專利名稱：固定化金屬離子親和層析膠的制備技術(shù)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程下游蛋白質(zhì)純化技術(shù)。
固定化金屬離子親和層析技術(shù)是一種分離純化帶有His-tag蛋白質(zhì)的方法，這種膠能特異性地與帶有純化標(biāo)記His-tag的蛋白質(zhì)螯合從而使蛋白質(zhì)通過金屬離子牢固地吸附在膠上，其他雜質(zhì)蛋白由于不帶有上述純化標(biāo)記則不能與金屬離子螯合，也就不能吸附到膠上；然后用Washing Buffer(Washing Buffer(8x)∶480mM咪唑，4M NaCl，160mM Tris；用濃HCl調(diào)pH值為7．9)將沒有吸附的雜質(zhì)蛋白沖洗掉；再用Eluting Buffer(Elute Buffer(4x)∶4M咪唑，2M NaCl，80mM Tris；用濃HCl調(diào)pH值為7．9)把所需要的目的蛋白在層析儀上洗脫下來。這樣，就可以獲得只含有目的蛋白質(zhì)的洗脫液，再將此洗脫液透析脫鹽、濃縮，冷凍干燥就可以獲得純度很高的目的蛋白質(zhì)，并且蛋白質(zhì)的生物活性不受影響。隨著“人類基因組計(jì)劃”的逐步完成，“蛋白質(zhì)組計(jì)劃”即將全面展開，在“蛋白質(zhì)組計(jì)劃”中必須大量運(yùn)用基因工程手段制備各種與人類健康有關(guān)的蛋白質(zhì)。而在基因工程中，除了克隆、表達(dá)外，緊接的問題就是如何純化表達(dá)出來的目的蛋白質(zhì)，這是基因工程下游技術(shù)中一個(gè)非常重要的組成部分。固定化金屬離子親和層析膠就能滿足這些要求，它可以用來特異性吸附帶有His-tag純化標(biāo)記的蛋白質(zhì)，并通過親和層析純化基因工程中表達(dá)的目的蛋白質(zhì)。因此，該親和層析膠在將來的生命科學(xué)研究領(lǐng)域以及生物制藥中應(yīng)用前景是非常廣闊的。
目前，固定化金屬離子親和層析膠的制備技術(shù)在國(guó)外已有少數(shù)幾個(gè)生物大公司(如QIAGEN公司、Amersham Pharmacia公司等)研究出并且已經(jīng)在生產(chǎn)有關(guān)產(chǎn)品。這些公司產(chǎn)品所涉及的主要原料除了載體膠以外，還有亞氨基二乙酸鈉(IDA-Na2)或次甲基三乙酸(NTA)等，這些原料難得且價(jià)格非常昂貴。再加上國(guó)外這些大公司的制備技術(shù)路線以及所用其他費(fèi)用也較高，因此生產(chǎn)成本也就很高，價(jià)格很昂貴(一般每50ml價(jià)格為3000-4000元人民幣)。
本發(fā)明的目的就是要提供一種固定化金屬離子親和層析膠的制備技術(shù)，既操作方便、過程簡(jiǎn)單、結(jié)果可靠，又成本低、花費(fèi)小，能制備出在理化指標(biāo)、純化蛋白質(zhì)的功能等方面都優(yōu)于或等同于國(guó)外生物大公司的相關(guān)產(chǎn)品。本制備技術(shù)為我們首創(chuàng)，與國(guó)外公司有很大不同，如在這種膠的主要制備原料中，并沒有象國(guó)外大公司那樣用載體[瓊脂糖(Agrose)或Sepharose4B或Sepharose6B]與亞氨基二乙酸二鈉(IDA-Na2)或次甲基三乙酸(NTA)來合成親和膠；而是直接用亞氨基二乙酸(IDA)作為起始原料與載體(Sepharose4B或6B)反應(yīng)合成親和膠。另外，在某些重要的反應(yīng)條件上(如溫度、pH值、反應(yīng)時(shí)間等)也與上述生物大公司及有關(guān)資料上所描述的大不相同。特別本發(fā)明制備的膠的成本比國(guó)外生物大公司及有關(guān)資料上介紹制備的膠的成本要低的多；按我們的成本預(yù)測(cè)，用本制備技術(shù)生產(chǎn)的親和層析膠的預(yù)測(cè)售價(jià)僅是每50ml為300-500元左右。
綜上所述，本技術(shù)與目前國(guó)外(國(guó)內(nèi)尚無)已有的技術(shù)相比，主要有以下優(yōu)點(diǎn)
1、生產(chǎn)成本大大降低。我們用IDA作為起始原料，IDA比IDA-Na2的市場(chǎng)售價(jià)低很多(大約是1∶20)且非常易得(國(guó)內(nèi)就有生產(chǎn))；而IDA-Na2必須從國(guó)外進(jìn)口，且價(jià)格很高。另外本發(fā)明用Sepharose做起始原料，比國(guó)外公司所用的瓊脂糖(Agrose)要便宜許多；兩方面綜合起來核算，估計(jì)本研究的成本不到國(guó)外公司的生產(chǎn)成本的十分之一。
2、制備過程簡(jiǎn)便，一般的技術(shù)人員一學(xué)即會(huì)。
3、成品膠的理化指標(biāo)及分離純化蛋白的功能很好。我們采用原子吸收法對(duì)本發(fā)明制備的親和層析膠測(cè)定了螯合Ni2+的量，并與國(guó)外大公司的產(chǎn)品及有關(guān)資料報(bào)道的結(jié)果進(jìn)行了比較。結(jié)果表明，本發(fā)明制備的膠的理化指標(biāo)比他們的指標(biāo)均要高許多。此外，我們特地設(shè)計(jì)了一種帶有His-tag標(biāo)記的蛋白質(zhì)(人B淋巴細(xì)胞刺激因子，hBLyS)，用來檢測(cè)此合成膠的分離純化的效果；結(jié)果也表明，本發(fā)明制備的金屬離子Ni2+親和層析膠在分離純化帶有His-tag標(biāo)記的蛋白質(zhì)方面，效果是非常令人滿意的。
本發(fā)明的目的是通過如下的技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的本制備技術(shù)的總體設(shè)計(jì)及反應(yīng)流程如下 本發(fā)明的制備過程從亞氨基二乙酸及相應(yīng)的載體開始，這是目前國(guó)內(nèi)外尚未有的新技術(shù)。
具體制備步驟1、將載體(Sepharose6B或Sepharose4B)用G-3漏斗抽干，稱取50g放入一個(gè)三角燒瓶中，加入CNBr或環(huán)氧氯丙烷(1-2倍載體膠體積)，用NaOH調(diào)pH值為6．5-12，再加入0．0375gNaBH4；在22℃-60C攪拌反應(yīng)1-2小時(shí)后，加入10ml 0．2M NaOH及5mlCNBr或環(huán)氧氯丙烷，間隙攪拌5-12小時(shí)，使膠充分活化并在膠顆粒中的分子上的-OH基團(tuán)接上環(huán)氧丙基；2、活化好的載體膠于G-3漏斗上抽干，再放回三角燒瓶中，加入IDA，在pH為6．5-12的條件下(用0．2M Na2CO3溶液調(diào)pH)與手臂IDA(亞氨基二乙酸)攪拌反應(yīng)，反應(yīng)溫度是30℃-50℃；反應(yīng)2-6小時(shí)；3、反應(yīng)完的膠用G-3漏斗抽干；4、抽干的膠回轉(zhuǎn)至三角瓶中，用2-5倍體積的1M的NiSO4溶液與之反應(yīng)；反應(yīng)條件為30℃-50℃、攪拌反應(yīng)3-5小時(shí)；5、結(jié)合了Ni2+的膠在G-3漏斗上充分抽干，用稀HAc淋洗2-3次，再用雙蒸水淋洗2-3次，抽干；6、用20％的乙醇保存于4℃冰箱；這樣就制備了固定化Ni2+親和層析膠；取出部分產(chǎn)物做分析實(shí)驗(yàn)。
對(duì)本發(fā)明制備產(chǎn)物的鑒定1、原子吸收檢測(cè)取出上述發(fā)明制備的親和膠(抽干)2g，用含有EDTA的溶液20ml將2g膠上的所有Ni2+螯合下來進(jìn)入溶液，然后用標(biāo)準(zhǔn)曲線法在原子吸收儀上進(jìn)行測(cè)定。
結(jié)果取上述含有2g膠中的Ni2+的EDTA溶液0．5ml用ddH2O稀釋到250ml后，用原子吸收法測(cè)得其中[Ni2+]=0．0168mmol／L。
計(jì)算得到每克抽干膠中螯合的Ni2+為4．93mg或84μmol；每毫升沉淀膠中螯合的Ni2+為4．11mg或70μmol。
從上述測(cè)定結(jié)果看，比有關(guān)資料報(bào)道的數(shù)字15．7μmol of Ni2+／ml of gel[1]及8-12μmol Ni2+／ml膠[2](QIAGEN公司)均要高出許多。其中，實(shí)驗(yàn)樣品的計(jì)算結(jié)果比8-12μmol Ni2+／ml of gel高出5．83-8．75倍；比15．7μmol of Ni2+／mlof gel高出近4．46倍。
2、分離純化蛋白質(zhì)的效果檢測(cè)參考有關(guān)文獻(xiàn)[3]，取2ml本研究制備的Ni2+親和層析膠做成親和層析柱，用Binding Buffer平衡好后，另取用大腸桿菌BL21菌株表達(dá)的含有目的蛋白質(zhì)hBLyS的總蛋白上清液上樣加入柱子，再用Washing Buffer沖洗掉不吸附的雜質(zhì)蛋白，最后用洗脫液洗脫目的蛋白。電腦記錄的洗脫圖象呈單一銳峰。
可見，洗脫目的蛋白質(zhì)hBLyS的純度以及膠對(duì)目的蛋白hBLyS的吸附效果都是很好的(沖洗液經(jīng)電泳檢測(cè)不含有目的蛋白hBLyS)。另外，洗脫液不經(jīng)透析、濃縮，直接進(jìn)行電泳檢測(cè)時(shí)，凝膠上也只見一條帶子，這也說明此膠分離純化蛋白質(zhì)的效果是非常好的。
參考文獻(xiàn)1、 Michele C. Smith,Thomas C. Furman,Charles Pidgeon.Immobilized IminodiaceticAcid Metal Peptide Complexes.Identification of Chelating Peptide Purification Handlesfor Recombinant Proteins.Inorg.Chem.1987,26,1965～19692、The QIAexpressionist(QIAGEN),2nd Edition,1992(因?yàn)槭且槐拘?cè)子，故只能附上相關(guān)的一頁)。
3、pET System Manual(Novagen),7th Edition,1997(注因?yàn)槭且槐拘?cè)子，故未附上復(fù)印件)。
權(quán)利要求
1．一種固定化金屬離子親和層析膠的制備技術(shù)，其特征是將載體(Sepharose6B或Sepharose4B)用G-3漏斗抽干，放入一個(gè)三角燒瓶中，加入CNBr或環(huán)氧氯丙烷，用NaOH調(diào)pH值為6．5-12，再加入NaBH4，在22℃-60℃攪拌反應(yīng)1-2小時(shí)后，加入NaOH及CNBr或環(huán)氧氯丙烷，間隙攪拌5-12小時(shí)，使膠充分活化；活化好的載體膠于G-3漏斗上抽干，再放回三角燒瓶中，加入IDA，在pH為6．5-12的條件下(用0．2M Na2CO3溶液調(diào)pH)與手臂IDA(亞氨基二乙酸)攪拌反應(yīng)，反應(yīng)溫度是30℃-50℃，反應(yīng)2-6小時(shí)，反應(yīng)完的膠用G-3漏斗抽干，抽干的膠回轉(zhuǎn)至三角瓶中，用2-5倍體積的NiSO4溶液與之反應(yīng)；反應(yīng)條件為30℃-50℃、攪拌反應(yīng)3-5小時(shí)；把膠在G-3漏斗上充分抽干，用稀HAc淋洗2-3次，再用雙蒸水淋洗2-3次，抽干；用20％的乙醇保存于4℃冰箱。
全文摘要
本發(fā)明是一種固定化金屬離子親和層析膠的制備技術(shù),用Sepharose 6B和亞氨基二乙酸(IDA)作為主要原料,經(jīng)活化、接臂、固定等反應(yīng)合成出Ni
文檔編號(hào)C07K1/00GK1280134SQ0011214
公開日2001年1月17日 申請(qǐng)日期2000年3月16日 優(yōu)先權(quán)日2000年3月16日
發(fā)明者張雙全, 劉平 申請(qǐng)人:南京師范大學(xué)