專利名稱：大蹼鈴蟾皮膚肽及其制備方法和在制藥中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明提供一種大蹼鈴蟾皮膚肽及其制備方法和在制藥中的應(yīng)用，屬于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。
自從抗生素發(fā)明以來(lái)，人類在控制和治療微生物感染疾病中取得了較大的成就，但隨著藥物的持續(xù)使用，目前微生物抗藥性已成為臨床微生物感染疾病治療的重大問(wèn)題，以至于某些病原細(xì)菌已沒(méi)有臨床治療的一線藥物。萬(wàn)古霉素抗性的葡萄球菌、腸球菌以及其他革蘭氏陰性感染疾病目前均是世界范圍內(nèi)的臨床難題。三類主要引起腦膜炎的細(xì)菌在臨床上也出現(xiàn)了強(qiáng)的抗藥性，抗青霉素、氯霉素腦膜炎雙球菌，肺炎球菌，對(duì)抗新頭孢菌素抗生素的肺炎球菌也廣泛出現(xiàn)。因此新一類抗生素的研制已成為當(dāng)務(wù)之急和國(guó)際上的熱點(diǎn)。與目前廣泛使用的抗生素相比，多肽抗生素具有很多優(yōu)點(diǎn)如在最小作用濃度時(shí)，快速而廣譜的殺滅微生物(包括目前臨床抗藥菌)，對(duì)真菌也有抑制作用，抗性菌株生成性小，對(duì)局部感染和全身感染都有效，正成為新一類抗生素，其研制目前受到廣泛重視。
腫瘤也是危害人類健康的另一類主要疾病，而且治療藥物匱乏，目前在化療中所使用的藥物，如阿霉素，環(huán)磷酰胺等等均具有較大的人體毒性，副作用非常大，因而腫瘤治療藥物的開(kāi)發(fā)是藥物研制的熱點(diǎn)。
很多兩棲類動(dòng)物在中國(guó)屬于傳統(tǒng)中藥和民族藥物而廣泛應(yīng)用。這些兩棲類動(dòng)物的皮膚和內(nèi)臟具有廣泛的藥理活性和臨床療效，已報(bào)道藥理活性有廣譜抗微生物作用、抗腫瘤、局部麻醉、鎮(zhèn)痛、免疫調(diào)節(jié)、心血管系統(tǒng)作用等。在國(guó)外，兩棲類皮膚特定藥理活性單體化合物的尋找已是新藥發(fā)明的熱點(diǎn)。由于兩棲類皮膚中含有大量結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、抗菌譜廣的抗菌肽，因此從兩棲類皮膚獲得臨床可用的抗菌肽已引起世界的廣泛關(guān)注，據(jù)國(guó)外文獻(xiàn)報(bào)道從爪蟾(Xenopus laevis)皮膚分泌液獲得的抗菌肽Magainin具廣譜抗微生物作用，為此在美國(guó)以爪蟾皮膚抗菌肽Magainin為名成立了Magainin制藥公司。他們生產(chǎn)的爪蟾皮膚抗菌肽Magainin類似物MSI-78已進(jìn)入三期臨床。在用抗菌肽nisin治療母牛乳房皮膚感染時(shí)，發(fā)現(xiàn)用藥僅一分鐘后，金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和肺炎球菌的數(shù)量成4倍對(duì)數(shù)的減少而不產(chǎn)生任何副作用。在國(guó)外，抗菌肽已開(kāi)始用于抗腫瘤的研究和治療，但未見(jiàn)詳細(xì)的報(bào)道。國(guó)外學(xué)者也已報(bào)道從東方鈴蟾(Bombinaorientalis)和花鈴蟾(Bombina variegata)中分離出若干具廣譜抗微生物活性的多肽類物質(zhì)，如Bombinin和BLP-like多肽。
我國(guó)對(duì)兩棲類藥物的應(yīng)用有悠久的歷史，但對(duì)其活性成分和藥理性質(zhì)的研究主要集中于生物堿等有機(jī)小分子，對(duì)其皮膚活性肽類物質(zhì)的研究還較少。大蹼鈴蟾(Bombinamaxima)主要分布于我國(guó)的云南、四川省，是我國(guó)的特色資源動(dòng)物之一，也是特色的民族民間藥物。
發(fā)明人將本發(fā)明的大蹼鈴蟾皮膚肽全序列結(jié)構(gòu)經(jīng)蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行搜尋比較，未發(fā)現(xiàn)有任何相同多肽。
本發(fā)明的目的是基于上述現(xiàn)有技術(shù)基礎(chǔ)，提供一種新的具有廣譜抗微生物(包括革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌，革蘭氏陰性細(xì)菌、真菌)，抗腫瘤活性的大蹼鈴蟾皮膚肽及其制備方法和在制藥中的應(yīng)用。
為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明提供了如下技術(shù)方案大蹼鈴蟾皮膚肽，為我們首次從兩棲類動(dòng)物大蹼鈴蟾皮膚分泌物中分離得到的一種單鏈多肽，分子量2674.2，等電點(diǎn)9.8，多肽全序列一級(jí)結(jié)構(gòu)為甘氨酸-異亮氨酸-甘氨酸-蘇氨酸-賴氨酸-異亮氨酸-亮氨酸-甘氨酸-甘氨酸-纈氨酸-賴氨酸-蘇氨酸-丙氨酸-亮氨酸-賴氨酸-甘氨酸-丙氨酸-亮氨酸-賴氨酸-谷氨酸-亮氨酸-丙氨酸-絲氨酸-蘇氨酸-酪氨酸-丙氨酸-酰胺化天冬酰胺(NH2-GIGTKILGGVKTALKGALKELASTYAN-NH2)。
大蹼鈴蟾皮膚肽的制備方法，是將活體大蹼鈴蟾用水清洗干凈，置于帶蓋的玻璃容器中，滴加無(wú)水乙醚(1升體積容積加1毫升無(wú)水乙醚)，密閉容器3-5分鐘，可見(jiàn)大量的泡沫狀物質(zhì)從大蹼鈴蟾皮膚分泌出來(lái)，收集分泌物，離心(10000rpm，20分鐘)、冷凍干燥后，經(jīng)DEAE-Sephadex A-50離子交換后，收取所得峰I經(jīng)Sephadex G-50凝膠過(guò)濾后取峰IV，峰IV再經(jīng)CM-Sephadex C-25離子交換，取第三步柱層析分離出的峰I即可。然后用高效液相色譜HPLC方法鑒定其純度，分子量測(cè)定采用快原子轟擊質(zhì)譜法(Fast atom bombardment mass spectrometry，F(xiàn)AB-MS)，等電聚焦電泳測(cè)定等電點(diǎn)，用自動(dòng)氨基酸測(cè)序儀測(cè)定氨基酸序列結(jié)構(gòu)。
大蹼鈴蟾皮膚肽作為制備治微生物感染疾病藥物、腫瘤治療藥物的應(yīng)用。
下面用本發(fā)明的大蹼鈴蟾皮膚肽的藥理實(shí)驗(yàn)結(jié)果來(lái)說(shuō)明本發(fā)明的藥效作用和有益效果1，大蹼鈴蟾皮膚肽抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的作用抗菌活性檢測(cè)，采用杯碟法，培養(yǎng)基為普通瓊脂培養(yǎng)基。分別注入加熱融化的培養(yǎng)基20ml于平皿中作為底層，使其在皿底內(nèi)均勻攤布，凝固后，另取培養(yǎng)基適量加熱融化后，分別在每皿中加入5ml菌懸液，搖勻，使其在底層上均勻攤布，作為菌層。冷卻后，在平皿中等距離均勻放入已消毒的不銹鋼杯6個(gè)。第一個(gè)鋼杯加入0.3mg/ml濃度的待測(cè)化合物溶液0.1ml，其余鋼杯采用二倍稀釋法加入樣品液，37℃培養(yǎng)，觀察抑菌圈大小。抑菌圈10mm以上的作為最小抑菌濃度(minimal inhibitory concentration，MIC)。細(xì)菌菌株來(lái)源于昆明醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，此試驗(yàn)重復(fù)四次，取平均值，結(jié)果如表1。
表1，大蹼鈴蟾皮膚肽抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的作用
由表1可見(jiàn)，大蹼鈴蟾皮膚肽第一步DEAE-Sephadex A-50離子交換粗品及純化大蹼鈴蟾皮膚肽均具有顯著的抑制細(xì)菌(包括革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌，革蘭氏陰性細(xì)菌)生長(zhǎng)的作用。
2，大蹼鈴蟾皮膚肽抑制真菌生長(zhǎng)的作用抗真菌活性檢測(cè)，采用杯碟法。培養(yǎng)基為改良沙保氏(Sabousand)培養(yǎng)基，分別注入加熱融化的培養(yǎng)基20ml于平皿中作為底層，使其在皿底內(nèi)均勻攤布，凝固后，另取培養(yǎng)基適量加熱融化后，分別在每皿中加入5ml菌懸液，搖勻，使其在底層上均勻攤布，作為菌層。冷卻后，在平皿中等距離均勻放入已消毒的不銹鋼杯6個(gè)。第一個(gè)鋼杯加入0.3mg/ml濃度的待測(cè)化合物溶液0.1ml，其余鋼杯采用二倍稀釋法加入樣品液，37℃培養(yǎng)，觀察抑菌圈大小。抑菌圈10mm以上的作為最小抑菌濃度(minimal inhibitoryconcentration，MIC)。真菌株來(lái)源于云南大學(xué)微生物研究所，此試驗(yàn)重復(fù)三次，取平均值，結(jié)果如表2。
表2，大蹼鈴蟾皮膚肽抑制真菌生長(zhǎng)的作用
由表2可見(jiàn)，除抑制細(xì)菌生長(zhǎng)外，大蹼鈴蟾皮膚肽第一步DEAE-Sephadex A-50離子交換粗品及純化大蹼鈴蟾皮膚肽均具有顯著的抑制真菌生長(zhǎng)的作用。
表3，大蹼鈴蟾皮膚肽抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的作用
3.大蹼鈴蟾皮膚肽抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的作用在96孔平底細(xì)胞培養(yǎng)板上，將待測(cè)化合物用完全培養(yǎng)基進(jìn)行5倍或2倍倍比稀釋，共六個(gè)稀釋度，每個(gè)稀釋度設(shè)3個(gè)重復(fù)孔，每孔100μl，同時(shí)設(shè)置正常細(xì)胞對(duì)照。每孔滴加3×105/ml的C8166細(xì)胞或Molt-4細(xì)胞100μl。置37℃，5％CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。72小時(shí)(C8166)或48小時(shí)(Molt-4)用MTT方法測(cè)定待測(cè)化合物對(duì)細(xì)胞的毒性作用。EC50是對(duì)50％宿主細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞毒作用時(shí)的藥物濃度。
目前臨床上所用大部分抗生素類藥物不具有抑制腫瘤細(xì)胞作用。從表3可見(jiàn)，大蹼鈴蟾皮膚肽粗品及不同批號(hào)的純化大蹼鈴蟾皮膚肽均有顯著的體外抑制殺滅腫瘤細(xì)胞的作用。
從上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果可得出本發(fā)明大蹼鈴蟾皮膚肽的有益效果在于大蹼鈴蟾皮膚肽粗品及不同批號(hào)的純化大蹼鈴蟾皮膚肽均有顯著的抑制細(xì)菌和真菌生長(zhǎng)作用，所用微生物菌株包括大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌、痢疾桿菌、白色念珠菌、青霉、米曲霉等，結(jié)果表明大蹼鈴蟾皮膚肽具廣譜抗微生物活性(包括革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌，革蘭氏陰性細(xì)菌，真菌；MIC在3-20μg/ml范圍內(nèi))。同時(shí)大蹼鈴蟾皮膚肽具有顯著地抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的作用，大蹼鈴蟾皮膚肽對(duì)C8166，Molt-4腫瘤細(xì)胞的抑制率EC50平均分別為3.3μg/ml，25μg/ml，與文獻(xiàn)報(bào)道的同時(shí)具有腫瘤細(xì)胞抑制活性的其他來(lái)源抗菌肽相比，大蹼鈴蟾皮膚肽的腫瘤細(xì)胞抑制活性高5-10倍。因此，本發(fā)明的大蹼鈴蟾皮膚肽是一種首次從中國(guó)特色藥用生物資源中研制的新的具有抗微生物，抗腫瘤的生物活性多肽。
下面結(jié)合附圖用實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明的實(shí)質(zhì)性內(nèi)容，但本發(fā)明的內(nèi)容并不局限于此。


圖1為本發(fā)明大蹼鈴蟾皮膚肽的DEAE-Sephadex A-50離子交換層析圖。
圖2為本發(fā)明大蹼鈴蟾皮膚肽的Sephadex G-50凝膠過(guò)濾層析圖。
圖3為本發(fā)明大蹼鈴蟾皮膚肽的CM-Sephadex C-25離子交換層析圖。
實(shí)施例1，制備大蹼鈴蟾皮膚肽活體大蹼鈴蟾用水清洗干凈，將大蹼鈴蟾置于帶蓋的玻璃容器中，滴加無(wú)水乙醚(1升體積容積加1毫升無(wú)水乙醚)，密閉容器3-5分鐘，可見(jiàn)大量的泡沫狀物質(zhì)從大蹼鈴蟾皮膚分泌出來(lái)，收集分泌物，離心(10000rpm，20分鐘)、冷凍干燥、低溫保存。第一步DEAE Sephadex A-50離子交換，按上述方法獲得原材料大蹼鈴蟾分泌物凍干粉，凍干粉溶解于0.05M Tris-HCl，含10mM EDTA，pH7.3的緩沖液，裝于3.5KDa透析袋，于同樣緩沖液透析12小時(shí)；DEAE Sephadex A-50(Pharmacia產(chǎn)品)陰離子交換柱(500mm長(zhǎng)，26mm直徑)經(jīng)0.05M Tris-HCl，含10mM EDTA，pH7.3緩沖液平衡，已透析好的樣品上柱，經(jīng)兩個(gè)柱體積同樣緩沖液沖洗至穿透峰被完全洗脫，再用含NaCl的緩沖液進(jìn)行梯度洗脫，收集穿透峰I。
第二步，Sephadex G-50凝膠過(guò)濾第一步得到的活性成分穿透峰I凍干，溶解于0.1M Na2HPO4-NaH2PO4，pH6.0緩沖液，上樣于Sephadex G-50(Pharmacia產(chǎn)品)凝膠過(guò)濾柱(1000mm長(zhǎng)，26mm直徑)，用同樣緩沖液洗脫，收集峰IV。
第三步，CM Sephadex C-25離子交換凝膠過(guò)濾得到的活性成分峰IV上樣品于經(jīng)0.1M Na2HPO4-NaH2PO4，pH6.0緩沖液平衡的CM Sephadex C-25(Pharmacia產(chǎn)品)陽(yáng)離子交換柱(300mm長(zhǎng)，26mm直徑)，再用含NaCl的緩沖液進(jìn)行梯度洗脫，收集活性成分峰I即為大蹼鈴蟾皮膚肽。
2，分子量測(cè)定采用快原子轟擊質(zhì)譜法(Fast atom bombardment mass spectrometry，F(xiàn)AB-MS)，以甘油間硝基芐醇二甲亞砜(1∶1∶1，V∶V∶V，體積比)為底物，Cs+作為轟擊粒子，電流為1μA，發(fā)射電壓為25Kv。
3，純化大蹼鈴蟾皮膚肽用高效液相色譜HPLC方法鑒定其純度，分子量測(cè)定采用快原子轟擊質(zhì)譜法，等電聚焦電泳測(cè)定等電點(diǎn)，用自動(dòng)氨基酸測(cè)序儀測(cè)定氨基酸序列結(jié)構(gòu)。
通過(guò)上述方法制備的大蹼鈴蟾皮膚肽，是我們首次從中國(guó)兩棲類動(dòng)物大蹼鈴蟾皮膚分泌物中分離得到的一種單鏈多肽，分子量2674.2，等電點(diǎn)9.8，多肽全序列結(jié)構(gòu)為甘氨酸-異亮氨酸-甘氨酸-蘇氨酸-賴氨酸-異亮氨酸-亮氨酸-甘氨酸-甘氨酸-纈氨酸-賴氨酸-蘇氨酸-丙氨酸-亮氨酸-賴氨酸-甘氨酸-丙氨酸-亮氨酸-賴氨酸-谷氨酸-亮氨酸-丙氨酸-絲氨酸-蘇氨酸-酪氨酸-丙氨酸-酰胺化天冬酰胺(NH2-GIGTKILGGVKTALKGALKELASTYAN-NH2)。作為制備廣譜抗微生物藥、抗腫瘤藥的應(yīng)用。
權(quán)利要求
1，大蹼鈴蟾皮膚肽，其特征是從中國(guó)兩棲類動(dòng)物大蹼鈴蟾皮膚分泌物中分離得到的一種單鏈多肽，分子量2674.2，等電點(diǎn)9.8，多肽全序列一級(jí)結(jié)構(gòu)為甘氨酸-異亮氨酸-甘氨酸-蘇氨酸-賴氨酸-異亮氨酸-亮氨酸-甘氨酸-甘氨酸-纈氨酸-賴氨酸-蘇氨酸-丙氨酸-亮氨酸-賴氨酸-甘氨酸-丙氨酸-亮氨酸-賴氨酸-谷氨酸-亮氨酸-丙氨酸-絲氨酸-蘇氨酸-酪氨酸-丙氨酸-酰胺化天冬酰胺。
2，大蹼鈴蟾皮膚肽的制備方法，其特征是將活體大蹼鈴蟾用水清洗干凈，置于帶蓋的玻璃容器中，滴加無(wú)水乙醚，密閉容器3-5分鐘，可見(jiàn)大量的泡沫狀物質(zhì)從大蹼鈴蟾皮膚分泌出來(lái)，收集分泌物，離心去除沉淀、冷凍干燥后，經(jīng)離子交換、凝膠過(guò)濾柱層析分離純化，即可制備得到大蹼鈴蟾皮膚肽。
3，大蹼鈴蟾皮膚肽作為制備治微生物感染疾病藥物、腫瘤治療藥物的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。大蹼鈴蟾皮膚肽,是從中國(guó)兩棲類動(dòng)物大蹼鈴蟾皮膚分泌物中分離得到的一種單鏈多肽,分子量2674.2,等電點(diǎn)9.8,多肽全序列一級(jí)結(jié)構(gòu)為:NH
文檔編號(hào)C07K14/435GK1336384SQ0012241
公開(kāi)日2002年2月20日 申請(qǐng)日期2000年7月29日 優(yōu)先權(quán)日2000年7月29日
發(fā)明者張?jiān)? 賴仞, 鄭永唐, 唐紹宗, 李文輝 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院昆明動(dòng)物研究所