專利名稱:非豆科植物中的生物固氮的制作方法
1.發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明公開了一種根瘤菌轉(zhuǎn)化株，它們能在非豆科植物中進(jìn)行侵入、形成根瘤和固氮，栽培該非豆科植物的種子預(yù)先用對(duì)此根瘤菌轉(zhuǎn)化株具有專一性的物質(zhì)進(jìn)行過(guò)包膜。這些有根瘤的非豆科植物可以在不使用氮肥的情況下生長(zhǎng);收割后植物的剩余部分和秸桿比它們未形成根瘤的對(duì)比植株具有更高的蛋白含量、干物質(zhì)含量和氮含量。
本發(fā)明通過(guò)一些具體的實(shí)例來(lái)說(shuō)明。在這些實(shí)例中，用根瘤菌的轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)合體使禾本科植物(Poaceae)小麥、大麥、高梁、水稻和蕓香屬(Brassicas)中的油菜(十字花科Cruciferae)形成根瘤。在實(shí)例中還說(shuō)明了能在桉屬植物(桃金娘科Myrtaceae)中固氮的根瘤菌轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)合體。
2.發(fā)明背景植物代謝的一個(gè)基本特點(diǎn)是利用硝酸鹽和其它無(wú)機(jī)氮化合物合成氨基酸、蛋白質(zhì)、葉綠素、維生素、激素和生物堿等這樣一些對(duì)于植物的生長(zhǎng)發(fā)育必不可少的有機(jī)化合物。雖然植物從土壤中吸收硝酸鹽和其它的氮化合物，但是，氮的基本來(lái)源仍然是大氣中游離的二氮(N2)，而游離的二氮必須被固定和轉(zhuǎn)化成可被植物利用的形式。
2.1.生物固氮生物的二氮固定作用(通常稱為生物固氮作用)是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，其中包括使游離氮通過(guò)一系列的中間產(chǎn)物還原成氨，這是通過(guò)固氮微生物來(lái)實(shí)現(xiàn)的，它們中有些是與某些維管植物共生的。最重要的共生固氮菌是根瘤菌屬，它有許多種，每一種都與豆科植物的一個(gè)或幾個(gè)近緣種共生(例如豌豆、菜豆、三葉草等)，其結(jié)果是與其它不能固氮的植物不同，豆科植物生長(zhǎng)時(shí)不需要氮肥。事實(shí)上，豆科植物可以豐富土壤中的氮含量，鑒于許多豆科植物具有這樣的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，已經(jīng)有了用于為豆科種子接種的細(xì)菌培養(yǎng)物。此外，含有可生存的固氮菌的豆科植物種子的包膜已有過(guò)公開(US3，499，748和4，149，869)。
共生固氮包括以下過(guò)程一種專一于一種具體的豆科植物宿主的根瘤菌侵染該豆科植物宿主的根，然后在根上形成根瘤，根瘤菌以稱為類菌體的內(nèi)共生狀態(tài)生活在根中，這種類菌體與該豆科植物宿主密切配合起著固氮這樣的獨(dú)特作用;這種類菌體的特性非常象一個(gè)細(xì)胞器。有趣的是，根瘤菌在植物體外一般不固氮。對(duì)豆科植物中共生固氮各方面的綜述參見《植物基因研究-涉及微生物與植物相互作用的基因》的第3、4和5章(D·P·S·Verma，T·H·Hohn，Springer Verlag，N·Y·1984)。
侵染、形成根瘤和固氮都包含了根瘤菌及其專一的豆科植物宿主之間復(fù)雜的相互作用。為了發(fā)生最初的侵染，根瘤菌和豆科植物必須彼此“識(shí)別”，這種非常專一的識(shí)別據(jù)信是涉及到豆科植物宿主的外源凝集素(一種在根毛中發(fā)現(xiàn)的糖蛋白)與細(xì)菌表面的多糖之間的相互作用;這種相互作用可以認(rèn)為是一種很專一的“鎖和鑰匙”類型的機(jī)制。已把這種專一性比擬成抗體-抗原的相互作用。沒(méi)有這個(gè)相互作用，侵染就不會(huì)發(fā)生。在這種專一的“識(shí)別”后，根瘤菌就附著到特定的豆科植物宿主的根上，侵染是通過(guò)宿主對(duì)入侵根瘤菌的反應(yīng)來(lái)控制的一種非致病形式進(jìn)行的。通常，根瘤菌通過(guò)根毛進(jìn)入豆科植物，并且細(xì)菌侵染是以由宿主植物形成的稱為侵入線的管狀結(jié)構(gòu)為媒介的，該侵入線深入到根部皮層的內(nèi)部細(xì)胞。根瘤菌從侵入線中釋放，但關(guān)閉在宿主形成的稱為類菌體周膜的膜狀包裹體中;因此，這些類菌體被限制在細(xì)胞外的間隔里。破壞此過(guò)程的這種微妙的順序會(huì)導(dǎo)致對(duì)宿主的致病性侵入。
在宿主豆科植物被根瘤菌侵入之后，只在對(duì)該過(guò)程復(fù)雜的相互作用的反應(yīng)中才會(huì)發(fā)生隨后的根瘤形成。在該過(guò)程中，豆科植物影響了根瘤菌基因的表達(dá)，而根瘤菌反過(guò)來(lái)影響了形成根瘤所要求的豆科植物基因的活性。根瘤組織中的細(xì)胞在植物的特殊結(jié)構(gòu)區(qū)域中高度地組織化，在把細(xì)菌排斥在表皮和分生組織區(qū)之外的類菌體周膜中照常有細(xì)菌。在為了對(duì)類菌體輸入氧和氮及為宿主植物輸入氨必須解決的擴(kuò)散問(wèn)題上，根瘤的組織和形態(tài)是具有生化意義的。有效的根瘤(即實(shí)際上固氮的根瘤)的一個(gè)區(qū)別特征是存在豆血紅蛋白，一種看來(lái)在根瘤呼吸中起作用的氧結(jié)合蛋白(也就是這種蛋白質(zhì)的高濃度促使氧擴(kuò)散到類菌體區(qū)域)。這種蛋白也與保護(hù)固氮酶(固氮過(guò)程中一種必不可少的酶)不因過(guò)量的氧而中毒有關(guān)。豆血紅蛋白顯然是一種真正的共生產(chǎn)物-其球蛋白由植物基因編碼，而其血質(zhì)合成主要依靠細(xì)菌。
最后，根瘤中發(fā)生的共生固氮是一種協(xié)同作用，類菌體具有固氮機(jī)制而豆科植物同化產(chǎn)生的氨使之成為有機(jī)物形式，然后作為整株植物及這些類菌體的養(yǎng)分而被利用;豆科植物提供了一個(gè)使類菌體能夠固氮的合適環(huán)境和能量來(lái)源。在整個(gè)過(guò)程中會(huì)發(fā)生很多問(wèn)題如果宿主植物的細(xì)菌被“錯(cuò)配合”，侵入就不會(huì)成功，因而形成根瘤的整個(gè)過(guò)程和共生固氮就不會(huì)發(fā)生;此外，成功地形成了根瘤也不意味著固氮必定會(huì)發(fā)生，因?yàn)榈玫降母隹赡苁怯腥毕莸摹?br>2.1.1.在共生中涉及的豆科植物基因宿主基因產(chǎn)品的兩個(gè)主類，豆血紅蛋白和根瘤素在共生固氮期間被特異地誘導(dǎo)。雖然根瘤中的豆血紅蛋白的結(jié)構(gòu)和功能是比較清楚的，但對(duì)根瘤素了解不多。但有趣的是，最近有一篇文章報(bào)道了豆血紅蛋白植物的DNA序列可在非豆科植物中檢測(cè)到。因此表明這些氧結(jié)合蛋白的基因的存在領(lǐng)域比以前認(rèn)為的更為廣泛(Hattori和Johnson，1985，Plant Mol·Biol·4∶285-292)。
2.1.2.共生中涉及的根瘤菌基因幾年前就發(fā)現(xiàn)，形成根瘤所需的根瘤基因是處在其本身也攜帶固氮基因的一種大的質(zhì)粒中(稱為共生質(zhì)粒)。自那以后，已發(fā)現(xiàn)很多根瘤菌可以通過(guò)把具有不同宿主專一性的另一個(gè)根瘤菌屬的共生質(zhì)粒轉(zhuǎn)移到該根瘤菌中來(lái)引導(dǎo)根瘤菌識(shí)別一個(gè)新的豆科植物共生體。沒(méi)有跡象表明從一個(gè)根瘤菌得到的根瘤菌共生質(zhì)粒轉(zhuǎn)移到另一個(gè)根瘤菌可以使宿主的范圍擴(kuò)大到非豆科植物。有趣的是，將根瘤菌的共生質(zhì)粒引入到根瘤土壤桿菌(Agrobacterium tumefaciens)(一種導(dǎo)致稱為冠癭瘤的植物腫塊生長(zhǎng)的細(xì)菌)中會(huì)賦予土壤桿菌在豆科植物中產(chǎn)生根瘤的能力;可是，這些小瘤是有缺陷的，它們不能固氮(Hooykaas，《細(xì)菌-植物相互作用的分子遺傳學(xué)》A.Puhler，eds，Springer Verlag，NY·1983，229-239)。
這幾年中，各種跡象表明，根瘤菌在豆科植物中形成根瘤的效果能通過(guò)接觸某些植物分泌物而增加，也許這種接觸刺激了形成根瘤的基因的表達(dá)，所有的豆科植物分泌物都產(chǎn)生這種效果，但是來(lái)自各非豆科植物的分泌物則不產(chǎn)生這種效果。
2.1.3 生物固氮和非豆科植物一種稱為法蘭克氏菌(Frankia)的非根瘤菌屬的細(xì)菌能與一些如赤楊屬(Alnus)(榿木)、木麻黃屬(Casuarina)(食火雞樹)、薊木屬(Ceanothus)、胡禿子屬(Eleagnus)、楊梅屬(Myrica)(番櫻桃)和吐根屬(Psychotria)、(一種熱帶木本植物)等維管非豆科植物共生。一篇基于在試管內(nèi)聯(lián)合煙草細(xì)胞培養(yǎng)系和根瘤菌的數(shù)據(jù)的報(bào)道指出，一些非豆科植物可以提供能被根瘤菌利用的因子(Gibson等，1976，Planta 128∶233-239);但是，沒(méi)有指出和觀察到專一的識(shí)別關(guān)系、共生關(guān)系或?qū)Ｒ坏南嗷プ饔?。事?shí)上在豆科種類之外，唯一知道的在非豆科植物種子植物和根瘤菌之間穩(wěn)定共生的例子是Parasp-onia。它是一種熱帶大馬來(lái)亞科(Malayan)(榆樹)，發(fā)現(xiàn)在澳大利亞被分離的天然存在的根瘤菌種在Parasponia中具有形成根瘤和固氮的作用(Trinick，1980，New Phytol·85∶37-45和86∶17-26;Trinick，1981，《固氮作用的現(xiàn)代觀點(diǎn)》Gibson等編，Elsevier Press，p480;Trinick等人，1976，Arch·Microbiol·108∶159-166;并參見Bender等人，1985，植物科學(xué)，38∶138-140)。
3.發(fā)明的概要本發(fā)明描述了可以在非豆科植物中共生固氮的根瘤菌轉(zhuǎn)化株，更具體地說(shuō)，本發(fā)明的根瘤菌轉(zhuǎn)化株可以(a)侵入到用一種專一于該根瘤菌轉(zhuǎn)化株的蛋白質(zhì)混合物包膜種子生長(zhǎng)得到的非豆科植物的根;(b)使這些非豆科植物的根形成根瘤，以及(c)在這些根瘤中固氮，因而不需要使用氮肥來(lái)加速這些非豆科植物的生長(zhǎng)發(fā)育。還描述了用于鑒別各種根瘤菌和本發(fā)明的轉(zhuǎn)化株的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基。
還描述了包膜的非豆科植物種子，這些種子部份地可以通過(guò)本發(fā)明的根瘤菌轉(zhuǎn)化株在非豆科植物中建立共生固氮，這種種子的包膜物質(zhì)包括豆科植物提取物、豆科提取物的層析組分、專一于該根瘤菌轉(zhuǎn)化株的結(jié)晶或純化蛋白，該種子的包膜物質(zhì)也可以包含根瘤菌轉(zhuǎn)化株本身以作為其中的一個(gè)組份。
還描述了生產(chǎn)根瘤菌轉(zhuǎn)化株、非豆科植物種子包膜和在根瘤菌轉(zhuǎn)化株和非豆科植物之間建立共生的方法。
3.1.定義在本文中所使用的術(shù)語(yǔ)“根瘤菌轉(zhuǎn)化株”被定義為一種含有插入DNA的根瘤菌，該DNA可以通過(guò)若干方法中的任一種而產(chǎn)生，包括但不限于轉(zhuǎn)化(即用質(zhì)粒DNA感染)、轉(zhuǎn)染(即用游離DNA、噬菌體DNA或病毒DNA感染)或結(jié)合(即從一種細(xì)菌得到的一個(gè)復(fù)制質(zhì)粒轉(zhuǎn)移到另一種細(xì)菌上);由結(jié)合得到的細(xì)菌轉(zhuǎn)化株是本發(fā)明轉(zhuǎn)化株的一個(gè)子集，并可以專門稱之為轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)合體。
在此所使用的術(shù)語(yǔ)“親代根瘤菌”被定義為可結(jié)合產(chǎn)生本發(fā)明根瘤菌轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)合體的那些親代種，以及這樣一些根瘤菌種，從它們中可分離出質(zhì)?；駾NA序列并且可用來(lái)轉(zhuǎn)化根瘤菌從而產(chǎn)生本發(fā)明的根瘤菌轉(zhuǎn)化株。
4.圖1是表示在播種后各個(gè)時(shí)期收割的小麥作物的干物質(zhì)量(A)和氮含量(B)的曲線圖，三組小麥?zhǔn)谴碛筛鲛D(zhuǎn)化株形成根瘤的小麥(+R-N)，用氮肥施肥但不用根瘤菌轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)合體處理的小麥(-R+N)，及既不用根瘤菌的轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)合體形成根瘤又未用氮肥處理的小麥(-R-N)。
圖2是表示播種后各個(gè)時(shí)期收割的大麥作物的干物質(zhì)量(A)和氮含量(B)的曲線圖。三組大麥分別代表由根瘤菌的轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)合體形成根瘤的大麥(+R-N);用氮肥但未用根瘤菌的轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)合體處理過(guò)的大麥，以及既不用根瘤菌的轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)合體形成根瘤又未用氮肥處理的大麥(-R-N)。
5.本發(fā)明的詳細(xì)描述本發(fā)明涉及在非豆科植物中形成根瘤和固氮的根瘤菌轉(zhuǎn)化株。這種形成根瘤的非豆科植物可以在沒(méi)有氮肥的情況下生長(zhǎng)，并且與施用氮肥而不形成根瘤的對(duì)比株相比具有相同或者更高的蛋白含量、干物質(zhì)量和氮含量。在形成根瘤的非豆科植物收割后剩下的秸桿中也含有較高的蛋白質(zhì)。
更具體地說(shuō)，本發(fā)明的根瘤菌轉(zhuǎn)化株具有能使從專一于該轉(zhuǎn)化株的材料包膜的種子生長(zhǎng)出來(lái)的非豆科植物形成根瘤的能力。本發(fā)明涉及這些根瘤菌轉(zhuǎn)化株，生產(chǎn)這些根瘤菌轉(zhuǎn)化株的方法，用于非豆科種子包膜的物質(zhì)，包膜種子本身，用根瘤菌轉(zhuǎn)化株使非豆科植物形成根瘤的方法以及產(chǎn)生具有高蛋白含量的形成根瘤的非豆科植物。
為了更清楚地?cái)⑹銎鹨?，本發(fā)明按下列順序進(jìn)行討論(a)根瘤菌轉(zhuǎn)化株;(b)非豆科植物的包膜物質(zhì);(c)在非豆科植物中實(shí)現(xiàn)共生固氮以及(d)形成根瘤的非豆科植物。
5.1 根瘤菌轉(zhuǎn)化株本發(fā)明根瘤菌轉(zhuǎn)化株的生產(chǎn)和鑒定是以下述最初的發(fā)現(xiàn)為基礎(chǔ)的，即各種不同的根瘤菌菌種當(dāng)它在其豆科宿主之外的營(yíng)養(yǎng)介質(zhì)中生長(zhǎng)時(shí)產(chǎn)生一種具有特征顏色的菌落，只要這種營(yíng)養(yǎng)介質(zhì)除了含有維持細(xì)菌生長(zhǎng)必需的養(yǎng)分外，還含有從與該根瘤菌種的專一配對(duì)的豆科植物宿主中得到的未變性的提取物。菌落的顏色可作為鑒定特定的根瘤菌種的手段。事實(shí)上，不同種的根瘤菌可以在一個(gè)含有專一于每個(gè)菌種的各個(gè)豆科植物宿主的未變性提取物的混合物的營(yíng)養(yǎng)介質(zhì)上培養(yǎng)，各個(gè)菌種將形成具有其特征顏色的菌落。
本發(fā)明還以另外的發(fā)現(xiàn)為基礎(chǔ)，即這些能夠侵染非豆科植物而形成根瘤并固氮的根瘤菌轉(zhuǎn)化株在含有該轉(zhuǎn)移株的親代根瘤菌的豆科宿主共生體提取物的營(yíng)養(yǎng)介質(zhì)中形成雪白色菌落;而那些可以從該非豆科的根瘤中分離并在上述還含有該非豆科宿主提取物的介質(zhì)中培養(yǎng)的轉(zhuǎn)化株類菌體會(huì)形成灰白色菌落。因此，這種營(yíng)養(yǎng)介質(zhì)提供了一種比較簡(jiǎn)單的鑒定本發(fā)明轉(zhuǎn)化株的手段。這種營(yíng)養(yǎng)介質(zhì)在下一小節(jié)中給予描述。
5.1.1.用于鑒別根瘤菌轉(zhuǎn)化株的營(yíng)養(yǎng)介質(zhì)這種營(yíng)養(yǎng)介質(zhì)應(yīng)含有根瘤菌生長(zhǎng)所必需的營(yíng)養(yǎng)成分，包括但不限于任何一種公知的碳源、氮源和鹽類以及B類維生素和可以以單獨(dú)的氨基酸、三肽或寡肽等形式存在的基本氨基酸如L-丙氨酸、L-絲氨酸和L-色氨酸等。豆科植物提取物成分對(duì)于根瘤菌種的鑒定是有用的，而不是作為根瘤菌的營(yíng)養(yǎng)所必需的，也就是說(shuō)，如果在一種不含有豆科宿主提取物或含有變性的豆科宿主提取物(例如在加入豆科植物提取物后對(duì)該介質(zhì)高壓滅菌使該提取物變性)的營(yíng)養(yǎng)介質(zhì)中培養(yǎng)一種根瘤菌，則仍會(huì)形成菌落，但是每個(gè)根瘤菌種的菌落在顏色上各不相同。下面的表Ⅰ列入了各個(gè)根瘤菌種形成的特征菌落的顏色，它們是在含有與劃線接種在平板上的各個(gè)菌種的豆科植物宿主共生體提取物的營(yíng)養(yǎng)介質(zhì)上培養(yǎng)的。應(yīng)該指出，本發(fā)明這些例子中所用的介質(zhì)在溫度32℃以上進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，在介質(zhì)上生長(zhǎng)的一切根瘤菌落都形成紅色菌落;這是一種可逆的顏色變化，因?yàn)楫?dāng)溫度降低時(shí)，例如到18°-30℃之間的某個(gè)溫度時(shí)每個(gè)菌落都將變回其特征顏色。此外該營(yíng)養(yǎng)介質(zhì)可以通過(guò)加入半胱氨酸和苯丙氨酸加以改變，以產(chǎn)生具有對(duì)這些菌種特定顏色的不同色調(diào)的菌落。
表Ⅰ在含有專一配對(duì)豆科宿主提取物的營(yíng)養(yǎng)介質(zhì)中培養(yǎng)的不同根瘤菌種的菌落顏色＊根瘤菌 豆科植物宿主共生體 菌落顏色豇豆根瘤菌 豇豆屬(花生，含羞草屬M(fèi)imosa， 棕灰色(R·Cowpea) (Vigna)金合歡屬Acacia，銀合歡屬Leucaena)R·japohicum 大豆屬(黃豆) 桔紅色(Glycin)豆科根瘤菌 山黧豆屬(豌豆) 金黃色(R·leguminosarum)(Lathyrus)羽扇豆根瘤菌 羽扇豆屬(白羽扇豆) 淡黃色(R·lupini) (Lupinus)草木犀根瘤菌 草木犀屬(甜三葉草) 棕黃色(R·meliloti) (Melilotus)菜豆根瘤菌 菜豆屬(菜豆) 深棕色(R·Phaseoli) (Phaseolus)三葉草根瘤菌 三葉草屬(三葉草) 淡棕色(R·trifoli) (Trifolium)
＊在32℃以下的溫度(即18℃-30℃之間)，在第6.1節(jié)中要詳述的營(yíng)養(yǎng)介質(zhì)中培養(yǎng)的菌落。
營(yíng)養(yǎng)介質(zhì)中的豆科植物提取物可以從豆科宿主植物的任何部分產(chǎn)生，包括但不限于苗、莖、根或種子;幼苗的提取物似乎產(chǎn)生最快的顏色反應(yīng)。豆科植物提取物可以如下制備，先把植物部分粉碎成細(xì)顆粒，將這些粉碎物在含有pH約7.2的緩沖液的乙醇中勻漿，通過(guò)離心使不溶物質(zhì)沉淀，上清液可用蒸餾水透析，直到再次離心時(shí)很清徹為止。為了使植物物質(zhì)的分解降至最低，整個(gè)過(guò)程在4℃下進(jìn)行。
可以按照Allen等人改進(jìn)的方法(Allen等人，1973，Biochem.J.131∶155-162;Allen等人，1975，F(xiàn)EBS Letters 50(3)∶362-364;Gordon等，1972，F(xiàn)EBS Letters 24(2)∶193-196;Peomans等人，1982，Planta.156∶568-572;Trowbridge，1974，J.Biol.Chem.249∶6004-6012)用層析法分離這種豆科植物提取物。簡(jiǎn)要地說(shuō)，用一個(gè)半乳糖衍生的CH-瓊脂糖凝膠(Sepharose)4B(瑞典 Pharmacia公司)和DEAE-52(Whatman公司)柱對(duì)該提取物如下述進(jìn)行層析分離(a)首先將提取物加到半乳糖衍生的CH-Sepharose 4B柱上，去除不結(jié)合的物質(zhì)，并通過(guò)用緩沖液洗脫進(jìn)行收集，按5ml組分收集，并用分光光度法測(cè)定280nm波長(zhǎng)處的光吸收;繼續(xù)洗脫直到洗脫液中測(cè)不到吸收值為止。合并在280nm處顯示出吸收值的組分留作在DEAE-52上進(jìn)行層析。那些與半乳糖衍生的Sepharose 4B柱床結(jié)合的物質(zhì)通過(guò)在柱上加入4%的葡萄糖而洗脫;洗脫液按5ml組分收集，也通過(guò)在280nm處的吸收進(jìn)行分析;(b)將含有不與半乳糖衍生的Sepharose 4B結(jié)合的組分加到DEAE-52柱上，它先在pH7.2下然后在pH9.2下被洗脫，按5ml收集組分進(jìn)行280nm處的光吸收檢測(cè)。合并在pH7.2下含有吸收峰值的組分，并將在pH9.2下含有吸收峰值的組分也合并。一個(gè)特定豆科宿主的這三種組分(即用葡萄糖洗脫的組分和在pH7.2及pH9.2下洗脫的組分)可以合并起來(lái)，并可用來(lái)代替上述營(yíng)養(yǎng)介質(zhì)中的完整提取物。事實(shí)上，這三種組分中的有效成分可以結(jié)晶保存。這些由豆科宿主得到的晶體可以用來(lái)代替豆科宿主提取物而作為用于鑒別本發(fā)明根瘤菌轉(zhuǎn)化株的營(yíng)養(yǎng)介質(zhì)的一個(gè)成分。
雖然，我們并不限于任何一種理論或?qū)Πl(fā)明的解釋，但是層析組分可能含有蛋白質(zhì)，也可能含有糖蛋白。對(duì)衍生的Sepharose 4B的親和性表明該蛋白質(zhì)中有可能至少有一個(gè)是外源凝集素。這一點(diǎn)可能是很有意義的，因?yàn)槎箍浦参锏耐庠茨乇徽J(rèn)為在根瘤菌共生體的最初識(shí)別中是重要的。一旦這些蛋白質(zhì)的氨基酸序列被確定，這些蛋白質(zhì)就能夠通過(guò)化學(xué)合成方法或者DNA重組技術(shù)、利用原核細(xì)胞或真核細(xì)胞的宿主載體表達(dá)系統(tǒng)來(lái)表達(dá)這些蛋白質(zhì)而制備。最好是在真核細(xì)胞宿主載體表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)蛋白質(zhì)，因?yàn)檎婧思?xì)胞可以以更相似于天然蛋白的方式得到該蛋白質(zhì)，這在蛋白質(zhì)是外源凝集素時(shí)尤為重要。此外，這些被識(shí)別的蛋白質(zhì)，可以從與豆科宿主不同的來(lái)源中分離出來(lái)。按照這種理論，我們并不排除這種可能性，即在提取物中存在的象碳水化合物、生物堿、激素等這樣的其它因子可能是該提取物具有活性的一個(gè)重要因素。
雖然前面所述的營(yíng)養(yǎng)介質(zhì)對(duì)鑒定本發(fā)明轉(zhuǎn)化株提供了一個(gè)方便的檢測(cè)方法，但是，還是對(duì)轉(zhuǎn)化株DNA的特征作了初步鑒定。本發(fā)明的在非豆科植物中共生固氮的根瘤菌轉(zhuǎn)化株似乎具有其結(jié)合轉(zhuǎn)化株的親代根瘤菌中不包含的質(zhì)粒。雖然我們并不限于任何一種理論或?qū)Πl(fā)明的解釋，但是注意到這些質(zhì)?？赡馨瑢?duì)這些根瘤菌轉(zhuǎn)化株的新宿主范圍起作用的DNA序列是有意義的。
產(chǎn)生本發(fā)明根瘤菌轉(zhuǎn)化株的方法將在下面詳細(xì)討論。
5.1.2.產(chǎn)生根瘤菌轉(zhuǎn)化株的交錯(cuò)劃線培養(yǎng)法產(chǎn)生本發(fā)明根瘤菌轉(zhuǎn)化株的交錯(cuò)劃線培養(yǎng)法包括以下步驟，將兩種不同的根瘤菌菌種(親代)以交錯(cuò)劃線方式接種到一個(gè)固體培養(yǎng)基上，該介質(zhì)除了含有細(xì)菌生長(zhǎng)必需的養(yǎng)分外，還含有無(wú)論是(a)每個(gè)根瘤菌菌種豆科宿主共生體的未變性提取物的混合物;(b)如上面5.1.1節(jié)所述的由每個(gè)豆科宿主提取物得到的三種層析組分;(c)由每個(gè)豆科宿主層析組分得到的晶體;或(d)與其相關(guān)的蛋白質(zhì)(包括糖蛋白)。以后將稱這些成分為豆科植物提取物、層析組分、晶體或蛋白質(zhì)。每個(gè)親代根瘤菌菌種將形成一些沿劃線具有特征顏色的菌落。在親代菌落的交替行之間產(chǎn)生了根瘤菌的轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)合體(這里稱為根瘤菌F1轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)合體)。根瘤菌F1轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)合體與其親代不同，形成乳白色菌落，并且不能使任何植物形成根瘤。
從乳白色菌落中分離出根瘤菌F1轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)合體，并與一個(gè)第三親代根瘤菌以交替行方式在固體培養(yǎng)介質(zhì)上培養(yǎng)，該介質(zhì)除了含有用于產(chǎn)生F1轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)合體所用的豆科提取物、層析組分、晶體或蛋白質(zhì)外，還含有由該第三親代根瘤菌的豆科宿主共生體得到的第三種未變性豆科提取物、層析組分、晶體或蛋白質(zhì)。在根瘤菌F1轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)合體形成的乳白色菌落和第三親代根瘤菌形成的有色菌落的交錯(cuò)行之間產(chǎn)生根瘤菌F2轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)合體。通過(guò)它們雪白的顏色鑒別出這種根瘤菌F2轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)合體，它們能夠侵入到經(jīng)本文所述那樣處理和播種生長(zhǎng)的非豆科植物中，并能形成根瘤和固氮。
由于采用了專門化的介質(zhì)，就可能鑒別和挑選上面產(chǎn)生的根瘤菌F1和F2轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)合體。在進(jìn)行每一種交叉時(shí)，在配對(duì)的各行之間出現(xiàn)兩種類型的菌落(a)含有其親代菌落混合顏色的一個(gè)有色菌落和(b)乳白色的F1轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)合體或雪白色的F2轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)合體。這種混合顏色的菌落含有不穩(wěn)定的根瘤菌;這些根瘤菌只有第一代能夠在它兩個(gè)親代根瘤菌的豆科宿主共生體中形成根瘤。換句話說(shuō)，由每個(gè)豆科宿主的根瘤中回收的細(xì)菌只能再次使該特定的豆科宿主形成根瘤。乳白色菌落的F1轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)合體是穩(wěn)定的，但不能使任何植物形成根瘤。令人驚異的是雪白色菌落的F2轉(zhuǎn)化株竟是能使非豆科植物形成根瘤和共生固氮的穩(wěn)定根瘤菌。
用來(lái)產(chǎn)生F2轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)合體的親代根瘤菌可以是根瘤菌的一個(gè)第三菌種。另一個(gè)F1轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)合體或者也可以是另一個(gè)F2轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)合體。如果該第三親代含有另一個(gè)F1轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)合體，那么其營(yíng)養(yǎng)介質(zhì)至少要含有四種豆科提取物、層析組分、晶體或蛋白質(zhì);即用于產(chǎn)生兩個(gè)F1轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)合體的二個(gè)親代根瘤菌的每個(gè)豆科宿主共生體的那些提取物、層析組分、晶體或蛋白質(zhì)。如果該第三親代包括了一個(gè)F2轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)合體，那么其營(yíng)養(yǎng)介質(zhì)要至少含有五種宿主豆科的提取物、層析組分、晶體或蛋白質(zhì);即用于產(chǎn)生F1轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)合體的兩個(gè)親代根瘤菌每一個(gè)的豆科宿主共生體以及用于產(chǎn)生F2轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)合體的三個(gè)親代根瘤菌每個(gè)的豆科宿主共生體的那些提取物、層析組分、晶體或蛋白質(zhì)。
親代菌落的交錯(cuò)劃線法是產(chǎn)生這種轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)合體的一個(gè)方便的方法;但是，任何形式的接種或接種方法都可用來(lái)在彼此靠近的地方培養(yǎng)親代菌落，結(jié)果就能出現(xiàn)結(jié)合作用。可以采用圓、橢圓、波浪或螺旋圖形。事實(shí)上，一些不同的親代可以用劃線接種到培養(yǎng)板上，以在同一板上產(chǎn)生一些不同的轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)合體。
5.1.3.產(chǎn)生根瘤菌轉(zhuǎn)化株的另一些方法雖然交錯(cuò)劃線培養(yǎng)法是產(chǎn)生根瘤菌F2轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)合體的一個(gè)方便的方法，但是本發(fā)明并不限于這種方法。事實(shí)上除了結(jié)合之外，用對(duì)增大根瘤菌的宿主范圍專一性起作用的適當(dāng)質(zhì)粒進(jìn)行轉(zhuǎn)化也考慮在本發(fā)明的范圍之內(nèi)，此外，DNA重組技術(shù)、包括利用適當(dāng)序列進(jìn)行根瘤菌感染的噬菌體和其它載體也考慮在本發(fā)明的范圍中。
例如，根瘤菌的一個(gè)特別有用的系統(tǒng)是能用于轉(zhuǎn)化根瘤菌的Tn5轉(zhuǎn)座子。共生質(zhì)粒可以通過(guò)用一個(gè)含有nif基因的標(biāo)記DNA探針的雜交作用來(lái)鑒別。這種共生質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移可以通過(guò)以下方式實(shí)現(xiàn)(a)通過(guò)利用Tn5將一個(gè)標(biāo)志基因結(jié)合到該共生質(zhì)粒中去，例如一個(gè)對(duì)抗菌素有抗性的基因可以利用轉(zhuǎn)座子Tn5通過(guò)一個(gè)結(jié)合供體和受體細(xì)菌被結(jié)合到該共生質(zhì)粒中，并根據(jù)所要求的抗性來(lái)選擇雜交體;(b)通過(guò)在大腸桿菌中對(duì)該共生質(zhì)?；蚱涞鞍走M(jìn)行克隆并用該質(zhì)粒本身轉(zhuǎn)化根瘤菌;(c)通過(guò)重組具有例如象Pvw5jl或Tn5-Mob這樣的與標(biāo)志基因(例如抗菌素的抗性)一起的轉(zhuǎn)移基因的質(zhì)粒;以及(d)通過(guò)將包含有具有其被結(jié)合的標(biāo)志基因的質(zhì)粒與該受體細(xì)菌，同時(shí)與一個(gè)促進(jìn)轉(zhuǎn)移的輔助細(xì)菌雜交。
5.2 非豆科植物種子的包膜及包膜的種子為了在本發(fā)明的根瘤菌轉(zhuǎn)化株之間實(shí)現(xiàn)共生現(xiàn)象，非豆科種子應(yīng)當(dāng)用一種專一于該根瘤菌轉(zhuǎn)化株的物質(zhì)處理或包膜。這些包膜物質(zhì)可以包括或不包括該根瘤菌轉(zhuǎn)化株本身。在包膜物質(zhì)中有無(wú)根瘤菌轉(zhuǎn)化株只是影響到后來(lái)實(shí)現(xiàn)在該生長(zhǎng)植物中共生所采用的方法。
5.1.2 非豆科植物種子的包膜包膜物質(zhì)包括但不限于其中含有或不含有根瘤菌轉(zhuǎn)化株的以下物質(zhì)(a)由根瘤菌轉(zhuǎn)化株每個(gè)親代共生體的豆科宿主植物得到的提取物的混合物;(b)由轉(zhuǎn)化株的每個(gè)親代根瘤菌共生體的豆科宿主植物得到的層析組分;(c)由豆科提取物和/或?qū)游鼋M分得到的晶體或(d)與其相關(guān)的蛋白質(zhì)。如前面解釋過(guò)的那樣，這些蛋白質(zhì)可以由化學(xué)合成方法、DNA重組技術(shù)或一些另外的來(lái)源分離產(chǎn)生。
雖然我們不限于任何一種理論或?qū)Πl(fā)明的解釋，前面所述的這些包膜物質(zhì)可以包含一些對(duì)非豆科植物與根瘤菌轉(zhuǎn)化株之間實(shí)現(xiàn)共生現(xiàn)象是重要因子中的任何一個(gè)，包括但不限于外源凝集素、黃酮等。
根瘤菌(Rhizobium)的根瘤基因與正常根毛的卷曲有關(guān)，并因此與共生體/宿主的識(shí)別和根瘤形成有關(guān)，最近有報(bào)道指出，豆科植物根部的滲出物可誘導(dǎo)此基因的表達(dá)(Rossen等，1985，EMBO4(13A)∶3369-3373)。更最近有報(bào)道指出，一組由豆科植物根部分泌的稱為黃酮的物質(zhì)可誘導(dǎo)根瘤菌中形成根瘤的基因的表達(dá)(見Redmond等，1986，Nature 323∶632-635)。黃酮通常是由各種植株的花和葉產(chǎn)生，已知只有豆科植物在根部能分泌或含有黃酮。根據(jù)Redmond等人的報(bào)道，豌豆、菜豆、大豆、苜蓿和三葉草等根部分分泌物中的某種黃酮能誘導(dǎo)三葉草根瘤菌(R·trifoli)的nod A基因的表達(dá)，而非豆科植物玉米、水稻和Parasponia的根部分泌物不能。從共生的觀點(diǎn)看來(lái)，根瘤菌的刺激不是豆科植物宿主專一性的，即所誘導(dǎo)出的根瘤菌中nod A的表達(dá)是對(duì)于若干種不同豆科植物分泌物的反應(yīng)。因此，黃酮可能是根瘤菌與豆科植物之間的早期信號(hào)之一，在那之后發(fā)生宿主專一性更高的第二步識(shí)別(如外源凝集素-多糖的識(shí)別系統(tǒng))，從而建立特異的宿主-共生體聯(lián)合。黃酮誘導(dǎo)系統(tǒng)可能是一個(gè)早期現(xiàn)象，它使得用豆科植物提取物處理的非豆科植物種子能夠接受本發(fā)明F2根瘤菌轉(zhuǎn)化體的感染。存在于豆科植物提取物中的黃酮也許在吸脹或預(yù)萌發(fā)期間由非豆科植物種子所吸收，然后轉(zhuǎn)移到幼苗的根部，這樣在分泌時(shí)便可吸引根瘤菌轉(zhuǎn)化體。
本發(fā)明種子包膜包含的豆科植物提取物中的其它因子，在非豆科植物宿主F2轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)合體的建立中也許是很重要的。例如，種子包膜中可能含有外源凝集素，它被認(rèn)為與根瘤菌及其豆科植物宿主間的專一性識(shí)別反應(yīng)有關(guān)。最近有一份報(bào)告描述了一種粒狀外源凝集素三葉草素A(Trifolin A)，它可從三葉草根部的分泌物中分離出來(lái)，它專一性地與三葉草根瘤菌相結(jié)合(Truchet等，1986，Physiol·Plant 66∶575-582)。有趣的是，含有外源凝集素的豆科植物根部分泌物能使根瘤菌突變體恢復(fù)識(shí)別其豆科植物宿主并形成根瘤的能力(見Halverson等人，1984，Plant Physiol·74∶84-89及1985，Plant Physiol·77∶621-625)。在本發(fā)明的種子包膜中，很有可能存在著一種或更多的外源凝集素，它可使根瘤菌轉(zhuǎn)化體及其非豆科植物共生體之間發(fā)生專一性識(shí)別。
5.2.2.包膜非豆科植物種子的方法非豆科植物種子可通過(guò)多種方法進(jìn)行包膜，這些方法包括但不限于浸漬及空氣干燥、噴灑、包封(如在聚合體中)、浸漬及在鼓形容器中干燥等。所選方法根據(jù)所用包膜而定。例如，如果根瘤菌轉(zhuǎn)化體是包含在包膜混合物中，所用方法和成分應(yīng)當(dāng)保證細(xì)菌的成活性;這些混合物包括，但不限于含有凝膠以維持較高溫度的包膜混合物;另外，可用含有殺菌劑的碾成粉末的種皮包裹種子。在任何一種方法中，都應(yīng)當(dāng)保證包膜中的活性物質(zhì)不變性或不受到破壞。
在本發(fā)明的實(shí)例中，通過(guò)在豆科植物提取物中浸漬及空氣干燥對(duì)非豆科植物種子進(jìn)行包膜，最好是進(jìn)行三次。兩次浸漬使根瘤菌轉(zhuǎn)化體的穿透性很低，而四次浸漬似乎並不能改善穿透性。
5.3.在非豆科植物中建立共生固氮可用若干方法保證根瘤菌轉(zhuǎn)化體對(duì)非豆科植物的感染;所選擇的方法一部分根據(jù)所用非豆科植物種子包膜的性質(zhì)而定。
例如，用上述包膜處理過(guò)但不含根瘤菌轉(zhuǎn)化體的非豆科植物種子，可用根瘤菌轉(zhuǎn)化體的懸浮液澆灌。種子、幼苗或植株也可象這樣用一定體積的細(xì)菌懸浮液澆灌。如果種子包膜中含有根瘤菌轉(zhuǎn)化體，則只需要種植和澆水就可以了。
根據(jù)植物種類、土壤或環(huán)境條件等，最好是加入不含氮素的肥料。實(shí)際上，我們?cè)趯?shí)驗(yàn)室的試驗(yàn)中已發(fā)現(xiàn)，在播種初期加入2mM氮素已足以提高植株的初始生長(zhǎng)而不傷害或“關(guān)掉”根瘤菌轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)合體。這樣就更貼切地模仿了自然條件，因?yàn)樵诖蠖鄶?shù)土壤中(即使是沒(méi)有施肥的)含有一定數(shù)量的氮素(不多于2mM)，不需要向土壤中加入氮素。
5.4.形成根瘤的非豆科植物通過(guò)本發(fā)明的根瘤菌轉(zhuǎn)化體形成根瘤的非豆科植物含有一定的氮素，其干物質(zhì)的含量等于或大于沒(méi)有根瘤但施過(guò)氮肥的相應(yīng)植株，有根瘤植株的氮素和干物質(zhì)含量高于沒(méi)有根瘤也沒(méi)有施過(guò)氮肥的相應(yīng)植株。有根瘤植株的氨基酸組成的分析表明，在大多數(shù)情況中，每種氨基酸的比例不變，但每個(gè)植株的總濃度有所上升。而在某些情況下，觀察到了較高水平的色氨酸和亮氨酸。
有趣的是，我們發(fā)現(xiàn)在某些種的有根瘤非豆科植株收獲后的秸桿殘留物中，一致地含有大約6%至大約9%的蛋白;這與通常在其無(wú)根瘤的相應(yīng)植株中發(fā)現(xiàn)的1.5%至2%的蛋白含量相比是一個(gè)鮮明的對(duì)照。這種高蛋白秸桿可有利地作為蛋白質(zhì)源使用，例如，用于農(nóng)業(yè)或家養(yǎng)動(dòng)物的飼料混合物中。
本發(fā)明的能在非豆科植物中形成根瘤并固氮的根瘤菌轉(zhuǎn)化體，能夠減少使用費(fèi)用昂貴的氮肥并最終能夠改善土壤。
5.4.1.根瘤的特點(diǎn)通過(guò)本發(fā)明根瘤菌轉(zhuǎn)化體形成的非豆科植物根瘤的形態(tài)在外觀上是相當(dāng)正常的，然而，所形成的小根瘤較多。根瘤菌似乎是通過(guò)侵入線進(jìn)入根部的，而類菌體似乎是保留在間隔中。實(shí)際上，在根瘤中觀察到了一種帶紅色的顏色，它可能是豆血紅蛋白或與其密切相關(guān)的一種蛋白。根瘤的電子顯微照片表明，皮層中的維管束成圓周狀排列，而側(cè)根中的維管束位于中央。根瘤中心部分的大多數(shù)細(xì)胞充滿了類菌體。
6.實(shí)例產(chǎn)生根瘤菌轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)合體及使非豆科植物形成根瘤的材料和方法下述實(shí)例描述了利用本發(fā)明根瘤菌轉(zhuǎn)化體在下列屬于禾本科的非豆科植物中形成根瘤的方法小麥、大麥、高梁和水稻。此外，不屬于禾本科的蕓苔屬中的一員(屬于十字花科)也通過(guò)本發(fā)明根瘤菌轉(zhuǎn)化體使之形成了根瘤。有趣的是，在禾本科之外的另一種植物上也觀察到了正效應(yīng)，即桉屬(Eucalyptus)(它是桃金娘科中的一員)在每個(gè)實(shí)例中，都使用交錯(cuò)劃線培養(yǎng)法產(chǎn)生根瘤菌轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)合體。使非豆科植物的種子在豆科植物的提取液中浸漬，從而在非豆科植物的種子上形成一層包膜，用來(lái)制備上述提取液的豆科植物是專一于用于使非豆科植物形成根瘤的特異根瘤菌轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)合體的。通過(guò)播種包膜種子，使它們萌發(fā)并用根瘤菌轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)合體的懸浮液澆灌籽苗，從而使非豆科植物的包膜種子感染上根瘤菌轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)合體;在8-12星期內(nèi)發(fā)育出固氮根瘤。
在實(shí)例中進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)室研究，將非豆科植物分成三組并如下述進(jìn)行處理(a)第一組用根瘤菌轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)合體處理而不施加氮肥(+R-N);(b)第二組用氮肥處理而不用根瘤菌轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)合體(-R+N);(c)第三組既不用根瘤菌轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)合體也不用氮肥處理(-R-N)。在生長(zhǎng)的一定階段，從植株上取樣，測(cè)定每個(gè)植株有機(jī)氮的總含量、每個(gè)植株的干物質(zhì)量、在某些實(shí)驗(yàn)中還測(cè)定每個(gè)植株的蛋白含量及其氨基酸組成。在某些實(shí)例中還進(jìn)行了大田研究。結(jié)果表明，每一種通過(guò)根瘤菌轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)合體形成根瘤的非豆科植物的植株都能夠固氮，在生長(zhǎng)中不需要氮肥。實(shí)際上，在許多例子中，有根瘤的非豆科植物(+R-N)比之施肥的無(wú)根瘤組(-R+N)或未處理組(-R-N)，氮含量和干物質(zhì)含量都要高。
除非特別指出，下述材料和方法用于后面的每個(gè)實(shí)例中。
6.1.交錯(cuò)劃線培養(yǎng)法后面的每個(gè)實(shí)例中所用的交錯(cuò)劃線培養(yǎng)法包括如下步驟在瓊脂營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基上，以交錯(cuò)線條(相距3mm)劃線培養(yǎng)兩種不同的根瘤菌(親代)，該培養(yǎng)基中除了生長(zhǎng)必要的養(yǎng)分外，還含有專一于各種親代根瘤菌的各種豆科植物宿主的未變性的提取物。在低于32℃的生長(zhǎng)溫度下如18℃和30℃之間保溫后，各種親代根瘤菌形成了具有該種特征顏色的菌落;在有色的親代菌落的交錯(cuò)線條之間，產(chǎn)生了根瘤菌轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)合體(F1轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)合體)。根瘤菌的F1轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)合體與其親代不同，它形成乳白色菌落而且不能使植物形成根瘤。應(yīng)當(dāng)注意，在32℃以上的溫度在此處所用的瓊脂培養(yǎng)基上保溫，導(dǎo)致在平板上劃線的所有根瘤菌種都形成紅色菌落，但如果溫度降到32℃以下(如最好是在18℃至30℃之間)，則將會(huì)出現(xiàn)各種菌落的具有特征的顏色。
從乳白色菌落中分離出根瘤菌的F1轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)合體，如上述與第三種根瘤菌親代在瓊脂營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基上進(jìn)行交錯(cuò)劃線培養(yǎng)(相距3mm)，該培養(yǎng)基中除了用于產(chǎn)生乳白色菌落的豆科植物的未變性的提取物外，還含有第三種豆科植物的未變性的提取物，它來(lái)自對(duì)第三種親代根瘤菌具有專一性的豆科植物宿主。在根瘤菌的F1轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)合體的乳白色菌落和第三親代根瘤菌形成的有色菌落的交錯(cuò)線條之間，產(chǎn)生了根瘤菌的F2轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)合體。根瘤菌的F2轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)合體菌落可通過(guò)其雪白色加以鑒別這些F2轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)合體在對(duì)非豆科植物進(jìn)行前述的處理和種植后，能夠使它們感染，形成根瘤并能夠固氮。下面更詳細(xì)地描述了用于產(chǎn)生根瘤菌轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)合體的材料和方法。
6.1.1.親代根瘤菌的分離用作親代的根瘤菌種從土壤樣品中分離得到，或從已發(fā)育到高級(jí)階段的豆科植物根瘤中分離得到。
從土壤中分離親代根瘤菌，是通過(guò)將由該根瘤菌形成根瘤的宿主豆科植物的種子置入土壤樣品中而達(dá)到的。通常情況在3-4星期后收獲植株，如生長(zhǎng)緩慢則在10-12星期后收獲。
從豆科植物根瘤中分離親代根瘤菌的方法如下從豆科植物的根部切下根瘤，并連帶著切下大約1cm的圍繞該根瘤的根部組織，通過(guò)浸入3%HgCl2中進(jìn)行滅菌處理，然后在80%乙醇中洗滌。將根瘤從根部組織上分離下來(lái)，在無(wú)菌條件下在研缽中研碎。將研碎的材料鋪在下述的瓊脂營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基上。通過(guò)在同樣組成的培養(yǎng)基上再培養(yǎng)以純化菌落，直到形成兩次單菌落為止。將從純化的單菌落上分離的根瘤菌在所述瓊脂營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基上進(jìn)行交錯(cuò)劃線培養(yǎng)，以培養(yǎng)出親代根瘤菌菌落的交錯(cuò)線條。
6.1.2.瓊脂營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基用于以交錯(cuò)線條培養(yǎng)根瘤菌的瓊脂培養(yǎng)基，是通過(guò)將下列養(yǎng)分以所指出的數(shù)量加到100ml蒸餾水中制備而成的KH2PO40.15gK2HPO40.15gKNO32.50g(NH4)2SO40.135gMgSO4·7H2O 0.25g甘露醇 10.00g瓊脂 12.00g溶液1 1.00ml酵母提取物 5.00ml溶液1的組成如下MnCl2·4H2O 500mg
H3BO3300mgZnSO4·2H2O 200mgNaMoO4·2H2O 20mgCuSO4·5H2O 2mgCoCl2·6H2O 2mg蒸餾水加至最終體積為100ml然后將上述定義的瓊脂培養(yǎng)基在2巴下高壓滅菌20分鐘，冷卻至55℃至60℃之間的溫度，再加入下列物質(zhì)溶液2、溶液3和溶液4各1.0ml;從對(duì)于各種待培養(yǎng)的親代根瘤菌具有專一性的宿主豆科植物中產(chǎn)生的未變性的豆科植物提取物各20ml;下列氨基酸各15mg;L-丙氨酸、L-絲氨酸和L-色氨酸。為避免豆科植物提取物中的蛋白變性，不應(yīng)當(dāng)對(duì)最終的培養(yǎng)基組合物進(jìn)行高壓蒸汽滅菌。
溶液2、溶液3和溶液4的組成如下所示。都是用無(wú)菌蒸餾水制備的。
溶液2煙酸 50mgHCl硫胺素 50mgHCl吡哆醇 50mg肌醇 50mg生物素 50mg加入無(wú)菌蒸餾水至最終體積100ml溶液3碘化鉀 75mg
無(wú)菌蒸餾水 100ml溶液4CaCl2·H2O 15mg無(wú)菌蒸餾水 100ml6.1.3.豆科植物提取物用于瓊脂培養(yǎng)基及包膜非豆科植物種子的豆科植物提取物如下述制備。
將整個(gè)植株或所選擇的部分植株如洗凈的根部、滅菌的種子或氣生部分、或者最好是幼莖破碎成細(xì)小的顆粒，用80%乙醇在研缽中研磨成稀勻漿，在其中加入等體積的鉀-鈉鹽緩沖液，pH7.2，該緩沖液組成如下K2HPO40.430gNaH2PO41.469gNaCl 7.200g加入無(wú)菌蒸餾水至最終體積為1000ml將植物提取液勻漿和緩沖液的混合物在4℃下靜置48小時(shí)后，以大約5000xg離心30分鐘使其沉淀。然后，使上清液在4℃下在無(wú)菌蒸餾水中透析48小時(shí)，其間換水5至6次，直至得到澄清無(wú)色的提取液。將提取液保存在4℃下。
6.1.4.根瘤菌轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)合體的分離將兩種親代根瘤菌在32℃以下的溫度以交錯(cuò)線條(相距3mm)在含有上述合適的豆科植物提取物的瓊脂培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)，親代根瘤菌形成具有各自特征顏色的菌落。而在有顏色的親代菌落線條之間產(chǎn)生了兩種菌落(a)具有親代菌落的混合顏色的菌落和(b)根瘤菌的F1轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)合體的乳白色菌落。有色菌落和F1轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)合體的乳白色菌落之間的比例多少有些變化，但平均范圍為大約100∶3(混合色菌落∶乳白色菌落)?；旌项伾淇梢愿腥緝煞N宿主豆科植物，但只是一代有效;即混合色菌落的根瘤菌可使兩種親代根瘤菌的豆科植物宿主共生體形成根瘤，但從各種豆科植物宿主的根瘤中回收的根瘤菌只能使那一種特異的豆科植物宿主再次形成根瘤。與之相反，F(xiàn)1轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)合體的乳白色菌落不能感染任何一種植株。
由于很難將單個(gè)雜交菌落轉(zhuǎn)移到新的培養(yǎng)基上而不沾染上一個(gè)或更多的有色菌落的污染，因此，通過(guò)將乳白色菌落轉(zhuǎn)移至另一個(gè)瓊脂培養(yǎng)基上(組成相同)而進(jìn)行一次或多次的生物清除，一般大約在10至12星期后，直至得到了具有穩(wěn)定而均一的乳白色的F1轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)合體的純培養(yǎng)物。
然后，將形成乳白色菌落的F1轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)合體的純培養(yǎng)物，以交錯(cuò)劃線的方式(相距3mm)與另一種根瘤菌在低于32℃的溫度下在與用于F1轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)合體組成相同的瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)，但該培養(yǎng)基中還另外含有第三種豆科植物提取物，它來(lái)自對(duì)第三種親代根瘤菌具有專一性的豆科植物宿主。F1轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)合體產(chǎn)生具有其乳白色特征的菌落，而親代根瘤菌產(chǎn)生具有其特征顏色的菌落。在乳白色菌落和有色菌落的線條之間產(chǎn)生了兩種菌落有色菌落和雪白色菌落。雪白色菌落中含有根瘤菌的F2轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)合體，它能在非豆科植物上形成固氮根瘤。用乳白色菌落的清除和分離中所用方法同樣處理F2轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)合體的雪白色菌落，并用于感染非豆科植物。
在非豆科植物中形成根瘤后，可從根瘤中分離得到根瘤菌的F2轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)合體的類菌體并在瓊脂培養(yǎng)基中培養(yǎng)。如果瓊脂培養(yǎng)基具有與用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)合體的瓊脂培養(yǎng)基的同樣組分(即含有來(lái)自專一于用于產(chǎn)生F2轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)合體的各種親代根瘤菌豆科植物宿主的三種豆科植物提取物)，并加有一種其非豆科植物宿主的提取物，則從非豆科植物的根瘤中分離得到的F2轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)合體將形成一種灰色菌落。
6.2 非豆科植物種子的制備將非豆科植物種子在20℃下在含有3%的硫酸鈣和低於10%的三種豆科植物提取物的混合物的水溶液中浸漬三次，每次三小時(shí)，使之包膜，該豆科植物提取物的制備如6.13部分所述。該提取物是用來(lái)生產(chǎn)根瘤菌F2轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)合體，在每次浸漬后，將種子在40℃下空氣干燥12小時(shí)。
6.3 用根瘤菌F2轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)合體侵染非豆科植物用根瘤菌F2轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)合體侵染非豆科植物的作用是通過(guò)播種包膜的非豆科植物種子並用根瘤菌F2轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)合體澆灌發(fā)芽的籽苗來(lái)完成的，在下面的實(shí)例中描述了實(shí)驗(yàn)室研究及大田研究情況，其中，發(fā)芽的籽苗用以下三者之一的方法處理(a)用根瘤菌F2轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)合體處理而不加無(wú)機(jī)氮肥(+R-N)，(b)施加無(wú)機(jī)氮肥而不用根瘤菌F2轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)合體處理(-R+N)，(c)既不用根瘤菌F2轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)合體，也不用無(wú)機(jī)氮肥(-R-N)處理。在最后的植物中測(cè)定了每株植物的氮含量。干物重量，而且有時(shí)也測(cè)定其氨基酸組成。
所用的材料和方法具體描述如下6.3.1 實(shí)驗(yàn)室研究在實(shí)驗(yàn)室研究中，將包膜的非豆科植物種子播種在一升填有3毫米的“Fibo”(R)一燒結(jié)塊的容器(Jydsk Papir Vaerk，Arhus)中，每個(gè)容器中播種4-5個(gè)種子?！癋ibo”燒結(jié)塊就是直徑約3毫米，充有空氣的、煅燒過(guò)的粘土礫石，一般是用作絕熱材料。
當(dāng)發(fā)芽的種子在“Fibo”一燒結(jié)塊表面上長(zhǎng)出幾厘米時(shí)，按下述灌燒每只容器中的籽苗(a)+R-N組，澆入50毫升根瘤菌F2轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)合體的懸浮液，然后每星期在每只容器中對(duì)植物澆灌50-80毫升的無(wú)氮肥料溶液;(b)-R+N組，不用根瘤菌F2轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)合體處理而施加無(wú)機(jī)氮肥;以后每星期在每只容器中向植物澆灌50-80毫升的同樣的無(wú)機(jī)氮肥;(c)-R-N組，在每只容器中澆入50-80毫升的無(wú)氮肥料。所用的無(wú)機(jī)氮肥和無(wú)氮肥料規(guī)定如下肥料標(biāo)準(zhǔn)溶液的毫升數(shù)/升最后容積標(biāo)準(zhǔn)溶液 氮肥 無(wú)氮肥料NH4NO3(1.0M) 20 0CaSO4·2H2O(0.012M) 65 65KH2PO4(0.10M) 20 20MgSO4·7H2O (0.20M) 15 15Fe(EDTA)FeSO4·7H2O(2.490g) 10 10Na2EDTA(3.716g)最終容積為一升
(續(xù))標(biāo)準(zhǔn)溶液 氮肥 無(wú)氮肥料MnCl3·4H2O(106.1mg/l) 10 10H3BO3(142.2mg/l) 10 10ZnSO4·7H2O(110.7mg/l) 10 10CuSO4·5H2O(8.0mg/l) 10 10Na2MoO4·2H2O(11.1mg/l) 10 10用以澆灌籽苗的根瘤菌F2轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)合體懸浮液是通過(guò)在含有200毫升的下列營(yíng)養(yǎng)介質(zhì)的300毫升燒瓶中培養(yǎng)根瘤菌轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)合體制得的KH2PO41.0 gK2HPO41.0 gMgSO4·7H2O 0.36 gCaSO4·2H2O 0.17 gFeCl3·6H20.005 gKNO30.7 g酵母提取物 1.0 g甘露醇 3.0 g加入蒸餾水到最終體積為 1000 毫升細(xì)菌在28℃下生長(zhǎng)2-3天直到培養(yǎng)物中的細(xì)菌密度用分光光度計(jì)測(cè)量(620nm處的光吸收)已達(dá)到0.8。這就表明細(xì)菌已進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，培養(yǎng)過(guò)程還沒(méi)有達(dá)到穩(wěn)定，此后細(xì)胞在約5000×g的條件下離心30分鐘而沉淀。并在無(wú)菌水中再懸浮而洗滌，這樣的洗滌重復(fù)1-2次，以除去細(xì)菌細(xì)胞上全部含氮化合物。最后的細(xì)胞沉淀在1.8升無(wú)菌水中再懸浮。將最后的懸浮液用來(lái)澆灌非豆科植物籽苗。
6.3.2 大田研究在大田研究中，將包膜的非豆科植物種子播種在從未耕種過(guò)的土壤中。開墾土地，并分割成寬30英尺、長(zhǎng)90英尺的田塊，為了防止化學(xué)試劑從一塊地中泄漏而進(jìn)入并沾染另一塊地，種子相間地播入田中，(即在播種的田塊塊間留一塊未播種的田塊)。在田塊中，種子播成6行，每行相間60英寸，而在每行中種子相隔8英寸。
每一塊地中含有下列各組之一(a)+R-N組，用根瘤菌F2轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)合體處理，并用前面規(guī)定的無(wú)氮肥料澆灌，(b)-R+N組，不用根瘤菌F2轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)合體處理而用前面規(guī)定的無(wú)機(jī)氮肥澆灌;(c)-R-N組，既不用根瘤菌F2轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)合體也不用無(wú)機(jī)氮肥處理而施以無(wú)氮肥料。
以下的步驟是用根瘤菌F2轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)合體侵染+R-N組在每粒播種的種子下面4英寸處接種根瘤菌F2轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)合體培養(yǎng)物。播種和接種過(guò)程都可以由機(jī)器完成，該機(jī)器帶有一只裝有按上述大規(guī)模制備的根瘤菌F2轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)合體懸浮液的300加侖儲(chǔ)罐(即根瘤菌F2轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)合體在10000加侖罐中生長(zhǎng)到對(duì)數(shù)期時(shí)再稀釋到O.D.620為0.8)，大約在每粒種子下的土坯中接種1.5毫升的根瘤菌F2轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)合體培養(yǎng)物，然后種子和籽苗如前所述進(jìn)行澆灌。
6.4.非豆科植物的干物質(zhì)重量、氮含量以及蛋白質(zhì)含量的分析方法在實(shí)驗(yàn)室研究中定期地從每組植物的許多容器中取出植株，使每只容器只剩3株植物，將它們移出用凱氏定氮法分析而測(cè)定每只容器中(即3株植物)有機(jī)氮的總含量和干物質(zhì)重量。為此，將這些植物的氣生部分分離，在80℃溫度下干燥48小時(shí)，稱重、粉碎并在研缽中研磨，將研磨過(guò)的料樣按標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行凱氏定氮分析。每個(gè)分析要重復(fù)4-6次，根據(jù)每株植物的氮含量及干物質(zhì)量記錄結(jié)果。在每種情況下，由根瘤菌形成根瘤的植物的干物質(zhì)量及氮含量都比施加氮肥組或未處理組的要高。
在大田研究中，定期地收獲許多植物，用凱氏定氮法分析每株植物的氮含量，將氮含量的百分率乘以6.25因子而確定每株植物的蛋白質(zhì)量。在某些研究中，也測(cè)定了蛋白質(zhì)的氨基酸組成。在各種情況下，由根瘤菌形成根瘤的非豆科植物的蛋白質(zhì)量要比用無(wú)機(jī)氮肥處理和用無(wú)氮肥料處理的植物要高。
7.實(shí)例，使小麥形成根瘤的小麥根瘤菌(Rhizobium Tritici)使小麥生成根瘤的小麥根瘤菌是根據(jù)第6部分所述方法制備的，先用菜豆根瘤菌(R·Phaseoli)和豇豆銀合歡根瘤菌(R·Cowpea Leucaena)雜交，以生成F1轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)合體，然后再將它和三葉草根瘤菌(R·trifoli)雜交。用生成的小麥根瘤菌(R·tritoli)使四種小麥Anja、Kraka、Vuka和Williams生成根瘤。
7.1.小麥根瘤菌的制備為了制備小麥根瘤菌，要用下列親代根瘤菌來(lái)制備F1轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)合體乳白菌落(a)菜豆根瘤菌是由長(zhǎng)在Aarhus，MS-1附近發(fā)現(xiàn)的土樣中的菜豆裁培品種Prospector中分離得到，(b)豇豆銀合歡根瘤菌，是由新幾內(nèi)亞、巴布亞(Papua，New Guinea)熱帶樹銀合歡(Leucaena Leucocephala)〔屬於蝶形花科屬(Fabaceae)〕分離而得到。
親代根瘤菌是在前面所述的瓊脂培養(yǎng)基上交錯(cuò)培養(yǎng)，介質(zhì)中所用的豆科植物提取物是分別從菜豆的氣生部分和銀合歡(Leucaena Leucocephala)的葉子提取。由菜豆根瘤菌形成的菌落具有特征的深棕色，而由豇豆銀合歡根瘤菌所形成的菌落則有特征的棕灰色。
清洗由乳白菌落制得的根瘤菌F1轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)合體，并用三葉草根瘤菌(R·trifoli)按前面所述進(jìn)行交錯(cuò)劃線培養(yǎng)。該三葉草根瘤菌是由長(zhǎng)在Randers附近土壤中發(fā)現(xiàn)的紅三葉草(red Clover)中分離而得的。用在介質(zhì)中的豆科植物提取物可以由菜豆的氣生部分、銀合歡葉子和紅三葉草的氣生部分分離得到。由F1轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)合體形成的菌落有特征的乳白色，而由三葉草根瘤菌形成的菌落則有特征的淺棕色。
由在劃線中間得到的雪白菌落所制得的根瘤菌F2轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)合體，這里又稱為小麥根瘤菌，按上述方法清洗、分離，此過(guò)程需20周，然后將F2轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)合體用於使小麥生成根瘤。
7.2.用小麥根瘤菌使小麥生成根瘤利用小麥根瘤菌使四種小麥Anja、Kraka、Vuka和Williams生成根瘤，將小麥種子在如前所述的含有3%硫酸鈣和約10%以下用以產(chǎn)生小麥根瘤菌的豆科植物提取物的溶液中浸漬處理三次。用以包膜種子的三種豆科植物提取物是由菜豆的氣生部分、銀合歡葉子和紅三葉草的氣生都分制得的。種子在每次浸漬后，空氣干燥，并按下述播種。
7.2.1.實(shí)驗(yàn)室研究對(duì)三種小麥(Anja、Kraka和Vuka)進(jìn)行如前所述的實(shí)驗(yàn)，即在每個(gè)填有“Fibo”-燒結(jié)塊的一升容器中種入4-5粒包膜的種子，并使之發(fā)芽。將三種小麥中每一種都分成三組(a)+R-N組，用50毫升如前制備的小麥根瘤菌懸浮液，灌澆籽苗以后每星期用無(wú)氮肥料澆灌，(b)-R+N組，不用小麥根瘤菌而用無(wú)機(jī)氮肥澆灌籽苗，(c)-R-N組，既不用無(wú)機(jī)氮肥，也不用小麥根瘤菌而用如前所述的無(wú)氮肥料澆灌籽苗。用小麥根瘤菌處理的植物在8-10周之間發(fā)育根瘤。將每只容器中的植物減少到3株。將每組中十只容器中的植物用來(lái)分析其干物量及氮含量。
7.2.2.大田研究在大田研究中，包膜的麥種按前面6.3.2.部分中所述的方法播種。(a)+R-N組種子，如前所述，用小麥根瘤菌的懸浮液處理并用無(wú)氮肥料澆灌，(b)-R+N組種子，不用小麥根瘤菌處理而用無(wú)機(jī)氮肥澆灌，(c)-R-N組種子，既不用小麥根瘤菌，也不用無(wú)機(jī)氮肥處理，而只簡(jiǎn)單地用無(wú)氮肥料澆灌。
7.3.生有根瘤小麥的干物重量、氮含量及蛋白質(zhì)量的分析按6.4.部分所述的分析方法分析生有根瘤小麥植物的性能。
7.3.1.實(shí)驗(yàn)室研究的結(jié)果分別將在播種后56、70、87、100和118天的小麥從容器中收獲，用前面所述的方法分析每株植物的干物質(zhì)量及氮含量(凱氏定氮法)。
分析結(jié)果示於圖1，圖中每株植物的干物質(zhì)量(A)和每株植物的氮含量(B)都是按對(duì)應(yīng)的播種天數(shù)標(biāo)志的。
下面列出的三類麥種的平均干物質(zhì)量和平均氮含量數(shù)據(jù)是有助于理解示圖。
小麥種類 干物質(zhì)量 氮含量克/100種子 毫克/種子Anja 4.403 1.103Kraka 3.611 0.896Vuka 4.052 0.819不同時(shí)間收獲的植物數(shù)如下收獲的植物數(shù)植物組 播種后天數(shù)56 70 87 100 118試驗(yàn)1+R-N 33 30 21 23 25-R+N 24 30 20 21 20-R-N 24 26 22 26 35試驗(yàn)2+R-N 11 10 7 8 8-R+N 8 10 7 7 7-R-N 8 9 7 9 12圖1中的結(jié)果表明，在生長(zhǎng)期間，用根瘤菌處理的小麥植物比施氮肥的植物有更高的氮含量和干物量。在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，+R-N組植物的干物量幾乎比-R+N組植物高出40%而這兩組植物又比未處理的-R-N組植物要高。
7.3.2.大田研究的結(jié)果在大田研究的小麥植物經(jīng)過(guò)一個(gè)生長(zhǎng)季節(jié)后收獲，如前所述分析每株植物的蛋白質(zhì)量。結(jié)果列于表Ⅱ中。清楚地表明，用小麥根瘤菌處理過(guò)的植物(+R-N)要比無(wú)論是用無(wú)機(jī)氮肥(-R+N)還是用無(wú)氮肥料(-R-N)處理的植物都有較高的蛋白質(zhì)量。
表Ⅱ小麥的蛋白質(zhì)量植物組 蛋白質(zhì)量/每株植物+R-N 22-28%-R+N 12-14%-R-N ND＊＊ND無(wú)數(shù)據(jù)，這些未處理的植物8周以后已死亡。
8.實(shí)例使大麥生成根瘤的大麥根瘤菌(Rhizobium Hordei)使大麥生成根瘤的大麥根瘤菌，是按第6節(jié)中所述方法生成的，先用菜豆根瘤菌和豆科根瘤菌雜交，以產(chǎn)生F1轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)合體，然后再將它與豇豆銀合歡根瘤菌雜交，生成的大麥根瘤菌用於使四種大麥Hasso，Cerise，Harry和Igri，生成根瘤。
8.1.大麥根瘤菌的制備為了制備大麥根瘤菌，要用下列親代根瘤菌來(lái)制備F1轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)合體乳白菌落(a)菜豆根瘤菌是由長(zhǎng)在Aarhus附近土壤中發(fā)現(xiàn)的菜豆植物栽培品種，Prospector，中分離得到，(b)豆科根瘤菌，是由菜園豌豆中分離而得。
親代根瘤菌在前述的瓊脂介質(zhì)上交錯(cuò)劃線培養(yǎng)。用于介質(zhì)中的豆科植物提取物分別由菜豆和菜用豌豆的氣生部分獲得。由菜豆根瘤菌形成的菌落具有特征的深棕色，而由豆科根瘤菌形成的菌落則具有特征的金黃色。
按前面所述，清洗由乳白菌落制得的根瘤菌F1轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)合體，並用豇豆銀合歡根瘤菌交錯(cuò)劃線培養(yǎng)，豇豆銀合歡根瘤菌是由熱帶樹木銀合歡(Leucaena Leucocephala)分離而得。用在介質(zhì)中的豆科植物提取物分別由菜豆和菜用豌豆的氣生部分和銀合歡的葉子中分離而得的。由F1轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)合體形成的菌落是乳白色而由豇豆銀合歡根瘤菌生成的菌落則有特征的棕灰色。
將由在劃線中間得到雪白菌落所制得的根瘤菌F2轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)合體，這里又稱大麥根瘤菌，按上述方法清洗、分離。將F2轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)合體用於使大麥形成根瘤。
8.1.1.大麥根瘤菌的性能三種親代菌株的質(zhì)粒DNA，F(xiàn)1轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)合體和F2轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)合體(大麥根瘤菌)是采用Hirsh等人的改進(jìn)方法(1980，J.Gen.Microbiol，120∶403-412)分離得到的。該法包括通過(guò)在4℃溫度下，在40%SDS(十二烷基硫酸鈉)中經(jīng)過(guò)夜培養(yǎng)使根瘤溶解。利用在0.7%瓊脂糖凝膠中的電泳作用使質(zhì)粒DNA分離。分析結(jié)果表明，大麥根瘤菌具有一個(gè)低分子量的其他質(zhì)粒，該質(zhì)粒在三種親代根瘤菌或F1轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)合體中都沒(méi)有觀察到。
8.2.用大麥根瘤菌使大麥形成根瘤用大麥根瘤菌使四種大麥Hasso、Cerise、Igri和Harry形成根瘤。將大麥種子在前述含有3%硫酸鈣和約低于10%的用以產(chǎn)生大麥根瘤菌的豆科植物提取液中，浸漬三次。用以包膜種子的豆科植物提取物是由菜豆、菜園豌豆的氣生部分以及銀合歡的葉子得來(lái)的，種子在每次浸漬后，空氣干燥，并按下法播種。
8.2.1.實(shí)驗(yàn)室研究對(duì)所使用的每一種大麥進(jìn)行如前所述的實(shí)驗(yàn)，即在每個(gè)填有“Fibo”一燒結(jié)塊的一升容器中種入4-5粒包膜種子。將每一種大麥都分成如下三組(a)+R-N組，用50毫升如前所述制備的大麥根瘤菌懸浮液澆灌籽苗，以后每周再用無(wú)氮肥料澆灌，(b)-R+N組，不用大麥根瘤菌處理而用無(wú)機(jī)氮肥澆灌籽苗，(c)-R-N組，既不用大麥根瘤菌，也不用無(wú)機(jī)氮肥，而用非氮肥澆灌籽苗。用大麥根瘤菌處理的植物在8-10周間就發(fā)育根瘤。將每只容器中植物減少到三株，將每組中十只容器中的植物用來(lái)分析其干物質(zhì)量和氮含量。
8.3.形成根瘤大麥的干物質(zhì)量、氮含量及蛋白質(zhì)量的分析按6.4部分中所述的方法來(lái)分析形成根瘤的大麥植物的性能。
8.3.1.實(shí)驗(yàn)室研究結(jié)果從容器中收獲分別播種59、71、85、108、128天的植物，如前述分析每株植物的干物量及氮含量(凱氏定氮法)。
分析結(jié)果示於圖2中，圖中每株植物的干物量及氮含量都按相應(yīng)的播種天數(shù)標(biāo)志。
下面所列的每種大麥的平均干物量及平均氮含量有助於理解示圖
干物量 氮含量大麥 克/100種子 毫克/種子Hasso 3.922 0.732Cerise 4.217 0.792Igri 3.932 0.775Harry 5.068 0.826不同時(shí)間收獲的植物量如下收獲的植物數(shù)播種天數(shù)植物組 59 71 85 108 128試驗(yàn)1+R-N 23 23 27 31 37-R+N 17 14 30 23 40-R-N 14 18 28 20 32試驗(yàn)2+R-N 8 8 9 10 12-R+N 6 5 10 8 13-R-N 5 6 9 7 11圖2結(jié)果表明，在生長(zhǎng)期間，用根瘤菌處理的植物其氮含量和干物量都要比施加氮肥的植物要高。在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，+R-N組植物的干物質(zhì)量要比-R+N組植物幾乎高出18-22%。而這兩組植物的干物質(zhì)量又比施加無(wú)氮肥料的-R-N組大麥植物要高。
8.4.在形成根瘤的大麥中15N的富集將大麥植物在有15N的大氣中進(jìn)行培養(yǎng)，然后對(duì)部分植物分析其15N量以表示其固氮作用。更具體的是，將有小根瘤的大麥(95天的)放入一個(gè)小室中，使其根部在有15N的大氣下培育23小時(shí)。根部培養(yǎng)室中的大氣含有80%的N2(其中15N占12.85原子%)和20%的O2。培養(yǎng)期后，分析樣品中15N的含量，并用凱氏定氮法測(cè)定植物中的總氮含量。結(jié)果列于表Ⅲ中。
表Ⅲ部分形成根瘤大麥的氮含量干物質(zhì)量 N 總N植物部分 (克) (毫克/克) (毫克)根 0.448 8.9 3.99芽 1.017 7.5 7.63整株植物 1.465 7.93 11.62部分形成根瘤大麥的15N量樣品數(shù)目原子%15N＊根 4 0.450±0.011芽 3 0.392±0.003＊大氣中15N含量約為0.370原子%。
表Ⅲ中的數(shù)據(jù)表明，形成根瘤的大麥植物的根和芽比大氣中含有更多的15N。這些結(jié)果說(shuō)明形成根瘤的大麥植物具有固氮作用。
8.5.形成根瘤大麥的形態(tài)學(xué)用電子顯微鏡觀察某些大的根瘤，包括用醋酸鈾酰和檸檬酸鉛染色的超薄橫截面。大麥根瘤的細(xì)胞組織和Newcomb(1976，Can.J.Bot54;2163-2186)報(bào)導(dǎo)的豌豆根瘤的組織一樣，即維管束位于皮層的四周，而根瘤的中心部分是充滿了類菌體的植物細(xì)胞。
進(jìn)一步的研究包括對(duì)小的大麥根瘤表面以及大的大麥根瘤的表面進(jìn)行光學(xué)顯微鏡和電子顯微鏡分析(掃描和透射二種)，將觀察到的形態(tài)與豌豆、白三葉草(White Clover)和黃豆(Soybean)的進(jìn)行比較。當(dāng)植物長(zhǎng)到50天，長(zhǎng)成植物的75%左右時(shí)，可以看到小的大麥根瘤(對(duì)小麥也進(jìn)行了這種觀察)。長(zhǎng)到89-110天就能看到大的大麥根瘤。大的大麥根瘤雖少但不會(huì)弄錯(cuò)。測(cè)出其大小約為2-4毫米長(zhǎng)，直徑為1～2毫米，長(zhǎng)在主根上，位置約在原種子位以下2-6厘米。在切開的十三只大根瘤中，有十一只內(nèi)部呈紅棕色，就是說(shuō)，和長(zhǎng)了20-35天的豆科植物根瘤中豆血紅蛋白的顏色一樣，剩下剖開的兩只大根瘤中，一只呈白色，就象一只年幼未成熟的豆科植物根瘤，另一只則呈綠色，象變老的豆科植物根瘤。大麥感染過(guò)程可能是分兩個(gè)階段進(jìn)行的。第一階段是大麥根瘤菌進(jìn)入根部，而沒(méi)有誘發(fā)根瘤反應(yīng)，而在第二階段中在滯后一段時(shí)期后開始形成根瘤。
8.6.重新分離的大麥類菌體的抗抗生素作用將細(xì)菌從大的大麥根瘤中重新分離出來(lái)并進(jìn)行抗抗生素試驗(yàn)。此重新分離的細(xì)菌能抵抗400μg/ml濃度以下的壯觀霉素二鹽酸。最初用來(lái)誘發(fā)大麥植物(即培養(yǎng)劑)的大麥根瘤菌F2轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)合體也具有同樣的抗性。當(dāng)在普通的酵母甘露醇瓊脂上生長(zhǎng)時(shí)，培養(yǎng)劑和重新離析的菌種都能形成白色不透明的菌落。
大麥根瘤菌F2轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)合體的親代之一也能抵抗同樣濃度的壯觀霉素二鹽酸(Spectinomycin dihydrochloride)。這種親代就是豆科根瘤菌菌株MAI，當(dāng)它在普通的酵母甘露醇瓊脂上生長(zhǎng)時(shí)就形成淡黃色不透明的菌落。因此壯觀霉素的抗基因并不是在共生質(zhì)粒上，大麥根瘤菌F2轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)合體似乎是含有一個(gè)非共生質(zhì)?；蛴H代豆科植物根瘤菌MAI的主要染色體的雜種。但這并不排除大麥根瘤菌F2轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)合體會(huì)使MAI的共生質(zhì)粒停留的可能。
9.實(shí)例使高梁形成根瘤的高梁根瘤菌(Rhizobium Sorghi)使高梁形成根瘤的高梁根瘤菌，是按第6部分所述而制備的。先用羽扇豆根瘤菌(R·Lupini)和豇豆銀合歡根瘤菌雜交產(chǎn)生F1轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)合體，然后再將它和草木犀根瘤菌(R·metiloti)雜交。由此生成的高梁根瘤菌用於使三種高梁Safra、Dabar和Feterita形成根瘤。
9.1.高梁根瘤菌的制備為制備高梁根瘤菌，要用下列親代根瘤菌來(lái)制備F1轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)合體乳白菌落(a)羽扇豆根瘤菌，是由在Jutland中心發(fā)現(xiàn)的羽扇豆分離而得，(b)豇豆銀合歡根瘤菌，由在新幾內(nèi)亞、巴布亞發(fā)現(xiàn)的熱帶樹銀合歡(屬於蝶形花科族)分離得到。
親代根瘤菌在如前所述的瓊脂介質(zhì)上進(jìn)行交錯(cuò)劃線培養(yǎng)，用於介質(zhì)中的豆科植物提取物分別由羽扇豆和銀合歡葉子獲得。由羽扇豆根瘤菌形成的菌落具有特征的淺黃色而由豇豆銀合歡根瘤菌形成的菌落則有特征的棕灰色。
按上述方法清洗由乳白色菌落得到的根瘤菌F1轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)合體并與由在Stahr發(fā)現(xiàn)的紫苜宿(alfalfa)分離得到的草木犀根瘤菌的菌株交錯(cuò)劃線培養(yǎng)。用在介質(zhì)中的豆科植物提取物是羽扇豆、銀合歡和紫苜蓿的葉子中獲得的。由F1轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)合體形成的菌落是乳白色的而由草木犀根瘤菌形成的菌落則有特征的黃棕色。
將由在劃線中間得到的白色菌落獲得的根瘤菌F2轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)合體，這里也稱高梁根瘤菌，按上述清洗、離析。並將F2轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)合體用於使高梁形成根瘤。
9.2.用高梁根瘤菌使高梁形成根瘤用高梁根瘤菌使三種高梁，Safra、Dabar和Feterita形成根瘤。將高梁種子在上述的含有3%硫酸鈣和低于約10%的用於形成高梁根瘤菌的豆科植物提取物的溶液中浸漬三次。用以包膜種子的豆科植物提取物是由羽扇豆、銀合歡和紫苜蓿的葉子中獲得的。種子在每次浸漬后空氣干燥，并按下述播種。
9.2.1.實(shí)驗(yàn)室研究對(duì)三種高梁Safra、Dabar和Feterita進(jìn)行如前所述的實(shí)驗(yàn)，即將在每個(gè)填有“Fibo”一燒結(jié)塊的一升容器中種入4-5粒包膜種子，并使之發(fā)芽。每一種高梁分成三組(a)+R-N組，用50毫升如前制備的高梁根瘤菌懸浮液澆灌籽苗，以后每星期用無(wú)氮肥料澆灌，(b)-R+N組，不用高梁根瘤菌，而用無(wú)機(jī)氮肥灌澆籽苗，(c)-R-N組，既不用高梁根瘤菌，也不用無(wú)機(jī)氮肥，而用無(wú)氮肥料澆灌。用高梁根瘤菌澆灌的植物在10周內(nèi)根部發(fā)育根瘤。將每只容器中植物減少到3株，將每組中10只容器中的植物用來(lái)分析。
9.2.2.大田研究在大田研究中，包膜高梁種子(Feterita菌株)按6.3.2.部分中所述的方法播種。(a)+R-N組，種子如前所述，用高梁根瘤菌懸浮液處理并用無(wú)氮肥料澆灌，(b)-R+N組，種子不用高梁根瘤菌處理，而用無(wú)機(jī)氮肥灌澆，(c)-R-N組，種子既不用高梁根瘤菌，也不施用無(wú)機(jī)氮肥，僅簡(jiǎn)單地澆灌無(wú)氮肥料。
9.3.形成根瘤高梁的干物質(zhì)量、氮含量及蛋白質(zhì)量的分析按6.4.部分所述的方法分析高梁植物的性能。
9.3.1.實(shí)驗(yàn)室研究結(jié)果收獲播種了76-152天后的高梁，按上述分析每株植物的干物質(zhì)量及氮含量(凱氏定氮法)。
下列高梁的平均干物質(zhì)量及平均氮含量結(jié)果是有用的干物質(zhì)量 氮含量高梁 克/100種子 %/種子Safra 3.724 2.32Dabar 2.944 2.17Feterita 3.840 1.42不同時(shí)間收獲的植物數(shù)量如下植物組 播種76-152天后收獲的植物總數(shù)+R-N 121-R+N 62-R-N 709.3.2.大田研究的結(jié)果大田研究的高梁植物經(jīng)過(guò)一個(gè)生長(zhǎng)季節(jié)后進(jìn)行收獲。如前述分析每株植物的蛋白質(zhì)量以及氨基酸組成。列在表Ⅳ中的結(jié)果清楚地表明，用高梁根瘤菌處理過(guò)的植物無(wú)論比用氮肥處理的組(-R+N)或用無(wú)氮肥料處理的組(-R-N)都含有更高的蛋白質(zhì)量。
氨基酸組成分析表明，用根瘤菌處理的植物和施加氮肥的植物具有相同的氨基酸組成，但在用根瘤菌處理的植物中的色氨酸和亮氨酸似乎有所提高。
表Ⅳ高梁的蛋白質(zhì)含量植物 每株植物種子的蛋白質(zhì)含量+R-N 34-52%-R+N 16%-R-N 4%＊＊由于-R-N組在14周后就死亡，所以沒(méi)有獲得種子。植物的氮含量和蛋白質(zhì)含量如上述測(cè)定。
10.實(shí)例使水稻形成根瘤的水稻根瘤菌(Rhizobium Oryzae)使水稻形成根瘤的水稻根瘤菌是按第6部分所述而制備的。先用草木犀根瘤菌(R.meliloti)與豇豆銀合歡根瘤菌雜交以產(chǎn)生F1轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)合體，然后將它再和三葉草根瘤菌雜交，生成的水稻根瘤菌用於使水稻形成根瘤。
10.1.水稻根瘤菌的制備為制備水稻根瘤菌，要用下列親代根瘤菌來(lái)制備F1轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)合體乳白色菌落(a)草木犀根瘤菌，由在Victoria附近發(fā)現(xiàn)的草木犀分離得到，(b)豇豆銀合歡根瘤菌，由在新幾內(nèi)亞、巴布亞的熱帶樹銀合歡(屬于蝶形花科族)分離得到。
親代根瘤菌在如前述的瓊脂介質(zhì)上進(jìn)行交錯(cuò)劃線培養(yǎng)。用于介質(zhì)中的豆科植物提取物分別是由紫苜蓿、銀合歡的葉子獲得。由草木犀根瘤菌形成的菌落具有特征的黃棕色而由豇豆銀合歡根瘤菌形成的菌落則有特征的棕灰色。
按上述方法清洗由乳白色菌落得到的根瘤菌F1轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)合體并用在Randers發(fā)現(xiàn)的紅三葉草分離得到的三葉草根瘤菌菌株交錯(cuò)劃線培養(yǎng)。用在介質(zhì)中的豆科植物提取物是由紫苜蓿、銀合歡和紅三葉草的葉子獲得的。由F1轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)合體形成的菌落是乳白色的而由三葉草根瘤菌形成的菌落則有特征的淡棕色。
將由在劃線中間得到的雪白菌落獲得的根瘤菌F2轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)合體，這里也稱水稻根瘤菌，按上述清洗、分離。將F2轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)合體用於使水稻形成根瘤。
10.2.用水稻根瘤菌使水稻形成根瘤將稻種在前述的、含有3%硫酸鈣和低于10%的用於產(chǎn)生水稻根瘤菌的豆科植物提取物的溶液中，浸漬三次。用以包膜種子的豆科植物提取物是由紫苜蓿和銀合歡及紅三葉草的葉子獲得的。種子在每次浸漬后，空氣干燥，并按下述播種。
10.2.1.大田研究大田研究中，包膜稻種按6.3.2部分所述的方法播種，(a)+R-N組種子，如前述，用水稻根瘤菌的懸浮液處理，并用無(wú)氮肥料澆灌，(b)-R+N組種子，不用水稻根瘤菌處理，而用無(wú)機(jī)氮肥澆灌，(c)-R-N組種子，既不用水稻根瘤菌也不用無(wú)機(jī)氮肥處理，而只簡(jiǎn)單地用無(wú)氮肥料澆灌。
10.3.形成根瘤水稻的蛋白質(zhì)及氮含量分析按6.4.部分所述的方法來(lái)分析有根瘤水稻的性能。
10.3.1.大田研究的結(jié)果在兩年半期間，每4個(gè)半月收獲植物(一年二次)并如前述分析水稻的蛋白質(zhì)量。
列在表Ⅴ中的結(jié)果清楚地表示，用水稻根瘤菌處理的水稻(+R-N)無(wú)論比用無(wú)機(jī)氮肥(-R+N)處理或者未處理的(-R-N)植物都含有更高的蛋白質(zhì)量表Ⅴ水稻的蛋白質(zhì)含量植物組 每株植物的蛋白質(zhì)含量+R-N 12.0-18%-R+N 1.5-3%-R-N 0.5-1%11.實(shí)例在桉屬中用作氮肥的根瘤菌在一種不屬於禾本科植物的桉屬(桃金娘科)〔Eucalyptus(family Myrtaceae)〕中觀察到用根瘤菌作為氮肥是有正效果的。在試驗(yàn)的兩種植物中，藍(lán)桉(E·globulus)在生物量增加方面反應(yīng)很明顯，而沒(méi)觀察到根瘤。
11.1.根瘤菌081324的制備根據(jù)第6部分中的方法制備對(duì)桉屬有效的根瘤菌081324，先將豇豆銀合歡根瘤菌和豆科根瘤菌雜交，產(chǎn)生F1轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)合體，然后將它與三葉草根瘤菌雜交，產(chǎn)生的F2轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)合體，菌種081324，用於處理兩種桉屬植物。這種根瘤菌不感染任何其他本實(shí)例中所述的植物。
11.2.用根瘤菌081324處理桉屬植物將桉屬種子，如前在谷物中所述一樣，在豌豆(Pea)、蠶豆(beans)、羽扇豆(lupin)、三葉草(clover)、紫苜蓿(alfalfa)和銀合歡(leucaena)的一種豆科植物的提取物中予先萌發(fā)。處理過(guò)的種子播在粗砂中，而播種沒(méi)有處理過(guò)的種子作為對(duì)照。
萌發(fā)后，予處理的幼苗用無(wú)氮肥料和六個(gè)不同的根瘤菌F2轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)合體之一的懸浮液灌澆(+R-N)。萌發(fā)后，一組未處理的幼苗施以氮肥(-R+N)而另一組則施加無(wú)氮肥料(-R-N)。四周后，用六種根瘤菌中的五種處理的幼苗都死亡，而用根瘤菌081324處理的幼苗則存活。存活的植株分別轉(zhuǎn)移到有土的六升的缽中，土上層是“Fibo”一燒結(jié)塊，以保存缽的潮濕並防止真菌的生長(zhǎng)。缽的底部有孔隙，以便流出過(guò)量的水。調(diào)節(jié)所施加的無(wú)氮肥料量，使之不可能有滯留水或細(xì)菌的污染。一共有28個(gè)缽，14個(gè)是+R-N，而另14個(gè)是-R+N。14個(gè)+R-N是用根瘤菌081324再接種的。
生長(zhǎng)四個(gè)月之后，+R-N組的桉屬植物比+R-N植物多1-2倍的生物量。檢查一株-R+N植物，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)根瘤。然而，由於根在土壤中生長(zhǎng)，因土壤粒子粘到根上，污染了細(xì)根，要檢測(cè)小瘤是很困難的。盡管在這種+R-N桉屬植物中不能看到瘤，但結(jié)果表明，增加的生物量是由於根瘤菌的固氮作用。
12.實(shí)例使蕓臺(tái)屬(Brassicas)形成根瘤的根瘤菌R1另一種非禾本科的植物的云臺(tái)屬成員，對(duì)根瘤菌處理也起正反應(yīng)。用根瘤菌R1(010824)處理油菜(rape)(Brassicanapus)導(dǎo)致植物的增長(zhǎng)並出現(xiàn)了根瘤。
12.1.根瘤菌R1 010824的制備使油菜生成根瘤的根瘤菌R1(010824)是根據(jù)第6部分中所述的方法制備的，先將菜豆根瘤菌與豇豆銀合歡根瘤菌劃線培養(yǎng)產(chǎn)生F1轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)合體，然后將F1轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)合體與三葉草根瘤菌雜交。
12.2.用根瘤菌R1 010824處理油菜油菜籽，如前用于谷物所述一樣，在一種蠶豆、銀合歡、三葉草的豆科植物提取物中予先萌發(fā)。將處理過(guò)的油菜種子播種在一個(gè)2升容器中，萌發(fā)后，一組正常施肥(-R+N)，另一組僅施加無(wú)氮肥料(-R-N)，第三組也施加無(wú)氮肥料，並用六種不同的根瘤菌的菌株處理(+R-N)。3 1/2 月后，-R-N植物只有三個(gè)最初的幼葉，而+R-N組植物，用三種標(biāo)為R4、R5和R6根瘤菌處理，也長(zhǎng)得同樣不好，然而，用根瘤菌轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)合體之一的，即菌種R1或010824的一組是有益的。用R1 010824處理的植株幾乎和最大的-R+N組的植株一樣大小，並看到了小根瘤。
13.實(shí)例形成根瘤的非豆科植物的總氮含量為證實(shí)由本發(fā)明的根瘤菌轉(zhuǎn)化體在非豆科植物中誘發(fā)的根瘤是有固氮活性。用凱氏定氮法分析植物的有機(jī)氮含量。
13.1.材料和方法實(shí)驗(yàn)的每種非豆科植物都分成三組(a)一組用根瘤菌轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)合體和無(wú)氮肥料處理(+R-N)，(b)第二組施加氮肥，而不用根瘤菌轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)合體處理(-R+N)，而(c)第三組，既不用根瘤菌轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)合體，也不施用氮肥處理(-R-N)。這三組植物在其他條件都一樣的情況下在生長(zhǎng)室生長(zhǎng)，並在直到成熟的整個(gè)生長(zhǎng)期間收割多次。每個(gè)容器中生長(zhǎng)3-5株植物。收獲時(shí)，其苗株都收集在一起。從這些材料中取出一個(gè)樣品，用于分析總有機(jī)氮含量，列于以下各節(jié)的結(jié)果，證明了形成根瘤的非豆科植物有固氮作用。
13.2.小麥和大麥植物兩種小麥，Cornette和Ralle，如前第7部分所述，用小麥根瘤菌形成根瘤。分析了氮含量，以每株植物頂部的毫克氮含量表示，和植物頂部的干物質(zhì)量。結(jié)果列于表Ⅶ表Ⅶ有根瘤小麥的干物質(zhì)量和氮含量試驗(yàn)1天數(shù)毫克/株植物＊+R-N -R+N -R-N(n＝4) (n＝2) (n＝2)30 DW 56.05±28.5 90.89±26.3 39.69±6.3N 1.14±0.5 2.67±0.6 0.51±050 DW 120.49±27.8 257.56±62.3 82.61±13.6N 2.26±0.3 3.99±1.4 0.66±0.364 DW 244.78±21.8 331.99±5.8 72.21±8.7N 3.03±0.3 5.01±0.4 0.44±0.176 DW 314.38±112.5 400.64±83.2 117.53±44.6N 4.28±1.3 6.56±2.1 0.69±0.297 DW 431.47±68.5 666.71±60.3 117.0±54.2N 5.19±0.7 7.52±1.4 0.6±0.2115 DW 523.49±38.6 668.55±113.4 82.96±3.2N 5.98±1.2 9.94±3.5 0.42±0.1
(續(xù))試驗(yàn)1天數(shù)毫克/株植物＊+R-N -R+N -R-N(n＝4) (n＝2) (n＝2)124 DW 565.11±23.2 700.77±79.4 113.94±12.3N 8.15±0.4 11.43±1.9 0.67±0試驗(yàn)2+R-N -R+N -R-N(n＝4) (n＝2) (n＝2)54 DW 158.85±36.3 304.91±72.3 90.30±12.4N 3.59±0.5 7.46±0.8 0.51±0.171 DW 447.88±83.1 705.64±37.0 89.54±23.0N 6.28±1.2 12.48±1.9 0.54±0.280 DW 513.37±120.7 871.57±205.5 117.04±2.6N 7.61±1.1 12.15±2.4 0.71±0.192 DW 903.53±25.6 1128.85±166.4 131.18±11.8N 11.81±0.45 14.56±1.89 0.72±0.1＊DW＝干物質(zhì)量實(shí)驗(yàn)1的植物是生長(zhǎng)在次優(yōu)的光照條件下。
表Ⅶ中的結(jié)果表明，+R-N植物的干物質(zhì)量約為-R+N組植物的82%，而+R-N組植物的氮含量約為-R+N植物的80%。
5種大麥，Jenny、Taarn、Lina、Grith和Triumph，如前第8部分所述，用大麥根瘤菌形成根瘤。分析氮含量，以每株植物頂部的毫克氮含量表示，並分析植物頂部的干物質(zhì)量。結(jié)果列于表Ⅷ。
表Ⅷ生有根瘤大麥的氮含量和干物質(zhì)量試驗(yàn)1天數(shù)毫克/植株＊+R-N -R+N -R-N(n＝10) (n＝5) (n＝5)31 DW 43.85±9.2 71.84±21.7 19.15±5.2N 0.99±0.2 2.15±0.9 0.27±0.150 DW 121.53±28.7 224.95±44.5 35.40±4.2N 2.56±0.5 4.03±1.3 0.41±0.164 DW 198.41±50.7 269.92±36.8 41.87±7.1N 2.61±0.5 4.05±1.1 0.35±0.176 DW 301.04±56.1 296.76±76.9 49.58±4.8N 4.09±0.6 5.22±2.9 0.61±0.396 DW 499.23±106.9 506.33±106.5 55.19±15.7N 5.34±1.4 9.90±1.2 0.35±0.1123 DW 535.47±123.7 556.38±124.3 64.10±11.55.55±1.1 10.34±3.7 0.44±0.1試驗(yàn)2+R-N -R+N -R-N(n＝6) (n＝3) (n＝3)54 DW 118.89±20.6 264.84±38.4 49.76±11.8N 3.30±0.4 7.78±0.7 0.45±0.1
(續(xù))試驗(yàn)2天數(shù)毫克/植株＊+R-N -R+N -R-N(n＝6) (n＝3) (n＝3)71 DW 313.06±46.1 405.53±120.8 53.49±9.9N 5.81±0.6 7.78±0.8 0.41±0.180 DW 711.29±279.6 617.75±94.3 68.42±2.6N 7.85±1.2 10.26±2.4 0.53±0.192 DW 802.30±147.3 837.08±196.4 57.07±19.5N 10.08±1.6 11.99±1.6 0.46±0.2＊DW＝干物質(zhì)量用根瘤菌形成根瘤的大麥植物與施用正常氮肥的植物長(zhǎng)得同樣大小，並有同樣的干物質(zhì)量。+R-N大麥的含氮量約為-R+N植物的83%，而為-R-N植物含氮量的20倍。在-R-N植物分析的氮含量是由種子測(cè)得的，在生長(zhǎng)期間並沒(méi)有增加氮量。
顯然，根瘤菌的轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)合體作為氮肥取代物的有效性是由于75%的植物上長(zhǎng)有小根瘤的作用。因?yàn)槊總€(gè)容器中生長(zhǎng)3-5個(gè)植株，不可能將根分開並僅分析有根瘤的植株?？紤]到100%的植物形成根瘤，並長(zhǎng)成大根瘤的則作用會(huì)更有效。
為了排除這樣的可能性，即+R-N，長(zhǎng)有根瘤的非豆科植物使用了根瘤菌接種物或細(xì)菌，而這些接種物和細(xì)菌在以后可能在容器中增生而作為氮源，進(jìn)行了下列實(shí)驗(yàn)將小麥Cornette和大麥Taarn各用豆科根瘤菌菌株M1接種，所用的方法、量和條件都與這些非豆科植物分別用根瘤菌轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)合體、小麥根瘤菌或大麥根瘤菌接種中所述一樣。用豆科植物根瘤菌接種的植物施以無(wú)氮肥料，氮的累積量與-R-N植物的比較。用豆科根瘤菌接種的植物和-R-N植物都無(wú)氮的積累。得出的結(jié)論是一種非專一性的細(xì)菌接種物，因此，不用給植物施加氮肥。相反，在表Ⅶ和表Ⅷ中所示的，發(fā)生在對(duì)各用小麥根瘤菌或大麥根瘤菌形成根瘤的反應(yīng)所積累的氮量，一定是由于固氮作用引起的。
13.3.高梁和水稻植物三種高梁，Dabar、Safra和Feterita，如前第9部分所述，使用高梁根瘤菌形成根瘤。分析氮含量，以每株植物頂部的毫克量氮表示，和植物頂部的干物質(zhì)量，結(jié)果示於表Ⅸ中表Ⅸ形成根瘤高梁的干物質(zhì)量和氮含量天數(shù)毫克/植物＊+R-N -R+N -R-N(n＝6) (n＝3) (n＝3)30 DW 38.83±10.1 49.60±22.5 25.60±4.2N 0.40±0.1 1.42±0.7 0.26±059 DW 102.93±15.2 329.51±87.7 42.84±8.0N 1.00±0.2 5.93±2.3 0.31±080 DW 179.84±62.2 602.34±44.9 43.77±21.5N 2.00±0.8 9.86±2.7 0.31±0101 DW 439.83±95.8 576.18±75.4 53.71±12.4N 4.40±0.9 11.02±0.9 0.31±0125 DW 1242.94±391.4 1198.99±596.0 56.76±7.8N 11.65±2.4 12.44±6.8 0.27±0＊DW＝干物質(zhì)量水稻的M-201菌種如前第10部分所述的，使用水稻根瘤菌形成根瘤。分析氮含量，以每株植物頂部的毫克氮含量表示，和植物頂部的干物質(zhì)量，結(jié)果示於表Ⅹ中表Ⅹ有根瘤小麥的干物質(zhì)量和氮含量天數(shù) 毫克/植物 +R-N -R+N -R-N62 DW 32.28 48.87 23.44N 0.32 1.10 0.1674 DW 48.04 94.73 21.63N 1.15 2.65 0.1698 DW 107.47 115.40 29.9N 2.91 3.45 0.36128 DW 174.89 130.83 22.16N 5.16 4.33 0.38＊DW＝干物質(zhì)量結(jié)果表明，+R-N植物積累的干物質(zhì)量最初低於-R+N植物，然而，在實(shí)驗(yàn)的后期，由+R-N積累的干物質(zhì)量與-R+N植物相等，而且還可以超過(guò)。+R-N植物含氮的積累量和-R+N植物似乎相同。
13.4.油菜兩種油菜，Hanna和Topas，如前第12部分所述，使用根瘤菌010824形成根瘤，分析氮含量，以每株植物頂部的毫克氮含量表示，和植物頂部的干物質(zhì)量，結(jié)果示於表Ⅺ
表Ⅺ形成根瘤的油菜的干物質(zhì)量和氮含量天數(shù)毫克/植株＊+R-N -R+N -R-N47 DW 67.25±17.4 344.91±31.6 9.71±0.2N 0.89±0.3 6.71±0.1 0.22±0.259 DW 99.40±14.3 477.07±62.8 13.90±4.5N 1.64±0.4 7.03±0.2 0.11±0.173 DW 248.56±24.3 766.47±72.7 14.92±9.9N 2.00±0.7 10.25±1.9 0.10±0.0498 DW 424.80±72.5 704.73± 12.11±7.9N 3.42±1.1 17.66±5.1 0.10±0.05110 DW 547.37±22.2 1049.77±388.6 17.86±12.1N 5.73±1.9 24.33±7.9 0.26±0.2129 DW 1013.59±241.8 1955.60±330.0 15.39±6.0N 10.24±0.9 33.21±8.6 0.16±0.09147 DW 2231.55 ND NDN 16.66 ND ND＊DW＝干物質(zhì)量n＝每個(gè)樣品4個(gè)植株ND＝未測(cè)結(jié)果表明+R-N植物的干物質(zhì)量的累積量約為-R+N植物的50%，而+R-N植物的含氮量約為-R+N植物的30%。雖然累積量低於施加氮肥的植物，但在油菜植株中觀察到的小根瘤說(shuō)明有根瘤的植物在沒(méi)有氮肥的情況下也能生長(zhǎng)成活。(比較+R-N植物與-R-N植物的結(jié)果，其中-R-N植物既無(wú)干物質(zhì)量又無(wú)氮素積累)。
14.微生物的保藏下列根瘤菌已經(jīng)保藏在美國(guó)典型培養(yǎng)物收集中心〔American Type Cutfure Collection(ATCC)〕，Rockville，MD，並以下列保藏號(hào)注冊(cè)根瘤菌 保藏號(hào)小麥根瘤菌(R·tritici) 53407大麥根瘤菌(R·hordei) 53404高梁根瘤菌(R·Sorghi) 53405水稻根瘤菌(R·Oryzae) 53406R1(010824)根瘤菌本發(fā)明不限於保藏的微生物的范圍，因?yàn)楸２氐木唧w事打算作為發(fā)明的一個(gè)單獨(dú)說(shuō)明，而且功能上相等的任何微生物都是在本發(fā)明的范圍內(nèi)。實(shí)際上，除了本發(fā)明所列出的和描述的以外，各種改變，從說(shuō)明書和附圖的技術(shù)來(lái)看，對(duì)本領(lǐng)域的專業(yè)人員都是顯而易見的，這些改變也都落在所附的權(quán)利要求
范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種在非豆科植物中共生固氮的根瘤菌轉(zhuǎn)化體。
2.權(quán)利要求
1的根瘤菌轉(zhuǎn)化體，還包括轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)合體。
3.權(quán)利要求
1的根瘤菌轉(zhuǎn)化體，其特征為在與一種非豆科宿主共生體進(jìn)入共生前，在營(yíng)養(yǎng)介質(zhì)上培養(yǎng)形成雪白的菌落，該營(yíng)養(yǎng)基除了生長(zhǎng)所必需的營(yíng)養(yǎng)外，還有根瘤菌轉(zhuǎn)化株的每種親代根瘤菌的每個(gè)豆科宿主共生體的提取物。
4.權(quán)利要求
1的根瘤菌轉(zhuǎn)化體，其特征為在與非豆科宿主共生體進(jìn)入共生后，在營(yíng)養(yǎng)介質(zhì)上培養(yǎng)時(shí)形成灰色菌落，該營(yíng)養(yǎng)介質(zhì)中除了生長(zhǎng)必要的營(yíng)養(yǎng)外，還含有根瘤菌轉(zhuǎn)化體的每個(gè)親代根瘤菌種每個(gè)豆科宿主共生體的提取物和根瘤菌轉(zhuǎn)化體的非豆科宿主共生體的提取物。
5.權(quán)利要求
1的根瘤菌轉(zhuǎn)化體，能在屬于禾本科(Poaeceae)的一種非豆科植物中共生固氮。
6.權(quán)利要求
5的根瘤菌轉(zhuǎn)化體，能在小麥中共生固氮。
7.權(quán)利要求
6的根瘤菌轉(zhuǎn)化體，能在小麥Anja品種中共生固氮。
8.權(quán)利要求
6的根瘤菌轉(zhuǎn)化體，能在小麥Kraka品種中共生固氮。
9.權(quán)利要求
6的根瘤菌轉(zhuǎn)化體，能在小麥Vuka品種中共生固氮。
10.權(quán)利要求
5的根瘤菌轉(zhuǎn)化體，能在大麥中共生固氮。
11.權(quán)利要求
10的根瘤菌轉(zhuǎn)化體，能在大麥Hasso品種中共生固氮。
12.權(quán)利要求
10的根瘤菌轉(zhuǎn)化體，能在大麥Cerise品種中共生固氮。
13.權(quán)利要求
10的根瘤菌轉(zhuǎn)化體，能在大麥Harry品種中共生固氮。
14.權(quán)利要求
10的根瘤菌轉(zhuǎn)化體，能在大麥Igri品種中共生固氮。
15.權(quán)利要求
5的根瘤菌轉(zhuǎn)化體，能在高梁中共生固氮。
16.權(quán)利要求
15的根瘤菌轉(zhuǎn)化體，能在高梁Safra品種中共生固氮。
17.權(quán)利要求
15的根瘤菌轉(zhuǎn)化體，能在高梁Dabar品種中共生固氮。
18.權(quán)利要求
15的根瘤菌轉(zhuǎn)化體，能在高梁Fcterita品種中共生固氮。
19.權(quán)利要求
5的根瘤菌轉(zhuǎn)化體，能在水稻中共生固氮。
20.權(quán)利要求
1的根瘤菌轉(zhuǎn)化體，能在屬于蕓臺(tái)(Brass-ica)科的一種非豆科植物中共生固氮。
21.權(quán)利要求
20的根瘤菌轉(zhuǎn)化體，能在油菜中共生固氮。
22.小麥根瘤菌(R·tritici)，保藏在ATCC中，保藏號(hào)為53407，或突變體、重組體或其遺傳工程的衍生物。
23.大麥根瘤菌(R·hordei)，保藏在ATCC中，保藏號(hào)為53404，或突變體、重組體或其遺傳工程的衍生物。
24.高梁根瘤菌(R·Sorghi)、保藏在ATCC中，保藏號(hào)為53405，或突變體、重組體或其遺傳工程的衍生物。
25.水稻根瘤菌(R·Oryzae)，保藏在ATCC中，保藏號(hào)為53406，或突變體、重組體或其遺傳工程的衍生物。
26.R1(010824)根瘤菌，保藏在ATCC中，保藏號(hào)為，或突變體、重組體或其遺傳工程的衍生物。
27.一種用于處理非豆科植物種子的材料，包括在非豆科植物中共生固氮的根瘤菌轉(zhuǎn)化體的每種親代根瘤菌的豆科宿主共生體的豆科植物提取物。
28.一種用于處理非豆科植物種子的材料，包括來(lái)自在非豆科植物中共生固氮的根瘤菌轉(zhuǎn)化體的每種親代根瘤菌的豆科宿主共生體的豆科植物提取物的層析組分。
29.一種用於處理非豆科植物種子的材料，包括來(lái)自在非豆科植物中共生固氮的根瘤菌轉(zhuǎn)化體的每種親代根瘤菌的豆科宿主共生體的豆科植物提取物的晶體。
30.根據(jù)權(quán)利要求
27、28或29中處理非豆科植物種子的材料，其中還包括在非豆科植物中共生固氮的根瘤菌轉(zhuǎn)化體。
31.用于處理非豆科植物種子的一種材料，包括和權(quán)利要求
27、28或29的材料有關(guān)的一種蛋白質(zhì)。
32.根據(jù)權(quán)利要求
31的用於處理非豆科植物種子的一種材料，其中還包括在非豆科植物中共生固氮的根瘤菌轉(zhuǎn)化體。
33.一種用對(duì)根瘤菌轉(zhuǎn)化體專一的材料處理的非豆科植物種子，該根瘤菌轉(zhuǎn)化體能在由非豆科種子萌發(fā)的非豆科植株中共生固氮，其中所用的材料包括(a)根瘤菌轉(zhuǎn)化體的每個(gè)親代根瘤菌的豆科宿主共生體的豆科植物提取物，(b)每種豆科植物提取物的層析組分，(c)來(lái)自每種豆科植物提取物的層析組分的晶體，或(d)一種蛋白質(zhì)或和每種豆科提取物有關(guān)的蛋白質(zhì)。
34.根據(jù)權(quán)利要求
33處理非豆科植物種子，其中的材料還包括在從非豆科植物種子萌發(fā)的非豆科植物中共生固氮用的根瘤菌轉(zhuǎn)化體。
35.權(quán)利要求
33的非豆科植物種子，包括來(lái)自屬于禾本科(Poaeceae)的一種非豆科植物種子。
36.權(quán)利要求
35的非豆科植物種子，包括小麥種子。
37.權(quán)利要求
36的小麥種子，包括Anja小麥品種。
38.權(quán)利要求
36的小麥種子，包括Kraka小麥品種。
39.權(quán)利要求
36的小麥種子，包括Vuka小麥品種。
40.權(quán)利要求
35的非豆科種子，包括大麥種子。
41.權(quán)利要求
40的大麥種子，包括Hasso大麥品種。
42.權(quán)利要求
40的大麥種子，包括Cerise大麥品種。
43.權(quán)利要求
40的大麥種子，包括Harry大麥品種。
44.權(quán)利要求
40的大麥種子，包括Igri大麥品種。
45.權(quán)利要求
35的非豆科植物種子，包括高梁種子。
46.權(quán)利要求
45的高梁種子，包括Safra高梁品種。
47.權(quán)利要求
45的高梁種子，包括Dabar高梁品種。
48.權(quán)利要求
45的高梁種子，包括Feterita高梁品種。
49.權(quán)利要求
35的非豆科植物種子，包括水稻種子。
50.權(quán)利要求
35的非豆科植物種子，包括蕓苔科(Brassica)種子。
51.權(quán)利要求
49的云苔科種子，包括油菜種子。
52.一種由根瘤菌轉(zhuǎn)化體形成根瘤的非豆科植物，該根瘤菌轉(zhuǎn)化體能在非豆科植物中共生固氮。
53.權(quán)利要求
52的非豆科植物，使用在非豆科植物中能共生固氮的根瘤菌轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)合體形成根瘤。
54.權(quán)利要求
52的非豆科植物，包括禾本科(Poaeceae)的成員。
55.權(quán)利要求
54的非豆科植物，包括小麥植物。
56.權(quán)利要求
55的小麥植物，包括Anja品種。
57.權(quán)利要求
55的小麥植物，包括Kraka品種。
58.權(quán)利要求
55的小麥植物，包括Vuka品種。
59.權(quán)利要求
54的非豆科植物，包括大麥植物。
60.權(quán)利要求
59的大麥植物，包括Hasso品種。
61.權(quán)利要求
59的大麥植物，包括Cerise品種。
62.權(quán)利要求
59的大麥植物，包括Harry品種。
63.權(quán)利要求
59的大麥植物，包括Igri品種。
64.權(quán)利要求
54的非豆科植物，包括高梁植物。
65.權(quán)利要求
64的高梁植物，包括Safra品種。
66.權(quán)利要求
64的高梁植物，包括Dabar品種。
67.權(quán)利要求
64的高梁植物，包括Feterita品種。
68.權(quán)利要求
54的非豆科植物，包括水稻植物。
69.權(quán)利要求
54的非豆科植物，包括蕓臺(tái)科植物。
70.權(quán)利要求
69的蕓臺(tái)科植物，包括油菜植物。
71.在非豆科植物中共生固氮的根瘤菌F2轉(zhuǎn)化結(jié)合體的制備方法，包括(a)在固體營(yíng)養(yǎng)基上，將第一種根瘤菌親代和第二種根瘤菌親代交錯(cuò)劃線培養(yǎng)，所用培養(yǎng)介質(zhì)除了含有生長(zhǎng)必要的營(yíng)養(yǎng)以外，還含有(ⅰ)每種親代根瘤菌的豆科宿主共生體的非變性提取物，或(ⅱ)來(lái)自每種親代根瘤菌的豆科宿主共生體的非變性提取物的層析組分，或(ⅲ)由每種親代根瘤菌的豆科宿主共生體的非變性提取物層析組分得到的晶體，或(ⅳ)和提取物、層析組分或晶體有關(guān)的蛋白質(zhì)，(b)在約18至約30℃溫度下，培養(yǎng)根瘤菌親代，以至使根瘤菌親代形成一種具有特征顏色的菌落，(c)選擇生長(zhǎng)在根瘤菌親代菌落中間的乳白色菌落的根瘤菌F1轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)合體，(d)將根瘤菌F1轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)合體與第三個(gè)根瘤菌親代在培養(yǎng)基上交錯(cuò)劃線培養(yǎng)，培養(yǎng)基除了含有(a)步中所含的營(yíng)養(yǎng)外，還含有一種豆科植物提取物、層析組分、結(jié)晶體或第三種根瘤菌親代的蛋白質(zhì)，和(e)在約18℃至約30℃的溫度下，培養(yǎng)根瘤F1轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)合體和第三種根瘤菌親代以至根瘤菌形成菌落，(f)選擇生長(zhǎng)在根瘤菌F1轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)合體和第三種根瘤菌親代之間的一種根瘤菌F2轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)合體的雪白色菌落。
72.根據(jù)權(quán)利要求
71的方法，其中第三種根瘤菌親代包括一種第三種根瘤菌品種，第二種根瘤菌F1轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)合體或第二種根瘤菌F2轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)合體。
專利摘要
本發(fā)明是涉及在非豆科植物中形成根瘤固氮的根瘤菌轉(zhuǎn)化體。長(zhǎng)有根瘤的非豆科植物能在無(wú)氮肥料中生長(zhǎng)，并比其施加氮肥的無(wú)根瘤的對(duì)應(yīng)物有更高的蛋白質(zhì)含量、干物質(zhì)量和氮含量，有根瘤的非豆科植物收獲后留下的秸桿也有高的蛋白質(zhì)含量。
文檔編號(hào)A01G1/00GK86107988SQ86107988
公開日1987年12月2日 申請(qǐng)日期1986年12月30日
發(fā)明者斯文—埃里克·尼爾森, 格雷特·莫奇·塞倫森 申請(qǐng)人:斯文-埃里克·尼爾森, 格雷特·莫奇·塞倫森導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan