專利名稱：新的成纖維細胞生長因子的制作方法
本申請要求申請日為2000年12月8日的美國臨時申請60/251，837的優(yōu)先權(quán)，該申請全文引入本文作參考。
背景技術(shù)：
成纖維細胞生長因子在許多生物學功能包括例如細胞增殖和分化以及發(fā)育中發(fā)揮重要作用。
發(fā)明描述已經(jīng)鑒別了編碼成纖維細胞生長因子(FGF)、優(yōu)選FGF-20(在與本申請相應的臨時申請中稱為FGF-21)或FGF-23(與公布的FGF-22相同)的新的核酸，多肽序列，及其核酸調(diào)節(jié)因子，這是一類參與發(fā)育、分化和形態(tài)發(fā)生(例如細胞之間信號傳導及細胞增殖)的多肽。本發(fā)明的一種FGF，其片段及其衍生物，具有一或多種以下生物學活性，包括但非限于；FGF活性；及FGF特異性免疫原性活性。根據(jù)本發(fā)明，鑒別了至少兩類新FGF，例如FGF-20和FGF-23。
“FGF活性”是指例如促進傷口愈合；促進神經(jīng)元存活；刺激細胞增殖，例如干細胞、成纖維細胞、神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細胞、少突膠質(zhì)細胞、神經(jīng)膜細胞或它們的祖細胞增殖；調(diào)節(jié)細胞分化；誘導胚胎發(fā)育；刺激神經(jīng)突長出；增強神經(jīng)或神經(jīng)元損傷恢復；刺激髓鞘形成；刺激血管發(fā)生；受體結(jié)合活性；調(diào)節(jié)腫瘤發(fā)生等。
“FGF特異性免疫原性活性”是指例如FGF多肽激發(fā)針對FGF的選擇性免疫應答，例如針對哺乳動物FGF-20的選擇性免疫應答。因此，由選自哺乳動物FGF(例如

圖1和圖2中的FGF)的氨基酸序列刺激抗體、T細胞、巨噬細胞、B細胞、樹突細胞，是一種特異性免疫原性活性。這些應答可以常規(guī)測定。
FGF，如FGF-20或FGF-23，是全長哺乳動物多肽，其具有可得自天然來源的氨基酸序列，并具有一或多種上述活性。其可以具有圖1和圖2所示序列，序列中具有起自起始密碼子止于終止密碼子的一個開放讀框。其包括天然發(fā)生的正常序列，天然發(fā)生的突變序列，及天然發(fā)生的多態(tài)性序列，包括單核苷酸多態(tài)性(SNP)等序列。天然來源包括例如活細胞，例如得自組織或完整有機體，培養(yǎng)細胞系，包括原代及無限增殖化細胞系，活檢組織等。
本發(fā)明還涉及哺乳動物FGF的片段。所述片段優(yōu)選是“生物活性的”?！吧锘钚缘摹笔侵杆龆嚯钠卧诨钕到y(tǒng)或活系統(tǒng)成分中具有活性。生物活性包括那些提及的活性，例如FGF活性，如FGF受體結(jié)合活性，及FGF免疫原性活性。片段可以根據(jù)任何所需方法制備，包括化學合成，遺傳工程，裂解產(chǎn)物等。FGF的生物學片段包括這樣的多肽，其在蛋白質(zhì)的羧基或氨基端的氨基酸序列被除去或修飾。
FGF-20和FGF-23的任何可公開獲得的核酸片段及多肽片段，或其同源片段，均不包括在本發(fā)明內(nèi)，例如g5762262，其是從Xenopus laevis中鑒別的相似序列。可公開獲得的核酸的核苷酸及氨基酸序列可以通過查詢公共數(shù)據(jù)庫而鑒別。
本發(fā)明還涉及一種FGF-20，其具有圖1所示的第1-211位推導氨基酸序列，及一種FGF-23，其具有圖2所示的第1-169位推導氨基酸序列。推斷FGP-20的分子量為大約23.5kdal，pI為大約9.25。推斷FGF-23的分子量為大約19.6kdal，pI為大約12.32。
蛋白質(zhì)的相同性程度是指蛋白質(zhì)中相同的氨基酸數(shù)目與氨基酸殘基總數(shù)的比值相似性程度是指相同的氨基酸殘基數(shù)加上保守取代的氨基酸數(shù)(如用V取代L等)與氨基酸殘基總數(shù)的比值。對于DNA，相同性與相似性相同，均是指相同核苷酸數(shù)與總長度的比值。
本發(fā)明的FGF多肽，例如具有圖1和圖2所示氨基酸序列，可以通過任何適當方法分析以鑒別所述多肽中其它結(jié)構(gòu)和/或功能結(jié)構(gòu)域，包括跨膜區(qū)域，疏水區(qū)域。例如FGF多肽可以通過例如以下所述方法分析；Kyte和Doolittle，分子生物學雜志157105，1982；EMBL Protein Predict；Rost和Sander，蛋白質(zhì)1955-72，1994。
本發(fā)明FGF的其它同源物可以根據(jù)不同方法得自哺乳動物和非哺乳動物來源。例如，可利用與衍生自圖1和圖2的寡核苷酸雜交選擇同源物，例如Sambrook等，分子克隆1989，第11章所述。這種同源物可以具有與GENE不同數(shù)量的核苷酸及氨基酸序列相同性和相似性。哺乳動物生物體包括例如嚙齒動物，小鼠，大鼠，倉鼠，猴子，豬，牛等。非哺乳動物生物體包括例如脊椎動物，無脊椎動物，斑馬魚，雞，果蠅，C.elegans，Xenopus，酵母如S.pombe，S.cerevisiae，蛔蟲，原核生物，植物，Arabidopsis，病毒，artemia等。
本發(fā)明還涉及FGF特異性氨基酸序列，例如見于圖1和圖2的特定序列中的一個指定氨基酸序列，見于本發(fā)明FGF中的保守氨基酸基序。可以使用相關(guān)蛋白質(zhì)之間的對比，如其它相關(guān)FGFs(見例如Venkataraman等，美國科學院院報963658-3663，1999)，以選擇特異于FGF的序列。
例如，對比FGF-20和FGF-23的蛋白質(zhì)序列，并基于與圖1和圖2所示同源的保守區(qū)域產(chǎn)生氨基酸基序。本發(fā)明涉及任何核酸或其多肽序列，例如包含三或多個保守或同源殘基的多肽，例如LYGS，HFLP，VQGTR，RIEENGHNTY，QFEENWYNTY，AGTPSA，AAERSA等。其它特異性和/或保守氨基酸序列可以常規(guī)發(fā)現(xiàn)，例如通過使用BLAST計算機程序查詢基因/蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫而發(fā)現(xiàn)。FGF特異性氨基酸序列或基序可以用于產(chǎn)生作為抗原的肽，以產(chǎn)生特異性免疫應答。通過這種免疫獲得的抗體可以用作哺乳動物FGF蛋白的特異探針以進行診斷或研究。
正如所論及的，本發(fā)明多肽可以包含F(xiàn)GF的不同氨基酸序列(例如全長序列，即具有圖1和圖2所示起始和終止密碼子，成熟氨基酸序列，即FGF多肽是作為前體產(chǎn)生，所述前體被加工成成熟多肽，或這些序列的片段)。有用的片段包括例如包含或基本由任何前述結(jié)構(gòu)域及特異的和保守的氨基酸序列組成的片段。
本發(fā)明FGF多肽的片段可以加以選擇以具有特異生物活性，例如FGF受體結(jié)合活性或免疫原性活性。
這些活性的測定見于下文及實施例所述。這些多肽也可以如EP496 162所述鑒別和制備。一個有用片段可包含或基本上由例如圖1和圖2所示的大約9個連續(xù)氨基酸，優(yōu)選大約10，15，20，30，40個連續(xù)氨基酸組成。
本發(fā)明的多肽也可以與圖1和圖2所示氨基酸序列具有100％或略低的氨基酸序列相同性。針對以下論述；序列相同性是指在對比序列的相應位置發(fā)現(xiàn)與圖1和圖2所示序列相同的核苷酸或氨基酸。與圖1和圖2所示氨基酸序列具有低于100％序列相同性的多肽，可以含有與天然發(fā)生序列不同的取代，包括同源和非同源氨基酸取代。同源氨基酸取代實例見以下所述。基于FGF多肽序列對比，相同和同源殘基總和除以殘基總數(shù)等于序列相似性百分率。為計算序列相同性和相似性，將對比序列進行序列對比，并根據(jù)任何所需方法，公式，計算機程序等計算，包括例如FASTA，BLAST。與圖1和圖2所示氨基酸序列具有低于100％氨基酸序列相同性的多肽，可以具有大約99％，98％，97％，95％，90.5％，90％，85％，70％或低如大約60％序列相同性。
本發(fā)明還涉及FGF-21和FGF-23的FGF多肽突變蛋白，即具有與得自天然來源的氨基酸序列不同的氨基酸序列的任何多肽(哺乳動物FGF的片段與天然發(fā)生的FGF盡管氨基酸數(shù)目不同但在氨基酸序列上沒有差異)。因此，F(xiàn)GF多肽突變蛋白包含氨基酸取代，插入和缺失，包括非天然發(fā)生的氨基酸。
本發(fā)明FGF氨基酸序列的突變蛋白還可以基于從基因數(shù)據(jù)庫(例如Genbank，EMBL)中進行同源性查詢而制備。序列同源性查詢可以通過各種方法實現(xiàn)，包括BLAST計算機程序，Smith-Waterman公式等。通過鑒別及對比多肽之間一個結(jié)構(gòu)域內(nèi)的相同和/或同源氨基酸，然后基于這種序列對比修飾一個氨基酸，可以將突變蛋白導入一個序列中。例如，本發(fā)明的FGF與各種已知FGF呈現(xiàn)序列相同性，例如Venkataraman等，美國科學院院報963658-3663，1999所述。這些多肽之間的序列對比，尤其在Venkataraman等氨基酸取代的表1中鑒別的保守氨基酸殘基對比，可以鑒別修飾后預期會降低、減少或消除FGF生物活性如受體結(jié)合活性的殘基。例如，當序列對比揭示出在兩或多個結(jié)構(gòu)域之間保守的相同氨基酸時，預計所述氨基酸的消除或取代會負面影響其生物活性。
氨基酸取代可以通過用一個同源氨基酸取代另一個氨基酸而產(chǎn)生。同源氨基酸可以基于側(cè)鏈的大小和極化程度限定，包括小型非極性氨基酸；半胱氨酸，脯氨酸，丙氨酸，蘇氨酸；小型極性氨基酸；絲氨酸，甘氨酸，天冬氨酸，天冬酰胺；大型極性氨基酸；谷氨酸，谷氨酰胺，賴氨酸，精氨酸；中等極性氨基酸；酪氨酸，組氨酸，色氨酸；大型非極性氨基酸苯丙氨酸，甲硫氨酸，亮氨酸，異亮氨酸，纈氨酸。同源氨基酸還可以如下分組無電荷的極性R組，甘氨酸，絲氨酸，蘇氨酸，半胱氨酸，酪氨酸，天冬酰胺，谷氨酰胺；酸性氨基酸(負電荷的)，天冬氨酸和谷氨酸；堿性氨基酸(正電荷的)，賴氨酸，精氨酸，組氨酸。同源氨基酸還包括如下所述那些氨基酸Dayhoff，蛋白質(zhì)序列和結(jié)構(gòu)圖5，1978，及Argos，EMBO雜志8，779-785，1989。
本發(fā)明涉及突變蛋白多肽及編碼這種多肽的突變蛋白核酸。因此，本發(fā)明涉及圖1和圖2所示核苷酸序列，其中所述編碼多肽及一或多個氨基酸位置的核酸被取代或缺失，或既取代又缺失，并且由所述核酸編碼的多肽具有一種生物活性，例如增強神經(jīng)或神經(jīng)元損傷恢復。一種多肽突變蛋白及其相應核苷酸編碼序列可以具有圖1和圖2所示氨基酸序列，但在一或多個位置由同源氨基酸取代，例如具有1，5，10，15或20個取代。修飾怎樣影響所述活性可以根據(jù)上述，下述及本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法測定。例如本領(lǐng)域已知許多分析FGF活性的方法，包括例如測定神經(jīng)元存活及其它神經(jīng)營養(yǎng)活性的分析，如實施例中所述及例如Kanda等，li7t.J.Devl.Neuroscie7tce，12(3)191-200，1999所述，及FGF受體結(jié)合活性分析。
正如所述的，氨基酸取代也可以基于與相關(guān)其它FGF的相似性而產(chǎn)生。其它突變可以通過修飾或突變圖1和圖2所示核苷酸序列，及選擇那些影響其一或多種活性的突變的而常規(guī)選擇，例如根據(jù)以下所述方法和實施例通過測定活性選擇。
本發(fā)明的哺乳動物FGF，其片段或取代的多肽還可以包含各種修飾，其中這類修飾包括脂質(zhì)修飾，甲基化，磷酸化，糖基化，共價修飾(例如R組氨基酸)，氨基酸取代，氨基酸缺失，或氨基酸添加。對所述多肽進行修飾可以根據(jù)多種方法實現(xiàn)，包括重組，合成，化學法等。
本發(fā)明多肽(例如全長多肽，其片段，其突變體)可以以多種方式應用，例如在分析中作為針對抗體的免疫原，作為生物活性劑(例如具有一或多種與本發(fā)明FGF相關(guān)的活性)。
編碼本發(fā)明FGF的多肽，其衍生物，或其片段，可以與一或多個結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)域，功能結(jié)構(gòu)域，可檢測結(jié)構(gòu)域，抗原結(jié)構(gòu)域，和/或感興趣的所需多肽組合，以非天然存在的方式排列，即它們是非天然發(fā)生的。包含這種特征的多肽是一種嵌合或融合多肽。這種嵌合多肽可以根據(jù)多種方法制備，包括化學，合成，準合成，和/或重組方法。編碼嵌合多肽的一種嵌合核酸在一個連續(xù)(例如具有多個N-末端結(jié)構(gòu)域以穩(wěn)定或增強活性)或間斷的開放讀框中，可以含有連續(xù)的多個結(jié)構(gòu)域或所需的多肽，例如含有內(nèi)含子，剪接位點，增強子等。所述嵌合核酸可以根據(jù)多種方法生產(chǎn)。見例如美國專利No.5,439,819所述。結(jié)構(gòu)域或所需多肽可以具有任何所需性質(zhì)，包括一種生物功能如信號傳導，生長促進，細胞定向(例如信號序列，靶向序列，如定向至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)或核)等，一種結(jié)構(gòu)功能如疏水性，親水性，跨膜等，受體-配體功能，和/或可檢測功能，例如與酶，熒光多肽，綠熒光蛋白組合(Chalfie等，科學263802，1994；Cheng等，自然生物技術(shù)14606，1996；Levy等，自然生物技術(shù)14610，1996)等。另外，一種多肽，或其一部分，當導入宿主細胞中時可以用作檢測標記。例如編碼本發(fā)明氨基酸序列的核酸，可以在讀框中融合一個所需編碼序列，作為進行純化，選擇或生產(chǎn)的標記。所述融合區(qū)域可以編碼一個切割位點以易于表達，分離，純化等。
本發(fā)明多肽可以在一個表達系統(tǒng)中生產(chǎn)，例如在根據(jù)本發(fā)明的體內(nèi)、體外、無細胞、重組、細胞融合等表達系統(tǒng)中。通過這種系統(tǒng)對所述多肽進行的修飾包括糖基化，氨基酸取代(例如通過使用不同密碼子)，多肽加工如消化，切割，內(nèi)肽酶或外肽酶活性，附加化學組分，包括脂質(zhì)和磷酸等。
本發(fā)明多肽可以根據(jù)常規(guī)方法從天然來源，轉(zhuǎn)化的宿主細胞(培養(yǎng)基或細胞)中回收，包括去污劑提取(例如非離子型去污劑，TritonX-100，CHAPS，octylglucoside，Igepal CA-630)，硫酸銨或乙醇沉淀，酸提取，陰離子或陽離子交換層析，磷酸纖維素層析，疏水作用層析，羥磷灰石層析，凝集素層析，凝膠電泳。需要時在完成成熟蛋白質(zhì)構(gòu)型中可以使用蛋白質(zhì)重折疊步驟。最后，可以使用高效液相層析(HPLC)進行純化。FGF多肽也可以用本領(lǐng)域已知的其它FGF分離方法分離，例如以下所述多種FGF分離方法美國專利5,604,293，5,395,756，5,155,214，4,902,782及Santos-Ocampo等，生物化學雜志2711726-1731，1996(從細菌宿主中純化FGF，如從大腸桿菌中純化)。另一種方法是與一個親和標記(Flag表位，HA表位，myc表位，6×組氨酸，麥芽糖結(jié)合蛋白，殼多糖酶等)一起重組表達FGF，然后通過抗標記抗體綴合的親和層析純化。
本發(fā)明還涉及核酸，如編碼本發(fā)明FGF多肽及其片段的DNA和RNA。FGF核酸(如FGF-20或FGF-23)或其片段，是具有可得自天然來源的核苷酸序列的核酸。其因此包括天然發(fā)生的序列，正常序列，天然發(fā)生的突變體，及天然發(fā)生的多態(tài)等位基因(例如SNP)等。天然來源包括例如得自組織和完整生物體的活細胞，腫瘤，培養(yǎng)的細胞系，包括原代和無限增殖的細胞系。
本發(fā)明的核酸序列可以含有如圖1和圖2所示完整編碼序列，其簡并序列和片段。本發(fā)明的核酸序列還可以包含一個核苷酸序列，其與上述和下述任何核苷酸序列均100％互補，例如是它們的反義序列。
本發(fā)明的核酸序列可以得自許多不同來源。其可以得自DNA或RNA，如聚腺苷酸化mRNA，例如分離自組織，細胞或整個生物體。所述核酸可以直接得自DNA或RNA，或得自cDNA文庫。所述核酸可以得自特定發(fā)育階段的細胞或組織(例如得自胚胎或成人心臟或骨骼肌細胞或組織)，具有所需基因型，表型等。
如以上關(guān)于FGF多肽的論述，包含編碼本發(fā)明多肽的核苷酸序列的核酸，可以包括僅編碼序列；編碼序列和附加的編碼序列(例如編碼前導肽，分泌性肽，導向肽，酶促肽，熒光肽或其它診斷性肽的序列)，編碼序列和非編碼序列，例如在5’或3’末端或分散于編碼序列中的非翻譯序列，例如內(nèi)含子。包含不間斷編碼多肽的核苷酸序列的核酸，是指所述核苷酸序列含有一個FGF氨基酸編碼序列，所述編碼序列不被非編碼核苷酸中斷或介于其間，例如沒有內(nèi)含子。這種核苷酸序列還可以稱為是連續(xù)的。編碼人，小鼠，或其它哺乳動物FGF等的基因組DNA可以常規(guī)獲得。
本發(fā)明的核酸還可以包含一個表達控制序列，其可操縱地連接于上述核酸。術(shù)語“表達控制序列”是指一個核酸序列，其調(diào)節(jié)由與其可操縱連接的核酸編碼的多肽表達。表達可以在mRNA或多肽水平調(diào)節(jié)。因此，所述表達控制序列包括mRNA元件和蛋白質(zhì)相關(guān)元件。這種元件包括啟動子，增強子(病毒或細胞的)，核糖體結(jié)合序列，轉(zhuǎn)錄終止子等。當所述表達控制序列的定位方式使得實現(xiàn)或達到所述編碼序列表達時，表達控制序列就是可操縱地連接于所述核苷酸編碼序列。例如，當一個啟動子可操縱地連接于編碼序列的5’時，該編碼序列的表達由該啟動子驅(qū)動。表達控制序列可以異源于正?；蚧蛘呖梢允瞧鋬?nèi)源性的。
本發(fā)明的核酸可以基于核酸雜交而選擇。兩個單鏈核酸制備物雜交在一起的能力是其核苷酸序列互補性的測定標準，例如核苷酸之間的堿基配對如A-T，G-C等。本發(fā)明因此還涉及與包含圖1和圖2所示核苷酸序列的核酸雜交的核酸及其互補體。與圖1和圖2的序列雜交的核苷酸序列具有互補核酸鏈，或在存在聚合酶(即一種適當?shù)暮怂岷铣擅?的情況下作為模板。本發(fā)明包括核酸的兩條鏈，例如有義鏈和反義鏈。
可以選擇雜交條件以選擇與圖1和圖2所示核苷酸序列具有所需量核苷酸互補性的核酸。能與這種序列雜交的核酸，優(yōu)選序列之間具有例如大約85％，更優(yōu)選90％，92％，及特別優(yōu)選95％，97％或100％互補性。本發(fā)明特別涉及與圖1和圖2所示核苷酸序列在低或高嚴格條件下雜交的核酸序列。
可以用多種方式選擇與FGF序列雜交的核酸。例如，印跡(即含有核酸的基質(zhì))，芯片陣列，及其它包含感興趣核酸的基質(zhì)，可以在預雜交溶液(6×SSC，0.5％SDS，100μg/ml變性的鮭精DNA，5×Denhardt′s溶液，和50％甲酰胺)中于30℃溫育過夜，然后根據(jù)已知程序與可檢測寡核苷酸探針(見下文)在雜交溶液(例如6×SSC，0.5％SDS，100μg/ml變性鮭精DNA和50％甲酰胺)中于42℃雜交過夜。在高嚴格條件下洗滌印跡，以使例如堿基對錯配少于5％(例如在65℃在0.1％SSC和0.1％SDS中洗滌兩次各30分鐘)，即選擇具有95％或更高序列相同性的序列。高嚴格條件的其它非限制實例包括在含有30mM NaCl和0.5％SDS的水相緩沖液中于65℃最后洗滌一次。另一種高嚴格條件例如是在7％SDS，0.5M NaPO4，pH7，1mM EDTA中于50℃雜交例如過夜，隨后在42℃用1％SDS溶液洗滌一或多次。
高嚴格性洗滌可以使錯配少于5％，而不嚴格或低嚴格性洗滌條件(例如在37℃在0.2％SSC和0.5％SDS中洗滌兩次各30分鐘)可以使錯配接近20％。低嚴格條件的另一個非限制性實例包括在42℃在含有30mM NaCl和0.5％SDS的緩沖液中最后洗滌一次。洗滌和雜交也可以如Sambrook等，分子克隆，第9章所述進行。
雜交也可以基于計算所述探針與其靶位之間形成的雜交體的解鏈溫度(Tm)而進行，如Sambrook等所述。通常地，解鏈溫度Tm是在此溫度短寡核苷酸(含有18個核苷酸或更少)將從其靶序列中解鏈，該溫度如下計算Tm＝(A和T的數(shù)目)×2℃+(C和G的數(shù)目)×4℃。針對較長的分子，Tm＝81.5+16.61og10[Na+]+0.41(％GC)-600/N，其中[Na+]是鈉離子的摩爾濃度，％GC是探針中GC堿基對的百分率，N是長度。雜交可以在低于該溫度的一些溫度進行，以保證所述探針和靶位可以雜交。通過進一步降低溫度可以允許錯配。。
可以選擇嚴格條件以分離在探針(例如FGF的寡核苷酸)和靶核酸之間具有例如至少大約95％，優(yōu)選97％核苷酸互補性的序列及其互補體。
根據(jù)本發(fā)明，核酸或多肽在圖1和圖2所示核苷酸或氨基酸序列中可以包含一或多個不同之處。對核苷酸和/或氨基酸序列進行改變或修飾可以通過任何適當方法實現(xiàn)，包括定點或隨機誘變。。
本發(fā)明的編碼哺乳動物FGF如FGF-20或FGF-23的核酸，可以包含在天然發(fā)生的基因中存在的核苷酸，例如天然發(fā)生的多態(tài)性，正?；蛲蛔兊任换?核苷酸或氨基酸)，在哺乳動物自然群體如人，猴子，豬，小鼠，大鼠或兔子中發(fā)現(xiàn)的突變。例如，人FGF核酸或多肽包含在自然人群中出現(xiàn)的核苷酸或氨基酸。術(shù)語“天然發(fā)生的”是指所述核酸可得自天然來源，例如動物組織和細胞，體液，組織培養(yǎng)細胞，法醫(yī)樣品。天然發(fā)生的突變可以包括核苷酸序列的缺失(例如截短的氨基或羧基端)，取代，倒置，或添加。這些基因可以根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知方法通過核酸雜交而檢測和分離。編碼本發(fā)明哺乳動物FGF的核苷酸序列可以含有在天然發(fā)生的基因，轉(zhuǎn)錄物，或cDNA中發(fā)現(xiàn)的密碼子。例如圖1和圖2所示，或者其可以含有編碼相同氨基酸序列的簡并密碼子。例如，可以改變序列中的密碼子以優(yōu)化所述序列以在所需宿主中表達。
本發(fā)明的核酸可以包含例如DNA，RNA，合成的核酸，肽核酸，修飾的核苷酸，或混合物。DNA可以是雙鏈或單鏈的。包含核酸的核苷酸可以根據(jù)所需目的通過許多已知鍵結(jié)合，所述鍵例如酯，sulfamate，sulfamide，硫代膦酸酯，氨基膦酸酯，甲基膦酸酯，氨基甲酸等，所述目的例如對核酸酶如RNAase H的抗性，改良體內(nèi)穩(wěn)定性等。見例如美國專利No.5,378,825所述。
可以對所述核酸進行多種修飾，如附著可檢測標記(抗生物素蛋白，生物素，放射性元素)，改良雜交，檢測或穩(wěn)定性的組分。所述核酸分子還可以根據(jù)所需方法附于固體支持物，例如硝基纖維素，磁性或順磁性微球體(例如美國專利No.5,411,863；美國專利No.5,543,289所述；例如包含鐵磁性，超磁性，順磁性，超順磁性，氧化鐵和多糖微球體)，尼龍，瓊脂糖，重氮化纖維素，乳膠固體微球體，聚丙烯酰胺等。見例如美國專利No5,470,967；5,476,925；5,478,893所述。
本發(fā)明的另一方面涉及寡核苷酸或核酸探針。這種寡核苷酸或核酸探針可以用于例如檢測，定量或分離測試樣品中哺乳動物FGF核酸，或鑒別FGF同源物。在一個優(yōu)選實施方案中，所述核酸可以用作寡核苷酸探針，例如在PCR，差異展示，基因芯片(例如Affymetrix GeneChips；美國專利No.5,143,854，美國專利No,5,424,186；美國專利No.5,874,2 19；PCT WO92/10092；PCT WO90/15070)和其它所用方法中。針對包括研究，診斷和法醫(yī)學目的在內(nèi)的許多不同目的，需要進行檢測。針對診斷目的，需要鑒別樣品中核酸序列的存在或數(shù)量，其中所述樣品得自組織，細胞，體液等。在一個優(yōu)選方法中，本發(fā)明涉及一種檢測核酸的方法，包括將測試樣品中靶核酸與一種寡核苷酸在有效實現(xiàn)所述靶核酸與所述寡核苷酸雜交的條件下接觸；及檢測雜交情況。本發(fā)明的寡核苷酸還可以用于合成核酸的擴增中，如PCR(例如Saiki等，科學24153，1988；美國專利No.4,683,202；PCR方案方法和應用指導，Innis等編輯，學術(shù)出版社，紐約1990)；差異展示(見例如Liang等，核酸研究213269-3275，1993；美國專利No.5,599,672；WO97/18454)。
可以與針對其它基因的寡核苷酸組合完成檢測，所述其它基因例如參與信號轉(zhuǎn)導，生長，癌癥，細胞程序死亡的基因，或上述或下述任何基因等。寡核苷酸還可以用于測試突變，例如使用錯配DNA修復技術(shù)，如美國專利No.5,683,877；美國專利No.5,656,430；Wu等，美國科學院院報898779-8783，1992所述。
本發(fā)明的寡核苷酸可以包含圖1和圖2的任何連續(xù)核苷酸序列或其互補序列，或者任何所述序列或其互補序列。本發(fā)明的這些寡核苷酸(核酸)可以是任何所需大小，例如大約10-200個核苷酸，12-100個核苷酸，優(yōu)選12-50個，12-25個，14-16個，至少大約15個，至少大約20個，至少大約25個核苷酸等。所述寡核苷酸可以具有非天然發(fā)生的核苷酸，例如肌苷，AZT，3TC等。所述寡核苷酸與圖1和圖2所示序列可以具有100％相同性或互補，或者其可以具有錯配或核苷酸取代，例如1，2，3，4或5個取代。例如，所述寡核苷酸與圖1和圖2所示序列可以具有70-99％相同性，例如90，95或97％相同性。根據(jù)本發(fā)明，所述寡核苷酸可以包含一個試劑盒，其中所述試劑盒包括一種所需的緩沖液(例如磷酸鹽緩沖液，tris緩沖液等)，檢測成分等。所述寡核苷酸可以用本領(lǐng)域已知放射性或非放射性標記加以標記。
本發(fā)明的另一方面是哺乳動物FGF獨有的一個核苷酸序列。FGF獨有的一個序列，是指FGF中出現(xiàn)的一特定順序的核苷酸，例如在圖1和圖2的核苷酸序列中，但在其它核酸中很少或不常見，尤其在動物核酸優(yōu)選哺乳動物如人，大鼠，小鼠等核酸中不存在。獨特的核苷酸序列包括編碼圖1和圖2所示氨基酸的序列或其互補序列。這種序列在本文所述的及并入?yún)⒖嫉娜魏畏椒ㄖ芯捎米魈结?。包括有義和反義核苷酸序列。本發(fā)明的獨特核酸可以常規(guī)測定。包含這個獨特序列的核酸可以用作雜交探針，以鑒別包含核酸混合物的樣品中例如人或小鼠FGF的存在情況，例如在Northern印跡中。雜交可以在高嚴格條件(如上述)下進行，以選擇與所述探針具有至少95％相同性(即互補性)的核酸(及其可含有編碼序列的互補體)，但也可以使用較低嚴格條件。獨特的FGF核苷酸序列也可以在其5’或3’末端與本專利提及的各種核苷酸序列在讀框內(nèi)融合，所述序列包括FGF其它部分，酶，GFP等的編碼序列，表達控制序列等。
正如已經(jīng)論述的，雜交可以根據(jù)所需選擇性在不同條件下進行，例如Sambrook等，分子克隆1989所述。例如，為特異性檢測本發(fā)明的FGF，可以將寡核苷酸與靶核酸在所述寡核苷酸只與其雜交的條件下雜交，例如其中所述寡核苷酸與靶核酸100％互補。如果需要選擇低于100％核苷酸互補性的靶核酸，可以使用不同條件，所述互補性例如是至少大約99％，97％，95％，90％，86.4％，85％，70％，67％。
本發(fā)明的核酸可以根據(jù)任何所需方法標記。所述核酸可以使用放射性示蹤物標記，常用的示蹤物如32P，35S，125I，3H或14C。放射標記可以根據(jù)任何方法進行，例如在3’和5’末端用放射標記的核苷酸，多核苷酸激酶(有或無磷酸酶去磷酸作用)或連接酶(根據(jù)欲標記的末端而定)末端標記。也可以使用非放射性標記，將本發(fā)明核酸與具有以下性質(zhì)的殘基組合，所述性質(zhì)為免疫學性質(zhì)(抗原，半抗原)，對某些試劑(配體)的特異親和性，使可檢測酶反應完成的性質(zhì)(酶或輔酶，酶底物，或參與酶反應的其它物質(zhì))，或特征性物理性質(zhì)如熒光性或發(fā)射或吸收所需波長的光等。
本發(fā)明的核酸，包括寡核苷酸，反義核酸等，可以用于在所有器官，組織，細胞等中檢測FGF的表達，這通過多種方法進行，包括Northern印跡，PCR，原位雜交，差異展示，核酸陣列，斑點印跡等。這種核酸可以特別用于檢測FGF的擾亂表達，例如細胞特異性和/或亞細胞改變。FGF的水平可以單獨或與其它基因產(chǎn)物特別是參與神經(jīng)元生理的其它基因產(chǎn)物組合測定。
本發(fā)明的核酸可以在許多不同系統(tǒng)中表達，根據(jù)所需目的在體內(nèi)或在體外表達。例如，核酸可以插入表達載體中，導入所需宿主中，并在有效實現(xiàn)由所述核酸編碼的多肽表達的條件下培養(yǎng)。有效條件包括適于所述宿主細胞產(chǎn)生所述多肽的任何培養(yǎng)條件，包括有效溫度，pH，培養(yǎng)基，培養(yǎng)宿主細胞的培養(yǎng)基中的添加劑(例如如果所述編碼核酸毗鄰dhfr基因，則為增強或誘導表達的添加劑，如丁酸鹽或氨甲蝶呤)，環(huán)己酰亞胺，細胞密度，培養(yǎng)皿等。核酸可以通過任何有效方法導入細胞中，包括例如裸DNA，磷酸鈣沉淀，注射，DEAE-葡聚糖介導的轉(zhuǎn)染，與脂質(zhì)體融合，與增強細胞對其攝取的制劑綴合，病毒轉(zhuǎn)染。導入本發(fā)明核酸的細胞是一種轉(zhuǎn)化的宿主細胞。所述核酸可以在宿主細胞染色體外或整合入染色體中。其可以是穩(wěn)定或瞬時的。根據(jù)與宿主細胞的相容性選擇表達載體。宿主細胞包括哺乳動物細胞例如COS，CV1，BHK，CHO，HeLa，LTK，NIH 3T3，293，PAE，人成纖維細胞，人原位腫瘤細胞，睪丸細胞，神經(jīng)膠質(zhì)細胞，神經(jīng)原，少突膠質(zhì)細胞，成神經(jīng)細胞瘤細胞，神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞等，昆蟲細胞如Sf9(S.frugipeda)和果蠅，細菌如大腸桿菌，鏈球菌，芽孢桿菌，酵母如Sacharomyces，S.cerevisiae，真菌細胞，植物細胞，胚胎干細胞(例如哺乳動物，如小鼠或人)，神經(jīng)元干細胞，成纖維細胞，肌細胞，心肌細胞，和T細胞。
表達控制序列根據(jù)與宿主相容性及所需目的相似選擇，例如高拷貝數(shù)，高數(shù)量，誘導，擴增，控制表達?？梢詰玫钠渌蛄邪ㄔ鰪娮尤鐏碜許V40，CMV，RSV的增強子，誘導型啟動子，細胞類型特異性元件，或允許選擇性或特異性細胞表達的序列?？梢杂糜隍?qū)動表達的啟動子包括例如內(nèi)源性啟動子，細胞信號轉(zhuǎn)導途徑中其它基因的啟動子，針對細菌宿主的MMTV，SV40，trp，lac，tac或T7啟動子；或針對酵母的α因子，醇氧化酶，或PGH啟動子。RNA啟動子可以用于產(chǎn)生RNA轉(zhuǎn)錄物，如T7或SP6。見例如Melton等，核酸研究19(18)7035-7056，1984；Dunn和Studie，分子生物學雜志166477-435，1984；美國專利No.5,891,636；Studier等，基因表達技術(shù)，酶學方法8560-89，1987。
本發(fā)明的核酸或多肽在核酸或蛋白質(zhì)電泳，層析等中可以用作大小標記。指定的限制片段可以通過掃描限制位點序列，計算大小，及進行相應限制消化而確定。
本發(fā)明的FGF多肽和核酸可以是“分離的”。術(shù)語“分離的”是指在其原始環(huán)境或自然狀態(tài)中未發(fā)現(xiàn)的形式，例如更濃縮的，更純化的，從組分中分離的，存在于表達異源FGF基因的細胞裂解物中。當FGF在轉(zhuǎn)染的細胞系中作為異源基因表達時，將本發(fā)明基因在基因表達的條件下導入細胞中。術(shù)語“異源”是指基因已經(jīng)通過“人工”導入細胞系中?；?qū)爰毎抵械姆椒ㄈ缟鲜?。表達FGF基因的轉(zhuǎn)染(或轉(zhuǎn)化)的細胞可以如實施例所述裂解及作為裂解物(即“分離的”)使用，或可以使用完整細胞系。
通常地，術(shù)語“有效條件”是指例如可以達到所需結(jié)果的一種環(huán)境。這種環(huán)境包括例如緩沖液，氧化劑，還原劑，pH，輔因子，溫度，離子濃度，所用細胞的合適時期和/或階段(如在細胞周期的特定部分，或在特定基因被表達的特殊階段)，培養(yǎng)條件(包括底物，氧，二氧化碳等)。
為增強穩(wěn)定性，可以修飾施用的核酸，例如使其對細胞酶，氧化，還原，核酸酶等有抗性，或增強細胞對其的攝取?？梢允褂萌魏芜m當修飾，包括例如連接于吖啶嵌入劑和/或疏水尾部的硫代磷酸酯，甲基磷酸酯，磷酸二酯寡核苷酸，補骨脂素衍生物，2-核糖修飾，戊糖衍生物，氮堿基衍生物等。見例如美國專利No.5,576,208和美國專利No.5,744,362所述。在本發(fā)明中可以使用的其它衍生物，修飾等見上述。一般地，本發(fā)明的反義核酸可以包含天然發(fā)生核苷酸、非天然發(fā)生核苷酸的單體及其組合，以增強細胞攝取和/或穩(wěn)定性。
反義核酸可以作為裸核酸，與促進細胞對其攝取的其它制劑復合或形成膠囊，注射入細胞中，或任何適當輸送方式而施用。
本發(fā)明還涉及本發(fā)明FGF如FGF-20和FGF-23的使用方法。這種方法包括針對以下一或多種目的為宿主施用有效量的本發(fā)明FGF或編碼該FGF的核酸促進以下細胞存活和/或增殖，例如神經(jīng)元，少突膠質(zhì)細胞，神經(jīng)膜細胞，干細胞，尤其神經(jīng)干細胞，內(nèi)皮細胞，角化細胞，及能應答FGF-20或FGF-23的任何細胞類型，例如在細胞表面表達其關(guān)聯(lián)受體(如FGFR 1-4)的細胞，或其祖細胞；促進傷口愈合；調(diào)節(jié)細胞分化；誘導胚胎發(fā)育；刺激神經(jīng)突生長；增強神經(jīng)或神經(jīng)元損傷恢復；刺激髓鞘形成；刺激血管發(fā)生；受體結(jié)合活性。
本發(fā)明還涉及本發(fā)明FGF如FGF-20和FGF-23或編碼該FGF的核酸的使用指導和方法。這種方法包括針對以下一或多種目的為宿主施用有效量的本發(fā)明FGF增強神經(jīng)和軸突損傷恢復；刺激髓鞘形成，血管發(fā)生，傷口愈合，潰瘍愈合，誘導骨缺失修復，促進移植物存活及誘導胚胎發(fā)育。上述應用是FGF促進細胞存活和/或增殖，抑制和/或刺激某些細胞分化的潛在活性結(jié)果。FGF可以誘導以下來源的干細胞，祖細胞，前體細胞和成熟細胞的存活/增殖神經(jīng)元，少突膠質(zhì)細胞，神經(jīng)膜細胞，內(nèi)皮細胞，角質(zhì)細胞及表達任何FGF受體的其它類型細胞。另外，F(xiàn)GF可以通過誘導神經(jīng)突生長/延伸而誘導神經(jīng)元祖細胞分化。
可以進行以下體外和體內(nèi)分析以測定FGF對上述細胞功能的活性。
體外分析在體外誘導少突膠質(zhì)細胞增殖用于測定FGF對細胞增殖作用的少突膠質(zhì)細胞是建立的細胞系如N20.1或初級嚙齒動物少突膠質(zhì)細胞。初級嚙齒動物(大鼠)少突膠質(zhì)細胞和少突膠質(zhì)細胞祖細胞可以通過以下一種技術(shù)分離和純化示差粘附技術(shù)(Mitrovic等，1994)；Percol梯度離心(Mattera等，神經(jīng)化學研究1984，6(1)41-50及Kim等，神經(jīng)科學雜志1983年12月；62(1-3)295-301)及免疫分離。不管少突膠質(zhì)細胞的來源(初級細胞或細胞系)或其分離和純化方法如何，均可以進行少突膠質(zhì)細胞增殖分析，時間為3，5和7天。陽性對照物是FGF家族的其它成員如FGF-2或FGF-9。通過MTT分析和3H-胸苷摻入分析測定細胞增殖。少突膠質(zhì)細胞增殖分析也見于Danilenko等，Arch Biochem Biophys.1999 Jan 1361(1)34-46。
誘導神經(jīng)突生長PC 12分析可以在PC-12細胞系(衍生自大鼠嗜鉻細胞瘤)(Rydel，1987 Greene，1976)中測試FGF家族新成員誘導分化和神經(jīng)突生長情況。另外，由于示出一部分NGF誘導應答是由于自分泌NGF誘導的FGF-2產(chǎn)生所致，因此可以檢測新FGF對PC12細胞產(chǎn)生NGF正調(diào)節(jié)的作用(Chevet等，生物化學雜志1999 Jul 23274(3)20901-8)。
后根神經(jīng)節(jié)(DRG)中的神經(jīng)突生長DGR通過解剖大鼠胎兒DRG并將其在神經(jīng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)而分離；DRG中神經(jīng)突生長程度通過肉眼評價并與未處理的對照組比較確定神經(jīng)突的數(shù)量和長度而加以量化。
可以對源于成纖維細胞和內(nèi)皮細胞的細胞進行分析。針對成纖維細胞，可以使用加以修改的NIH 3T3增殖分析而進行分析。為確定FGF誘導內(nèi)皮細胞增殖的作用，可以使用以下細胞HUVEC細胞，微血管內(nèi)皮細胞和主動脈內(nèi)皮細胞?？扇缥墨I中所述進行相關(guān)體外分析，以確定FGF作為治療劑治療創(chuàng)傷，潰瘍或骨損傷的治療潛力。
與CNS再生相關(guān)的其它分析包括激活生長相關(guān)或存活相關(guān)的基因表達的分析(Meiners等，發(fā)育生物學1993 Dec160(2)480-93)，在體內(nèi)調(diào)節(jié)其它生長因子的分析(Yoshida，1992)，調(diào)節(jié)神經(jīng)元電生理學的分析(Terlau，1990)，作為少突膠質(zhì)細胞，神經(jīng)膜細胞或星形膠質(zhì)細胞促有絲分裂原或分化因子的活性的分析(Genburger，1987；Stemple，1988；Kalcheim，Dev Biol.1989 Jul134(1)1-10；Murphy，1990)，促進皮質(zhì)神經(jīng)元，海馬神經(jīng)元，運動神經(jīng)元，感覺神經(jīng)元，交感神經(jīng)元或副交感神經(jīng)元體外存活的分析(Eckstein，1994；Unsicker等，Ann N.Y Acad Sci.1991638300-5；Grothe等，Int JDev Biol.1996 Feb40(1)403-10)，體外促進運動神經(jīng)元存活的分析等。
體內(nèi)分析可例如在以下模型中檢測新FGF再形成髓鞘的潛力a)缺乏髓磷脂的動物模型，如將來自用FGF處理的供體動物的SVZ細胞移植入髓磷脂缺乏的小鼠中，并測定少突膠質(zhì)細胞在體內(nèi)的延伸；b)去髓鞘動物模型，如PLT誘導的CR-EAE及MBP過繼轉(zhuǎn)移誘導的CR-EAE。也見于Gumpel，1992和Hinks等，分子細胞神經(jīng)學1999Aug14(2)153-68所述分析。
可在以下體內(nèi)模型中測試FGF誘導神經(jīng)再生神經(jīng)保護的能力機械損害/損傷模型(橫斷傘形穹(fimbria fornix)途徑，坐骨神經(jīng)，脊髓，視神經(jīng)及橫斷DRG)；由于腦血管損害而造成的神經(jīng)元損害模型，如頸動脈閉塞，短暫MCAO閉塞，及缺氧-缺血性腦損傷；及由于MPTP產(chǎn)生的損害或KA產(chǎn)生的癲癇發(fā)作而化學誘導的神經(jīng)變性模型。
典型的體內(nèi)分析包括例如在海馬局部缺血后測定神經(jīng)元損失減少(Sasaki，1992；MacMillan等，Can J Neurol Sci 1993 Feb20(1)37-40)，在傳導途徑損傷后促進皮質(zhì)神經(jīng)元存活(Gomez-Pinilla，1992；Peterson等，神經(jīng)學雜志1996 Feb 116(3)886-98)，保護前腦基底膽堿能神經(jīng)元免于創(chuàng)傷引起的變性，及減少MPTP引起的或損害引起的黑質(zhì)神經(jīng)元損失(Anderson等，自然1998 Mar 24332(6162)360-1；Otto，1989；Gomez-Pinilla，1992；Otto，1990)；及在體外作為“神經(jīng)球”的神經(jīng)祖細胞的長期生長(參見Svendsen等，神經(jīng)學趨勢1999Aug22(S)357-64)。使用的創(chuàng)傷模型也見于如視神經(jīng)橫斷(Sievers，1987)；坐骨神經(jīng)橫斷(Cordeiro等，Plast Reconstr Surg.1989 June83(6)1013-9；Khouri等，顯微外科198910(3)206-9)，橫斷的DRG(Aebischer等，神經(jīng)學研究雜志1989 Jul.？3(3)282-9)，脊髓橫斷(Cheng等，科學1996 Jul 26273(5274)510-3 1996)，及面神經(jīng)損傷(Kuzis 1990)；使用的腦血管損傷模型如缺氧-局部缺血性腦損傷模型(MacMillen，1993)和MCA閉塞模型(Kawamata等，美國科學院院報1997 Jul 2294(15)8179-84；Schabitz，1999)；及其它神經(jīng)變性模型如kianic acid(KA)處理(Liu等，Brain Res 1993 Oct 29626(1-2)335-8)或搖擺小鼠中MND(Ikeda等，神經(jīng)學研究1995 Dec17(6)445-8)。
術(shù)語“施用”是指將FGF，編碼FGF的核酸，或其它活性劑，輸送至靶位，例如創(chuàng)傷，損傷的組織等。FGF可以施用于任何靶位(例如在體內(nèi)，在體外或原位)，包括培養(yǎng)細胞和具有要治療的創(chuàng)傷，病變或疾病的宿主，通過適于達到上述作用的有效途徑施用，例如FGF配方可以通過直接注射入靶位或附近而施用。也可以如下施用，如局部，腸道，非腸道，靜脈內(nèi)，肌內(nèi)，皮下，口服，鼻內(nèi)，腦內(nèi)，心室內(nèi)，池內(nèi)，顱內(nèi)，植入所需部位，例如在凝膠泡沫中，膠原充填的神經(jīng)中等，例如根據(jù)所處理的靶位位置確定。FGF也可以使用滲透泵持續(xù)施用。FGF還可以作為由細胞攝取的核酸而施用。施用核酸的方法包括上述那些方法，及本領(lǐng)域已知其它常規(guī)技術(shù)。
將有效量的FGF施用于靶位。有效量是這樣的數(shù)量，其能夠達到所需作用，優(yōu)選有益或治療作用。這種數(shù)量可以常規(guī)確定，例如通過進行劑量應答實驗，其中為靶細胞施用不同劑量以確定達到所需目的的有效量，例如刺激神經(jīng)突生長或促進神經(jīng)元存活?；谠S多因素選擇數(shù)量，包括施用FGF的環(huán)境(例如腦部損傷的患者，動物模型，組織培養(yǎng)細胞等)，處理的細胞的位置，處理的患者或動物的年齡，健康狀態(tài)，性別和體重等。
一方面，本發(fā)明涉及治療神經(jīng)元損傷的方法，如神經(jīng)損傷或創(chuàng)傷，脊髓損傷或創(chuàng)傷，由例如發(fā)生局部缺血，梗塞，出血和動脈瘤導致的神經(jīng)組織損傷，本發(fā)明還涉及治療神經(jīng)元疾病的方法，例如神經(jīng)元變性疾病如Alzheimer′s病，Parkinson′s病，Huntington′s病，多發(fā)性硬化癥，脊髓病，脊髓炎和脊髓空洞癥等，所述方法包括施用有效量的本發(fā)明FGF。
本發(fā)明的FGF可以用于治療特征在于破壞神經(jīng)元和少突膠質(zhì)細胞的CNS和PNS神經(jīng)變性和脫髓鞘病變。FGF可用作再生髓鞘治療劑以治療多發(fā)性硬化癥及其它初級和/或二級CNS或PNS脫髓鞘病變。CNS初級脫髓鞘病變包括腎上腺性腦白質(zhì)營養(yǎng)不良，腦白質(zhì)病(如漸進性多病灶腦白質(zhì)病)，腦脊髓炎(如急性播散性靜脈周腦脊髓炎)。二級CNS脫髓鞘表示CNS創(chuàng)傷，中毒(氰化物，六氯酚)或局部缺血(中風)中脫髓鞘損傷形成。PNS脫髓鞘病變包括初級功能失調(diào)如Guillian-Barre綜合征(GBS)，異型球蛋白血癥，慢性炎癥性脫髓鞘多神經(jīng)病變(CIDP)。另外，F(xiàn)GF用于治療CNS和PNS神經(jīng)變性病變，其中神經(jīng)損傷由于損傷/創(chuàng)傷(機械性，化學性，腦血管損傷及由于感染和自身免疫應答引起的炎癥)所致，及用于治療其它神經(jīng)變性病變。
本發(fā)明的FGF還可以用于促進移植物存活。例如，F(xiàn)GF可用于刺激多種細胞，組織或器官的移植物存活(例如異基因的，等基因的或自體移植物)，所述細胞，組織或器官如皮膚，肌束，骨，腎臟，角膜等。本發(fā)明還涵蓋了細胞移植物進入源于神經(jīng)元，神經(jīng)膠質(zhì)細胞或干細胞的CNS或PNS中。移植物可以制備自天然來源或通過移植的細胞或組織在體外擴展或通過使用分化的或未分化的干細胞制備。術(shù)語“促進”是指與未處理的細胞，組織或器官相比，增強經(jīng)FGF處理的移植的細胞，組織或器官存活。分析移植物存活的方法是常規(guī)方法。
測定移植物存活的分析是本領(lǐng)域常規(guī)進行及熟知的。常規(guī)體外分析包括例如MTT，MTS，Thy摻入，存活/死亡細胞分析(例如用鈣黃綠素AM和溴乙錠同源二聚體-EthD-1雙重染色)，測定總細胞數(shù)，例如通過使用顯微鏡評估或通過計數(shù)細胞的物理方法如使用血細胞計數(shù)儀。常規(guī)體內(nèi)方法包括例如CNS指征，神經(jīng)學功能改善檢測，或成像技術(shù)如MTR，MRS，CT或MRI，有或無Gd增進。
可以根據(jù)本發(fā)明進行治療的其它情況包括預防因MI所致心肌損傷，誘導血管發(fā)生，傷口愈合，潰瘍愈合，預防骨破壞及誘導新骨形成，促進移植物存活及誘導胚胎發(fā)育。
在治療上述疾病/狀況中有用的FGF活性包括促進細胞存活和/或增殖，抑制和/或刺激以下類型細胞分化誘導以下來源的干細胞，祖細胞，前體細胞和成熟細胞存活/增殖神經(jīng)元，少突膠質(zhì)細胞，神經(jīng)膜細胞，內(nèi)皮細胞，角質(zhì)細胞，成骨細胞及表達任何FGF受體的其它細胞。另外，F(xiàn)GF通過誘導神經(jīng)突生長/延伸而誘導神經(jīng)元祖細胞分化的作用在治療任何類型神經(jīng)元損傷/損害中均有用。
術(shù)語“治療”是指引起所述損傷或疾病改善的任何作用，如促進神經(jīng)元，神經(jīng)膠質(zhì)細胞，少突膠質(zhì)細胞，星形細胞，神經(jīng)膜細胞等存活，刺激髓鞘形成，刺激細胞增殖等，如上所述。為治療這種損傷和疾病，F(xiàn)GF可以配制為組合物，或核酸，并應用于損傷或病變區(qū)域，例如使用外科技術(shù)。
本發(fā)明的FGF還可以針對本文揭示的任何治療方法通過施用核酸而施用，例如在基因治療中。基因輸送載體可以源于病毒或非病毒來源(見Jolly，癌癥基因治療151-64(1994)；Kimura，人體基因治療5845-852(1994)；Connelly，人體基因治療1185-193(1995)；及Kaplitt，自然遺傳學6148-153(1994))。輸送包含本發(fā)明治療劑編碼序列的構(gòu)建體的基因治療載體可以局部或系統(tǒng)應用。這些構(gòu)建體可以利用病毒或非病毒載體方法。這種編碼序列的表達可以施用內(nèi)源哺乳動物啟動子或異源啟動子誘導。所述編碼序列的表達可以是組成型或調(diào)節(jié)性的。
本發(fā)明可以應用攜帶或表達選擇的感興趣核酸分子的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒?？梢詰玫哪孓D(zhuǎn)錄病毒載體包括如下所述那些載體EP 0415 731；WO90/07936；WO94103622；WO93/25698；WO93/25234；美國專利5,219,740；WO93/11230；WO93/10218；Vile和Hart，癌癥研究533860-3864(1993)；Vile和Hart，癌癥研究53962-967(1993)；Ram等，癌癥研究5383-88(1993)；Takamiya等，神經(jīng)學研究雜志33493-503(1992)；Baba等，神經(jīng)外科雜志79729-735(1993)；美國專利No.4,777,127；GB專利No.2,200,651；及EP 0 345 242。優(yōu)選的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒包括WO91/02805所述那些。
適于與上述逆轉(zhuǎn)錄病毒載體構(gòu)建體一起使用的包裝細胞系可易于制備(見PCT出版物WO95/30763和WO92/05266)，并用于產(chǎn)生生產(chǎn)細胞系(也稱為載體細胞系)，以生產(chǎn)重組載體顆粒。在本發(fā)明特別優(yōu)選的實施方案中，包裝細胞系從人體(如HT1080細胞)或水貂親代細胞系中生產(chǎn)，從而產(chǎn)生在人體血清中可以免于失活的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒。
本發(fā)明還應用基于α病毒的載體，其可以作為基因輸送載體。這種載體可以從眾多α病毒中構(gòu)建，包括例如新培斯病毒載體，Semliki森林病毒(ATCC VR-67；ATCC VR-1247)，Ross River病毒(ATCC VR-373；ATCC VR-1246)和委內(nèi)瑞拉馬腦炎病毒(ATCC VR-923；ATCC VR-1250 ATCC VR-1249；ATCC VR-532)。這種載體系統(tǒng)的代表性實例包括以下所述那些載體系統(tǒng)美國專利Nos.5,091,309；5,217,S79；和5,185,440；及PCT出版物Nos.WO92/10578；WO94/21792；WO95/27069；WO95/27044；和WO95107994。
本發(fā)明的基因輸送載體還可以應用細小病毒如腺伴隨病毒(AAV)載體。代表性實例包括AAV載體，由Srivastava在WO93/09239，Samulski等，病毒雜志633822-3S28(1989)；Mendelson等，病毒學166154-165(1988)；及Flotte等，P.N.A.S.9010613-10617(1993)所揭示。
腺病毒載體的代表性實例包括以下所述那些載體Berkner，生物技術(shù)6616-627(1988)；Rosenfeld等，科學252431-434(1991)；WO93/19191；Kolls等，P.N.A.S.915-219(1994)；Kass-Eisler等，P.N.A.S.9011498-11502(1993)；Guzman等，循環(huán)882838-2848(1993)；Guzman等，循環(huán)研究7312021207(1993)；Zabner等，細胞75207-216(1993)；Li等，人體基因治療4403-409(1993)；Cailaud等，歐洲神經(jīng)學雜志51287-1291(1993)；Vincent等，自然遺傳學5130-134(1993)；Jaffe等，Abat.Gebiet 1372-378(1992)；及Levrero等，基因101195-202(1992)?？蓱糜诒景l(fā)明的腺病毒基因治療載體例如還包括以下所述那些WO94/12649，WO93/03769；WO93/19191；WO94/28938；WO95/11984和WO～95/00655?？梢圆捎眠B接于滅活腺病毒的DNA，如Curiel，人體基因治療3147-154(1992)所述。
可以應用其它基因輸送載體和方法，包括連接于或未連接于滅活腺病毒的聚陽離子濃縮DNA，例如Curiel，人體基因治療3147-154(1992)所述；配體連接的DNA，例如Wu，生物化學雜志26416985-16987(1989)；真核細胞輸送載體細胞，例如見1994年5月9日提請的美國專利申請No.08/240,030，和美國專利申請No.08/404,796；光聚合的水凝膠材料的沉積；手握式基因轉(zhuǎn)移粒子槍，如美國專利No.5,149,655所述；電離輻射，如美國專利No.5,206,152和WO92/11 033所述；用細胞膜中和或融合核電荷。其它方法如Philip，分子細胞生物學142411-2418(1994)及Woffendin，美國科學院院報911581-1585(1994)所述。
也可以應用裸DNA。裸DNA導入方法例如WO90/11092和美國專利No.5,580,859所述。使用可生物降解的乳膠珠可改善攝取效力。DNA包被的乳膠珠在珠被胞吞開始后有效轉(zhuǎn)運至細胞中。進一步改進所述方法可以通過對所述珠進行處理以提高疏水性，從而促進內(nèi)涵體的破壞及所述DNA釋放入胞質(zhì)中。可作為基因輸送載體的脂質(zhì)體見于美國專利No.5,422,120，PCT專利出版物Nos.WO95/13796，WO94/23697和WO91/14445，及EP No.0 524 968所述。
適合使用的其它非病毒輸送系統(tǒng)包括機械輸送系統(tǒng)，如Woffendin等，美國科學院院報91(24)11581-11585(1994)所述方法。另外，這種的編碼序列和表達產(chǎn)物可以通過光聚合水凝膠材料的沉積輸送。可用于輸送編碼序列的其它常規(guī)基因輸送方法，包括例如使用手握式基因轉(zhuǎn)移粒子槍，如美國專利No.5,149,655所述；使用電離輻射以激活轉(zhuǎn)移的基因，如美國專利No.5,206,152和PCT專利出版物No.WO92/11033所述。
本發(fā)明還涉及一種刺激細胞增殖的方法，包括施用有效量的FGF-9(例如Kanda等，如前)，F(xiàn)GF-20或FGF-23，或其生物活性片段。術(shù)語“刺激細胞增殖”是指施用的FGF導致細胞分裂或有絲分裂。FGF可以以任何有效形式(核酸或多肽)施用于任何適當宿主。
例如，在一個實施方案中，該方法可用于鑒別FGF的興奮劑和拮抗劑。在這種情況中，將FGF施用于細胞系、包括建立的和初級細胞如脊髓運動神經(jīng)元可以是有用的。建立細胞系包括例如美國組織培養(yǎng)物保藏中心(atccc.org)中貯存的任何細胞系，包括例如DBTRG-OSMG，PFSK-1，MSTO-211H，NCI-H378，NCIN41/，NCI-H526，HCN-1A，HCN-2，CATH.a，NG108-15，NCI-H446，NCI-H209，NCI-H146，NCI-H82，NCI-H345，NCI-H510A，D283 Med，D341 Med，C6，IMR-32，Neuro-2a，NB41A3，BC3H1，A172，Mpf，T98G[T98-G]，SCP，CCF-STTG1，DI TNCI，CTX TNA2，PG-4(S+L-)，G355-5，SW 598[SW-598；SW598]，C6/LacZ，9L/lacZ，NIE-115，SH-SY5Y，BE(2)-M17，BE(2)-C，MC-IXC，SK-N-BE(2)，CHP212，C6/IacZ7，M059K，M059J，F(xiàn)98，RG2[D74]，NCI-H250，NCI-H1915，OAl，TE 615.T，SVG p12，TE671亞系No.2，MBr C11，SK-N-MC，SW1088[SW-1088；SW1088]，SW 1783[SW-1783；SW1783]，U-87 MG，U-118 MG，U-138 MG，MDA-MB-361，DU 145，Hs 683，H4，293，PC-12，P19，NTERA-2cl.D1[NT2/D1]，BCE C/D-1b，SK-N-AS，SK-N-FI，SK-N-DZ，SK-N-SH，Daoy，優(yōu)選N20.1細胞。
FGF的推定興奮劑和拮抗劑可以在體外施用于已經(jīng)施用FGF的細胞，如上述細胞系，或者推定的制劑可以在體外或體內(nèi)施用于天然產(chǎn)生FGF的細胞。這種制劑的興奮或拮抗作用可以用任何本領(lǐng)域公認的分析測定，如本文所述那些分析。
也可以用本發(fā)明FGF刺激神經(jīng)干細胞以增殖。所得細胞可以用作移植回其所衍生的同一患者中的神經(jīng)細胞來源(即自體的)，排除了與異基因移植相關(guān)的任何典型問題，如排斥。因此，本發(fā)明方法涉及施用有效量的FGF以刺激神經(jīng)干細胞增殖和分化，并將所述干細胞移植回去。
本發(fā)明還涉及特異識別本發(fā)明FGF的抗體。特異于FGF的抗體是指所述抗體識別在FGF內(nèi)或包括其的一個限定氨基酸序列，如圖1和圖2所示序列。因此，一種特異性抗體一般與圖1和圖2中發(fā)現(xiàn)的一個氨基酸序列即一個表位的結(jié)合親和性比與例如通過免疫印跡分析或其它常規(guī)免疫分析檢測/測定的一個不同表位的結(jié)合親和性高。因此，特異于人FGF-21的一個表位的抗體可用于檢測樣品中所述表位的存在情況，例如含有人FGF-21基因產(chǎn)物的組織樣品，將其與沒有所述表位的樣品區(qū)分。這種抗體見于Santa Cruz，生物技術(shù)公司研究產(chǎn)品目錄并可據(jù)此配制。
抗體，例如多克隆抗體，單克隆抗體，重組抗體，嵌合抗體，人化抗體，可以根據(jù)任何所需方法制備。也見于篩選重組免疫球蛋白文庫(例如Orlandi等，美國科學院院報863833-3837，1989；Huse等，科學2561275-1281，1989)；體外刺激淋巴細胞群，Winter和Milstein，自然349293-299，1991。例如，針對單克隆抗體的生產(chǎn)，可以將圖1和圖2的多肽以有效量經(jīng)皮下和/或腹膜內(nèi)施用于小鼠，山羊或兔，有或無佐劑，以激發(fā)免疫應答。所述抗體也可以是單鏈或Fab片段。所述抗體可以是IgM，IgG，亞型，IgG2a，IgGI等。抗體和免疫應答也可以通過施用裸DNA而產(chǎn)生。見例如美國專利Nos.5,703,055；5,589,466；5,580,859所述。
用于誘導抗體的FGF或其片段不需要具有生物活性；然而，其在單獨或與載體組合的情況下必需具有免疫原性活性。用于誘導FGF特異性抗體的肽可以具有由至少5個氨基酸，優(yōu)選至少10個氨基酸組成的氨基酸序列。FGF氨基酸的短序列，例如5個氨基酸，可以與另一種蛋白質(zhì)如匙孔嘁血藍蛋白融合，或與另一種有用載體融合，所述嵌合分子用于抗體生產(chǎn)。在生產(chǎn)抗體中有用的FGF區(qū)域可以憑經(jīng)驗選擇，或者可以分析例如從cDNA中推導的GENE氨基酸序列，以確定高免疫原性區(qū)域。選擇適當表位的分析例如Ausubel FM等(1989，分子生物學通用方案，第2卷，John Wiley &Sons)所述。
產(chǎn)生抗體的有用序列包括例如圖1和圖2所示順序的序列。這種序列的抗體可用于區(qū)分FGF的不同轉(zhuǎn)錄物。見上述。
特定的FGF抗體可用于診斷特征在于FGF數(shù)量或分布不同的前病理改變狀態(tài)，及慢性或急性疾病。針對FGF的診斷測試包括利用抗體和標記以檢測人(或小鼠等，如果在使用小鼠的情況中)體液，組織或這種組織的提取物中的FGF。
本發(fā)明的多肽和抗體可以加以修飾或不加修飾而使用。通常地，可以將所述多肽和抗體與提供可檢測信號的物質(zhì)共價或非共價結(jié)合而標記。本領(lǐng)域已知并且在科技和專利文獻中均廣泛報道過眾多標記和綴合方法。適當?shù)臉擞洶ǚ派湫院怂?，酶，底物，輔因子，抑制劑，熒光劑，化學發(fā)光劑，磁性粒子等。教導使用這種標記的專利包括美國專利Nos.3,817,837；3,850,752；3,939,350；3,996,345；4,277,437；4,275,149和4,366,241。
結(jié)合FGF的抗體及其它配體可以通過各種方式使用，包括作為治療，診斷和商業(yè)研究手段，以在Western印跡，ELISA，免疫沉淀，RIA中例如確定動物，組織，細胞等中FGF多肽的水平，鑒別其細胞定位和/或分布，純化或包含其一部分的多肽，調(diào)節(jié)其功能。本發(fā)明涉及這種分析，進行這種分析的組合物和試劑盒。利用這些和其它方法，本發(fā)明的抗體可以用于檢測各種樣品中的FGF多肽或其片段，所述樣品包括組織，細胞，體液，血液，尿液，腦脊髓液。
另外，也可以制備結(jié)合本發(fā)明FGF多肽的配體或其衍生物，例如使用合成的肽文庫或aptamers(例如Pitrung等，美國專利No.5,143,854；Geysen等，免疫學方法雜志102259-274，1987；Scott等，科學249386，1990；Blackwell等，科學2501104，1990；Tuerk等，1990，科學249505)。
本發(fā)明還涉及一種根據(jù)所需方法制備的FGF多肽，例如美國專利No.5,434,050中所揭示方法。例如在結(jié)合分析中可以使用一種標記的多肽，以鑒別結(jié)合或附于FGF的物質(zhì)，追蹤在細胞，體外，體內(nèi)或原位系統(tǒng)中FGF的運動等。
本發(fā)明的核酸，多肽，抗體，配體等可以是分離的。術(shù)語“分離的”是指物質(zhì)處于在其原始環(huán)境或自然中未發(fā)現(xiàn)的形式，即更濃縮，更純化，從成分中分離等。分離的核酸包括例如具有分離自活動物體中發(fā)現(xiàn)的染色體DNA的FGF序列的核酸，例如作為完整基因，轉(zhuǎn)錄物或cDNA。這種核酸可以是載體的一部分或插入染色體中(通過在其正常位置之外的位置通過特異基因定向或通過隨機整合)，而且仍是分離的，不是其自然環(huán)境中發(fā)現(xiàn)的形式。本發(fā)明的核酸或多肽還可以是基本純化的?；炯兓侵负怂峄蚨嚯氖欠蛛x的，而且基本沒有其它核酸或多肽，即所述核酸或多肽是主要的及活性組分。
本發(fā)明還涉及一種包含F(xiàn)GF的轉(zhuǎn)基因動物，例如非人哺乳動物如小鼠轉(zhuǎn)基因動物可以根據(jù)已知方法制備，包括例如通過將重組基因原核注射入單細胞胚的原核中，將人工酵母染色體摻入胚胎干細胞中，基因定向方法，胚胎干細胞方法學。見例如美國專利Nos.4,736,866；4,873,191；4,873,316；5,082,779；5,304,489；5,174,986；5,175,384；5,175,385；5,221,778；Gordon等，美國科學院院報777380-7384，1980；Palmiter等，細胞41343-345，1985；Palmiter等，Ann.Rev.Genet.，20465-499，1986；Askew等，分子細胞生物學134115-4124，1993；Games等，自然373523-527，1995；Valancius和Smithies，分子細胞生物學111402-1408，1991；Stacey等，分子細胞生物學141009-1016，1994；Hasty等，自然350243-246，1995；Rubinstein等，核酸研究212613-2617，1993。本發(fā)明的核酸可以導入任何非人哺乳動物中，包括小鼠(Hogan等，操縱小鼠胚胎實驗指南，冷泉港實驗室，冷泉港，紐約1986)，豬(Hammer等，自然315343-345，1985)，綿羊(Hammer等，自然315343-345，1985)，牛，大鼠或靈長類動物。也見于例如Church，1987，生物技術(shù)趨勢513-19；Clark等，生物技術(shù)趨勢520-24，1987)；及DePamphilis等，生物技術(shù)6662-680，1988。另外，例如特定的轉(zhuǎn)基因大鼠和小鼠具有商業(yè)價值。這些轉(zhuǎn)基因動物是測試GENE功能，作為蛇的食物，作為遺傳標記以檢測株系起源(即其中已經(jīng)插入FGF-21，F(xiàn)GF-23或其片段)等的有用動物模型。這種轉(zhuǎn)基因動物還可以包含其它轉(zhuǎn)基因。轉(zhuǎn)基因動物可以根據(jù)任何適當方法制備及應用。
所述核酸的其它方面參考分子生物學標準教材。見例如Davis等，分子生物學基本方法，Elsevir科學出版公司，紐約，1986；Hames等，核酸雜交，IL出版社，1985；Sambrook等，分子克隆，CSH出版社1989；Howe，基因克隆和操縱，Cambridge大學出版社，1995。
附圖簡述圖1示出FGF-20的核苷酸和氨基酸序列(SEQ ID NO1和2)。
圖2示出FGF-23的核苷酸和氨基酸序列(SEQ ID NO3和4)。
圖3示出FGF-20蛋白與已知FGF家族成員的氨基酸序列對比。xfgf-20來自Xenopus laevis。
圖4示出少突膠質(zhì)細胞增殖。圖4A示出少突膠質(zhì)細胞增殖。圖4B示出活性通過煮沸所述蛋白質(zhì)而廢除。
圖5示出FGF-20對N20.1少突膠質(zhì)細胞增殖的作用。
圖6示出FGF對初級大鼠少突膠質(zhì)細胞(PRO)增殖的作用。圖6A示出用FGF-2處理的細胞。圖6B示出用FGF-20處理的細胞。
圖7示出FGF對神經(jīng)元起源的細胞系存活/增殖的作用。圖7A示出FGF-20的作用。圖7B示出FGF-2，F(xiàn)GF-9，和FGF-20的作用。
圖8示出神經(jīng)突生長。培養(yǎng)的PC12細胞用重組FGF-20加肝素(左側(cè))或只用肝素(右側(cè))處理6天。固定細胞并針對βIII微管蛋白進行染色，細胞核用7-AAD成象。在只用肝素處理的細胞中未觀測到神經(jīng)突生長。
圖9示出FGF-20是皮質(zhì)神經(jīng)元的強有力存活因子。
實施例實施例1少突膠質(zhì)細胞增殖和存活用于測定生長因子(GF)對細胞增殖作用的少突膠質(zhì)細胞是建立的細胞系如N20或初級嚙齒動物少突膠質(zhì)細胞。初級嚙齒動物(大鼠)少突膠質(zhì)細胞和少突膠質(zhì)細胞祖細胞通過差示粘附技術(shù)(Mitrovic，1994)和Percol梯度離心(Mattera等，神經(jīng)化學研究1984，6(1)41-50；Kim等，神經(jīng)學雜志1983 Dec62(1-3)295-301)分離和純化。將2.5×104個細胞/ml鋪板于96孔平板中進行少突膠質(zhì)細胞增殖分析。用生長因子刺激細胞3，5和7天。陽性對照物是FGF家族的其它成員，如FGF-2或FGF-9。細胞增殖通過MTT分析和3H胸苷摻入分析測定。
圖4，5和6示出FGF20以時間和劑量依賴方式刺激N 20.1少突膠質(zhì)細胞系的少突膠質(zhì)細胞增殖。N20.1細胞用FGF-20的部分純化的肝素瓊脂糖層析樣品處理。增殖通過MTT染色確定。FGF-20誘導少突膠質(zhì)細胞增殖(圖4A)，而且該活性通過煮沸所述蛋白質(zhì)而廢除(圖4B)。
上述觀測通過從肝素和S柱中制備部分純化的物質(zhì)而證實(圖5)。N20.1細胞用來自肝素或S柱的FGF-20處理。將所述細胞與FGF-20溫育5天，并通過MTT染色確定相對于未處理對照組的增殖的增加。FGF-9用作陽性對照，并使用適當?shù)南鄳彌_液(H和S)作為陰性對照。部分純化的物質(zhì)的活性與FGF-9活性相當。
另外，F(xiàn)GF-20誘導初級大鼠少突膠質(zhì)細胞增殖(圖6B)。少突膠質(zhì)細胞用FGF-2(圖6A)和FGF-20(圖6B)處理。將細胞與GF溫育3天，并通過MTT染色確定超過未處理對照組的增殖增加。部分純化的物質(zhì)的活性與FGF-2相當。FGF-20是少突膠質(zhì)細胞增殖的強有力誘導因子，而且其活性與FGF家族其它成員如FGF-2和FGF-9相當。
實施例2誘導神經(jīng)元存活通過將2.5×104個細胞/ml鋪板于96孔平板的低濃度血清培養(yǎng)基中進行神經(jīng)元存活分析。在這些條件下，神經(jīng)元由于生長因子的除去而發(fā)生細胞程序死亡。將細胞用生長因子刺激不同時間，3天-12天。陽性對照是FGF家族的其它成員如FGF-2或FGF-9。神經(jīng)元存活通過MTT測定。
圖7和圖9示出FGF-20是強有力的神經(jīng)營養(yǎng)因子，可刺激神經(jīng)元起源細胞存活。
將PC 12細胞鋪板于存在低濃度血清(1％Nu血清)的96孔平板中。將包括FGF-20在內(nèi)的不同生長因子以0.0025-2500ng/ml濃度加入。在7和10天后，用MTT分析測定相對存活率，并與未處理的對照組對比。FGF-20的數(shù)據(jù)示于圖7A，F(xiàn)GF-2，F(xiàn)GF-9和FGF-20的數(shù)據(jù)示于圖7B。
實施例3誘導神經(jīng)突生長FGF-20呈現(xiàn)對PC 12細胞生長有作用。這種作用不依賴于NGF預處理(見表1和圖9)。
在此分析中部分純化的FGF-21的表現(xiàn)與觀測到的FGF-9表現(xiàn)相似，它們的序列非常相似。另外，對比FGF家族不同成員在PC 12細胞中誘導神經(jīng)突生長的活性(FGF-1，F(xiàn)GF-2，F(xiàn)GF-4，F(xiàn)GF-6，F(xiàn)GF-7，F(xiàn)GF-8，F(xiàn)GF-9，F(xiàn)GF-10，F(xiàn)GF-16，F(xiàn)GF-16，F(xiàn)GF17，F(xiàn)GF-18，見表2)。在此系統(tǒng)中誘導神經(jīng)突生長的最強有力的FGF是FGF-2和FGF-9及FGF-20/21。發(fā)現(xiàn)兩個FGF，即FGF-7和FGF-10，在該系統(tǒng)中不論肝素存在與否均無活性。
從大鼠胚胎腦(E16)中分離初級大鼠胚胎腦皮質(zhì)細胞。在顯微鏡下切下皮質(zhì)層，并用Hanks溶液洗6次，不用酶處理而機械性解離。將神經(jīng)元在由以下成分組成的培養(yǎng)基中培養(yǎng)補加10％馬血清，10％FCS，2mM L-谷氨酰胺，HEPES緩沖液的DMEM。在24小時后，加入由10μM FdU和1μM胞嘧啶阿拉伯糖苷組成的抑制劑混合物培養(yǎng)3天，以抑制除了神經(jīng)元之外所有其它細胞增殖。在培養(yǎng)8天后，收獲神經(jīng)元并鋪板于含有低濃度血清(2％Nu血清)培養(yǎng)基的96孔平板中。加入濃度范圍在0.0025-2500ng/ml的不同生長因子，包括FGF-20。5天后，用MTT分析測定相對存活率并與未處理的對照對比。
表1FGF-20在PC 12細胞中是神經(jīng)突延伸的強有力誘導因子如圖7所示實驗鋪板并處理PC 12細胞。加入濃度范圍為0.0025-2500ng/ml的FGF-9和FGF-20。在處理7和12天后，神經(jīng)突延伸通過將所述細胞用Wright染色隨后用顯微鏡檢測而確定。％生長(outgrowth)表示估算的細胞數(shù)目。
由于FGF-9和FGF20/21處理所誘導的神經(jīng)突生長的觀測概況如下所示。最高濃度的部分純化的物質(zhì)對細胞有毒性，其影響存活(見圖7B)和神經(jīng)突生長(如下)。
在PC 12細胞中神經(jīng)突延伸生長因子濃度 ％生長ng/ml7天12天FGF-90 000.025 ＜5 50.25510-202.5 5-10 20-3025 60 60250 90 100250090-100 100FGF-210 000.025 ＜5 50.2510 102.5 20-303025 50 60250 90 80250000
表2神經(jīng)突生長-不同F(xiàn)GF家族成員之間的對比培養(yǎng)的PC 12細胞用FGF處理并目測記錄神經(jīng)突生長。FGF 20是測試的FGF家族成員中最強有力的神經(jīng)營養(yǎng)GF。
加入的FGF應答FGF-1(酸性FGF) ++FGF-2(堿性FGF) ++++FGF-4+FGF-6+FGF-7-FGF-8++FGF-9+++FGF-10 -FGF-16 +FGF-17 ++FGF-18 ++FGF-21 +++
權(quán)利要求
1.一種治療脊髓損傷；脊髓創(chuàng)傷；由缺血發(fā)作、梗塞、出血或動脈瘤引起的神經(jīng)組織損傷；Huntington′s??；脊髓??；脊髓炎；脊髓空洞癥的方法，包括為需要治療的患者施用有效量的FGF-20多肽或其生物活性片段。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述FGF-20多肽來源于人。
3.權(quán)利要求2的方法，其中所述多肽具有FGF-20特異性免疫原性活性。
4.權(quán)利要求1的方法，其中所述多肽包含圖1所示第1-211位氨基酸。
5.權(quán)利要求1的方法，其中所述多肽與圖1所示人FGF-20的第1-211位氨基酸具有95％序列相同性，且所述FGF-20具有FGF活性。
6.權(quán)利要求2的方法，其中所述多肽與圖1所示人FGF-20的第1-211位氨基酸具有95％序列相同性，且所述FGF-20具有FGF活性。
7.一種治療脊髓損傷；脊髓創(chuàng)傷；由缺血發(fā)作，梗塞，出血或動脈瘤引起的神經(jīng)組織損傷；Huntington′s??；脊髓病；脊髓炎；脊髓空洞癥的方法，包括為需要治療的患者施用有效量的具有編碼FGF-20多肽或其生物活性片段的核苷酸序列的核酸。
8.權(quán)利要求7的方法，其中所述核酸來源于人。
9.權(quán)利要求8的方法，其中所述核苷酸序列不間斷地編碼FGF-20。
10.權(quán)利要求7的方法，其中所述核苷酸序列與圖1所示核苷酸序列具有95％序列相同性。
11.權(quán)利要求8的方法，其中所述核苷酸序列與圖1所述核苷酸序列具有95％序列相同性。
12一種治療腎上腺腦白質(zhì)營養(yǎng)不良，漸進性多病灶腦白質(zhì)病，腦脊髓炎，Guillian-Barre綜合征，異型球蛋白血癥，或慢性炎癥性脫髓鞘多神經(jīng)病變的方法，包括為需要治療的患者施用有效量的具有編碼FGF-20多肽或其生物活性片段的核苷酸序列的核酸。
13.權(quán)利要求12的方法，其中所述FGF-20多肽來源于人。
14.權(quán)利要求13的方法，其中所述多肽具有FGF-20特異性免疫原性活性。
15.權(quán)利要求12的方法，其中所述多肽包含圖1所述第1-211位氨基酸。
16.權(quán)利要求12的方法，其中所述多肽與圖1所示人FGF-20的第1-211位氨基酸具有95％序列相同性，且所述FGF-20具有FGF活性。
17.權(quán)利要求13的方法，其中所述多肽與圖1所示人FGF-20的第1-211位氨基酸具有95％序列相同性，且所述FGF-20具有FGF活性。
18.一種治療腎上腺腦白質(zhì)營養(yǎng)不良，漸進性多病灶腦白質(zhì)病，腦脊髓炎，Guillian-Barre綜合征，異型球蛋白血癥，或慢性炎癥性脫髓鞘多神經(jīng)病變的方法，包括為需要治療的患者施用有效量的具有編碼FGF-20多肽或其生物活性片段的核苷酸序列的核酸。
19.權(quán)利要求18的方法，其中所述核酸來源于人。
20.權(quán)利要求19的方法，其中所述核苷酸序列不間斷編碼FGF-20。
21.權(quán)利要求18的方法，其中所述核苷酸序列與圖1所示核苷酸序列具有95％序列相同性。
22.權(quán)利要求19的方法，其中所述核苷酸序列與圖1所示核苷酸序列具有95％序列相同性。
23.一種促進移植物存活的方法，包括為需要治療的患者施用有效量的FGF-20多肽或其生物活性片段。
24.權(quán)利要求23的方法，其中所述FGF-20多肽來源于人。
25.權(quán)利要求24的方法，其中所述多肽具有FGF-20特異性免疫原性活性。
26.權(quán)利要求23的方法，其中所述多肽包含圖1所示第1-211位氨基酸。
27.權(quán)利要求23的方法，其中所述多肽與圖1所示人FGF-20的第1-211位氨基酸具有95％序列相同性，且所述FGF-20具有FGF活性。
28.權(quán)利要求24的方法，其中所述多肽與圖1所示人FGF-20的第1-211位氨基酸具有95％序列相同性，且所述FGF-20具有FGF活性。
29.一種促進移植物存活的方法，包括為需要治療的患者施用有效量的具有編碼FGF-20多肽或其生物活性片段的核苷酸序列的核酸。
30.權(quán)利要求29的方法，其中所述核酸來源于人。
31.權(quán)利要求30的方法，其中所述核苷酸序列不間斷編碼FGF-20。
32.權(quán)利要求29的方法，其中所述核苷酸序列與圖1所示核苷酸具有95％序列相同性。
33.權(quán)利要求30的方法，其中所述核苷酸序列與圖1所示核苷酸序列具有95％序列相同性。
全文摘要
本發(fā)明鑒別了新的核酸序列，多肽序列，及其核酸調(diào)節(jié)元件，其編碼成纖維細胞生長因子(FGF)，優(yōu)選FGF－20或FGF－23，這是參與發(fā)育、分化和形態(tài)發(fā)生例如細胞之間信號傳導及細胞增殖的一類多肽。本發(fā)明的FGF、其片段及衍生物具有一或多種以下生物學活性，例如促進傷口愈合；促進神經(jīng)元存活；刺激如下細胞增殖，例如干細胞，成纖維細胞，神經(jīng)元，神經(jīng)膠質(zhì)細胞，少突膠質(zhì)細胞，神經(jīng)膜細胞或其祖細胞增殖；調(diào)節(jié)細胞分化；誘導胚胎發(fā)育；刺激神經(jīng)突生長；增強神經(jīng)損傷或神經(jīng)元損傷恢復；刺激髓鞘形成；刺激血管發(fā)生；受體結(jié)合活性；調(diào)節(jié)腫瘤發(fā)生等。
文檔編號C07K14/50GK1518597SQ01820299
公開日2004年8月4日 申請日期2001年12月10日 優(yōu)先權(quán)日2000年12月8日
發(fā)明者彼得·W·布林格曼, 達里·福爾茲, 布拉尼斯拉娃·米特羅維奇, 蘇巴·斯里尼瓦桑, 詹姆斯·奧努佛, 奧努佛, 彼得 W 布林格曼, 斯拉娃 米特羅維奇, 斯里尼瓦桑, 福爾茲 申請人:舍林股份公司