金黃色葡萄球菌培養(yǎng)過夜3000 rpm離心收集細(xì)菌，2ml無菌水重懸。
[0047]3)取1ml金黃色葡萄球菌懸液(5X 10sCFU/mL)與2ml HAuC14磁力攪拌，混合均勾，反應(yīng)6小時(shí)。
[0048]4 )將上步反應(yīng)液經(jīng)4000rpm離心去除沉淀雜質(zhì)，取上清于20 °C反應(yīng)48h，12000rpm離心30min收集沉淀即納米金。
[0049]將本實(shí)施例所得沉淀納米金如圖1A離心管管底部分所示，將其用水重懸后為粉紅色如圖1B所示(將離心管倒置可以更方便、更準(zhǔn)確觀察納米金顏色與溶度)，其紫外光可見吸收曲線如圖1C所示，僅在524nm處有單一的吸收峰，說明納米金粒徑分布范圍在5?20nm，且純度尚。
[0050]圖2所示掃描電鏡圖進(jìn)一步說明本實(shí)施例制備的納米金粒徑在5?20nm范圍內(nèi)，且粒徑大小非常均勻。
[0051]本實(shí)施例生物合成納米金能長時(shí)間(達(dá)6個月以上)保持穩(wěn)定不團(tuán)聚，無需用界面活性劑保持納米金的穩(wěn)定性。
[0052]本實(shí)施例在常溫、常壓下反應(yīng)能夠合成粒徑較小、均勻的納米金，且純度高，穩(wěn)定性好。
[0053]實(shí)施例2
1)配置 lmmol/L 氯金酸(HAuC14)。
[0054]2) 25ml細(xì)菌培養(yǎng)基加入適量金黃色葡萄球菌培養(yǎng)過夜3000rpm離心收集細(xì)菌，2ml無菌水重懸。
[0055]3)取1ml金黃色葡萄球菌懸液(5X 10sCFU/mL)與2ml HAuC14磁力攪拌，混合均勾，反應(yīng)6小時(shí)。
[0056]4)收集所得產(chǎn)物，4000rpm離心去除沉淀雜質(zhì)，取上清于80°C水浴鍋反應(yīng)0.5h，12000rpm離心30 min收集沉淀即為納米金。
[0057]將本實(shí)施例所得沉淀納米金用水重懸后為粉紅色(如圖3中的插圖)，其紫外光可見吸收曲線如圖3所示，僅在524nm處有單一的吸收峰，說明納米金粒徑分布范圍在5?20nm，且純度尚。
[0058]本實(shí)施例在較短的時(shí)間內(nèi)通過加熱可以縮短反應(yīng)時(shí)間至30min。
[0059]實(shí)施例3
1)配置 10mmol/L 氯金酸(HAuC14)。
[0060]2) 25ml細(xì)菌培養(yǎng)基加入適量金黃色葡萄球菌培養(yǎng)過夜3000rpm離心收集細(xì)菌，2ml無菌水重懸。
[0061]3)取1ml金黃色葡萄球菌懸液(5X 10sCFU/mL)與2ml HAuClJg合均勾，反應(yīng)6小時(shí)。
[0062]4)收集所得產(chǎn)物，4000rpm離心去除沉淀雜質(zhì)，取上清于80°C水浴鍋反應(yīng)0.5 h，12000rpm離心30 min收集沉淀即納米金.將本實(shí)施例所得沉淀納米金用水重懸后為藍(lán)紫色(如圖4中的插圖)，其紫外光可見吸收曲線如圖4所示，僅在540nm處有單一的吸收峰，說明納米金粒徑分布范圍在30?80nm，
且純度高。
[0063]本實(shí)施例通過提高納米金的溶度可以合成粒徑較大的納米金，說明本發(fā)明方法對所得納米金的粒徑具有可控性，可以根據(jù)需要合成目的大小的納米金。
[0064]對比例1
1)配置 lmmol/L 氯金酸(HAuC14)。
[0065]2) 25ml細(xì)菌培養(yǎng)基加入適量大腸桿菌培養(yǎng)過夜3000rpm離心收集細(xì)菌，2ml無菌水重懸。
[0066]3)取1ml大腸桿菌懸液(5X 10sCFU/mL)與2ml HAuC14磁力攪拌，混合均勻，反應(yīng)6小時(shí)。
[0067]4)收集所得產(chǎn)物，4000rpm離心去除沉淀雜質(zhì)，取上清于80 °C反應(yīng)30min，12000rpm離心30 min收集沉淀即納米金。
[0068]本對比例所得沉淀納米金如圖5左圖離心管管底部分所示，將其用水重懸后為淡粉紅色如圖5右圖所示；從中可以看出，對比例1生成納米金的量明顯少于實(shí)施例1~3的生成量，說明在菌濃度和HAuC14用量相同的情況下，金黃色葡萄球菌生物合成納米金的能力遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過大腸桿菌。
[0069]本對比例結(jié)果說明，雖然大腸桿菌可以合成納米金，但是與金黃色葡萄球菌比較，大腸桿菌合成納米金產(chǎn)率較低，顏色較金黃色葡萄球菌產(chǎn)生的納米金淺，離心后所得納米金沉淀也比較少。
[0070]對比例2
1)配置 lmmol/L 氯金酸(HAuC14)。
[0071]2) 25ml細(xì)菌培養(yǎng)基加入適量糞球菌培養(yǎng)過夜3000rpm離心收集細(xì)菌，2ml無菌水重懸。
[0072]3)取1ml奠球菌懸液與2ml HAuC14磁力攪拌，混合均勾，反應(yīng)6小時(shí)。
[0073]4)收集所得產(chǎn)物，4000rpm離心去除沉淀雜質(zhì)，取上清于80 °C反應(yīng)30分鐘，12000rpm離心30分鐘收集沉淀即納米金。
[0074]本對比例所得沉淀納米金如圖6左圖離心管管底部分所示，將其用水重懸后為淡粉紅色如圖6右圖所示；從中可以看出，對比例2生成納米金的量明顯少于實(shí)施例1~3中的生成量，說明在菌液濃度和HAuC14用量相同的情況下，金黃色葡萄球菌生物合成納米金的能力遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過糞球菌。
[0075]本對比例結(jié)果說明，雖然糞球菌可以合成納米金，但是與金黃色葡萄球菌比較糞球菌合成納米金產(chǎn)率明顯降低。
[0076]對比例3
1)配置 lmmol/L 氯金酸(HAuC14)。
[0077]2) 25ml細(xì)菌培養(yǎng)基加入適量腸球菌培養(yǎng)過夜3000rpm離心收集細(xì)菌，2ml無菌水重懸。
[0078]3)取1ml腸球菌懸液與2ml HAuC14磁力攪拌，混合均勾，反應(yīng)6小時(shí)。
[0079]4)收集所得產(chǎn)物，4000rpm離心去除沉淀雜質(zhì)，取上清于80 °C反應(yīng)30分鐘，12000rpm離心30分鐘收集沉淀即納米金。
[0080]本對比例所得沉淀納米金如圖7左圖離心管管底部分所示，將其用水重懸后為淡粉紅色如圖7右圖所示；從中可以看出，對比例3生成納米金的量明顯少于實(shí)施例1~3的生成量，說明在菌濃度和HAuC14用量相同的情況下，金黃色葡萄球菌生物合成納米金的能力遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過腸球菌。
[0081]本對比例結(jié)果說明，雖然腸球菌可以合成納米金，但是與金黃色葡萄球菌比較腸球菌合成納米金產(chǎn)率明顯降低。
[0082]下面對本發(fā)明制備的納米金的生物相容性進(jìn)行檢測。
[0083]實(shí)驗(yàn)組:
1)培養(yǎng)U251細(xì)胞長至密度為60%?70%；
2)取實(shí)施例1制備的納米金(12000rpm離心后獲得的納米金)，按20μ g / ml濃度處理細(xì)胞12小時(shí)，檢測細(xì)胞生長情況。
[0084]對照組:除了所用納米金同實(shí)驗(yàn)組不一樣，其他均同實(shí)驗(yàn)組，本組所用的納米金為實(shí)施例1步驟3)中4000rpm離心后上清液中的納米金。
[0085]空白對照組:除了所用不加納米金，其他操作均與實(shí)驗(yàn)組相同。
[0086]檢測結(jié)果如圖8所示，從中可以看出，實(shí)施例1制備的納米金處理U251細(xì)胞，細(xì)胞生長良好，細(xì)胞內(nèi)吞噬大量納米金，說明本發(fā)明制備的納米金的生物相容性非常好，不影響細(xì)胞的生長，且容易被細(xì)胞吞噬。而4000rpm離心后上清液中的納米金處理細(xì)胞后，未見細(xì)胞存活，細(xì)胞也未吞噬納米金，說明該納米金具有高度細(xì)胞毒性。4000rpm離心后的納米金雖然去除了大顆粒雜質(zhì)，但仍然具有細(xì)胞毒性。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種利用金黃色葡萄球菌生物合成納米金的方法，其特征在于:包括以下步驟: 1)將金黃色葡萄球菌液與氯金酸混勻，使混合液反應(yīng)4?6h; 2)將上步反應(yīng)液離心，收集上清繼續(xù)反應(yīng)0.5?48h ； 3)將上步反應(yīng)液離心，收集沉淀即得納米金。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:步驟1)所述混合液中金黃色葡萄球的濃度為 1 X 10s?1 X 10 9CFU/mL。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:步驟1)所述混合液中氯金酸的濃度為IX 10 2?IX 10 2 mmol/Lo4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:步驟1)所述混合液反應(yīng)的溫度為15?37。。。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:步驟2)所述離心的轉(zhuǎn)速為3000?6000rpmo6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:步驟2)所述反應(yīng)的溫度為20?80°C。7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:步驟3)所述離心的轉(zhuǎn)速為10000?15000rpmo8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:步驟3)所述離心的時(shí)間為20?60min。9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:所制備的納米金具有生物相容性。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種利用金黃色葡萄球菌生物合成納米金的方法，該方法為將金黃色葡萄球菌液與氯金酸混勻，使混合液反應(yīng)4～6h；將反應(yīng)液離心，收集上清繼續(xù)反應(yīng)0.5～48h；再將反應(yīng)液離心，收集沉淀即得納米金。本發(fā)明生物合成的納米金具有生物性容性，對細(xì)胞不具有毒性；所得納米金粒徑均勻、可控，可按要求合成所需的尺寸。所得納米金能長時(shí)間保持穩(wěn)定不團(tuán)聚，不使用界面活性劑使納米金保持穩(wěn)定。本發(fā)明由于合成是在室溫、室壓下進(jìn)行，因此可避免使用有機(jī)溶劑所造成的污染及減少能源的消耗，且金黃色葡萄球菌獲取簡便，經(jīng)濟(jì)，可再生。
【IPC分類】B22F9/24, B82Y40/00
【公開號】CN105345021
【申請?zhí)枴緾N201510664346
【發(fā)明人】邱小忠, 華文熙, 王樂禹
【申請人】南方醫(yī)科大學(xué)
【公開日】2016年2月24日
【申請日】2015年10月14日