桔小實(shí)蠅抗敵百蟲和高效氯氰菊酯抗藥性水平檢測(cè)cDNA芯片的制備方法及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種桔小實(shí)蠅抗敵百蟲和高效氯氰菊酯抗藥性水平檢測(cè)cDNA芯片及其制作方法和應(yīng)用。本發(fā)明利用正向抑制性消減雜交（suppressionsubtractivehybridization，SSH）方法分別獲得了不同抗性品系桔小實(shí)蠅抗藥性特異上調(diào)表達(dá)基因片段，再PCR擴(kuò)增各抗藥性相關(guān)特異表達(dá)基因，純化回收得到118個(gè)桔小實(shí)蠅抗敵百蟲抗性相關(guān)特異性基因片段，103個(gè)桔小實(shí)蠅抗高效氯氰菊酯抗性相關(guān)特異性基因片段。以上述特異的抗性靶基因片段為DNA探針，構(gòu)建了桔小實(shí)蠅抗敵百蟲和高效氯氰菊酯檢測(cè)cDNA芯片。本發(fā)明cDNA芯片能夠簡(jiǎn)單有效地實(shí)現(xiàn)對(duì)桔小實(shí)蠅抗藥性水平的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)。
【專利說明】桔小實(shí)蠅抗敵百蟲和高效氯氰菊酯抗藥性水平檢測(cè)cDNA芯片的制備方法及其應(yīng)用【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及昆蟲抗藥性檢測(cè)【技術(shù)領(lǐng)域】。更具體地，涉及一種檢測(cè)桔小實(shí)蠅抗敵百蟲和高效氯氰菊酯的抗性水平的CDNA芯片及其制備方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]世界衛(wèi)生組織在1957年對(duì)昆蟲抗藥性的定義是:“昆蟲具有耐受殺死正常種群中大多數(shù)個(gè)體的藥量的能力并在其種群中發(fā)展起來的現(xiàn)象”。昆蟲對(duì)殺蟲劑的抗藥性是一種進(jìn)化現(xiàn)象，是昆蟲種群內(nèi)部遺傳結(jié)構(gòu)在殺蟲劑選擇作用下持續(xù)變化的外在表現(xiàn)，是昆蟲種群的一種特性，主要包括自然耐藥性、交互抗藥性、負(fù)交互抗藥性及多抗藥性等。昆蟲產(chǎn)生抗藥性的后果是:現(xiàn)行的化學(xué)藥劑防治劑量效果降低-人們開始加大藥劑劑量-昆蟲抗性增強(qiáng)最終導(dǎo)致防治失敗，給環(huán)境和人類食品安全生產(chǎn)帶來嚴(yán)重的破壞性后果。桔小實(shí)蠅是我國(guó)華南及西南地區(qū)果實(shí)蔬菜上的重要害蟲之一，每年給我過農(nóng)業(yè)生產(chǎn)特別是經(jīng)濟(jì)水果造成重大的經(jīng)濟(jì)損失。目前，田間防治桔小實(shí)蠅主要采用的化學(xué)藥劑防治，多年的田間種群監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)顯示桔小實(shí)蠅已經(jīng)對(duì)多種農(nóng)藥產(chǎn)生了抗藥性。
[0003]為了延緩昆蟲抗藥性發(fā)展，減少農(nóng)藥劑量的使用，保護(hù)環(huán)境和人類安全，對(duì)昆蟲抗藥性進(jìn)行監(jiān)測(cè)，實(shí)時(shí)掌握其抗藥性動(dòng)態(tài)，及時(shí)輪換使用不同類型的農(nóng)藥是治理昆蟲抗藥性產(chǎn)生的一種很好的策略。昆蟲抗藥性的機(jī)制主要分為:行為抗性、靶標(biāo)抗藥性和生理代謝抗藥性。很多研究證明昆蟲的這些抗藥性機(jī)制都是由基因調(diào)控的，基因與抗藥性是一種內(nèi)因-表觀的關(guān)系。因 此，了解不同類型殺蟲劑作用下，昆蟲產(chǎn)生抗性時(shí)，其體內(nèi)特異性抗性相關(guān)基因的表達(dá)情況，可以為了解昆蟲抗性發(fā)展水平提供依據(jù)。
[0004]基因芯片雜交技術(shù)(gene chip hybrid analysis)是基于核酸分子原位雜交技術(shù)原理發(fā)展而來的，根據(jù)堿基互補(bǔ)的原理，利用基因探針在基因混合物中識(shí)別特定基因。該技術(shù)將大量DNA探針分子固定于支持物上，然后與熒光標(biāo)記的樣品(DNA或RNA)進(jìn)行雜交，通過檢測(cè)雜交信號(hào)強(qiáng)弱來判斷樣品中靶分子的數(shù)量。可以對(duì)來源于不同的個(gè)體、組織、細(xì)胞周期、發(fā)育階段、分化階段、病變、刺激下的細(xì)胞內(nèi)mRNA或反轉(zhuǎn)錄后產(chǎn)生的cDNA進(jìn)行檢測(cè)，從而對(duì)這些基因表達(dá)的個(gè)體特異性、組織特異性、發(fā)育階段特異性、分化階段特異性、病變特異性、刺激特異性進(jìn)行綜合的分析和判斷，迅速將某個(gè)或幾個(gè)基因與相關(guān)因素聯(lián)系起來，加快這些基因功能的確定，具有廣闊的應(yīng)用前景。利用表達(dá)性基因芯片雜交技術(shù)，可以同時(shí)對(duì)抗藥性及敏感昆蟲體內(nèi)的成千上萬個(gè)不同基因進(jìn)行差異表達(dá)定量檢測(cè)。
[0005]桔小實(shí)蠅是我國(guó)華南及西南地區(qū)果實(shí)蔬菜上的重要害蟲之一。在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，為了減少損失，目前，田間防治桔小實(shí)蠅主要采用的化學(xué)藥劑防治，多年的田間種群監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)顯示桔小實(shí)蠅已經(jīng)敵百蟲、高效氯氰菊酯等多種農(nóng)藥已經(jīng)產(chǎn)生了抗藥性。2002-2004年，研究學(xué)者采用藥膜法測(cè)定了廣東、海南、福建、廣西等4省(區(qū))桔小實(shí)蠅漢dorsalis種群對(duì)敵百蟲和高效氯氰菊酯的抗藥性，結(jié)果表明澄海、閩南桔小實(shí)蠅種群對(duì)敵百蟲抗藥性達(dá)到4.56和4.07倍，大部分地區(qū)桔小實(shí)蠅種群對(duì)上述2種殺蟲劑抗藥性尚處于敏感階段，同時(shí)監(jiān)測(cè)2003-2004年廣州郊區(qū)桔小實(shí)蠅成蟲對(duì)敵百蟲和高效氯氰菊酯的抗藥性變化，發(fā)現(xiàn)除敵百蟲外，桔小實(shí)蠅對(duì)高效氯氰菊酯的抗藥性變化不明顯。在接下來的2005-2007年間繼續(xù)對(duì)我國(guó)7個(gè)省份不同地區(qū)的田間桔小實(shí)蠅抗藥性發(fā)展進(jìn)行了監(jiān)測(cè)，結(jié)果表明不同地區(qū)桔小實(shí)蠅均對(duì)上述2種藥劑抗藥性呈上升趨勢(shì)。隨后2008-2012年對(duì)全國(guó)不同地區(qū)的連續(xù)監(jiān)測(cè)表明田間桔小實(shí)蠅種群均對(duì)上述2種藥劑抗性達(dá)到了中抗甚至高抗水平。
[0006]為了延緩昆蟲抗藥性發(fā)展，減少農(nóng)藥劑量的使用，保護(hù)環(huán)境和人類安全，對(duì)昆蟲抗藥性進(jìn)行監(jiān)測(cè)，實(shí)時(shí)掌握其抗藥性動(dòng)態(tài)，及時(shí)輪換使用不同類型的農(nóng)藥是治理昆蟲抗藥性產(chǎn)生的一種很好的策略。
[0007]目前桔小實(shí)蠅的抗藥性監(jiān)測(cè)主要采用的是生物測(cè)定法，但傳統(tǒng)的生物測(cè)定方法比較繁瑣，操作起來比較復(fù)雜，每次測(cè)定都需要大量的蟲源，往往需要先從野外采集部分蟲源帶回人工飼養(yǎng)繁殖以達(dá)到供試蟲數(shù)，結(jié)果使測(cè)得的抗藥性水平具有滯后性。另外，生物測(cè)定受外界環(huán)境(如:蟲態(tài)、營(yíng)養(yǎng)、溫度、濕度等)的影響較大，重復(fù)性和精確性較低。而分子生物學(xué)抗藥性監(jiān)測(cè)技術(shù)，其靈敏度較高，僅用少量試蟲就可對(duì)抗藥性程度進(jìn)行檢測(cè)，可實(shí)現(xiàn)對(duì)樣品的高通量并行檢測(cè)，操作簡(jiǎn)單，操作簡(jiǎn)單、省時(shí)且試驗(yàn)誤差小，可以確定害蟲個(gè)體的抗藥性程度，這一點(diǎn)是生物測(cè)定方法所無法達(dá)到的。而實(shí)現(xiàn)分子抗藥性監(jiān)測(cè)就要對(duì)抗藥性基因進(jìn)行全面了解，檢測(cè)更多的抗藥性相關(guān)基因才能更準(zhǔn)確的反映抗藥性發(fā)展水平。
[0008]昆蟲抗藥性機(jī)制是其體內(nèi)基因調(diào)控的結(jié)果，雖然研究者們已經(jīng)對(duì)桔小實(shí)蠅的抗藥性機(jī)制從多個(gè)方面進(jìn)行了探討，但是也存在著一些問題，在抗藥性靶標(biāo)基因的研究上較少，僅僅涉及到Malpha 6基因，在代謝抗藥性相關(guān)研究中也僅對(duì)個(gè)別酶或蛋白變化現(xiàn)象進(jìn)行了初步研究，并沒有涉及到其編碼的基因研究。同時(shí)昆蟲抗藥性是多基因共同協(xié)調(diào)作用的結(jié)果，是一種多基因效應(yīng)現(xiàn)象。但到底有多少基因參與到抗藥性作用、不同的抗藥性水平涉及抗藥性基因是否 相同及抗藥性基因是怎樣參與抗藥性過程等方面的研究尚缺少報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有檢測(cè)桔小實(shí)蠅抗藥性的技術(shù)不足，提供了一種檢測(cè)桔小實(shí)蠅抗敵百蟲和高效氯氰菊酯的抗性相關(guān)基因表達(dá)水平的cDNA芯片。
[0010]本發(fā)明的另一目的在于提供上述cDNA芯片的構(gòu)建方法。
[0011 ] 本發(fā)明還有一個(gè)發(fā)明目的是提供上述芯片的應(yīng)用。
[0012]本發(fā)明的發(fā)明目的是通過以下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn):
提供一種檢測(cè)桔小實(shí)蠅抗敵百蟲和高效氯氰菊酯抗性水平的cDNA芯片，所述芯片包含221個(gè)靶基因cDNA探針；其中118個(gè)靶基因DNA探針為桔小實(shí)蠅抗敵百蟲抗性相關(guān)特異性基因片段，103個(gè)靶基因DNA探針為桔小實(shí)蠅抗高效氯氰菊酯抗性相關(guān)特異性基因片段。
[0013]其中，118個(gè)桔小實(shí)蠅抗敵百蟲特異性基因片段是:S004(4)-A9、S004⑷-B7、S004 ⑷-D6、S004(4)-H9、S004(5)_B10、S004(5)_B5、S004(5)_C10、S004(5)_C7、S004(5)-D1、S004(5)-D10、S004(5)_D11、S004(5)_G1、S004(5)_H3、S004(5)_H7、S004(6)-10、S004(6)-12、S004(6)_18、S004(6)_21、S004(7)_100、S004(7)_109、S004(7)-138、S004(7)-156、S004(7)_165、S004(7)_183、S004(8)_197、S004(8)_199、S004(8)-217、S004(8)-225、S004(8)_240、S004(8)_248、S004(9)_293、S004(9)_308、S004(9)-328、S004(10)-394、S004 (10)-401、S004 (10)-443、S004 (10)-471、S005(1)_A1、、S005 ⑴-B2、、S005 ⑴-Cl、S005 ⑴-D12、S005 ⑴-G8、S005 ⑵-A8、S005 ⑵-C7、S005 ⑵-E8、S005 ⑵-Gl、S005 ⑶-A5、S005 ⑶-A9、S005 ⑶-All、S005 ⑶-C11、S005 ⑶-D12、S005 ⑶-D8、S005 ⑶-H12、S005 ⑷-A2、S005 ⑷-A3、S005 ⑷-A8、S005 (4)-B8、S005 (4)-G1、S005 (4)_G2、S005 (5)_A5、S005 (5)_B7、S005 (5)_E11、
S005(5) -G6、S005 (5) -G9、S005 (5) -H2、S005 (6) -13、S005 (6) -17、S005 (6) -49、S005 (7) -98、S005(7)-100、S005(7)-103、S005(7)_116、S005(7)_107、S005(7)_131、S005(7)_176、S005(7)-178、S005(7)-18U S005(7)_188、S005(7)_189、S005(8)_200、S005(8)_194、S005(8)-211、S005(8)-212、S005(8)_213、S005(8)_216、S005(8)_224、S005(8)_235、S005(8)-236、S005(8)-254、S005(8)_259、S005(8)-26U S005(8)_286、S005(8)_264、S005(9)-293、S005(9)-299、S005(9)_304、S005(9)_308、S005(9)_310、S005(9)_312、S005(9)-317、S005(9)-329、S005(9)_333、S005 (9)-350、、S005(9)_355、S005(9)_357、S005(9)-358、S005(9)-359、S005(9)_371、S005 (10)-388、S005 (10)-390、S005 (10)-401、
5007⑶-Gil、S007(6)-34、S007(7)_107、S007 ⑴-178、S007(8)_192、S007(8)_259、S007(10)-420，序列如 SEQ ID N0.5" SEQ ID N0.122 所示。
[0014]103個(gè)桔小實(shí)蠅抗高效氯氰菊酯特異性基因片段是:S002(1)-A3、S002(1)_B4、S002⑶-D9、 S002⑶-E7、 S002(4)_C10、 S002⑷-E4、 S002(4)_F8、 S002(5)_E5、S002 (6)-16, S002(6)-19, S002 (6)-82, S002(8)_270、S002(10)-416、S002 (10)-452、
5002(10)-444、S008(l)-B2、S008 (I)-DlU S008 (1)_D5、S008(1)_D6、S008(1)_E3、S008⑴-F10、 S008⑴-F12、 S008⑵-B1、 S008⑵-F10、 S008(2)_F12、 S008⑵-Gl、
5008⑶-BIO、S008(3)-C11、S008 ⑶-DIO、S008(5)_B12、S008(5)_B8、S008(5)_C7、S008 (5)-E5、S008 (5)-G11、S008 (5)_H2、S008 (6)_14、S008 (6)_29、S008 (6)_42、S008 (6)-58、S008 (6)-64、S008 (6)_77、S008 (6)_85、S008 (6)_93、S008 (7)_130、S008(7)-135、S008 (8)-276, S003 (I)-AlO, S003 (1)_B6、S003(1)_D7、S003(1)_E1、
5003(I) -E9、S003 (I) -F2、S003 (I) -F5、S003 (I) -F9、S003 (I) -G4、S003 (2) -C6、S003 (2) -D4、S003 ⑵-D5、S003 ⑵-E7、S003 ⑵-F3、S003 ⑵-G5、S003 ⑶ _F1、S003 (3)_H10、S003⑷-A8、 S003⑷-Cl、 S003(4)_C12、 S003⑷_F1、 S003⑷-G6、 S003(5)_B11、
S003(5) -B2、S003 (5) -B8、S003 (5) -E6、S003 (5) -H5、S003 (6) -8、S003 (6) -32、S003 (6) -51、S003(6)-74、S003 (6)-81, S003(6)_92、S003(7)_151、S003(7)_160、S003(7)_165、S003(7)-167、S003(7)-175、S003(8)_196、S003(8)_204、S003(8)_220、S003(8)_224、S003(8)-231、S003(8)-249、S003(8)_271、S003(8)_284、S003(8)_288、S003(9)_311、S003(9)-312、S003(9)-321、S003(9)_352、S003(10)-395、S003 (10)-404、S003(10)-405、S003(10)-406、S003(10)-432、S003(10)-469，序列如 SEQ ID N0.123~SEQ ID N0.225 所示。
[0015]本發(fā)明提供的cDNA芯片的構(gòu)建方法如下:
51.SSH文庫(kù)構(gòu)建:分別提取桔小實(shí)蠅敏感品系、敵百蟲抗性品系和高效氯氰菊酯抗性品系的RNA，按本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建SSH文庫(kù)的策略和方法(Li，2011)，分別構(gòu)建與抗敵百蟲和抗高效氯氰菊酯相關(guān)的SSH文庫(kù)；
52.從SI構(gòu)建的兩個(gè)文庫(kù)中分別隨機(jī)挑選2820個(gè)差減重組克隆子，然后搖菌、提取重組質(zhì)粒DNA ；
53.分別以S2獲得的重組質(zhì)粒DNA為模板，以接頭引物NestedPCR Primer IF (SEQID N0.1)和 Nested PCR Primer 2R (SEQ ID N0.2)進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，將各基因 PCR 產(chǎn)物凝膠電泳檢測(cè)其濃度和片段的單一性，并進(jìn)行純化回收；
54.將S3純化產(chǎn)物采用芯片點(diǎn)樣儀點(diǎn)樣于化學(xué)修飾的載玻片載體上，同時(shí)設(shè)置陽性和陰性對(duì)照，得到初始基因芯片； 55.分別采用構(gòu)建SSH文庫(kù)時(shí)使用的抗性品系總RNA和敏感品系總RNA為檢測(cè)樣，對(duì)
S4得到的初始基因芯片進(jìn)行DNA芯片雜交，去除假陽性差異基因，選擇在基因芯片上雜交后上調(diào)信號(hào)值大于等于2的樣品為抗性相關(guān)差異表達(dá)基因；
56.以S5得到的抗性相關(guān)差異表達(dá)基因的重組質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物同S3所述，對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行純化回收并測(cè)序，序列采用DNAstar軟件進(jìn)行拼接組裝，去除重復(fù)和冗繁序列，挑取出單一非重疊序列作為特異性抗性相關(guān)靶標(biāo)基因。
[0016]S7.將S6得到的特異性抗性相關(guān)靶標(biāo)基因利用基因芯片點(diǎn)樣儀點(diǎn)樣于化學(xué)修飾的玻璃片載體上，同時(shí)設(shè)置陽性和陰性對(duì)照，委托北京博奧生物有限公司構(gòu)建檢測(cè)桔小實(shí)蠅抗敵百蟲和抗高效氯氰菊酯的抗性水平的cDNA芯片。
[0017]其中，步驟SI所述SSH文庫(kù)構(gòu)建的具體操作包括接頭連接、第一次扣除雜交、第二次扣除雜交、第一次抑制性PCR、第二次抑制性PCR ;利用桔小實(shí)蠅看家基因G6PDH進(jìn)行半定量PCR，分別檢測(cè)所述接頭連接和消減雜交效率，引物序列為G6TOH-F:5’ -GCTGCCGAAACCTACAAA-3’ (SEQ ID N0.3)，G6PDH-R:5’ -CGCTTATCATAGCCACCC-3’ (SEQID N0.4)，擴(kuò)增片段中不含Tfea I酶切位點(diǎn)。
[0018]步驟S7所述化學(xué)修飾的玻璃片載體是指:通過化學(xué)反應(yīng)在載體表面上引入氨基官能團(tuán)，使DNA能夠與表面官能團(tuán)能共價(jià)結(jié)合，穩(wěn)定地固化于支持物表面。
[0019]本發(fā)明具有以下有益效果:
本發(fā)明首次采用基因芯片技術(shù)，發(fā)掘并尋找桔小實(shí)蠅抗藥性相關(guān)基因片段，然后利用抗性相關(guān)基因片段點(diǎn)制成特異性靶標(biāo)抗性相關(guān)cDNA芯片，對(duì)桔小實(shí)蠅抗性水平進(jìn)行監(jiān)測(cè)。可以同時(shí)對(duì)抗藥性及敏感蟲體內(nèi)的成千上萬個(gè)不同基因進(jìn)行差異表達(dá)定量檢測(cè)，過程簡(jiǎn)單有效，彌補(bǔ)了傳統(tǒng)生測(cè)方法的不足，實(shí)現(xiàn)高通量、快速、準(zhǔn)確實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)桔小實(shí)蠅抗性發(fā)展，從而延緩其抗藥性，實(shí)現(xiàn)食品生產(chǎn)安全。
[0020]另外，分別通過對(duì)抗敵百蟲3.21倍、16.8倍和69.5倍及抗高效氯氰菊酯5.3倍、21.6倍和160.9倍桔小實(shí)蠅成蟲品系抗性相關(guān)基因表達(dá)水平的檢測(cè)表明，該基因芯片具有高通量、集成化和微型化的優(yōu)點(diǎn)。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0021]圖1為初始基因芯片篩選SSH克隆文庫(kù)雜交掃描圖。
[0022]圖2為本發(fā)明制備cDNA芯片檢測(cè)桔小實(shí)蠅抗性品系雜交掃描圖。
【具體實(shí)施方式】
[0023]以下結(jié)合具體實(shí)施例來進(jìn)一步說明本發(fā)明，除非特別說明，本發(fā)明采用的試劑、設(shè)備和實(shí)驗(yàn)方法為本【技術(shù)領(lǐng)域】常規(guī)試劑、設(shè)備和方法。[0024]本發(fā)明實(shí)施例消減雜交(SSH)采用Clontech公司生產(chǎn)的試劑盒(購(gòu)自廣州瑞真生物公司，具體操作參照本實(shí)驗(yàn)室李怡峰博士論文進(jìn)行);PCR擴(kuò)增試劑、感受態(tài)細(xì)胞DH5 a購(gòu)自瑞真生物公司，總RNA提取試劑Trizol購(gòu)自Invitrogen公司，克隆載體pGEM_T購(gòu)自Promega 公司。
[0025]分子生物學(xué)基本操作:瓊脂糖凝膠電泳、PCR產(chǎn)物純化回收、克隆連接、轉(zhuǎn)化、質(zhì)粒提取、酶切鑒定等分子生物學(xué)操作按照《分子克隆實(shí)驗(yàn)操作指南》(科學(xué)出版社，第三版，黃培堂編譯，2002年)操作。序列測(cè)序有上海英濰捷基公司廣州分公司完成。
[0026]實(shí)施例1檢測(cè)桔小實(shí)蠅抗敵百蟲和高效氯氰菊酯抗性水平的cDNA芯片的構(gòu)建 1、桔小實(shí)蠅抗敵百蟲和高效氯氰菊酯抗性品系SSH文庫(kù)的構(gòu)建
(I)結(jié)小實(shí)妮抗性品系選育:
用試驗(yàn)室飼養(yǎng)保留的敏感品系作為抗藥性品系篩選的親代Ftl，在室內(nèi)同一條件下飼養(yǎng)，采用藥膜法，分別用敵百蟲和高效氯氰菊酯進(jìn)行逐代篩選。
[0027]敏感品系Ftl的選擇標(biāo)準(zhǔn):敵百蟲對(duì)桔小實(shí)蠅成蟲敏感品系的致死中濃度LC50=2.65mg/L ;高效氯氰菊酯對(duì)桔小實(shí)蠅敏感品系的致死中濃度LC5(I=3.36mg/L。
[0028]抗性品系的獲得:經(jīng)過一些代數(shù)的篩選后，敵百蟲篩選至22代后，敵百蟲對(duì)桔小實(shí)蠅成蟲的致死中濃度LC5Q=184.17mg/L ;高效氯氰菊酯篩選至24代后，高效氯氰菊酯對(duì)桔小實(shí)蠅成蟲的致死中濃度為L(zhǎng)C5(i=538.49mg/L。
[0029]具體篩選步驟為:首先測(cè)定親代(Ftl)對(duì)敵百蟲和高效氯氰菊酯的毒力敏感基線，然后采用藥膜法，以致死中濃度(LC5tl)對(duì)種群進(jìn)行抗藥性篩選；以丙酮稀釋藥劑至親代LC50濃度，均勻涂布于250mL錐形瓶中，待丙酮完全揮發(fā)后，放入50-60頭羽化后3_5天的桔小實(shí)蠅成蟲，用醫(yī)用紗布封口，倒置24hr，條件為:光周期:14hr光照:10hr黑暗，溫度26-30°C，濕度:60%-95%。24hr后，存活下來的成蟲移入養(yǎng)蟲籠中用人工飼料飼養(yǎng)。連續(xù)處理三代。從第四代開始根據(jù)第三代成蟲的LC5tl濃度處理接下來的三代，以此類推，使其種群獲得抗藥性，得到桔小實(shí)蠅抗敵百蟲和抗高效氯氰菊酯成蟲品系。
[0030](2)分別以步驟(1)中各抗性品系為檢測(cè)子，以敏感品系成蟲為驅(qū)動(dòng)子，分別構(gòu)建各抗性品系特異性差異基因表達(dá)文庫(kù)。
[0031]構(gòu)建的特異性差異基因表達(dá)文庫(kù)經(jīng)過兩輪消減雜交和2次選擇性PCR后，獲得了庫(kù)容量為9.48 X IO3的桔小實(shí)蠅成蟲抗敵百蟲品系差異基因表達(dá)文庫(kù)，庫(kù)容量為1.05 X IO4的桔小實(shí)蠅成蟲抗高效氯氰菊酯品系差異基因表達(dá)文庫(kù)。
[0032]2、初始基因芯片的制備
(I)從抗敵百蟲和抗高效氯氰菊酯品系SSH文庫(kù)中分別隨機(jī)挑選2820個(gè)差減重組克隆子，然后搖菌、提取重組質(zhì)粒DNA。
[0033](2)采用 Nested PCR Primer IF(序列見 SEQ ID N0.1)和 Nested PCR Primer 2R(序列見SEQ ID N0.2)引物分別PCR擴(kuò)增每一個(gè)重組質(zhì)粒。PCR體系包括IOXPCR BufferIOu L, 2.5mmol/L dNTP 8 u L、F/2R 引物(10 y mol/L)各 4 y L，重組質(zhì)粒 DNA 模板 10_50ng、Taq DNA 聚合酶(5U/ii L) 0.L，加無菌水至 IOOii L。PCR 反應(yīng)參數(shù):94°C變性 30S，68°C退火30S, 72°C延伸1.5min, 35個(gè)循環(huán)，72°C延伸5min。
[0034](3)用酒精- 異丙醇法沉淀純化PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，凝膠電泳檢測(cè)其濃度和片段的單一性，以桔小實(shí)蠅G6H)H、28S和P -actin基因?yàn)閮?nèi)參基因?qū)φ眨a(chǎn)物送北京博奧生物有限公司點(diǎn)制成芯片，純化產(chǎn)物采用芯片點(diǎn)樣儀點(diǎn)樣于化學(xué)修飾的載玻片、硅片、膜或高分子材料等載體上。芯片樣品還包括Hex作為陽性對(duì)照，Blank (點(diǎn)樣溶液)作為陰性對(duì)照。整個(gè)點(diǎn)陣分為32個(gè)亞陣列，亞陣列有12列，11行，點(diǎn)間距為150 u m,點(diǎn)的直徑約為100 u m,每個(gè)樣品在芯片上重復(fù)3次。
[0035]3、cDNA芯片雜交確定桔小實(shí)蠅成蟲抗敵百蟲和抗高效氯氰菊酯抗性相關(guān)基因片段
分別采用構(gòu)建SSH文庫(kù)時(shí)使用的抗性品系總RNA和敏感品系總RNA為檢測(cè)樣，進(jìn)行cDNA芯片雜交，去除假陽性差異基因；選擇在基因芯片上雜交后上調(diào)信號(hào)值大于等于2的樣品為抗性差異表達(dá)片段；以重組質(zhì)粒為模板，上述Nested PCR Primer IF和Nested PCRPrimer 2R引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增體系與反應(yīng)參數(shù)同步驟(2)所述，對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行純化回收并測(cè)序，序列采用DNAstar軟件進(jìn)行拼接組裝，去除重復(fù)和冗繁序列，挑取出單一非重疊序列序列作為抗性相關(guān)特異性靶片段。
[0036]芯片雜交:探針RNA樣品的熒光標(biāo)記采用晶芯? cRNA擴(kuò)增標(biāo)記試劑盒(博奧生物有限公司，產(chǎn)品目錄號(hào):360060-10)，具體操作按照說明書進(jìn)行。標(biāo)記的DNA溶于80 ill雜交液中(3XSSC，0.2%SDS, 5 X Denhart’s，25%甲酰胺)，于42 °C雜交過夜。雜交結(jié)束后，先在42°C左右含0.2% SDS, 2 X SSC的液體中洗5 min，而后在0.2 X SSC中室溫洗5 min。玻片甩干后即可用于掃描。
[0037]芯片掃描:芯片用LuxScan IOKA雙通道激光掃描儀進(jìn)行掃描。
[0038]芯片圖像的采集與數(shù)據(jù)分析:采用LuxScan 3.0圖像分析軟件(CapitalBio公司)對(duì)芯片圖像(圖1)進(jìn)行分析，把圖像信號(hào)轉(zhuǎn)化為數(shù)字信號(hào)；根據(jù)cy5和cy3總體信號(hào)的整體平均值(global mean)對(duì)各芯片進(jìn)行片間線性校正；使用Lowess方法進(jìn)行片內(nèi)歸一化；每個(gè)基因有三個(gè)以上重復(fù)比值，即用SAM軟件進(jìn)行分析，F(xiàn)DR控制在5%以內(nèi)，再以2倍標(biāo)準(zhǔn)篩選差異表達(dá)基因。
[0039]4、檢測(cè)cDNA芯片的制備
對(duì)3中選取的差異表達(dá)片段的重組質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增引物、體系與反應(yīng)參數(shù)同步驟2 (2)所述，產(chǎn)物純化后片段點(diǎn)制成cDNA芯片，方法同上述初始基因芯片的制備。
[0040]實(shí)施例2本發(fā)明制備的cDNA芯片對(duì)桔小實(shí)蠅抗性品系抗藥性的檢測(cè) 1、桔小實(shí)蠅抗性品系的選育
用試驗(yàn)室飼養(yǎng)保留的敏感品系作為抗藥性品系篩選的親代H)，在室內(nèi)同一條件下飼養(yǎng)，采用藥膜法，分別用敵百蟲和高效氯氰菊酯進(jìn)行逐代篩選。具體步驟同前述。結(jié)果分別獲得了抗敵百蟲3.21倍、18.23倍和69.5倍抗性品系；抗高效氯氰菊酯6.8倍、16.2倍和160.74倍品系。冋時(shí)，測(cè)定了抗聞效氣氛菊酷160.74倍品系對(duì)敵百蟲的交互抗性為21.20倍。
[0041]2、結(jié)小實(shí)妮抗性品系和敏感品系樣品總RNA的提取
分別取選育的每一個(gè)抗性品系和敏感品系羽化后3飛天的成蟲提取總RNA (雌雄各8頭)，總RNA提取采用Trizol ( Invitrogen)試劑法,具體操作參照試劑說明。樣品破碎采用玻璃珠研磨法,研磨器為MiniBeadbeater-16研磨珠均質(zhì)器(Biospec,美國(guó))。
[0042]總RNA質(zhì)量檢測(cè):RNA提取完成后，取2 U L用微量紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA樣品的濃度與純度，高質(zhì)量的RNA樣品0D26(i/28(i應(yīng)在1.9^2.1之間。取5 ii L用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其質(zhì)量，桔小實(shí)蠅RNA質(zhì)量判定標(biāo)準(zhǔn):28S條帶亮度較弱，18S、5S條帶較明亮，符合昆蟲物種中大部分總RNA存在隱裂現(xiàn)象。
[0043]3、熒光標(biāo)記及雜交
各抗性品系和敏感品系總RNA的反轉(zhuǎn)錄、熒光標(biāo)記和雜交方法同前述。芯片掃描和圖像采集與數(shù)據(jù)分析均同前述，檢測(cè)結(jié)果見圖2。
[0044]4、cDNA芯片檢測(cè)結(jié)果
(I)抗敵百蟲品系cDNA芯片檢測(cè)結(jié)果
抗敵百蟲3.21倍品系相對(duì)于敏感品系，其上調(diào)差異表達(dá)基因共有12個(gè)，抗敵百蟲18.23倍品系相對(duì)于敏感品系，其上調(diào)差異表達(dá)基因共有50個(gè)，抗敵百蟲69.5倍品系相對(duì)于敏感品系，其上調(diào)差異表達(dá)基因共有51個(gè)(如表1和表2所示)。
[0045]抗高效氯氰菊酯160.74倍品系(對(duì)敵百蟲的交互抗性為21.20倍)相對(duì)于敏感品系在抗敵百蟲特異性表達(dá)基因芯片中的上調(diào)表達(dá)基因有43個(gè)(如表1和表2所不)。
[0046]表1桔小實(shí)蠅成蟲抗敵百蟲差異上調(diào)表`達(dá)基因
【權(quán)利要求】
1.一種檢測(cè)桔小實(shí)蠅抗敵百蟲和高效氯氰菊酯抗藥性水平的cDNA芯片，其特征在于，包含221個(gè)靶基因DNA探針；其中118個(gè)靶基因DNA探針為桔小實(shí)蠅抗敵百蟲抗性相關(guān)特異性基因片段，103個(gè)靶基因DNA探針為桔小實(shí)蠅抗高效氯氰菊酯抗性相關(guān)特異性基因片段。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述cDNA芯片，其特征在于，所述的118個(gè)桔小實(shí)蠅抗敵百蟲抗性相關(guān)特異性基因片段是:S004(4)-A9、S004(4)_B7、S004(4)-D6、S004(4)_H9、S004(5)-BIO、S004(5)-B5、S004(5)-C10、S004(5)_C7、S004(5)_D1、S004(5)_D10、S004(5)_D11、5004(5) -GU S004(5)-H3、S004 (5)_H7、S004(6)_10、S004 (6)_12、S004(6)_18、S004(6)-21、S004 ⑴-100、S004(7)_109、S004(7)_138、S004(7)_156、S004(7)_165、S004(7)-183、S004(8)-197、S004(8)_199、S004(8)_217、S004(8)_225、S004(8)_240、S004(8)-248、S004(9)-293、S004(9)_308、S004(9)_328、S004 (10)-394、S004 (10)-401、S004(10)-443、S004(10)-471、S005(1)_A1、S005(1)_B2、S005(1)_C1、S005(1)_D12、5005(I) -G8、S005 (2) -A8、S005 (2) -C7、S005 (2) -E8、S005 (2) -Gl、S005 (3) -A5、S005 (3) -A9、S005⑶-All、 S005(3)-C11、 S005⑶-D12、 S005⑶-D8、 S005⑶-H12、 S005⑷-A2、S005 (4) -A3、S005 (4) -A8、S005 (4) -B8、S005 (4) -Gl、S005 (4) -G2、S005 (5) -A5、S005 (5) -B7、S005 (5)-E11、S005 (5)-G6、S005 (5)_G9、S005 (5)_H2、S005 (6)_13、S005 (6)_17、S005(6)-49、S005(7)-98、S005(7)_100、S005(7)_103、S005(7)_116、S005(7)_107、S005(7)-131、S005(7)-176、S005(7)_178、S005(7)_181、S005(7)_188、S005(7)_189、S005(8)-200、S005(8)-194、S005(8)_211、S005(8)_212、S005(8)_213、S005(8)_216、S005(8)-224、S005(8)-235、S005(8)_236、S005(8)_254、S005(8)_259、S005(8)-26US005(8)-286、S005(8)-264、S005(9)_293、S005(9)_299、S005(9)-304, S005(9)_308、S005(9)-310、S005(9)-312、S005(9)_317、S005(9)_329、S005(9)_333、S005(9)_350、S005(9)-355、S005(9)-357、S005(9)_358、S005(9)_359、S005(9)_371、S005 (10)-388、S005(10)-390、S005(10)-401、S007 ⑶-Gil、S007(6)_34、S007 (7)-107, S007 (7)-178,S007(8)-192、S007(8)-259、S007(10)-420，序列如 SEQ ID N0.5" SEQ ID N0.122 所示; 所述的103個(gè)桔小實(shí)蠅抗高效氯氰菊酯抗性相關(guān)特異性基因片段是:S002(1)-A3、5002⑴-B4、S002 ⑶-D9、S002 ⑶-E7、S002 ⑷-CIO、S002 ⑷-E4、S002 (4)_F8、S002(5)-E5、S002(6)-16、S002 (6)-19, S002(6)_82、S002(8)_270、S002 (10)-416、S002(10)-452、S002(10)-444、S008(1)_B2、S008(1)_D11、S008(1)_D5、S008(1)_D6、S008⑴-E3、 S008⑴-F10、 S008⑴-F12、 S008⑵-B1、 S008(2)_F10、 S008⑵-F12、S008⑵-Gl、 S008⑶-BIO、 S008(3)_C11、 S008⑶-DIO、 S008(5)_B12、 S008(5)_B8、S008 (5)-C7、S008 (5)-E5、S008 (5)_G11、S008 (5)_H2、S008 (6)_14、S008 (6)_29、S008 (6)-42、S008 (6)-58, S008 (6)_64、S008 (6)_77、S008 (6)_85、S008 (6)_93、S008(7)-130、S008(7)-135、S008 (8)-276, S003(1)_A10、S003(1)_B6、S003(1)_D7、5003(I) -El、S003 (I) -E9、S003 (I) -F2、S003 (I) -F5、S003 (I) -F9、S003 (I) -G4、S003 (2) -C6、S003(2)-D4、 S003⑵-D5、 S003⑵-E7、 S003⑵-F3、 S003⑵-G5、 S003⑶_F1、S003(3)-H10、S003 ⑷-A8、S003 ⑷-Cl、S003 ⑷-C12、S003 ⑷ _F1、S003 ⑷-G6、S003 (5) -BH、S003 (5) -B2、S003 (5) -B8、S003 (5) -E6、S003 (5) -H5、S003 (6) -8、S003 (6) -32、S003(6)-51、S003(6)-74、S003 (6)-81, S003 (6)_92、S003 (7)_151、S003 (7)_160、S003(7)-165、S003(7)-167、S003(7)_175、S003(8)_196、S003(8)_204、S003(8)_220、S003(8)-224、S003(8)-23U S003(8)_249、S003(8)_271、S003(8)_284、S003(8)_288、S003(9)-311、S003(9)-312、S003(9)_321、S003(9)_352、S003 (10)-395、S003 (10)-404、S003(10)-405、S003(10)-406、S003(10)-432、S003(10)-469 ;序列如 SEQ ID N0.123~SEQID N0.225 所示。
3.權(quán)利要求1所述DNA芯片的構(gòu)建方法，其特征在于，步驟如下: 51.抑制性消減雜交(suppressionsubtractive hybridization, SSH)分別構(gòu)建桔小實(shí)蠅抗敵百蟲和抗高效氯氰菊酯抗性品系SSH文庫(kù)； 52.從SI構(gòu)建的兩個(gè)文庫(kù)中分別隨機(jī)挑選差減重組克隆子，提取重組質(zhì)粒DNA； 53.分別以S2獲得的重組質(zhì)粒DNA為模板，以NestedPCR Primer IF (SEQ ID N0.1)和Nested PCR Primer 2R (SEQ ID N0.2)為接頭引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，檢測(cè)各PCR產(chǎn)物濃度和片段的單一性，純化回收得到產(chǎn)物； 54.將純化回收得到的產(chǎn)物點(diǎn)樣于化學(xué)修飾的載體上，同時(shí)設(shè)置陽性和陰性對(duì)照，得到初始基因芯片； 55.分別采用步驟SI構(gòu)建文庫(kù)時(shí)使用的抗性品系總RNA和敏感品系總RNA為檢測(cè)樣，進(jìn)行DNA芯片雜交，去除假陽性差異基因，選擇在基因芯片上雜交后上調(diào)信號(hào)值大于2的樣品為抗性相關(guān)差異表達(dá)基因片段； 56.以S5得到的抗性 相關(guān)差異表達(dá)基因片段的重組質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物同S3所述，對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行純化回收、測(cè)序、拼接組裝，去除重復(fù)和冗繁序列，挑取出單一非重疊序列作為特異性抗性靶標(biāo)基因； 57.將S6得到的特異性抗性靶標(biāo)基因點(diǎn)樣于化學(xué)修飾的載體上，同時(shí)設(shè)置陽性和陰性對(duì)照，構(gòu)建得到檢測(cè)桔小實(shí)蠅抗敵百蟲和高效氯氰菊酯的抗性水平的cDNA芯片。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述cDNA芯片的構(gòu)建方法，其特征在于，S4和S7所述的載體為載玻片材料。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述cDNA芯片的構(gòu)建方法，其特征在于，S7所述的化學(xué)修飾是指通過化學(xué)反應(yīng)在載體表面上引入氨基官能團(tuán)，使DNA能夠與表面官能團(tuán)能共價(jià)結(jié)合，穩(wěn)定地固化于支持物表面。
6.權(quán)利要求1所述cDNA芯片在檢測(cè)桔小實(shí)蠅抗敵百蟲和高效氯氰菊酯的抗性水平方面的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C40B50/06GK103614473SQ201310609364
【公開日】2014年3月5日 申請(qǐng)日期:2013年11月27日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月27日
【發(fā)明者】曾玲, 姜建軍, 陸永躍, 何曉芳, 梁廣文, 溫碩洋 申請(qǐng)人:華南農(nóng)業(yè)大學(xué)