。相反，不結(jié)合VEGF-C的相似VEGFR-1-Ig融合蛋白不影響p42/p44 MAPK激活。
使用能夠在不存在IL-3的條件下傳輸IL-3依賴型Ba/F3細(xì)胞的VEGF-C依賴型存活和增生信號的嵌合VEGFR-3/促紅細(xì)胞生成素(Epo)受體在生物試驗(yàn)中也測定了可溶性VEGFR-3對VEGF-C信號傳導(dǎo)的影響(Achen等，Eur.J.Biochem.，2672505-2515，2000)。在該細(xì)胞測定中，在0.5∶1摩爾比(VEGFR-3-IgVEGF-C)下VEGF-C-依賴型細(xì)胞存活受到完全抑制，而VEGFR-1-Ig無影響。同樣，VEGFR-3-Ig也消除VEGFR-3/EpoR細(xì)胞的VEGF-D-誘導(dǎo)型存活。相反，即使VEGFR-2-Ig的摩爾數(shù)過量10倍也只能部分消除VEGF-C依賴性活力，這也許是由于VEGF-C與VEGFR-2的親和性更低。
B.可溶性VEGFR-3抑制體內(nèi)淋巴管的形成為了測定體內(nèi)VEGFR-3-Ig的抑制效果，在指導(dǎo)轉(zhuǎn)基因表達(dá)到皮膚的基層表皮細(xì)胞中的K14啟動(dòng)子控制下表達(dá)該融合蛋白。通過對皮膚RNA的northern印跡和對皮膚蛋白提取物的western印跡檢測小鼠中的VEGFR-3-Ig表達(dá)。這些小鼠表現(xiàn)健康且能生育并具有正常壽命。對皮膚的組織學(xué)檢查揭示了真皮和皮下層增厚。抗體染色證實(shí)了在基層角質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)VEGFR-3-Ig。染色皮膚切片的淋巴管內(nèi)皮標(biāo)記VEGFR-3(Jussila等，CancerRes.581599-1604，1998；Kubo等，Blood，96546-553，2000)和LYVE-1(Banerji等，J Cell Biol，144789-801，1999)時(shí)，在轉(zhuǎn)基因小鼠中沒有觀察到淋巴管，即使在對照小鼠的皮膚中淋巴管被染色。相反，在轉(zhuǎn)基因和野生型皮膚中均染色了血管的泛內(nèi)皮標(biāo)記PECAM-1/CD31。
C.可溶性VEGFR-3抑制淋巴管生成但不能抑制血管生成為了更好地觀察淋巴管，將K14-VEGFR-3-Ig小鼠與在Flt4基因座表達(dá)β-gal的雜合型VEGFR-3+/LacZ小鼠(Dumont等，Science 282，946-949，1998)交配。當(dāng)使用底物X-gal染色耳朵皮膚的整體固定的組織標(biāo)本時(shí)，沒有檢測到淋巴管，而在對照小鼠中，觀察到染成藍(lán)色的淋巴管。在使用生物素標(biāo)記的凝集素進(jìn)行的血管灌注染色(Thurston等，Science 286，2511-2514，1999)中，在K14-VEGFR-3-Ig小鼠中血管表現(xiàn)正常。
使用功能性測定監(jiān)測注射進(jìn)皮膚的伊文思藍(lán)染料或TRITC-葡聚糖的命運(yùn)也證實(shí)了不存在淋巴管。注射進(jìn)野生型小鼠下肢爪墊后，該染料迅速集中到圍繞坐骨靜脈的淋巴管，而在集合淋巴管不存在或者退化的轉(zhuǎn)基因小鼠中在該淋巴管中未見染料。對真皮內(nèi)注射進(jìn)耳朵或尾巴的TRITC葡聚糖使用熒光顯微鏡檢術(shù)也觀察到對照小鼠中的淋巴管，而在轉(zhuǎn)基因小鼠中未見該淋巴管。
D.循環(huán)可溶性VEGFR-3與內(nèi)部器官的淋巴組織瞬時(shí)丟失相關(guān)在兩周大時(shí)，與對照VEGFR-3+/LacZ同窩交配的小鼠相比時(shí)，VEGFR-3-Ig/VEGFR-3+/LacZ小鼠在諸如隔膜，心，肺，盲腸，胰腺，腸系膜和食道的器官內(nèi)如果還有淋巴管，也僅有少量薄且退化的淋巴管。通過免疫染色VEGFR-3和LYVE-1證實(shí)了X-Gal染色獲得的該發(fā)現(xiàn)。另外，在心包中缺乏淋巴管與至少一些小鼠中心包液的積累相關(guān)。在3周大時(shí)，淋巴管的再生長明顯。在成年轉(zhuǎn)基因小鼠中，只有一些諸如心臟和隔膜的器官有異常形式和不完全發(fā)育的淋巴管。
在內(nèi)部器官中可見的該效果表明可溶性VEGFR-3-Ig蛋白質(zhì)在血流中循環(huán)。事實(shí)上使用特異性酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)在轉(zhuǎn)基因小鼠血清中檢測到該融合蛋白；其水平在100-200ng/ml之間變化，在幼齡小鼠中最高。根據(jù)我們的體外實(shí)驗(yàn)，該濃度可中和大約20-40ng/ml的VEGF-C。VEGFR-3-Ig蛋白在血流中相當(dāng)穩(wěn)定，因?yàn)殪o脈內(nèi)注射的重組VEGFR-3-Ig在血清中存在至少9小時(shí)。
E.轉(zhuǎn)基因表型具有人淋巴水腫特征K14-VEGFR-3-Ig小鼠與其野生型同窩交配小鼠的區(qū)別在于其腳腫脹，且在出生時(shí)已經(jīng)可見。老年小鼠表現(xiàn)出皮膚增厚，真皮纖維變性和皮下脂肪沉積增加。磁共振成像(MRI)揭示了在轉(zhuǎn)基因小鼠的腳部皮膚和皮下組織有顯著的T2-高強(qiáng)度區(qū)，表明液體累積增加，而在同窩交配的對照小鼠中沒有該區(qū)域。這些高強(qiáng)度區(qū)的表面擴(kuò)散系數(shù)(ADC)為1.99
×10-3mm2/s，比ADC為1.32
×10-3mm2/s的正常組織更高，且比脂肪的該值高大約1-2個(gè)數(shù)量級(Thurston，等，Science 286，2511-2514(1999)。另外，淋巴結(jié)的大小和外觀有變化，特別是在圍繞下腔靜脈的大型主動(dòng)脈旁淋巴結(jié)中。然而，在VEGFR-3-Ig小鼠中可見腸系膜淋巴結(jié)和淋巴集結(jié)。
F.發(fā)育中的淋巴管通過內(nèi)皮細(xì)胞的編程性細(xì)胞死亡進(jìn)行退化在胚胎發(fā)生期間，在E14.5時(shí)出現(xiàn)K14-啟動(dòng)的轉(zhuǎn)基因表達(dá)顯著增加，到E16.5時(shí)，該表達(dá)包圍整個(gè)胚胎皮膚(Byrne，等，Development 120，2369-2383，1994)。當(dāng)通過X-Gal染色在VEGFR-3+/LacZ背景中分析時(shí)，E15的轉(zhuǎn)基因和野生型胚胎之間皮膚的淋巴網(wǎng)無區(qū)別。在E15.5-16.5時(shí)，轉(zhuǎn)基因胚胎的淋巴管在某些區(qū)域退化。在E17.5時(shí)，淋巴管仍形成連續(xù)網(wǎng)絡(luò)但是比對照胚胎中更細(xì)。在E18.5時(shí)，轉(zhuǎn)基因胚胎中全部皮膚淋巴網(wǎng)絡(luò)中斷，且在出生后在皮膚中沒有或者僅有少量單個(gè)中斷的淋巴管，主要伴隨著大型皮膚血管。因此，在胚胎發(fā)生期間在皮膚中開始形成淋巴管，但是當(dāng)轉(zhuǎn)基因開始表達(dá)時(shí)發(fā)生退化。然而，正如在Tie-啟動(dòng)子-LacZ背景中通過X-Gal染色所示，在K14-VEGFR-3-Ig胚胎中不會抑制皮膚血管系統(tǒng)的形成(Korhonen等，Blood86，1828-1835(1995))。
使用TUNEL染色檢測內(nèi)皮細(xì)胞中的編程性細(xì)胞死亡，通過同時(shí)染色PECAM-1可鑒定該細(xì)胞。在E17.5和E18.5時(shí)在轉(zhuǎn)基因胚胎的真皮中首先看見編程性死亡的內(nèi)皮細(xì)胞。在野生型胚胎中沒有看見內(nèi)皮細(xì)胞的編程性死亡。在轉(zhuǎn)基因皮膚中幾乎僅在VEGFR-3陽性內(nèi)皮中檢測到TUNEL-陽性細(xì)胞，表明VEGFR-3-Ig介導(dǎo)的編程性細(xì)胞死亡靶向淋巴管內(nèi)皮。
本實(shí)施例表明可溶性VEGFR-3融合蛋白抑制淋巴管生成且導(dǎo)致已有的胎兒體內(nèi)淋巴管退化。因此連續(xù)的VEGFR-3信號傳導(dǎo)是胎兒發(fā)育和淋巴管系統(tǒng)的維持所必需的。
K14-VEGFR-3-Ig小鼠的皮膚中缺乏淋巴管與在諸如人淋巴水腫(淋巴系統(tǒng)不全引起的一種疾病且其特征在于嚴(yán)重性遞增的肢端腫大)的真皮且特別是皮下脂肪層的增厚相關(guān)(Witte等，淋巴管發(fā)生機(jī)理，意義和臨床含義。參見Regulation of Angiogenesis(編輯，Goldberg，I.D.& Rosen，E.M.)65-112(Birkhauser Verlag，Basel，瑞士)1997；Mortimer，Cancer 83，2798-2802(1998))。在作為遺傳疾病的原發(fā)性淋巴水腫中，表面或皮下淋巴管通常發(fā)育不全或有再生障礙，它們不能將淋巴液轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)靜脈循環(huán)。當(dāng)手術(shù)，輻射，感染或創(chuàng)傷損傷淋巴管時(shí)形成非遺傳的繼發(fā)性或獲得性淋巴水腫。在淋巴水腫中，間隙空間內(nèi)富含蛋白的液體累積導(dǎo)致組織纖維變性和脂肪變性，干擾傷口愈合，且對感染易感。在K14-VEGFR-3-Ig小鼠中，在真皮中缺乏大分子運(yùn)輸，且特別是在老年小鼠中存在真皮纖維變性的跡象。另外，在轉(zhuǎn)基因小鼠中腳腫大且在皮膚和皮下組織中液體累積增加與人淋巴水腫的癥狀相似。因此K14-VEGFR-3-Ig小鼠的皮膚表型共有人淋巴水腫的一些特征。在一些淋巴水腫家族的研究中，在Flt4的酪氨酸激酶編碼區(qū)中檢測到雜合失活的錯(cuò)義突變(Karkkainen等，Nature Genet.，25153-159，2000；Irrthum等，Am.J.Hum.Gen.67259-301 2001)。至少一些淋巴水腫患者由于VEGFR-3信號傳導(dǎo)有缺陷而具有淋巴機(jī)能障礙。與這些觀察一致，本實(shí)施例中的結(jié)果表明通過可溶性VEGFR-3蛋白中斷VEGFR-3的信號傳導(dǎo)可完全破壞淋巴網(wǎng)絡(luò)并導(dǎo)致淋巴水腫樣表型。另外，在一些淋巴水腫病例中，某些局部淋巴結(jié)的大小和外觀可變，表明淋巴流動(dòng)和有功能的淋巴管系統(tǒng)是正常淋巴結(jié)形成所必需的。
VEGFR-3-Ig也誘導(dǎo)已經(jīng)形成的淋巴管退化。因此，發(fā)育期間抑制VEGF-C和/或VEGF-D與VEGFR-3的結(jié)合導(dǎo)致淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞的編程性細(xì)胞死亡和淋巴管網(wǎng)絡(luò)的破壞，這表明連續(xù)的VEGFR-3信號是淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞存活所必需的。在細(xì)胞培養(yǎng)物中，VEGFR-3激活與內(nèi)皮細(xì)胞存活相關(guān)的生化信號傳導(dǎo)級聯(lián)。盡管在皮膚中過量表達(dá)VEGF-C(Jeltsch等，Science，2761423-1425，1997)或VEGF-D的轉(zhuǎn)基因小鼠形成增生的真皮淋巴管系統(tǒng)，但是當(dāng)與K14-VEGFR-3-Ig小鼠交配時(shí)其真皮淋巴管也退化。由于兩種VEGFR-3配體也在皮膚中表達(dá)，因此在K14-VEGFR-3-Ig小鼠中觀察到的表型可能是由于同時(shí)抑制了VEGF-C和VEGF-D。
盡管VEGF-C和VEGF-D對于體外和體內(nèi)的血管內(nèi)皮細(xì)胞都具有促有絲分裂活性(Joukov等，EMBO J.16，3898-3911，1997；Achen等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95，548-553，1998；Cao等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95，14389-143921998；Witzenbichler等，Am.J..Pathol.153，381-394，1998；Marconcini等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96，9671-9676，1999)，但是VEGFR-3-Ig似乎不影響血管。K14-啟動(dòng)子表達(dá)的延遲起動(dòng)可解釋VEGFR-3-Ig蛋白的淋巴管特異性。在大約E14.5-16.5之前看不到K14-啟動(dòng)子活性的大量增加(Byrne等，Development 1202369-2383，1994)。盡管在E8.5時(shí)在發(fā)育中的血管中首先檢測到內(nèi)源性VEGFR-3的表達(dá)，但到E14.5-16.5時(shí)，在健康血管內(nèi)皮中該表達(dá)受到大幅度減量調(diào)節(jié)(Dumont等，Science 282，946-949 1998；Kaipainen，等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92，3566-3570，1995)。因此，在發(fā)育期間，當(dāng)正常情況下在健康組織的血管內(nèi)皮中不再存在VEGFR-3時(shí)，VEGFR-3信號比其它受體在皮膚的血管發(fā)生中起更小的作用。
在幼齡VEGFR-3-Ig小鼠中，一些內(nèi)部器官幾乎完全缺乏淋巴管，但是它們在成年小鼠中再生，盡管在一些器官中再生成異常形式。因此淋巴管系統(tǒng)的生長和維持可在成年器官中被再活化。VEGFR-3抑制水平的降低或來自例如，成熟結(jié)締組織基質(zhì)的獨(dú)立信號可再活化淋巴管發(fā)生，但是沒有獲得可表明VEGF-C或VEGF-D水平增加對其負(fù)責(zé)的證據(jù)。然而，通過腺病毒載體以超過通常在間隙液中發(fā)現(xiàn)的VEGF-C的量施用VEGF-C可導(dǎo)致成人組織中的淋巴管生長。在基因治療中使用不再結(jié)合VEGFR-2的修飾的VEGF-C(美國專利號6,130,071；Joukev等，J.Biol.Chem.，2736599-6602)可防止其對血管內(nèi)皮的潛在影響。
因此，可溶性VEGFR-3是體內(nèi)淋巴管發(fā)生的有效且特異性的抑制劑?？扇苄訴EGFR-3包含在本說明書別處所述的Flt4的胞外片斷。正如上文所見，優(yōu)選的可溶性VEGFR-3是包含VEGFR-3前3個(gè)結(jié)構(gòu)域的VEGFR-3，然而，應(yīng)明白可溶性VEGFR-3可以是或多或少含有圖2所示的VEGFR-3野生型序列的VEGFR-3的片斷。例如，該可溶性肽也可包含一個(gè)或多個(gè)IgIV，IgV，IgVI，IgVII。作為選擇，可溶性VEGFR-3可包含只有IgI與選自由IgII，IgIII，IgIV，IgV，IgVI和IgVII組成的組中的一個(gè)或多個(gè)結(jié)構(gòu)域的任意組合。
另外，本實(shí)施例還建立了具有人淋巴水腫特征的小鼠模型。由于淋巴水腫通常與皮膚相關(guān)，因此該小鼠模型用于了解和鑒定該疾病和用于試驗(yàn)可應(yīng)用于病人的新療法。
在本發(fā)明小結(jié)和詳細(xì)描述中引證的包括專利和雜志文章的所有文獻(xiàn)在此引用以其整體作為參考。
盡管結(jié)合其具體實(shí)施方案已經(jīng)在此描述了本發(fā)明，但應(yīng)理解可作出進(jìn)一步的修改，且本申請?jiān)噲D覆蓋一般遵循本發(fā)明的原理且包括與本說明書有偏差的本發(fā)明的任何變化，用法，或改編，因?yàn)樗鼈兟湓诒景l(fā)明所屬領(lǐng)域的已知或常規(guī)實(shí)踐的范圍內(nèi)，且可應(yīng)用于上文所述和下面所附權(quán)利要求書范圍內(nèi)的必要特征。
序列表<110>路德維格癌癥研究院利森蒂亞有限公司<120>Flt4(VEGFR-3)作為靶用于腫瘤成像和抗腫瘤治療<130>28113/34891<140>
<141>
<150>08/901,710<151>1997-07-28<150>08/340,011<151>1994-11-14<150>08/257,754<151>1994-07-09<150>07/959,951<151>1992-10-09<160>22<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>4195<212>DNA<213>人(Homo sapiens)<220>
<221>CDS<222>(20)..(3913)<400>1ccacgcgcag cggccggag atg cag cgg ggc gcc gcg ctg tgc ctg cga ctg 52Met Gln Arg Gly Ala Ala Leu Cys Leu Arg Leu1 5 10tgg ctc tgc ctg gga ctc ctg gac ggc ctg gtg agt ggc tac tcc atg 100Trp Leu Cys Leu Gly Leu Leu Asp Gly Leu Val Ser Gly Tyr Ser Met15 20 25acc ccc ccg acc ttg aac atc acg gag gag tca cac gtc atc gac acc 148Thr Pro Pro Thr Leu Asn Ile Thr Glu Glu Ser His Val Ile Asp Thr30 35 40ggt gac agc ctg tcc atc tcc tgc agg gga cag cac ccc ctc gag tgg 196Gly Asp Ser Leu Ser Ile Ser Cys Arg Gly Gln His Pro Leu Glu Trp45 50 55gct tgg cca gga gct cag gag gcg cca gcc acc gga gac aag gac agc 244Ala Trp Pro Gly Ala Gln Glu Ala Pro Ala Thr Gly Asp Lys Asp Ser60 65 70 75gag gac acg ggg gtg gtg cga gac tgc gag ggc aca gac gcc agg ccc 292
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atc agc ctg gag ctg gtg gtg aat gtg ccc ccc cag ata cat gag aag 1300Ile Ser Leu Glu Leu Val Val Asn Val Pro Pro Gln Ile His Glu Lys415 420 425gag gcc tcc tcc ccc agc atc tac tcg cgt cac agc cgc cag gcc ctc 1348Glu Ala Ser Ser Pro Ser Ile Tyr Ser Arg His Ser Arg Gln Ala Leu430 435 440acc tgc acg gcc tac ggg gtg ccc ctg cct ctc agc atc cag tgg cac 1396Thr Cys Thr Ala Tyr Gly Val Pro Leu Pro Leu Ser Ile Gln Trp His445 450 455tgg cgg ccc tgg aca ccc tgc aag atg ttt gcc cag cgt agt ctc cgg 1444Trp Arg Pro Trp Thr Pro Cys Lys Met Phe Ala Gln Arg Ser Leu Arg460 465 470 475cgg cgg cag cag caa gac ctc atg cca cag tgc cgt gac tgg agg gcg 1492Arg Arg Gln Gln Gln Asp Leu Met Pro Gln Cys Arg Asp Trp Arg Ala480 485 490gtg acc acg cag gat gcc gtg aac ccc atc gag agc ctg gac acc tgg 1540Val Thr Thr Gln Asp Ala Val Asn Pro Ile Glu Ser Leu Asp Thr Trp495 500 505acc gag ttt gtg gag gga aag aat aag act gtg agc aag ctg gtg atc 1588Thr Glu Phe Val Glu Gly Lys Asn Lys Thr Val Ser Lys Leu Val Ile510 515 520cag aat gcc aac gtg tct gcc atg tac aag tgt gtg gtc tcc aac aag 1636Gln Asn Ala Asn Val Ser Ala Met Tyr Lys Cys Val Val Ser Asn Lys525 530 535gtg ggc cag gat gag cgg ctc atc tac ttc tat gtg acc acc atc ccc 1684Val Gly Gln Asp Glu Arg Leu Ile Tyr Phe Tyr Val Thr Thr Ile Pro540 545 550 555gac ggc ttc acc atc gaa tcc aag cca tcc gag gag cta cta gag ggc 1732Asp Gly Phe Thr Ile Glu Ser Lys Pro Ser Glu Glu Leu Leu Glu Gly560 565 570cag ccg gtg ctc ctg agc tgc caa gcc gac agc tac aag tac gag cat 1780Gln Pro Val Leu Leu Ser Cys Gln Ala Asp Ser Tyr Lys Tyr Glu His575 580 585ctg cgc tgg tac cgc ctc aac ctg tcc acg ctg cac gat gcg cac ggg 1828Leu Arg Trp Tyr Arg Leu Asn Leu Ser Thr Leu His Asp Ala His Gly590 595 600aac ccg ctt ctg ctc gac tgc aag aac gtg cat ctg ttc gcc acc cct 1876Asn Pro Leu Leu Leu Asp Cys Lys Asn Val His Leu Phe Ala Thr Pro605 610 615ctg gcc gcc agc ctg gag gag gtg gca cct ggg gcg cgc cac gcc acg 1924Leu Ala Ala Ser Leu Glu Glu Val Ala Pro Gly Ala Arg His Ala Thr620 625 630 635ctc agc ctg agt atc ccc cgc gtc gcg ccc gag cac gag ggc cac tat 1972Leu Ser Leu Ser Ile Pro Arg Val Ala Pro Glu His Glu Gly His Tyr640 645 650gtg tgc gaa gtg caa gac cgg cgc agc cat gac aag cac tgc cac aag 2020Val Cys Glu Val Gln Asp Arg Arg Ser His Asp Lys His Cys His Lys
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Glu Ser Lys Pro Ser Glu Glu Leu Leu Glu Gly Gln Pro Val Leu Leu565 570 575Ser Cys Gln Ala Asp Ser Tyr Lys Tyr Glu His Leu Arg Trp Tyr Arg580 585 590Leu Asn Leu Ser Thr Leu His Asp Ala His Gly Asn Pro Leu Leu Leu595 600 605Asp Cys Lys Asn Val His Leu Phe Ala Thr Pro Leu Ala Ala Ser Leu610 615 620Glu Glu Val Ala Pro Gly Ala Arg His Ala Thr Leu Ser Leu Ser Ile625 630 635 640Pro Arg Val Ala Pro Glu His Glu Gly His Tyr Val Cys Glu Val Gln645 650 655Asp Arg Arg Ser His Asp Lys His Cys His Lys Lys Tyr Leu Ser Val660 665 670Gln Ala Leu Glu Ala Pro Arg Leu Thr Gln Asn Leu Thr Asp Leu Leu675 680 685Val Asn Val Ser Asp Ser Leu Glu Met Gln Cys Leu Val Ala Gly Ala690 695 700His Ala Pro Ser Ile Val Trp Tyr Lys Asp Glu Arg Leu Leu Glu Glu705 710 715 720Lys Ser Gly Val Asp Leu Ala Asp Ser Asn Gln Lys Leu Ser Ile Gln725 730 735Arg Val Arg Glu Glu Asp Ala Gly Arg Tyr Leu Cys Ser Val Cys Asn740 745 750Ala Lys Gly Cys Val Asn Ser Ser Ala Ser Val Ala Val Glu Gly Ser755 760 765Glu Asp Lys Gly Ser Met Glu Ile Val Ile Leu Val Gly Thr Gly Val770 775 780Ile Ala Val Phe Phe Trp Val Leu Leu Leu Leu Ile Phe Cys Asn Met785 790 795 800Arg Arg Pro Ala His Ala Asp Ile Lys Thr Gly Tyr Leu Ser Ile Ile805 810 815Met Asp Pro Gly Glu Val Pro Leu Glu Glu Gln Cys Glu Tyr Leu Ser820 825 830Tyr Asp Ala Ser Gln Trp Glu Phe Pro Arg Glu Arg Leu His Leu Gly835 840 845Arg Val Leu Gly Tyr Gly Ala Phe Gly Lys Val Val Glu Ala Ser Ala850 855 860Phe Gly Ile His Lys Gly Ser Ser Cys Asp Thr Val Ala Val Lys Met865 870 875 880Leu Lys Glu Gly Ala Thr Ala Ser Glu His Arg Ala Leu Met Ser Glu885 890 895
Leu Lys Ile Leu Ile His Ile Gly Asn His Leu Asn Val Val Asn Leu900 905 910Leu Gly Ala Cys Thr Lys Pro Gln Gly Pro Leu Met Val Ile Val Glu915 920 925Phe Cys Lys Tyr Gly Asn Leu Ser Asn Phe Leu Arg Ala Lys Arg Asp930 935 940Ala Phe Ser Pro Cys Ala Glu Lys Ser Pro Glu Gln Arg Gly Arg Phe945 950 955 960Arg Ala Met Val Glu Leu Ala Arg Leu Asp Arg Arg Arg Pro Gly Ser965 970 975Ser Asp Arg Val Leu Phe Ala Arg Phe Ser Lys Thr Glu Gly Gly Ala980 985 990Arg Arg Ala Ser Pro Asp Gln Glu Ala Glu Asp Leu Trp Leu Ser Pro99510001005Leu Thr Met Glu Asp Leu Val Cys Tyr Ser Phe Gln Val Ala Arg Gly101010151020Met Glu Phe Leu Ala Ser Arg Lys Cys Ile His Arg Asp Leu Ala Ala025103010351040Arg Asn Ile Leu Leu Ser Glu Ser Asp Val Val Lys Ile Cys Asp Phe104510501055Gly Leu Ala Arg Asp Ile Tyr Lys Asp Pro Asp Tyr Val Arg Lys Gly106010651070Ser Ala Arg Leu Pro Leu Lys Trp Met Ala Pro Glu Ser Ile Phe Asp107510801085Lys Val Tyr Thr Thr Gln Ser Asp Val Trp Ser Phe Gly Val Leu Leu109010951100Trp Glu Ile Phe Ser Leu Gly Ala Ser Pro Tyr Pro Gly Val Gln Ile105111011151120Asn Glu Glu Phe Cys Gln Arg Leu Arg Asp Gly Thr Arg Met Arg Ala112511301135Pro Glu Leu Ala Thr Pro Ala Ile Arg Arg Ile Met Leu Asn Cys Trp114011451150Ser Gly Asp Pro Lys Ala Arg Pro Ala Phe Ser Glu Leu Val Glu Ile115511601165Leu Gly Asp Leu Leu Gln Gly Arg Gly Leu Gln Glu Glu Glu Glu Val117011751180Cys Met Ala Pro Arg Ser Ser Gln Ser Ser Glu Glu Gly Ser Phe Ser185119011951200Gln Val Ser Thr Met Ala Leu His Ile Ala Gln Ala Asp Ala Glu Asp120512101215
Ser Pro Pro Ser Leu Gln Arg His Ser Leu Ala Ala Arg Tyr Tyr Asn122012251230Trp Val Ser Phe Pro Gly Cys Leu Ala Arg Gly Ala Glu Thr Arg Gly123512401245Ser Ser Arg Met Lys Thr Phe Glu Glu Phe Pro Met Thr Pro Thr Thr125012551260Tyr Lys Gly Ser Val Asp Asn Gln Thr Asp Ser Gly Met Val Leu Ala265127012751280Ser Glu Glu Phe Glu Gln Ile Glu Ser Arg His Arg Gln Glu Ser Gly128512901295Phe Ser Cys Lys Gly Pro Gly Gln Asn Val Ala Val Thr Arg Ala His130013051310Pro Asp Ser Gln Gly Arg Arg Arg Arg Pro Glu Arg Gly Ala Arg Gly131513201325Gly Gln Val Phe Tyr Asn Ser Glu Tyr Gly Glu Leu Ser Glu Pro Ser133013351340Glu Glu Asp His Cys Ser Pro Ser Ala Arg Val Thr Phe Phe Thr Asp345135013551360Asn Ser Tyr<210>5<211>1311<212>PRT<213>人(Homo sapiens)(FLT1)<400>5Met Val Ser Tyr Trp Asp Thr Gly Val Leu Leu Cys Ala Leu Leu Ser1 5 10 15Cys Leu Leu Leu Thr Gly Ser Ser Ser Gly Ser Lys Leu Lys Asp Pro20 25 30Glu Leu Ser Leu Lys Gly Thr Gln His Ile Met Gln Ala Gly Gln Thr35 40 45Leu His Leu Gln Cys Arg Gly Glu Ala Ala His Lys Trp Ser Leu Pro50 55 60Glu Asn Asn Asn Asn Asn Asn Met Val Ser Lys Glu Ser Glu Arg Leu65 70 75 80Ser Ile Thr Lys Ser Ala Cys Gly Arg Asn Gly Lys Gln Phe Cys Ser85 90 95Thr Leu Thr Leu Asn Thr Ala Gln Ala Asn His Thr Gly Phe Tyr Ser100 105 110Cys Lys Tyr Leu Ala Val Pro Thr Ser Lys Lys Lys Glu Thr Glu Ser115 120 125
Ala Ile Tyr Ile Phe Ile Ser Asp Thr Gly Arg Pro Phe Val Glu Met130 135 140Tyr Ser Glu Ile Pro Glu Ile Ile His Met Thr Glu Gly Arg Glu Leu145 150 155 160Val Ile Pro Cys Arg Val Thr Ser Pro Asn Ile Thr Val Thr Leu Lys165 170 175Lys Phe Pro Leu Asp Thr Leu Ile Pro Asp Gly Lys Arg Ile Ile Trp180 185 190Asp Ser Arg Lys Gly Phe Ile Ile Ser Asn Ala Thr Tyr Lys Glu Ile195 200 205Gly Leu Leu Thr Cys Glu Ala Thr Val Asn Gly His Leu Tyr Lys Thr210 215 220Asn Asn Tyr Leu Thr His Arg Gln Thr Asn Thr Ile Ile Asp Val Gln225 230 235 240Ile Ser Thr Pro Arg Pro Val Lys Leu Leu Arg Gly His Thr Leu Val245 250 255Leu Asn Cys Thr Ala Thr Thr Pro Leu Asn Thr Arg Val Gln Met Thr260 265 270Trp Ser Tyr Pro Asp Asn Asn Asn Glu Lys Asn Lys Arg Ala Ser Val275 280 285Arg Arg Arg Ile Asp Gln Ser Asn Ser His Ala Asn Ile Phe Tyr Ser290 295 300Val Leu Thr Ile Asp Lys Met Gln Asn Lys Asp Lys Gly Leu Tyr Thr305 310 315 320Cys Arg Val Arg Ser Gly Pro Ser Phe Lys Ser Val Asn Thr Ser Val325 330 335His Ile Tyr Asp Lys Ala Phe Ile Thr Val Lys His Arg Lys Gln Gln340 345 350Val Leu Glu Thr Val Ala Gly Lys Arg Ser Tyr Arg Leu Ser Met Lys355 360 365Val Lys Ala Phe Pro Ser Pro Glu Val Val Trp Leu Lys Asp Gly Leu370 375 380Pro Ala Thr Glu Lys Ser Ala Arg Tyr Leu Thr Arg Gly Tyr Ser Leu385 390 395 400Ile Ile Lys Asp Val Thr Glu Glu Asp Ala Gly Asn Tyr Thr Ile Leu405 410 415Leu Ser Ile Lys Gln Ser Asn Val Phe Lys Asn Leu Thr Ala Thr Leu420 425 430Ile Val Asn Val Lys Pro Gln Ile Tyr Glu Lys Ala Val Ser Ser Phe435 440 445Pro Asp Pro Ala Leu Tyr Pro Leu Gly Ser Arg Gln Ile Leu Thr Cys450 455 460
Thr Ala Tyr Gly Ile Pro Gln Pro Asn Thr Ile Lys Trp Phe Trp His465 470 475 480Pro Cys Asn His Asn His Ser Glu Ala Arg Cys Asp Phe Cys Ser Asn485 490 495Asn Glu Glu Ser Phe Ile Leu Asp Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Ala500 505 510Asp Ser Asn Met Gly Asn Arg Ile Glu Ser Ile Thr Gln Arg Met Ala515 520 525Ile Ile Glu Gly Lys Asn Lys Met Ala Ser Thr Leu Val Val Ala Asp530 535 540Ser Arg Ile Ser Gly Ile Tyr Ile Cys Ile Ala Ser Asn Lys Val Gly545 550 555 560Thr Val Gly Arg Asn Ile Ser Phe Tyr Ile Thr Asp Val Pro Asn Gly565 570 575Phe His Val Asn Leu Glu Lys Met Pro Thr Asn Asn Glu Gly Glu Asp580 585 590Leu Lys Leu Ser Cys Thr Val Asn Lys Phe Leu Tyr Arg Asp Val Thr595 600 605Trp Ile Leu Leu Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn610 615 620Asn Asn Asn Asn Asn Arg Thr Val Asn Asn Arg Thr Met His Tyr Ser625 630 635 640Ile Ser Lys Gln Lys Met Ala Ile Thr Lys Glu His Ser Ile Thr Leu645 650 655Asn Leu Thr Ile Met Asn Val Ser Leu Gln Asp Ser Gly Thr Tyr Ala660 665 670Cys Arg Ala Arg Asn Val Tyr Thr Gly Glu Glu Ile Leu Gln Lys Lys675 680 685Glu Ile Thr Ile Arg Asp Gln Glu Ala Pro Tyr Leu Leu Arg Asn Leu690 695 700Ser Asp His Thr Val Ala Ile Ser Ser Ser Thr Thr Leu Asp Cys His705 710 715 720Ala Asn Gly Val Pro Glu Pro Gln Ile Thr Trp Phe Lys Asn Asn His725 730 735Lys Ile Gln Gln Glu Pro Gly Ile Ile Leu Gly Pro Gly Ser Ser Thr740 745 750Leu Phe Ile Glu Arg Val Thr Glu Glu Asp Glu Gly Val Tyr His Cys755 760 765Lys Ala Thr Asn Gln Lys Gly Ser Val Glu Ser Ser Ala Tyr Leu Thr770 775 780
Val Gln Gly Thr Ser Asp Lys Ser Asn Leu Glu Leu Ile Thr Leu Thr785 790 795 800Cys Thr Cys Val Ala Ala Thr Leu Phe Trp Leu Leu Leu Thr Leu Leu805 810 815Ile Arg Lys Met Lys Arg Ser Ser Asn Ser Glu Ile Lys Thr Asp Tyr820 825 830Leu Ser Ile Ile Met Asp Pro Asp Glu Val Pro Leu Asp Glu Gln Cys835 840 845Glu Arg Leu Pro Tyr Asp Ala Ser Lys Trp Glu Phe Ala Arg Glu Arg850 855 860Leu Lys Leu Gly Lys Ser Leu Gly Arg Gly Ala Phe Gly Lys Val Val865 870 875 880Gln Ala Ser Ala Phe Gly Ile Lys Lys Ser Pro Thr Cys Arg Thr Val885 890 895Ala Val Lys Met Leu Lys Glu Gly Ala Thr Ala Ser Glu Tyr Lys Ala900 905 910Leu Met Thr Glu Leu Lys Ile Leu Thr His Ile Gly His His Leu Asn915 920 925Val Val Asn Leu Leu Gly Ala Cys Thr Lys Gln Gly Gly Pro Leu Met930 935 940Val Ile Val Glu Tyr Cys Lys Tyr Gly Asn Leu Ser Asn Tyr Leu Lys945 950 955 960Ser Lys Arg Asp Leu Phe Phe Leu Asn Lys Asp Ala Ala Leu His Met965 970 975Glu Pro Lys Lys Glu Lys Met Glu Pro Gly Leu Glu Gln Gly Lys Lys980 985 990Pro Arg Leu Asp Ser Val Thr Ser Ser Glu Ser Phe Ala Ser Ser Gly99510001005Phe Gln Glu Asp Lys Ser Leu Ser Asp Val Glu Glu Glu Glu Asp Ser101010151020Asp Gly Phe Tyr Lys Glu Pro Ile Thr Met Glu Asp Leu Ile Ser Tyr1025 103010351040Ser Phe Gln Val Ala Arg Gly Met Glu Phe Leu Ser Ser Arg Lys Cys104510501055Ile His Arg Asp Leu Ala Ala Arg Asn Ile Leu Leu Ser Glu Asn Asn106010651070Val Val Lys Ile Cys Asp Phe Gly Leu Ala Arg Asp Ile Tyr Lys Asn107510801085Pro Asp Tyr Val Arg Lys Gly Asp Thr Arg Leu Pro Leu Lys Trp Met109010951100Ala Pro Glu Ser Ile Phe Asp Lys Ile Tyr Ser Thr Lys Ser Asp Val
1105 111011151120Trp Ser Tyr Gly Val Leu Leu Trp Glu Ile Phe Ser Leu Gly Gly Ser112511301135Pro Tyr Pro Gly Val Gln Met Asp Glu Asp Phe Cys Ser Arg Leu Arg114011451150Glu Gly Met Arg Met Arg Ala Pro Glu Tyr Ser Thr Pro Glu Ile Tyr115511601165Gln Ile Met Leu Asp Cys Trp His Arg Asp Pro Lys Glu Arg Pro Arg117011751180Phe Ala Glu Leu Val Glu Lys Leu Gly Asp Leu Leu Gln Ala Asn Val1185 119011951200Gln Gln Asp Gly Lys Asp Tyr Ile Pro Ile Asn Ala Ile Leu Thr Gly120512101215Asn Ser Gly Phe Thr Tyr Ser Thr Pro Ala Phe Ser Glu Asp Phe Phe122012251230Lys Glu Ser Ile Ser Ala Pro Lys Phe Asn Ser Gly Ser Ser Asp Asp123512401245Val Arg Tyr Val Asn Ala Phe Lys Phe Met Ser Leu Glu Arg Ile Lys125012551260Thr Phe Glu Glu Leu Leu Pro Asn Ala Thr Ser Met Phe Asp Asp Tyr1265 127012751280Gln Gly Asp Ser Ser Thr Leu Leu Ala Ser Pro Met Leu Lys Arg Phe128512901295Thr Trp Thr Asp Ser Lys Pro Lys Ala Ser Leu Lys Ile Glu Val130013051310<210>6<211>6<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>在第1位和第2位的氨基酸獨(dú)立地選自天冬氨酸或谷氨酸<220>
<223>在第4位的氨基酸獨(dú)立地選自甲硫氨酸或纈氨酸<220>
<223>在第5位的氨基酸獨(dú)立地選自脯氨酸或天冬氨酸或谷氨酸<220>
<223>人工序列的描述共有序列<400>6Xaa Xaa Tyr Xaa Xaa Met1 5<210>7<211>70
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述寡核苷酸探針<400>7acatgcatgc caccatgcag cggggcgccg cgctgtgcct gcgactgtgg ctctgcctgg 60gactcctgga70<210>8<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述寡核苷酸探針<400>8acatgcatgc cccgccggtc atcc 24<210>9<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述寡核苷酸探針<400>9cggaattccc catgacccca ac22<210>10<211>33<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述寡核苷酸探針<400>10ccatcgatgg atcctacctg aagccgcttt ctt 33<210>11<211>34<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述寡核苷酸探針<400>11cccaagcttg gatccaagtg gctactccat gacc 34
<210>12<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述寡核苷酸探針<400>12gttgcctgtg atgtgcacca 20<210>13<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述寡核苷酸探針<400>13ctggagtcga cttggcggac t 21<210>14<211>60<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述寡核苷酸探針<400>14cgcggatccc tagtgatggt gatggtgatg tctaccttcg atcatgctgc ccttatcctc 60<210>15<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述寡核苷酸探針<400>15ctggagtcga cttggcggac t 21<210>16<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述寡核苷酸探針<400>16cgggatccct ccatgctgcc cttatcct28
<210>17<211>36<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述寡核苷酸探針<400>17ggcaagcttg aattcgccac catgcagcgg ggcgcc 36<210>18<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述寡核苷酸探針<400>18gttgcctgtg atgtgcacca 20<210>19<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述寡核苷酸探針<400>19ctggagtcga cttggcggac t 21<210>20<211>44<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述寡核苷酸探針<400>20cgcggatcca agcttactta ccttccatgc tgcccttatc ctcg 44<210>21<211>419<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>21Met His Leu Leu Gly Phe Phe Ser Val Ala Cys Ser Leu Leu Ala Ala1 5 10 15Ala Leu Leu Pro Gly Pro Arg Glu Ala Pro Ala Ala Ala Ala Ala Phe
20 25 30Glu Ser Gly Leu Asp Leu Ser Asp Ala Glu Pro Asp Ala Gly Glu Ala35 40 45Thr Ala Tyr Ala Ser Lys Asp Leu Glu Glu Gln Leu Arg Ser Val Ser50 55 60Ser Val Asp Glu Leu Met Thr Val Leu Tyr Pro Glu Tyr Trp Lys Met65 70 75 80Tyr Lys Cys Gln Leu Arg Lys Gly Gly Trp Gln His Asn Arg Glu Gln85 90 95Ala Asn Leu Asn Ser Arg Thr Glu Glu Thr Ile Lys Phe Ala Ala Ala100 105 110His Tyr Asn Thr Glu Ile Leu Lys Ser Ile Asp Asn Glu Trp Arg Lys115 120 125Thr Gln Cys Met Pro Arg Glu Val Cys Ile Asp Val Gly Lys Glu Phe130 135 140Gly Val Ala Thr Asn Thr Phe Phe Lys Pro Pro Cys Val Ser Val Tyr145 150 155 160Arg Cys Gly Gly Cys Cys Asn Ser Glu Gly Leu Gln Cys Met Asn Thr165 170 175Ser Thr Ser Tyr Leu Ser Lys Thr Leu Phe Glu Ile Thr Val Pro Leu180 185 190Ser Gln Gly Pro Lys Pro Val Thr Ile Ser Phe Ala Asn His Thr Ser195 200 205Cys Arg Cys Met Ser Lys Leu Asp Val Tyr Arg Gln Val His Ser Ile210 215 220Ile Arg Arg Ser Leu Pro Ala Thr Leu Pro Gln Cys Gln Ala Ala Asn225 230 235 240Lys Thr Cys Pro Thr Asn Tyr Met Trp Asn Asn His Ile Cys Arg Cys245 250 255Leu Ala Gln Glu Asp Phe Met Phe Ser Ser Asp Ala Gly Asp Asp Ser260 265 270Thr Asp Gly Phe His Asp Ile Cys Gly Pro Asn Lys Glu Leu Asp Glu275 280 285Glu Thr Cys Gln Cys Val Cys Arg Ala Gly Leu Arg Pro Ala Ser Cys290 295 300Gly Pro His Lys Glu Leu Asp Arg Asn Ser Cys Gln Cys Val Cys Lys305 310 315 320Asn Lys Leu Phe Pro Ser Gln Cys Gly Ala Asn Arg Glu Phe Asp Glu325 330 335Asn Thr Cys Gln Cys Val Cys Lys Arg Thr Cys Pro Arg Asn Gln Pro340 345 350
Leu Asn Pro Gly Lys Cys Ala Cys Glu Cys Thr Glu Ser Pro Gln Lys355 360 365Cys Leu Leu Lys Gly Lys Lys Phe His His Gln Thr Cys Ser Cys Tyr370 375 380Arg Arg Pro Cys Thr Asn Arg Gln Lys Ala Cys Glu Pro Gly Phe Ser385 390 395 400Tyr Ser Glu Glu Val Cys Arg Cys Val Pro Ser Tyr Trp Lys Arg Pro405 410 415Gln Met Ser<210>22<211>354<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>22Met Tyr Arg Glu Trp Val Val Val Asn Val Phe Met Met Leu Tyr Val1 5 10 15Gln Leu Val Gln Gly Ser Ser Asn Glu His Gly Pro Val Lys Arg Ser20 25 30Ser Gln Ser Thr Leu Glu Arg Ser Glu Gln Gln Ile Arg Ala Ala Ser35 40 45Ser Leu Glu Glu Leu Leu Arg Ile Thr His Ser Glu Asp Trp Lys Leu50 55 60Trp Arg Cys Arg Leu Arg Leu Lys Ser Phe Thr Ser Met Asp Ser Arg65 70 75 80Ser Ala Ser His Arg Ser Thr Arg Phe Ala Ala Thr Phe Tyr Asp Ile85 90 95Glu Thr Leu Lys Val Ile Asp Glu Glu Trp Gln Arg Thr Gln Cys Ser100 105 110Pro Arg Glu Thr Cys Val Glu Val Ala Ser Glu Leu Gly Lys Ser Thr115 120 125Asn Thr Phe Phe Lys Pro Pro Cys Val Asn Val Phe Arg Cys Gly Gly130 135 140Cys Cys Asn Glu Glu Ser Leu Ile Cys Met Asn Thr Ser Thr Ser Tyr145 150 155 160Ile Ser Lys Gln Leu Phe Glu Ile Ser Val Pro Leu Thr Ser Val Pro165 170 175Glu Leu Val Pro Val Lys Val Ala Asn His Thr Gly Cys Lys Cys Leu180 185 190Pro Thr Ala Pro Arg His Pro Tyr Ser Ile Ile Arg Arg Ser Ile Gln195 200 205Ile Pro Glu Glu Asp Arg Cys Ser His Ser Lys Lys Leu Cys Pro Ile
210 215 220Asp Met Leu Trp Asp Ser Asn Lys Cys Lys Cys Val Leu Gln Glu Glu225 230 235 240Asn Pro Leu Ala Gly Thr Glu Asp His Ser His Leu Gln Glu Pro Ala245 250 255Leu Cys Gly Pro His Met Met Phe Asp Glu Asp Arg Cys Glu Cys Val260 265 270Cys Lys Thr Pro Cys Pro Lys Asp Leu Ile Gln His Pro Lys Asn Cys275 280 285Ser Cys Phe Glu Cys Lys Glu Ser Leu Glu Thr Cys Cys Gln Lys His290 295 300Lys Leu Phe His Pro Asp Thr Cys Ser Cys Glu Asp Arg Cys Pro Phe305 310 315 320His Thr Arg Pro Cys Ala Ser Gly Lys Thr Ala Cys Ala Lys His Cys325 330 335Arg Phe Pro Lys Glu Lys Arg Ala Ala Gln Gly Pro His Ser Arg Lys340 345 350Asn Pro
權(quán)利要求
1.一種純化的多肽，它包含哺乳動(dòng)物血管內(nèi)皮生長因子受體-3(VEGFR-3)胞外域(EC)的一部分，其中所述的部分結(jié)合至少一種VEGFR-3配體且由VEGFR-3 EC的至少第一個(gè)，第二個(gè)，和第三個(gè)免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域組成，且其中該多肽缺少VEGFR-3免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域IV-VII，其中該多肽是缺少任何跨膜結(jié)構(gòu)域的可溶性多肽。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的純化多肽，其中該部分基本上由VEGFR-3-EC的第一個(gè)，第二個(gè)，和第三個(gè)免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域組成。
3.根據(jù)權(quán)利要求1-2任一項(xiàng)的純化多肽，其中VEGFR-3是人VEGFR-3。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)的純化多肽，其中該多肽還包含VEGFR-2或VEGFR-3的免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)的純化多肽，其中該VEGFR-3包含選自由SEQ ID NO2和SEQ ID NO4組成的組中的一個(gè)氨基酸序列。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)的純化多肽，其中該VEGFR-3包含由多核苷酸或寡核苷酸編碼的氨基酸序列，該多核苷酸或寡核苷酸在所述多核苷酸或寡核苷酸不能與編碼VEGFR-1的人基因雜交的雜交條件下與編碼VEGFR-3的人基因雜交，所述的雜交條件包括(a)雜交溶液含有50％的甲酰胺，5x Denhardt′s溶液，5x SSPE，0.1％SDS，和0.1mg/ml超聲處理的鮭精DNA；(b)在42℃的溫度中雜交持續(xù)18至24小時(shí)；和(c)雜交后在65℃的洗滌溫度中洗滌，所用洗滌溶液包含1x SSC和0.1％SDS。
7.一種融合蛋白，它含有與免疫球蛋白Fc肽融合的根據(jù)權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)的多肽。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-7任一項(xiàng)的多肽或融合蛋白，它還包含附著到該多肽上的細(xì)胞毒性劑。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的多肽或融合蛋白，其中該細(xì)胞毒性劑選自由植物毒素，細(xì)菌毒素，真菌毒素，放射性同位素，抗代謝產(chǎn)物，烷基化試劑，抗有絲分裂劑，和DNA插入劑組成的組中。
10.一種組合物，它含有根據(jù)權(quán)利要求1-9任一項(xiàng)的多肽或融合蛋白以及一種藥用上可接受的載體。
11.一種多核苷酸，它含有編碼根據(jù)權(quán)利要求1-7任一項(xiàng)的多肽或融合蛋白的核苷酸序列。
12.根據(jù)權(quán)利要求11的多核苷酸，還包含與編碼該多肽的序列可操作相連的表達(dá)控制序列。
13.一種表達(dá)載體，它包含與根據(jù)權(quán)利要求11的多核苷酸可操作地相連的表達(dá)調(diào)控序列。
14.根據(jù)權(quán)利要求13的表達(dá)載體，其中該表達(dá)調(diào)控序列包含在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中啟動(dòng)表達(dá)的啟動(dòng)子。
15.根據(jù)權(quán)利要求14的表達(dá)載體，它是選自由逆轉(zhuǎn)錄病毒，腺病毒，腺伴隨病毒，痘苗病毒和皰疹病毒組成的組中的病毒載體。
16.一種組合物，它含有根據(jù)權(quán)利要求11-15任一項(xiàng)的多核苷酸或載體和一種藥用上可接受的載體。
17.用根據(jù)權(quán)利要求11-15任一項(xiàng)的多核苷酸或載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。
18.根據(jù)權(quán)利要求1-10任一項(xiàng)的多肽，融合蛋白，或組合物在診斷腫瘤疾病的方法中的用途。
19.根據(jù)權(quán)利要求1-10任一項(xiàng)的多肽，融合蛋白，或組合物在治療腫瘤疾病的方法中的用途。
20.根據(jù)權(quán)利要求18-19任一項(xiàng)的多肽，融合蛋白，或組合物，其中該腫瘤疾病是以血管或淋巴管的新脈管形成為特征的腫瘤，且其中新脈管形成包括表達(dá)VEGFR-3的內(nèi)皮細(xì)胞。
21.根據(jù)權(quán)利要求18-19任一項(xiàng)的多肽，融合蛋白，或組合物，其中該腫瘤疾病是乳腺癌。
22.根據(jù)權(quán)利要求1-10任一項(xiàng)的多肽，融合蛋白，或組合物在診斷腫瘤轉(zhuǎn)移的方法中的用途。
23.根據(jù)權(quán)利要求1-10任一項(xiàng)的多肽，融合蛋白，或組合物在預(yù)防腫瘤轉(zhuǎn)移的方法中的用途。
24.根據(jù)權(quán)利要求11-17任一項(xiàng)的多核苷酸，載體，細(xì)胞，或組合物在診斷腫瘤疾病的方法中的用途。
25.根據(jù)權(quán)利要求11-17任一項(xiàng)的多核苷酸，載體，細(xì)胞，或組合物在治療腫瘤疾病的方法中的用途。
26.根據(jù)權(quán)利要求24-25任一項(xiàng)的多核苷酸，載體，細(xì)胞，或組合物，其中該腫瘤疾病是以血管或淋巴管的新脈管形成為特征的腫瘤，且其中新脈管形成包含表達(dá)VEGFR-3的內(nèi)皮細(xì)胞。
27.根據(jù)權(quán)利要求24-25任一項(xiàng)的多核苷酸，載體，細(xì)胞，或組合物，其中該腫瘤疾病是乳腺癌。
28.根據(jù)權(quán)利要求11-17任一項(xiàng)的多核苷酸，載體，細(xì)胞，或組合物在診斷腫瘤轉(zhuǎn)移的方法中的用途。
29.根據(jù)權(quán)利要求11-17任一項(xiàng)的多核苷酸，載體，細(xì)胞，或組合物在預(yù)防腫瘤轉(zhuǎn)移的方法中的用途。
30.一種抑制癌細(xì)胞增生或轉(zhuǎn)移擴(kuò)散的方法，包括給患有癌癥的哺乳動(dòng)物受試者施用含有編碼一種多肽的核苷酸序列的多核苷酸，該多肽含有哺乳動(dòng)物VEGFR-3-EC結(jié)構(gòu)域的一部分，其中所述的部分與至少一種VEGFR-3配體結(jié)合且由VEGFR-3-EC的至少一種免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域組成，其中該編碼的多肽是缺少任何跨膜結(jié)構(gòu)域的可溶性多肽，且其中在允許所述的多核苷酸吸收且從而由哺乳動(dòng)物受試者中的細(xì)胞表達(dá)編碼的多肽的條件下進(jìn)行給藥，且其中以抑制所述細(xì)胞增生的有效量施用該多核苷酸，載體，或組合物。
31.權(quán)利要求30的方法，其中該給藥包括施用包含該多核苷酸的載體。
32.根據(jù)權(quán)利要求30的方法，其中所述的給藥包含施用在根據(jù)權(quán)利要求11-17任一項(xiàng)的多核苷酸，載體，或組合物中的所述多核苷酸。
33.權(quán)利要求30-32的方法，其中所述的多核苷酸，載體或組合物包裹在脂質(zhì)體中。
34.權(quán)利要求31的方法，其中所述的病毒載體選自由逆轉(zhuǎn)錄病毒，腺病毒，腺伴隨病毒，痘苗病毒和皰疹病毒組成的組中。
35.根據(jù)權(quán)利要求30-34任一項(xiàng)的方法，其中該哺乳動(dòng)物受試者被診斷為患有以表達(dá)VEGFR-3的內(nèi)皮細(xì)胞增生為特征的癌癥且其中所述的給藥抑制所述受試者中血管生成和淋巴管生成中的至少一種。
36.根據(jù)權(quán)利要求35的方法，其中該癌癥包括以血管或淋巴管的新脈管形成為特征的腫瘤，且其中新脈管形成包含表達(dá)VEGFR-3的內(nèi)皮細(xì)胞且其中所述的給藥抑制所述受試者中血管生成和淋巴管生成中的至少一種。
37.根據(jù)權(quán)利要求30-33任一項(xiàng)的方法，其中該癌癥細(xì)胞表達(dá)選自由VEGFR-3，VEGF-C和VEGF-D組成的組中的至少一種多肽。
38.根據(jù)權(quán)利要求30-37任一項(xiàng)的方法，其中該受試者是人。
39.根據(jù)權(quán)利要求30-37任一項(xiàng)的方法，其中所述的癌癥是乳腺癌。
40.根據(jù)權(quán)利要求30-37任一項(xiàng)的方法，它還包含給受試者施用第二種癌癥治療劑的步驟。
41.權(quán)利要求40的方法，其中所述的第二種癌癥治療劑包括化療劑，放射性試劑，編碼癌癥治療劑的核酸和抗淋巴管生成劑或抗血管生成劑。
42.根據(jù)權(quán)利要求30-41任一項(xiàng)的方法，其中該細(xì)胞在可手術(shù)的腫瘤中，且其中在切除腫瘤之前，期間，或之后進(jìn)行該給藥步驟。
43.根據(jù)權(quán)利要求30的方法，其中該受試者具有選自由腦，肺，肝臟，脾臟，腎，淋巴結(jié)，小腸，血細(xì)胞，胰腺，結(jié)腸，胃，乳房，子宮內(nèi)膜，前列腺，睪丸，卵巢，皮膚，頭頸，食道，骨髓和血液組成的組中的組織，器官，或細(xì)胞的癌癥。
44.抑制哺乳動(dòng)物受試者中癌癥的轉(zhuǎn)移擴(kuò)散的方法，包括給懷疑患有癌癥的哺乳動(dòng)物受試者施用抑制所述癌癥轉(zhuǎn)移擴(kuò)散有效量的根據(jù)權(quán)利要求1-10任一項(xiàng)的多肽，融合蛋白或組合物。
45.抑制哺乳動(dòng)物受試者中癌癥的轉(zhuǎn)移擴(kuò)散的方法，包括給懷疑患有癌癥的哺乳動(dòng)物受試者施用抑制或減小所述癌癥生長有效量的根據(jù)權(quán)利要求1-10任一項(xiàng)的多肽，融合蛋白或組合物。
46.治療癌癥的方法，包括給診斷患有癌癥的哺乳動(dòng)物受試者施用一種組合物，該組合物包含根據(jù)權(quán)利要求1-10任一項(xiàng)的多肽，融合蛋白或組合物，而施用的量能有效抑制或減小該癌癥生長或腫瘤擴(kuò)散。
47.一種含有編碼一種多肽的核苷酸序列的多核苷酸在制備用于抑制癌細(xì)胞的細(xì)胞增生的藥物中的用途，該多肽含有哺乳動(dòng)物VEGFR-3-EC結(jié)構(gòu)域的一部分，其中所述的部分與至少一種VEGFR-3配體結(jié)合且由VEGFR-3-EC的至少一種免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域組成，其中該編碼的多肽是缺少任何跨膜結(jié)構(gòu)域的可溶性多肽。
48.根據(jù)權(quán)利要求47的用途，其中所述的多核苷酸在載體中。
49.根據(jù)權(quán)利要求47的用途，其中所述的多核苷酸是根據(jù)權(quán)利要求11-17任一項(xiàng)的多核苷酸，載體，細(xì)胞或組合物。
50.根據(jù)權(quán)利要求47-49的用途，其中所述的多核苷酸包裹在脂質(zhì)體中。
51.根據(jù)權(quán)利要求48的用途，其中所述的載體是包含選自由逆轉(zhuǎn)錄病毒，腺病毒，腺伴隨病毒，痘苗病毒和皰疹病毒組成的組中的病毒載體。
52.根據(jù)權(quán)利要求47的用途，其中所述的藥物用于被診斷為患有以表達(dá)VEGFR-3的內(nèi)皮細(xì)胞增生為特征的疾病的哺乳動(dòng)物受試者且其中所述的藥物抑制所述受試者中血管生成和淋巴管生成中的至少一種。
53.根據(jù)權(quán)利要求52的用途，其中該疾病包含以血管或淋巴管的新脈管形成為特征的腫瘤，且其中新脈管形成包含表達(dá)VEGFR-3的內(nèi)皮細(xì)胞且其中所述的藥物抑制所述受試者中血管生成和淋巴管生成中的至少一種。
54.根據(jù)權(quán)利要求52的用途，其中該癌細(xì)胞表達(dá)選自由VEGFR-3，VEGF-C和VEGF-D組成的組中的一種多肽。
55.根據(jù)權(quán)利要求47-54任一項(xiàng)的用途，其中所述的癌癥是乳腺癌。
56.根據(jù)權(quán)利要求47-54任一項(xiàng)的用途，所述的藥物還包含第二種癌癥治療劑。
57.根據(jù)權(quán)利要求56的用途，其中所述的第二種癌癥治療劑包括化療劑，編碼癌癥治療劑的核酸和抗淋巴管生成劑或抗血管生成劑。
58.根據(jù)權(quán)利要求47的用途，其中該細(xì)胞在可手術(shù)的腫瘤中，且其中在切除腫瘤之前，期間，或之后進(jìn)行該給藥步驟。
59.根據(jù)權(quán)利要求47的用途，其中所述的藥物用于具有選自由腦，肺，肝臟，脾臟，腎，淋巴結(jié)，小腸，血細(xì)胞，胰腺，結(jié)腸，胃，乳房，子宮內(nèi)膜，前列腺，睪丸，卵巢，皮膚，頭頸，食道，骨髓和血液組成的組中的組織，器官，或細(xì)胞癌癥的受試者。
60.根據(jù)權(quán)利要求1-10任一項(xiàng)的多肽，融合蛋白或組合物在制備用于抑制哺乳動(dòng)物受試者中癌轉(zhuǎn)移擴(kuò)散的藥物中的用途。
61.根據(jù)權(quán)利要求1-10任一項(xiàng)的多肽，融合蛋白或組合物在制備用于抑制或減小哺乳動(dòng)物受試者中癌生長的藥物中的用途。
62.根據(jù)權(quán)利要求1-10任一項(xiàng)的多肽，融合蛋白或組合物在制備用于治療哺乳動(dòng)物受試者中癌癥的藥物中的用途。
63.根據(jù)權(quán)利要求1-10任一項(xiàng)的多肽，融合蛋白或組合物在制備用于治療哺乳動(dòng)物受試者中癌癥的藥物中的用途。
全文摘要
本發(fā)明提供了純化的Flt4受體酪氨酸激酶多肽和其片斷，編碼該多肽的多核苷酸，特異性結(jié)合該多肽的抗體，及其用途。
文檔編號C07K19/00GK1494552SQ02806049
公開日2004年5月5日 申請日期2002年1月22日 優(yōu)先權(quán)日2001年1月19日
發(fā)明者卡里·阿利塔洛, 奧爾加·阿普雷利科瓦, 卡特里·帕朱索拉, 埃利那·阿姆斯特朗, 賈納·科霍南, 阿賈·凱佩南, 帕朱索拉, 阿姆斯特朗, 阿普雷利科瓦, 凱佩南, 卡里 阿利塔洛, 科霍南 申請人:路德維格癌癥研究院, 利森蒂亞有限公司