專利名稱：血漿腎素的質(zhì)譜分析的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及腎素活性的測量。在一個具體方面，本發(fā)明涉及通過HPLC-質(zhì)譜法測 量血漿腎素活性的方法。
背景技術(shù)：
下列發(fā)明背景的描述只是提供用來輔助理解本發(fā)明，并非承認描述或構(gòu)成本發(fā)明 的現(xiàn)有技術(shù)。如Fredline等Clin. Chem. 45 =659-664(1999)所述，腎素是通過腎小球旁細胞分 泌到血液中的蛋白水解酶。腎素作用于血管緊張素原，生成被稱作血管緊張素I(Angl)的 十肽。Angl被血管緊張素轉(zhuǎn)換酶進一步切割，形成被稱作血管緊張素2 (Ang2)的八肽。Ang2 刺激細胞生長、鈉的腎小管運輸和醛固酮釋放。Ang2是人最有效的血管加壓劑之一，并在血 壓調(diào)控中起重要作用。Ang2由于其循環(huán)濃度非常低和半衰期極短而難于直接測量；比Ang2 更穩(wěn)定的Angl為測量腎素-血管緊張素系統(tǒng)的狀態(tài)提供了更好的分析物。由Angl的生成 速率確定“血漿腎素活性”(PRA)被臨床用于高血壓的診斷和控制。確定PRA的經(jīng)典方法是放射免疫測定(RIA)，參見Sealey，Clin. Chem. 37 1811-1819(1991) ；Shionoiri 等，Horm Res. 37 171-175 (1992)。典型的放射免疫測定通 過在試管中同時制備一系列標準和未知的混合物而進行，各混合物包含相同濃度的標記 抗原和特異性抗體。適當?shù)姆磻?yīng)時間后，通過多種技術(shù)中之一將標記抗原的抗體結(jié)合(B) 部分與游離(F)部分分離。將標準品的B/F比作為未標記抗原濃度的函數(shù)作圖(標準曲 線)，且通過將觀測到的B/F比與標準曲線進行比較來確定未知的抗原濃度。放射免疫測 定法基于競爭性結(jié)合原理，且所用的抗體可進行與其它血漿蛋白如內(nèi)源血管緊張素的非特 異性結(jié)合。這種潛在的交叉反應(yīng)性可引起PRA的過高評價。另一個方法是在用RIA定量前 利用HPLC從其它血管緊張素中分離Angl (參見下列實例Meng等，J. Am. Soc. Nephrol. 6 1209-1215(1995) ；Meng 等，J. Chromatogr. 21，614 (1) 19-25 (1993) ；Kohara 等，P印tides 12 :1135-1141(1991))。已利用紫外光、熒光和質(zhì)譜檢測發(fā)展了用于定量Angl的這些HPLC 法(參見下列實例:Klickstein 等，Anal Biochem 120 146-150 (1982) ；Miyazaki 等，J Chromatogr. 490 :43_51(1989)和 Fredline 等，Clin. Chem. 45 :659_664(1999))。例如，F(xiàn)redline等描述了利用HPLC-電噴霧-串聯(lián)質(zhì)譜法進行血漿腎素活性的測 量。在進行該測量中，F(xiàn)redline等在水敏性酶抑制劑(即，苯甲基磺酰氟(PMSF))存在下 溫育血漿樣本，并通過觀測具有(m/z)649的前體離子的碰撞誘導(dǎo)解離來測量溫育期間生 成的血管緊張素1量。發(fā)明概述本發(fā)明提供了通過質(zhì)譜法測量樣本中血管緊張素1的量和測量樣本中血漿腎素 活性的方法，所述質(zhì)譜法包括串聯(lián)質(zhì)譜法。一方面，提供測量樣本中血管緊張素1的量的方法。該方法可包括(a)電離樣本 中的血管緊張素1，產(chǎn)生一種或更多種可由質(zhì)譜法檢測的離子；(b)通過質(zhì)譜法檢測血管緊 張素1離子(一種或更多種)的量，其中該離子選自質(zhì)/荷比為433. O士0. 5,619. 4士0. 5、647. 4士0. 5和1297 士0. 5的離子；以及(c)利用所檢測的血管緊張素1離子(一種或更多 種)的量來測量樣本中血管緊張素1的量。在一些實施方式中，該方法的定量極限是小于 或等于0. Ing/mL ；如小于或等于0. 05ng/mL ；如約0. 03ng/mL。在進一步的實施方式中，該 方法包括通過高效液相色譜(HPLC)從樣本純化血管緊張素1。在一些實施方式中，該方法 進一步包括用固相萃取柱純化樣本中的血管緊張素1。在其它實施方式中，通過與內(nèi)標的比 較，將血管緊張素1離子(一種或更多種)的量關(guān)聯(lián)于樣本中血管緊張素1的量。在一些 實施方式中，降解標準品可用于確定血管緊張素1生成后的降解程度。另一方面，提供測量樣本中血管緊張素1的量的方法。該方法可包括(a)電離 來自樣本的血管緊張素1，產(chǎn)生一種或更多種離子；以及(b)通過質(zhì)譜法測量至少一種 所述離子的量，其中所述離子選自具有下列質(zhì)/荷比的離子433. 0士0. 5,619. 4士0. 5、 647. 4士0.5和1297士0.5;以及其中所測的血管緊張素1離子(一種或更多種)的量提供 樣本中血管緊張素1的量的度量。在一些實施方式中，降解標準品可用于確定血管緊張素 1生成后的降解程度。另一方面，提供測量樣本中血管緊張素1的量的方法。該方法可包括(a)在適于 樣本中的腎素生成血管緊張素1的條件下，溫育與水穩(wěn)定性蛋白酶抑制劑預(yù)混合的樣本， 該水穩(wěn)定性蛋白酶抑制劑對腎素無效；(b)通過液相色譜從樣本中純化血管緊張素1 ;(c) 電離純化的血管緊張素1，產(chǎn)生一種或更多種可由質(zhì)譜檢測的離子；(d)通過質(zhì)譜檢測一種 或更多種血管緊張素離子的量；以及(e)利用所測的離子(一種或更多種)量來測量樣本 中血管緊張素1的量。在一些實施方式中，該方法的定量極限是小于或等于0. Ing/mL ；如 小于或等于0. 05ng/mL ；如約0. 03ng/mL。在進一步的實施方式中，由質(zhì)譜生成的離子選自 選自具有下列質(zhì)/荷比的離子:433. 0士0. 5、619. 4士0. 5、647. 4士0. 5禾口 1297士0. 5。在 相關(guān)的實施方式中，離子包括具有質(zhì)/荷比433. 0士0. 5的前體離子和一種或更多種碎片 離子，該碎片離子選自具有質(zhì)/荷比619. 4士0. 5和647. 4士0. 5的離子。在其它實施方 式中，通過與內(nèi)標的比較，將血管緊張素1離子(一種或更多種)的量關(guān)聯(lián)于檢測樣本中 血管緊張素1的量。在其它優(yōu)選實施方式中，該方法進一步包括用固相萃取柱純化樣本 中的血管緊張素1。在其它優(yōu)選實施方式中，水穩(wěn)定性蛋白酶抑制劑是氨乙基芐基磺酰氟 (aminoethylbenzylsulfonyl fluoride)。在一些實施方式中，降解標準品可用于確定血管 緊張素1生成后的降解程度。另一方面，提供測量樣本中血管緊張素1的量的方法。該方法可包括(a)在適于 樣本中的腎素生成血管緊張素1的條件下溫育樣本；(b)通過固相萃取從所述樣本中純化 血管緊張素1 ;(C)步驟(b)后，通過聯(lián)機處理的液相色譜進一步純化血管緊張素1 ;(d)電 離步驟(c)純化的血管緊張素1，產(chǎn)生一種或更多種可由質(zhì)譜法檢測的離子；以及(e)通過 質(zhì)譜檢測一種或更多種血管緊張素1離子的量，(f)利用所測的離子(一種或更多種)量來 測量樣本中血管緊張素1的量。在一些優(yōu)選實施方式中，液相色譜是高效液相色譜(HPLC)。 在其它實施方式中，該方法的定量極限是小于或等于0. Ing/mL ；如小于或等于0. 05ng/mL ； 如約0. 03ng/mL。在進一步的實施方式中，該方法包括生成離子，該離子包括選自具有下列 質(zhì)/荷比的離子的一種或更多種離子433. 0士0. 5,619. 4士0. 5,647. 4士0. 5禾口 1297士0. 5。 在相關(guān)的實施方式中，該方法包括生成血管緊張素1的前體離子，其中前體離子中至少一 種具有質(zhì)/荷比433.0士0.5。在相關(guān)的優(yōu)選實施方式中，該方法可包括生成血管緊張素1前體離子的一種或更多種碎片離子，其中碎片離子中至少一種具有質(zhì)/荷比619. 4士0. 5或 647. 4士0. 5。在進一步的實施方式中，溫育在對腎素無效的水穩(wěn)定性蛋白酶抑制劑的存在 下發(fā)生。在某些優(yōu)選實施方式中，水穩(wěn)定性蛋白酶抑制劑是氨乙基芐基磺酰氟。在一些實 施方式中，通過與內(nèi)標的比較，將血管緊張素1離子(一種或更多種)量關(guān)聯(lián)于檢測樣本中 血管緊張素1的量。在一些實施方式中，降解標準品可用于確定血管緊張素1生成后的降 解程度。另一方面，提供測量樣本中腎素活性的方法。該方法可包括(a)在適于樣本中的 腎素生成血管緊張素1的條件下溫育樣本；(b)通過固相萃取從樣本中純化血管緊張素1 ； (c)通過聯(lián)機處理的液相色譜進一步純化血管緊張素1 ;(d)電離純化的血管緊張素1，產(chǎn) 生一種或更多種可由質(zhì)譜法檢測的離子；(e)通過質(zhì)譜檢測一種或更多種血管緊張素1離 子的量；(f)利用所測的離子(一種或更多種)量來測量樣本中樣本中血管緊張素1的量； 以及(g)利用樣本中血管緊張素1的量來計算樣本中的腎素活性。在一些優(yōu)選實施方式 中，液相色譜是高效液相色譜(HPLC)。在另一個實施方式中，該方法的定量極限是小于或等 于0. Ing/mL ；如小于或等于0. 05ng/mL ；如約0. 03ng/mL。在進一步的實施方式中，該方法 包括生成血管緊張素1的前體離子，其中前體離子中至少一種具有質(zhì)/荷比433. 0士0. 5， 和生成血管緊張素1前體離子的一種或更多種碎片離子，該碎片離子選自具有質(zhì)/荷比 619. 4士0. 5或647. 4士0. 5的離子。在一些實施方式中，溫育在水穩(wěn)定性蛋白酶抑制劑的存 在下發(fā)生。在優(yōu)選的相關(guān)實施方式中，水穩(wěn)定性蛋白酶抑制劑是氨乙基芐基磺酰氟。在一 些實施方式中，通過與內(nèi)標的比較，將血管緊張素1離子(一種或更多種)量關(guān)聯(lián)于檢測樣 本中血管緊張素1的量。在一些實施方式中，降解標準品可用于確定血管緊張素1生成后 的降解程度。另一方面，提供測量樣本中腎素活性的方法。該方法包括(a)在適于樣本中的腎 素生成血管緊張素1的條件下，溫育與水穩(wěn)定性蛋白酶抑制劑預(yù)混合的樣本，該水穩(wěn)定性 蛋白酶抑制劑對腎素無效；(b)通過液相色譜純化血管緊張素1 ;(c)電離純化的血管緊張 素1，產(chǎn)生一種或更多種可由質(zhì)譜法檢測的離子；(d)通過質(zhì)譜檢測一種或更多種血管緊張 素1離子的量；(e)利用所測的離子(一種或更多種)量來測量所述樣本中血管緊張素1的 量；以及(f)利用樣本中血管緊張素1的量來計算樣本中的腎素活性。在一些優(yōu)選實施方 式中，液相色譜是高效液相色譜(HPLC)。在另一個實施方式中，該方法的定量極限是小于或 等于0. Ing/mL ；如小于或等于0. 05ng/mL ；如約0. 03ng/mL。在進一步的實施方式中，該方 法包括生成血管緊張素1的前體離子，其中前體離子中至少一種具有質(zhì)/荷比433. 0士0. 5， 和生成血管緊張素1前體離子的一種或更多種碎片離子，該碎片離子選自具有質(zhì)/荷比 619. 4士0.5或647. 4士0.5的離子。在一些優(yōu)選實施方式中，步驟(b)包括用固相萃取柱從 樣本中純化血管緊張素1。在進一步的實施方式中，水穩(wěn)定性蛋白酶抑制劑是氨乙基芐基磺 酰氟。在一些實施方式中，降解標準品可用于確定血管緊張素1生成后的降解程度。另一方面，提供測量樣本中腎素活性的方法。該方法包括(a)在適于樣本中的 腎素生成血管緊張素1的條件下溫育樣本；(b)通過液相色譜純化樣本中的血管緊張素1 ； (c)電離純化的血管緊張素1，產(chǎn)生一種或更多種可由質(zhì)譜法檢測的離子；(d)通過質(zhì)譜檢 測血管緊張素1離子(一種或更多種)的量，其中該離子(一種或更多種)選自具有下列 質(zhì) / 荷比的離子=433. 0士0. 5,619. 4士0. 5,647. 4士0. 5 和 1297士0. 5 ； (e)利用所檢測的離子(一種或更多種)的量來測量所述樣本中血管緊張素1的量；以及(f)利用樣本中血管 緊張素1的量來計算樣本中的腎素活性。在一些實施方式中，該方法的定量極限是小于或 等于0. Ing/mL ；如小于或等于0. 05ng/mL ；如約0. 03ng/mL。在一些實施方式中，溫育在水 穩(wěn)定性蛋白酶抑制劑的存在下發(fā)生。在優(yōu)選的相關(guān)實施方式中，水穩(wěn)定性蛋白酶抑制劑是 氨乙基芐基磺酰氟。在一些實施方式中，液相色譜是高效液相色譜(HPLC)。在一些實施方 式中，該方法的步驟(b)進一步包括用固相萃取柱純化血管緊張素1。在進一步的實施方式 中，通過與內(nèi)標的比較，將血管緊張素1離子(一種或更多種)的量關(guān)聯(lián)于檢測樣本中血管 緊張素1的量。在一些實施方式中，降解標準品可用于確定血管緊張素1生成后的降解程 度。在一些實施方式中，如果溫育約3小時后PRA低于0. 65ng血管緊張素/mL/hr，則 可將檢測樣本溫育較長一段時間(例如，直至約18小時)，從而建立PRA生成方案。優(yōu)選實施方式單獨地利用高效液相色譜(HPLC)、或利用高效液相色譜(HPLC)結(jié) 合一種或更多種純化方法來純化樣本中的血管緊張素1，所述一種或更多種純化方法例如 但不限于固相萃取技術(shù)或蛋白質(zhì)沉淀。在本文所公開方法的某些優(yōu)選實施方式中，在正離子模式下進行質(zhì)譜法?；蛘?，可 在負離子模式下進行質(zhì)譜法。在特別優(yōu)選的實施方式中，應(yīng)用正離子和負離子模式二者測 量血管緊張素1。在某些優(yōu)選實施方式中，利用電噴霧離子化(ESI)或基質(zhì)輔助激光解吸離 子化(MALDI)在正或負模式下測量血管緊張素1。在優(yōu)選實施方式中，質(zhì)譜儀中可檢測的血管緊張素1離子選自具有下列質(zhì)/荷 比(m/z)的離子1297 士 0. 5、756 士 0. 5、649 士 0. 5、647. 4 士 0. 5、619. 4 士 0. 5、534 士 0. 5、 506士0. 5,433. 0士0. 5、343士0. 5、255士0. 5和110士0. 5。在特別優(yōu)選的實施方式中，前體 離子具有質(zhì)/荷比433. 0士0. 5，并且碎片離子具有質(zhì)/荷比619. 4士0. 5或647. 4士0. 5。在優(yōu)選實施方式中，將可單獨檢測的同位素標記的血管緊張素1加入樣本作為內(nèi) 標。在這些實施方式中，將樣本中存在的內(nèi)源血管緊張素1和內(nèi)標的全部或部分電離，生成 大量質(zhì)譜儀中可檢測的離子，并且通過質(zhì)譜法檢測各自生成的一種或更多種離子。在相關(guān) 的實施方式中，同位素標記的血管緊張素1可包括13C和15N同位素標記的纈氨酸、精氨酸、 異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、苯丙氨酸脯氨酸亞基或其組合。在進一步的優(yōu)選實施方式中，同 位素標記的血管緊張素1具有纈氨酸亞基，其中碳原子被13C同位素取代且氮原子被15N同 位素取代，導(dǎo)致相對于天然血管緊張素1質(zhì)量增加6Da。在相關(guān)的優(yōu)選實施方式中，同位素 標記的血管緊張素1具有纈氨酸和異亮氨酸亞基，其中碳原子被13C同位素取代且氮原子被 15N同位素取代。這種同位素標記的血管緊張素1的質(zhì)量比天然血管緊張素1在標稱下高 13Da。在優(yōu)選實施方式中，通過與內(nèi)標的比較，將血管緊張素1離子(一種或更多種)的 存在和/或量關(guān)聯(lián)于檢測樣本中血管緊張素1的存在和/或量。在本文所公開方面的某些優(yōu)選實施方式中，血管緊張素1的定量極限(limit of quantitation, L0Q)小于或等于 0. Ing/mL ；如小于或等于 0. 05ng/mL ；如約 0. 03ng/ mL;以及血管緊張素1的定量上限(upper limit of quantitation, UL0Q)大于或等于 100，000fmol/mL。另一方面，提供用于血管緊張素1定量分析的試劑盒。試劑盒包含磷酸緩沖鹽水溶液中的氨乙基芐基磺酰氟(AEBSF)，其中所述磷酸緩沖鹽水溶液中的AEBSF以對至少一 次分析足夠的量存在。試劑盒可另外包含對至少一次分析足夠量的內(nèi)標和馬來酸。如本文所用，除非另外表述，單數(shù)形式“一(a)”、“一(an)”和“該(the) ”包括復(fù)數(shù) 指代物。因此，例如，對“一蛋白質(zhì)(a protein)”的提及包括多數(shù)蛋白質(zhì)分子。如本文所用，術(shù)語“純化”或“提純”并非指從樣本中去除目標分析物(一種或更 多種)之外的所有物質(zhì)。取而代之，純化是指相對于樣本中可干擾目標分析物檢測的其它 組分富集一種或更多種目標分析物的量的過程。本文中可通過多種方法純化樣本，以便允 許去除一種或更多種干擾物質(zhì)。例如，會干擾所選血管緊張素1母離子和子離子的質(zhì)譜檢 測的一種或更多種物質(zhì)。如本文所用，術(shù)語“檢測樣本”指可包含血管緊張素的任何樣本。如本文所用，術(shù) 語“體液”的意思是能從個體身體分離的任何液體。體液的實例包括血液、血漿、血清、膽汁、 唾液、尿液、眼淚、汗液及類似物。如本文所用，術(shù)語“色譜法”是指由液體或氣體運載的化學混合物分離為組分的過 程，這是由于化學實體在固定液相或固相周圍流動或流過固定液相或固相時的差別分布而 引起的。如本文所用，術(shù)語“液相色譜法”或“LC”意為這樣的過程在流體均勻地滲濾通過 細碎物的柱或滲濾通過毛細管通道時，流體溶液的一種或更多種組分的選擇性延遲。延遲 由該流體相對于固定相(一種或更多種)運動時混合物組分在一種或更多種固定相與本體 流體(bulk fluid)(即，流動相)之間的分布而引起。利用“液相色譜法”的分離技術(shù)的實 例包括反相液相色譜法(RPLC)、高效液相色譜法(HPLC)和湍流液相色譜法(TFLC)(有時被 稱為高湍流液相色譜法(HTLC)或高通量液相色譜法)。在一些實施方式中，可結(jié)合LC柱應(yīng) 用SPE柱。例如，可用TFLC萃取柱純化樣本，然后用HPLC分析柱另外純化。如本文所用，術(shù)語“高效液相色譜法”或“HPLC” (有時被稱為“高壓液相色譜法”) 指這樣的液相色譜法其中通過使流動相在壓力下穿過固定相來提高分離的程度，所述固 定相一般是緊密裝填的柱。如本文所用，術(shù)語“湍流液相色譜法”或“TFLC”(有時被稱為高湍流液相色譜法或 高通量液相色譜法)指這樣的色譜形式將所分析的物質(zhì)湍流穿過柱填料用作實現(xiàn)分離的 基礎(chǔ)。TFLC已被用于在質(zhì)譜分析前制備包含兩種未命名藥物的樣本。參見，例如，Zimmer 等，J Chromatogr A 854 :23_35 (1999)；同樣參見美國專利號 5，968，367、5，919，368、 5，795，469和5，772，874，其進一步說明了 TFLC。本領(lǐng)域技術(shù)人員理解“湍流”。當流體緩慢 和平穩(wěn)流動時，該流動被稱為“層流”。例如，以低速率穿過HPLC柱運動的流體為層流。在層 流中，流體顆粒的運動是有序的，顆?？傮w成直線運動。在較快的速度下，水的慣性克服流 體摩擦力，湍流產(chǎn)生。沒有觸及不規(guī)則界限的流體“超過”被摩擦減慢或被不均勻的表面偏 斜的流體。當流體湍流時，其以渦流和旋流(或漩渦)流動，具有比流體層流時更多的“拖 曳”。許多參考文獻可用于輔助確定何時流體流是層流或湍流(例如，Turbulent Analysis = Measurement and Prediction, P.S. Bernard & J.M.Wallace, John Wiley & Sons, Inc., (2000) ；An Introduction to Turbulent Flow,Jean Mathieu & Julian Scott,Cambridge University Press(2001))。如本文所用，術(shù)語“固相萃取”或“SPE”指這樣的方法其中由于溶于或懸浮于溶
10液(即，流動相)的組分對溶液所經(jīng)過的固體或經(jīng)過周圍的固體(即，固相)的親和力，化 學混合物被分離為組分。在一些實例中，隨流動相經(jīng)過固相或經(jīng)過固相周圍，不需要的流動 相組分可被固相保留，造成流動相中分析物的純化。在其它實例中，分析物可被固相保留， 使不需要的流動相組分經(jīng)過固相或固相周圍。在這些實例中，然后利用第二流動相將被保 留的分析物從固相洗脫，用于進一步的處理或分析。SPE——包括將湍流液相色譜(TFLC) 柱用作萃取柱，可通過單一或混合模式機制運行?；旌夏Ｊ綑C制在同一柱中應(yīng)用離子交換 和疏水保留；例如，混合模式SPE柱的固相可顯示強陰離子交換和疏水保留；或可顯示為柱 顯示強陽離子交換和疏水保留。如本文所用，術(shù)語“分析柱”指這樣的色譜柱其具有足夠的色譜板，從而實現(xiàn)從柱 洗脫的樣本中物質(zhì)的分離，其足以確定分析物的存在或含量。通常將這樣的柱與“萃取柱” 區(qū)分，萃取柱的主要目的是從非保留物質(zhì)中分離或萃取保留物質(zhì)，以便獲得純化的樣本用 于進一步分析。在優(yōu)選實施方式中，分析柱包含直徑約4 μ m的顆粒。如本文所用，術(shù)語“聯(lián)機(on-line) ”或“在線(in-line) ”例如用于“聯(lián)機自動方 式”或“聯(lián)機萃取”時，是指不需要操作員干預(yù)而進行的程序。例如，通過閥門和連接器管 道的仔細選擇，可按需將固相萃取柱和液相色譜柱連接，以使物質(zhì)從一個柱被送至下一個 柱，而不需要任何手動步驟。在優(yōu)選實施方式中，通過預(yù)設(shè)程序的計算機控制閥門和管道 的選擇，從而進行必要的步驟。最優(yōu)選地，將色譜系統(tǒng)也以這種聯(lián)機方式連接于檢測系統(tǒng)， 例如，MS系統(tǒng)。因此，操作員可在自動取樣器中放置多孔或多管樣本盤(tray)，并在計算 機控制下進行剩余的操作，導(dǎo)致全部所選樣本的純化和分析。相反，本文所用的術(shù)語“脫機 (off-line) ”指需要操作員手動干預(yù)的程序。因此，如果樣本經(jīng)歷沉淀且上清液隨后被手動 加樣到自動加樣器中，則沉淀和加樣步驟與隨后的步驟脫機。在本方法的多個實施方式中， 可以以聯(lián)機自動方式進行一個或更多個步驟。如本文所用，術(shù)語“質(zhì)譜法”或“MS”指通過其質(zhì)量識別化合物的分析技術(shù)。MS 指基于其質(zhì)荷比或“m/z”過濾、檢測和測量離子的方法。MS技術(shù)一般包括(1)電離化合 物，形成帶電化合物；和(2)測量帶電化合物的分子量，并計算質(zhì)荷比?？赏ㄟ^任何適當 的方法電離和檢測化合物?！百|(zhì)譜儀”一般包含電離器和離子檢測器?？傮w上，電離一種 或更多種目標分子，隨后將離子引入質(zhì)譜裝置，此處由于磁場和電場的組合，離子沿取決于 質(zhì)量(“m”)和電荷(“ζ”)的空間路徑行進。參見例如，美國專利號6，204，500，標題 % "Mass Spectrometry From Surfaces，，；6，107，623,標題為“Methods and Apparatus for Tandem Mass Spectrometry" ；6,268,"DNA Diagnostics Based On Mass Spectrometry" ；6, 124, 137,標題為 “Surface-Enhanced Photolabile Attachment And Release For Desorption And Detection Of Analytes，，;Wright等，Prostate Cancer and Prostatic Diseases 2 264-76(1999)；禾口 Merchant and Weinberger, Electrophoresis 21 1164-67(2000)。如本文所用，術(shù)語“正離子模式下操作”指那些生成和檢測正離子的質(zhì)譜法。如本 文所用，術(shù)語“負離子模式下操作”指那些生成和檢測負離子的質(zhì)譜法。如本文所用，術(shù)語“離子化”或“電離”指這樣的過程生成具有等于一個或更多個 電子單位的凈電荷的分析物離子。負離子是具有一個或更多個電子單位的凈負電荷的離 子，而正離子是具有一個或更多個電子單位的凈正電荷的離子。
如本文所用，術(shù)語“電子電離”或“EI”指這樣的方法其中氣相或蒸氣相中的目標 分析物與電子流相互作用。電子與分析物的碰撞產(chǎn)生分析物離子，該離子然后可經(jīng)受質(zhì)譜 技術(shù)。如本文所用，術(shù)語“化學電離”或“Cl”指這樣的方法其中反應(yīng)氣(例如，氨氣) 經(jīng)受電子碰撞，且通過反應(yīng)氣與分析物分子的相互作用生成分析物離子。如本文所用，術(shù)語“快原子轟擊(fast atom bombardment)，，或“FAB”指這樣的方 法其中高能原子束(通常為Xe或Ar)碰撞非揮發(fā)性樣本，解吸和電離樣本中包含的分子。 檢測樣本被溶于粘性液體基質(zhì)如甘油、硫代甘油、間硝基芐醇(m-nitrobenzyl alcohol), 18-冠-6冠醚(18-crown-6 crown ether)、2_硝基苯基辛醚、環(huán)丁砜、二乙醇胺和三乙醇胺 中。對化合物或樣本的適當基質(zhì)的選擇是經(jīng)驗法。如本文所用，術(shù)語“基質(zhì)輔助激光解吸離子化”或“MALDI，，指這樣的方法其中將 非揮發(fā)性樣本暴露于激光輻射，其通過多種離子化途徑使樣本中的分析物解吸和電離，該 離子化途徑包括光致電離、加質(zhì)子作用、去質(zhì)子作用和集群衰變(cluster decay) 0對于 MALDI，將樣本與能量吸收基質(zhì)混合，這促進分析物分子的解吸。如本文所用，術(shù)語“表面增強激光解析離子化”或“SELDI”指另一種方法，其中將 非揮發(fā)性樣本暴露于激光輻射，其通過多種離子化途徑使樣本中的分析物解吸和電離，該 途徑包括光致電離、加質(zhì)子作用、去質(zhì)子作用和集群衰變。對于SELDI，一般將樣本結(jié)合在優(yōu) 先保留一種或更多種目標分析物的表面。如MALDI，該方法也可利用能量吸收材料促進離子 化。如本文所用，術(shù)語“電噴霧離子化”或“ESI”指這樣的方法其中溶液沿短長度的 毛細管通過，對其末端應(yīng)用高的正電壓或負電壓。到達管末端的溶液被蒸發(fā)(霧化)為溶 劑蒸氣中的極小溶液液滴的噴射流或噴霧。該液滴霧流經(jīng)蒸發(fā)室，略微加熱該蒸發(fā)室以防 止冷凝和蒸發(fā)溶劑。隨液滴變小，表面電荷密度增加，直至這樣的時候相同電荷間的天然 排斥造成離子和中性分子被釋放。如本文所用，術(shù)語“大氣壓化學電離”或“APCI”指與ESI相似的質(zhì)譜法；但是，APCI 通過大氣壓下發(fā)生在血漿中的離子_分子反應(yīng)生成離子。通過噴霧毛細管和反電極間的放 電維持血漿。然后一般通過一組差異抽提截取過程的應(yīng)用將離子提取到質(zhì)量分析儀中?？?利用干燥并預(yù)加熱的N2氣的逆流來改進溶劑的去除。APCI中的氣相離子化可比ESI更有 效用于分析較小極性的種類。IiIl^ffi 白勺(Atmospheric Pressure Photoionization)" 或“APPI”指這樣的質(zhì)譜形式分子M的光致電離機制是光子吸收和電子噴射形成分子 離子M+。由于光子能量一般剛剛高于電離勢，分子離子較不易被分解。在許多情況下， 有可能不需要色譜法而分析樣本，從而節(jié)省了大量時間和成本。在水蒸汽或質(zhì)子溶劑存 在下，分子離子可提取H形成MH+。如果M具有高質(zhì)子親和力，這種情況趨于發(fā)生。其不 影響定量準確度，因為M+和MH+的總合是恒定的。質(zhì)子溶劑中的藥物化合物通常被觀 測為MH+，而非極性化合物如萘或睪酮通常形成M+。參見例如，Robb等，Atmospheric pressure photoionization :An ionization method for liquid chromatography-mass spectrometry. Anal. Chem. 72(15) :3653_59(2000)。如本文所用，術(shù)語“電感耦合等離子體”或“ICP”指這樣的方法其中樣本與部分電離的氣體在足夠高的溫度下相互作用，以使大部分元素霧化和電離。如本文所用，術(shù)語“場解吸”指這樣的方法其中將非揮發(fā)性檢測樣本放置在電離 表面上，且利用強電場生成分析物離子。如本文所用，術(shù)語“解吸”指分析物從表面的去除和/或分析物進入氣相。如本文所用，術(shù)語“定量極限”、“定量限值”或“L0Q”指測量在數(shù)量上有意義的點。 在該LOQ的分析物反應(yīng)是可識別的、離散的和可重現(xiàn)的，具有20%的精確度和80%至120% 的準確度。定量上限指分析物反應(yīng)的上部可計量線性范圍。如本文所用，術(shù)語“檢測極限”或“L0D”是測量值大于其相關(guān)的不確定性的點。任 意地將LOD限定為零濃度的3個標準偏差(SD)。關(guān)于定量測量——不包括離子質(zhì)量測量，本文所用的術(shù)語“約”指所述值加或減 10%。質(zhì)譜裝置在確定給定分析物的質(zhì)量方面可略微變化。在離子質(zhì)量或離子質(zhì)/荷比的 上下文中，術(shù)語“約”指+/-0. 5原子質(zhì)量單位。上述發(fā)明概述不具有限制性，根據(jù)以下發(fā)明詳述和根據(jù)權(quán)利要求書，本發(fā)明的其 它特征和優(yōu)勢將是顯而易見的。附圖簡述

圖1顯示Angl的碰撞誘導(dǎo)解離全掃描譜(m/z = 433. 0)。圖2顯示內(nèi)標的碰撞誘導(dǎo)解離全掃描譜(m/z = 434. 8)。圖3顯示Angl質(zhì)譜檢測的示例性校準曲線。圖4A、B和C分別顯示對于低濃度校準品，Angl (m/z = 433. 0士0. 5)、內(nèi)標(m/z = 434. 8士0. 5)和降解標準品(m/z = 437. 3士0. 5)的示例性質(zhì)量色譜圖。圖5A、B和C分別顯示對于顯示0. Ing/mL/hr的患者樣本，Angl (m/z = 433. 0士0. 5)、內(nèi)標(m/z = 434. 8士0. 5)和降解標準品(m/z = 437. 3士0. 5)的示例性質(zhì)量 色譜圖。發(fā)明詳述描述了用于測量樣本中血管緊張素1的量的方法。更具體地，描述了檢測和定量 與血漿樣本中腎素活性有關(guān)的血管緊張素1的方法。該方法利用液相色譜(LC)，最優(yōu)選 HPLC，來進行所選分析物的純化，并將該純化與獨特的質(zhì)譜(MS)法結(jié)合，從而提供檢測和 定量檢測樣本中血管緊張素1的高通量分析系統(tǒng)。優(yōu)選實施方式特別適合在大型臨床實 驗室中應(yīng)用，進行自動化PRA分析。所提供的方法具有增強的靈敏度，并在較短的時間內(nèi)完 成，以及具有比在其它PRA分析中所需較少的樣本制備。適當?shù)臋z測樣本包括可包含目標分析物的任何檢測樣本。在一些優(yōu)選實施方式 中，樣本是生物樣本；即，得自任何生物來源的樣本，如動物、細胞培養(yǎng)物、器官培養(yǎng)物等。在 某些優(yōu)選實施方式中，樣本得自哺乳動物，如狗、貓、馬等。特別優(yōu)選的哺乳動物是靈長類， 最優(yōu)選男性或女性人類。特別優(yōu)選的樣本包括血液、血漿、血清、唾液、腦脊髓液或其它組織 樣本。例如，這種樣本可得自患者；即，活人——男性或女性，其本人為了疾病或病癥的診 斷、預(yù)后或治療出現(xiàn)在臨床環(huán)境中。檢測樣本優(yōu)選得自患者，例如，血清或血漿。為了避免 血漿腎素原的不可逆冷激活，應(yīng)當將樣本在室溫下立即加工，或完全冷凍儲存并在使用前 立即解凍。 可應(yīng)用多種溫育條件以促進在色譜和或MS樣本分析前由腎素制備和生成血管緊張素1，以使分析可自動化。本發(fā)明合并了適于進行血管緊張素1生成的試劑合劑(reagent cocktail)的單次添加。反應(yīng)物合劑由在一個簡單步驟中預(yù)混合全部試劑而制備。通過用 水穩(wěn)定性酶抑制劑例如氨乙基芐基磺酰氟(AEBSF)替代一般應(yīng)用的水敏性酶抑制劑例如 苯甲基磺酰氟(PMSF)，實現(xiàn)試劑合劑的這一單一生成。這尤其可用于大樣本量的自動化，因 為勞動密集型分析設(shè)備(labor intensive assay setup)需要水基試劑和水敏性酶抑制劑 例如PMSF的混合。這種連續(xù)的添加需要各步驟之間劇烈的攪拌，從而保證溫育前試劑溶液 的同質(zhì)性。此外，應(yīng)當新制備PMSF，因為PMSF在水介質(zhì)中不穩(wěn)定。AEBSF具有比PMSF毒性 少得多的附加益處。根據(jù)本發(fā)明，包含水穩(wěn)定性AEBSF的試劑合劑與PMSF儲備液相比具有 意料之外的長穩(wěn)定性特征?？蓪⒑珹EBSF的試劑合劑在_20°C儲存直至約6個月、或在室溫 下儲存約一個星期。本發(fā)明考慮用于血管緊張素1定量分析的試劑盒。本發(fā)明所述的用于血管緊張素 1定量分析的試劑盒可包括這樣的試劑盒其包含對至少一次分析足夠量的磷酸緩沖鹽水 溶液中的AEBSF。本發(fā)明所考慮的試劑盒也可包含同位素標記的內(nèi)標和馬來酸。如果試劑 盒中需要包含降解標準品，可包含生成緩沖液(產(chǎn)生緩沖液，generation buffer)，該緩沖 液含有馬來酸、AEBSF和降解標準品。一般地，試劑盒也會包含以有形形式(例如，包含在 紙張或電子媒介上)記錄的、使用該包裝溶液用于測量分析來確定血管緊張素1含量的說 明書。利用模擬血清制備標準品和QC組，該模擬血清由用45mg/mL的牛血清白蛋白補充 的磷酸鹽緩沖液組成。沒有人或非人血漿或處理血清(stripped serum)來源被識別為不 包含可測量量的血管緊張素1。一般地，迅速解凍冷凍的血漿樣本和對照，從而防止在溫育前腎素原至腎素的冷 激活。將樣本在37°C溫育直至約3h。如果產(chǎn)生的樣本沒有生成令人滿意的PRA測量，則 可將溫育時間延遲至達約18h。然后將樣本冷凍(例如，送入約-20°C的溫度)，從而使溫 育停止，并在該狀態(tài)下儲存直至分析。根據(jù)本發(fā)明，可在轉(zhuǎn)換酶、降解標準品(纈氨酸和異 亮氨酸同位素標記的血管緊張素1)和血管緊張素酶抑制劑(EDTA和AEBSF)的存在下，在 37 0C 士 1°下用內(nèi)源性腎素底物(血管緊張素原)于PH 5.7溫育血漿腎素約1至2小時。溫育結(jié)束后，在LC純化前將樣本經(jīng)過液_液萃取或固相萃取。在本發(fā)明中，利用 與HPLC連接(聯(lián)機或脫機)的適當固相萃取柱改變血管緊張素1的萃取。根據(jù)優(yōu)選實施 方式，該方法包括溫育后向各樣本添加蟻酸和將樣本直接加樣至與HPLC-質(zhì)譜儀連接的固 相萃取柱上。包括高效液相色譜(HPLC)的液相色譜(LC)依賴于相對慢的層流技術(shù)。傳統(tǒng)的 HPLC分析依賴于柱填充，其中樣本經(jīng)柱的層流是來自樣本的目標分析物分離的基礎(chǔ)。技術(shù) 人員會理解，在這樣的柱中的分離是擴散過程，并且可選擇HPLC設(shè)備和適用于血管緊張素 1的柱。色譜柱一般包含基質(zhì)(即，填料物質(zhì))從而促進化學部分的分離(即，分級)。介質(zhì) 可包括微粒。該顆粒包含與各種化學部分相互作用從而促進化學部分分離的連接表面。一 種適當?shù)倪B接表面是疏水連接表面，如烷基連接表面。烷基連接表面可包含C-4、C-8、C-12 或C-18連接烷基，優(yōu)選C-8或C-18連接基團。色譜柱包含從相連的SPE柱直接或間接接 收樣本的進口和排出流出物的出口，該流出物包括經(jīng)分級的樣本。在一個實施方式中，可在 入口將樣本(或預(yù)純化的樣本)施用于柱，用溶劑或溶劑混合物洗脫，并在出口排出?？蔀?br> 14洗脫目標分析物(一種或更多種)選擇不同的溶劑模式。例如，可應(yīng)用梯度模式、等度模式 或多型(即，混合)模式進行液相色譜法。色譜法期間，物質(zhì)的分離通過變量實現(xiàn)，該變量 如洗脫劑(也被稱為“流動相”)的選擇、洗脫模式、梯度條件、溫度等。在某些實施方式中，可通過在目標分析物被柱填料物質(zhì)可逆保留、而一種或更多 種其它物質(zhì)未被保留的條件下將樣本應(yīng)用到柱，而純化分析物。在這些實施方式中，可應(yīng)用 目標分析物被柱保留的第一流動相條件，并且一旦未被保留的物質(zhì)被洗滌干凈，可隨后應(yīng) 用第二流動相條件，從柱去除被保留的物質(zhì)。可選地，可通過在這樣的流動相條件下將樣本 應(yīng)用到柱而純化分析物目標分析物以與一種或更多種其它物質(zhì)相比有差異的速率洗脫。 這樣的程序可富集一種或更多種目標分析物相對于一種或更多種其它樣本組分的含量。在另一個實施方式中，可在HPLC前將固相萃取(SPE)柱應(yīng)用到疏水柱色譜系統(tǒng) 上。在某些優(yōu)選實施方式中，可將包含聚合物吸附劑的柱與HPLC系統(tǒng)聯(lián)機連接。在某些優(yōu) 選實施方式中，將水中的HPLC級超純0. 蟻酸和乙腈中的0. 蟻酸用作流動相，進行 SPE柱和HPLC的樣本純化。優(yōu)選地，這些實施方式所用的SPE柱能從血漿回收80%以上的 血管緊張素。通過閥門和連接器管道的仔細選擇，可按需將一個或更多個固相萃取柱和色譜柱 連接，以使物質(zhì)從一個柱通過到達下一個柱，而不需要任何手動步驟。在優(yōu)選實施方式中， 通過預(yù)設(shè)程序的計算機控制閥門和管道的選擇，以便進行必要步驟。最優(yōu)選地，將色譜系統(tǒng) 也以這種聯(lián)機方式連接于檢測系統(tǒng)，例如，MS系統(tǒng)。因此，操作員可在自動取樣器中放置樣 本盤，并且在計算機的控制下進行剩余的操作，導(dǎo)致全部所選樣本的純化和分析。利用質(zhì)譜儀進行質(zhì)譜分析，該質(zhì)譜儀包含電離已分級樣本和產(chǎn)生帶電分子以用 于進一步分析的離子源。在多個實施方式中，可通過任何技術(shù)人員已知的方法電離檢測 樣本中存在的血管緊張素1。例如，可通過下列進行樣本的電離電子電離、化學電離、電 子電離、化學電離、電噴霧離子化(ESI)、光子電離、大氣壓化學電離(APCI)、光致電離、大 氣壓光致電離(APPI)、快原子轟擊(FAB)、液體二次電離(LSI)、基質(zhì)輔助激光解吸離子化 (MALDI)、場電離、場解吸、熱噴射/等離子體噴射電離、表面增強激光解吸離子化(SELDI)、 電感耦合等離子體(ICP)和粒子束電離。技術(shù)人員會理解，可基于要測量的分析物、樣本類 型、檢測器類型、正模式對負模式的選擇等來確定電離方法的選擇。在優(yōu)選實施方式中，可通過電噴霧離子化(ESI)或基質(zhì)輔助激光解吸離子化 (MALDI)電離血管緊張素1。在進一步的優(yōu)選實施方式中，通過正模式的加熱電噴霧離子化 (HESI)電離血管緊張素1。電離樣本后，可分析由此產(chǎn)生的帶正電或帶負電的離子，從而確定質(zhì)荷比。確定質(zhì) 荷比的適當?shù)姆治銎靼ㄈ厮臉O桿分析器(triple quadrupole analyzers)、四極桿分 析器(quadrupole analyzers)、離子阱分析器、傅里葉變換分析器、orbitrap分析器和飛行 時間分析器。可應(yīng)用幾種檢測模式檢測離子。例如，可應(yīng)用掃描模式——例如，高選擇性反 應(yīng)監(jiān)測(H-SRM)、多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)或選擇反應(yīng)監(jiān)測(SRM)——檢測所選離子，或者可選地， 可應(yīng)用選擇性離子監(jiān)測模式(SIM)檢測離子。優(yōu)選地，利用三重四極桿分析器確定質(zhì)荷比。 例如，在“四極桿”或“四極桿離子阱”裝置中，振蕩無線電頻率場中的離子受到與電極間所 用的DC電壓、RF信號的振幅以及質(zhì)/荷比成比例的力?？蛇x擇電壓和振幅，從而僅具有特 定質(zhì)/荷比的離子穿過四極桿全長，而所有其它離子偏離。因此，四極桿裝置可對注入該裝置的離子既充當“質(zhì)量過濾器”又充當“質(zhì)量檢測器”。一連串線性的三個四極桿被稱為 三重四極桿質(zhì)譜儀。第一(Ql)和第三(Q3)四極桿充當質(zhì)量過濾器，且中間的(Q2)四極桿 用作碰撞單元。該碰撞單元是僅RF四極桿(非質(zhì)量過濾)，其利用He、Ar或N氣( 10_3 Torr， 30eV)，引起來自Ql的所選母離子(一種或更多種)的碰撞解離。產(chǎn)生的碎片被送 至Q3，在Q3處其可被完全過濾或掃描。可通過應(yīng)用“串聯(lián)質(zhì)譜法”或“MS/MS”提高MS技術(shù)的選擇性。在該技術(shù)中，可在 MS裝置中過濾從目標分子生成的前體離子(也被稱為母離子)，隨后將前體離子碎片化，生 成一種或更多種碎片離子(也被稱為子離子或產(chǎn)物離子)，碎片離子隨后在第二 MS程序中 分析。通過前體離子的仔細選擇，僅由某些分析物生成的離子被送至碎裂室，在碎裂室與惰 性氣體原子的碰撞生成碎片離子。由于前體離子和碎片離子均于給定電離/碎裂條件組下 以可重現(xiàn)方式生成，MS/MS技術(shù)可提供極有力的分析工具。例如，可應(yīng)用過濾/碎裂的結(jié)合 去除干擾物質(zhì)，并且過濾/碎裂的結(jié)合在復(fù)雜樣本如生物樣本中尤其有用。質(zhì)譜儀一般為使用者提供離子掃描；即，在給定范圍內(nèi)(例如，100至IOOOamu)具 有具體質(zhì)/荷的各離子的相對豐度?？赏ㄟ^多種本領(lǐng)域已知的方法將分析物分析——即質(zhì) 譜——的結(jié)果關(guān)聯(lián)于原樣本中分析物的量。例如，假定取樣和分析參數(shù)被小心控制，可將給 定離子的相對豐度與將該相對豐度轉(zhuǎn)換為原分子的絕對量的表比較。可選地，分子標準品 可隨樣本一起運行，并基于由該標準品生成的離子建立標準曲線。利用這樣的標準曲線，可 將給定離子的相對豐度轉(zhuǎn)換為原分子的絕對量。在某些優(yōu)選實施方式中，利用內(nèi)標生成標 準曲線，以用于計算血管緊張素1的量。生成和利用這種標準曲線的方法在本領(lǐng)域是公知 的，并且普通技術(shù)人員能選擇適當?shù)膬?nèi)標。例如，同位素標記的血管緊張素1可用作內(nèi)標； 在某些優(yōu)選實施方式中，標準品是同位素標記的血管緊張素1，其中纈氨酸亞基已完全被纈 氨酸取代，其中碳原子已被13C同位素取代且氮原子已被15N同位素取代。將離子量關(guān)聯(lián)于 原分子量的眾多其它方法會被本領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟知。在某些實施方式中，如MS/MS——這里前體離子被分離以用于進一步碎裂，通常利 用碰撞活化解離來生成碎片離子，以用于進一步檢測。在CAD中，前體離子通過與惰性氣體 的碰撞得到能量，且隨后通過被稱為“單分子分解”的過程碎裂。前體離子中必須聚集足夠 的能量，以使離子中某些鍵可由于增加的振動能而斷裂。在特別優(yōu)選的實施方式中，如下利用MS/MS定量血管緊張素1。將樣本經(jīng)過液相 色譜，優(yōu)選固相萃取柱然后HPLC，來自色譜柱的液體溶劑流進入MS/MS分析器的加熱霧化 器接口(interface)，且在接口的加熱管道中將溶劑/分析物混合物轉(zhuǎn)化為蒸氣。通過接 口的電暈放電針使包含在霧化溶劑中的分析物(例如，血管緊張素1)電離，該電暈放電針 向霧化溶劑/分析物混合物應(yīng)用高電壓。離子——例如，前體離子——經(jīng)過裝置口并進入 第一四極桿。四極桿1和3(Q1和Q3)是質(zhì)量過濾器，使離子(即，“前體”離子和“碎片”離 子)基于其質(zhì)荷比(m/z)得到選擇。四極桿(Q2)是碰撞單元，在那離子被碎裂。質(zhì)譜儀的 第一四極桿(Ql)選擇具有血管緊張素1質(zhì)荷比的分子。具有正確的血管緊張素1質(zhì)/荷 比的前體離子被允許送入碰撞室(Q2)，而具有任何其它質(zhì)/荷比的不需要的離子與四極桿 的側(cè)部碰撞且被去除。進入Q2的前體離子與中性碰撞氣體分子——例如氬氣分子——碰 撞并碎裂。該過程被稱為碰撞活化解離(CAD)。生成的碎片離子被送入四極桿3 (Q3)，在那 里血管緊張素1的碎片離子被選擇而其它離子被去除。
該方法可包括以正離子或負離子模式中進行的MS/MS。利用本領(lǐng)域公知的標準方 法，普通技術(shù)人員能識別血管緊張素1的特定前體離子的一種或更多種碎片離子，該碎片 離子可用于在四極桿3 (Q3)中選擇。隨著離子與檢測器碰撞，其產(chǎn)生電子脈沖，該電子脈沖被轉(zhuǎn)換為數(shù)字信號。得到 的數(shù)據(jù)被傳遞至計算機，其將所收集的離子數(shù)對時間作圖。生成的質(zhì)量色譜圖與傳統(tǒng)HPLC 方法中生成的色譜圖相似。測量相應(yīng)于具體離子的峰下面積或該峰的振幅，并且將面積或 振幅關(guān)聯(lián)于目標分析物(血管緊張素1)的量。在某些實施方式中，測量碎片離子(一種或 更多種)和/或前體離子的曲線下面積或峰的振幅，從而確定血管緊張素1的量。如上所 述，可利用校準標準曲線，基于分子內(nèi)標——如同位素標記的血管緊張素1——的一種或更 多種離子的峰，將給定離子的相對豐度轉(zhuǎn)化為原分析物——例如，血管緊張素1——的絕對 量。這些數(shù)據(jù)可被傳遞至計算機，其生成離子數(shù)對時間的作圖。確定峰下面積，并通過 將標準濃度對Angl/內(nèi)標的峰面積比作圖而建立校準曲線。利用校準曲線，確定樣本中血 管緊張素1和所選內(nèi)標的量?？捎蛇@些確定量計算在給定時間內(nèi)血管緊張素1形成的速率， 即，在樣本溫育期間形成的血管緊張素1的量。該速率表示樣本中的腎素活性?？墒謩踊蛟谟嬎銠C軟件的協(xié)助下進行縮減(reduce)數(shù)據(jù)的基本過程。在根據(jù)下 列計算確定最終PRA值中，血漿的稀釋和生成時間被考慮
權(quán)利要求
1.測量樣本中血管緊張素1的量的方法，所述方法包括(a)電離來自所述樣本的血管緊張素1，產(chǎn)生一種或更多種可由質(zhì)譜檢測的離子；(b)通過質(zhì)譜檢測所述血管緊張素離子(一種或更多種)的量，所述離子選自具有質(zhì)/ 荷比 433/0士0. 5,619. 4士0. 5,647. 4士0. 5 和 1297士0. 5 的離子；以及(c)利用所檢測的離子(一種或更多種)的量來測量所述樣本中血管緊張素1的量。
2.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述方法具有小于或等于0.Ing/mL的定量極限。
3.權(quán)利要求1-2中任一項所述的方法，其中所述方法進一步包括通過高效液相色譜 (HPLC)從所述樣本純化血管緊張素1。
4.權(quán)利要求1-3中任一項所述的方法，其中所述方法進一步包括用固相萃取柱從所述 樣本純化血管緊張素1。
5.權(quán)利要求1-4中任一項所述的方法，其中通過與內(nèi)標的比較，將所述血管緊張素1離 子的量關(guān)聯(lián)于檢測樣本中血管緊張素1的存在或量。
6.測量樣本中血管緊張素1的量的方法，所述方法包括(a)在適于所述樣本中的腎素生成血管緊張素1的條件下，溫育與水穩(wěn)定性蛋白酶抑 制劑預(yù)混合的所述樣本，所述水穩(wěn)定性蛋白酶抑制劑對腎素無效；(b)通過液相色譜純化所述樣本中的血管緊張素1；(c)電離來自所述樣本的所述純化的血管緊張素1，產(chǎn)生一種或更多種可由質(zhì)譜檢測 的離子；(d)通過質(zhì)譜檢測所述血管緊張素1離子(一種或更多種)的量；以及(e)利用所檢測的離子(一種或更多種)的量來測量所述樣本中血管緊張素1的量。
7.權(quán)利要求6所述的方法，其中所述方法具有小于或等于0.Ing/mL的定量極限。
8.權(quán)利要求6-7中任一項所述的方法，其中所述血管緊張素1離子包括選自具有質(zhì)/ 荷比433. 0士0. 5,619. 4士0. 5,647. 4士0. 5和1297士0. 5的離子的一種或更多種離子。
9.權(quán)利要求6-8中任一項所述的方法，其中所述電離包括生成具有質(zhì)/荷比 433. 0士0. 5的前體離子、和生成選自具有質(zhì)/荷比619. 4士0. 5和647. 4士0. 5的離子的一 種或更多種碎片離子。
10.權(quán)利要求6-9中任一項所述的方法，其中通過與內(nèi)標的比較，將所述血管緊張素1 離子的量關(guān)聯(lián)于檢測樣本中血管緊張素1的存在或量。
11.權(quán)利要求6-10中任一項所述的方法，其中所述步驟(b)包括用固相萃取柱從所述 樣本純化血管緊張素1。
12.權(quán)利要求6-11中任一項所述的方法，其中所述水穩(wěn)定性蛋白酶抑制劑是氨乙基芐 基磺酰氟。
13.權(quán)利要求6-12中任一項所述的方法，進一步包括通過與降解標準品比較來測量所 述樣本中血管緊張素1的降解程度。
14.測量樣本中血管緊張素1的量的方法，所述方法包括(a)在適于所述樣本中的腎素生成血管緊張素1的條件下，溫育所述樣本；(b)通過固相萃取純化所述樣本中的血管緊張素1；(c)通過聯(lián)機處理的液相色譜進一步純化所述樣本中的血管緊張素1；(d)電離來自所述樣本的純化的血管緊張素1，產(chǎn)生一種或更多種可由質(zhì)譜檢測的離子；(e)通過質(zhì)譜檢測所述血管緊張素1離子(一種或更多種)的量；(f)利用所檢測的離子(一種或更多種)的量來測量所述樣本中血管緊張素1的量。
15.權(quán)利要求14所述的方法，其中所述液相色譜是高效液相色譜(HPLC)。
16.權(quán)利要求14-15中任一項所述的方法，其中所述方法具有小于或等于0.Ing/mL的 定量極限。
17.權(quán)利要求14-16中任一項所述的方法，其中所述血管緊張素1離子包括選自具有質(zhì) /荷比433. 0士0. 5,619. 4士0. 5,647. 4士0. 5和1297士0. 5的離子的一種或更多種離子。
18.權(quán)利要求14-17中任一項所述的方法，其中所述電離包括生成具有質(zhì)/荷比 433. 0士0. 5的前體離子、和生成選自具有質(zhì)/荷比619. 4士0. 5或647. 4士0. 5的離子的一 種或更多種碎片離子。
19.權(quán)利要求14-18中任一項所述的方法，其中步驟(a)中所述的溫育包括在水穩(wěn)定性 蛋白酶抑制劑存在下溫育，所述水穩(wěn)定性蛋白酶抑制劑對腎素無效。
20.權(quán)利要求19所述的方法，其中所述水穩(wěn)定性蛋白酶抑制劑是氨乙基芐基磺酰氟。
21.權(quán)利要求14-20中任一項所述的方法，其中通過與內(nèi)標的比較，將所述血管緊張素 1離子的存在或量關(guān)聯(lián)于檢測樣本中血管緊張素1的存在或量。
22.權(quán)利要求14-21中任一項所述的方法，進一步包括通過與降解標準品比較來測量 所述樣本中血管緊張素1的降解程度。
23.測量樣本中腎素活性的方法，所述方法包括(a)在適于所述樣本中的腎素生成血管緊張素1的條件下，溫育所述樣本；(b)通過固相萃取從所述樣本純化血管緊張素1；(c)通過聯(lián)機處理的液相色譜進一步純化血管緊張素1；(d)電離來自所述樣本的純化的血管緊張素1，產(chǎn)生一種或更多種可由質(zhì)譜檢測的離子；(e)通過質(zhì)譜檢測所述血管緊張素1離子(一種或更多種)的量；(f)利用所檢測的離子(一種或更多種)的量來測量所述樣本中血管緊張素1的量；以及(g)利用在所述樣本中所測量的血管緊張素1的量來計算所述樣本中的腎素活性。
24.權(quán)利要求23所述的方法，其中所述液相色譜是高效液相色譜(HPLC)。
25.權(quán)利要求23-24中任一項所述的方法，其中所述方法具有小于或等于0.Ing/mL的 定量極限。
26.權(quán)利要求23-25中任一項所述的方法，其中所述血管緊張素1離子包括選自具有質(zhì) /荷比433. 0士0. 5,619. 4士0. 5,647. 4士0. 5和1297士0. 5的離子的一種或更多種離子。
27.權(quán)利要求23-26中任一項所述的方法，其中所述電離包括生成具有質(zhì)/荷比 433. 0士0. 5的前體離子、和生成選自具有質(zhì)/荷比619. 4士0. 5或647. 4士0. 5的離子的一 種或更多種碎片離子。
28.權(quán)利要求23-27中任一項所述的方法，其中步驟(a)中所述的溫育包括在水穩(wěn)定性 蛋白酶抑制劑存在下溫育，所述水穩(wěn)定性蛋白酶抑制劑對腎素無效。
29.權(quán)利要求28所述的方法，其中所述水穩(wěn)定性蛋白酶抑制劑是氨乙基芐基磺酰氟。
30.權(quán)利要求23-29中任一項所述的方法，其中通過與內(nèi)標的比較，將所述血管緊張素 1離子的存在或量關(guān)聯(lián)于檢測樣本中血管緊張素1的存在或量。
31.權(quán)利要求23-30中任一項所述的方法，進一步包括通過與降解標準品比較來測量 所述樣本中血管緊張素1的降解程度。
32.測量樣本中腎素活性的方法，所述方法包括(a)在適于所述樣本中的腎素生成血管緊張素1的條件下，溫育與水穩(wěn)定性蛋白酶抑 制劑預(yù)混合的樣本，所述水穩(wěn)定性蛋白酶抑制劑對腎素無效；(b)通過液相色譜純化血管緊張素1；(c)電離來自所述樣本的純化的血管緊張素1，產(chǎn)生一種或更多種可由質(zhì)譜檢測的離子；(d)通過質(zhì)譜檢測所述血管緊張素1離子(一種或更多種)的量；(e)利用所檢測的離子(一種或更多種)的量來測量所述樣本中血管緊張素1的量；以及(f)利用在所述樣本中所測量的血管緊張素1的量來計算所述樣本中的腎素活性。
33.權(quán)利要求32所述的方法，其中所述液相色譜是高效液相色譜(HPLC)。
34.權(quán)利要求32-33中任一項所述的方法，其中所述方法具有小于或等于0.Ing/mL的 定量極限。
35.權(quán)利要求32-34中任一項所述的方法，其中所述血管緊張素1離子包括選自具有質(zhì) /荷比433. 0士0. 5,619. 4士0. 5,647. 4士0. 5和1297士0. 5的離子的一種或更多種離子。
36.權(quán)利要求32-35中任一項所述的方法，其中所述電離包括生成具有質(zhì)/荷比 433. 0士0. 5的前體離子、和生成選自具有質(zhì)/荷比619. 4士0. 5或647. 4士0. 5的離子的一 種或更多種碎片離子。
37.權(quán)利要求32-36中任一項所述的方法，其中步驟(b)中所述的純化血管緊張素1包 括用固相萃取柱純化血管緊張素1。
38.權(quán)利要求32-37中任一項所述的方法，其中所述水穩(wěn)定性蛋白酶抑制劑是氨乙基 芐基磺酰氟。
39.權(quán)利要求32-38中任一項所述的方法，其中通過與內(nèi)標的比較，將所述血管緊張素 1離子的存在或量關(guān)聯(lián)于檢測樣本中血管緊張素1的存在或量。
40.權(quán)利要求32-39中任一項所述的方法，進一步包括通過與降解標準品比較來測量 所述樣本中血管緊張素1的降解程度。
41.測量樣本中腎素活性的方法，所述方法包括(a)在適于所述樣本中的腎素生成血管緊張素1的條件下，溫育所述樣本；(b)通過液相色譜純化所述樣本中的血管緊張素1；(c)電離來自所述樣本的純化的血管緊張素1，產(chǎn)生一種或更多種可由質(zhì)譜檢測的離子；(d)通過質(zhì)譜檢測所述血管緊張素1離子(一種或更多種)的量，所述離子選自具有質(zhì) / 荷比 433. 0士0. 5,619. 4士0. 5,647. 4士0. 5 和 1297士0. 5 的離子；和(e)利用所檢測的離子(一種或更多種)的量來測量所述樣本中血管緊張素1的量；以及(f)利用在所述樣本中所測量的血管緊張素1的量來計算所述樣本中的腎素活性。
42.權(quán)利要求41所述的方法，其中所述電離包括生成具有質(zhì)/荷比433.0士0.5的前體 離子、和生成選自具有質(zhì)/荷比619. 4士0. 5或647. 4士0. 5的離子的一種或更多種碎片離子。
43.權(quán)利要求41-42中任一項所述的方法，其中所述方法具有小于或等于0.Ing/mL的 定量極限。
44.權(quán)利要求41-43中任一項所述的方法，其中步驟(a)中所述的溫育包括在水穩(wěn)定性 蛋白酶抑制劑存在下溫育，所述水穩(wěn)定性蛋白酶抑制劑對腎素無效。
45.權(quán)利要求44所述的方法，其中所述水穩(wěn)定性蛋白酶抑制劑是氨乙基芐基磺酰氟。
46.權(quán)利要求41-45中任一項所述的方法，其中通過高效液相色譜(HPLC)純化所述純 化的血管緊張素1。
47.權(quán)利要求41-46中任一項所述的方法，其中所述方法進一步包括用固相萃取柱從 所述樣本純化血管緊張素1。
48.權(quán)利要求41-47中任一項所述的方法，其中通過與內(nèi)標的比較，將所述血管緊張素 1離子的存在或量關(guān)聯(lián)于檢測樣本中血管緊張素1的存在或量。
49.權(quán)利要求41-48中任一項所述的方法，進一步包括通過與降解標準品比較來測量 所述樣本中血管緊張素1的降解程度。
全文摘要
提供了利用質(zhì)譜法測量血漿樣本中腎素活性的方法。該方法總體包括電離來自樣本的純化的血管緊張素1和檢測生成的血管緊張素1離子的量。然后將所檢測的血管緊張素1離子的量關(guān)聯(lián)于樣本中生成的血管緊張素1的量，該血管緊張素1的量進而被關(guān)聯(lián)于樣本中的腎素活性。
文檔編號H01J49/26GK102112857SQ200980130208
公開日2011年6月29日 申請日期2009年8月7日 優(yōu)先權(quán)日2008年8月8日
發(fā)明者C·E·拜爾斯特姆, N·J·克拉克, R·E·瑞茨 申請人:奎斯特診斷投資公司