本發(fā)明屬于農(nóng)藥殘留領域的檢測方法，具體涉及一種同時測定石斛鮮條中有機氯類和擬除蟲菊酯類農(nóng)藥殘留的方法。

背景技術：

石斛味甘、性微寒，具有益胃生津、滋陰清熱的功效，作為名貴的中藥材和保健品，越來越受到消費者的青睞和追捧。為了增加產(chǎn)量，農(nóng)藥已廣泛應用于石斛生產(chǎn)中，有機氯類和擬除蟲菊酯類農(nóng)藥因廣譜、高效、價廉而被廣泛使用。但這兩類農(nóng)藥對人體神經(jīng)中樞和消化系統(tǒng)毒害較大，并且會在人體肝臟中蓄積，長期過量使用后對人體健康危害較大，因此，對石斛中有機氯類和擬除蟲菊酯類農(nóng)藥殘留進行檢測并有效控制具有十分重要的意義。

針對農(nóng)藥殘留，歐盟、美國、日本等國家都制定了嚴格的農(nóng)藥殘留限量標準，我國主要施行GB 2763《食品安全國家標準 食品中農(nóng)藥最大殘留限量》標準，目前也有一些嚴于國家標準的石斛地方標準限量發(fā)布實施，如：DB53/T 683《地理標志產(chǎn)品 芒市石斛》、DB53/T 589《地理標志產(chǎn)品 龍陵紫皮石斛》、DB34/T 486《霍山石斛》等，這就意味著對石斛產(chǎn)品的質(zhì)量安全指標要求更高、更嚴。

查閱相關文獻，目前對石斛鮮條農(nóng)藥殘留檢測方法還沒有系統(tǒng)的研究報道?，F(xiàn)有的研究主要集中在對茶葉、中草藥、保健食品等方面。閻正、封棣等采用固相萃取-毛細管氣相色譜法開展了中草藥中13種有機氯農(nóng)藥的殘留量的研究；訾偉旗，杜斌采用毛細管氣相色譜法測定了中藥材中擬除蟲菊酯類農(nóng)藥等，這些方法均采用石油醚、丙酮或其兩者的混合溶劑來進行農(nóng)殘的提取，對于干燥和顏色淺的物質(zhì)來說，這種方法還是可行有效，但對于水分和多糖含量高、粘度大及顏色深的石斛鮮條來說，這種方法不能很好的把殘留在其上面的農(nóng)藥充分提取出來。

為了解決以上問題，本發(fā)明的目的是建立一種同時測定石斛鮮條中有機氯類和擬除蟲菊酯類農(nóng)藥殘留的方法。經(jīng)反復實驗確證，該方法簡便、準確、快速、實用，各項技術指標滿足檢測要求，能夠很好的應用于石斛鮮條農(nóng)藥殘留的測定。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供了一種測定石斛鮮條中有機氯和擬除蟲菊酯農(nóng)藥殘留的方法，目的是解決目前石斛鮮條農(nóng)殘測定前處理繁瑣、種類單一、操作復雜、結(jié)果不準確等問題。石斛鮮條經(jīng)切碎、乙腈提取、Florisil 固相萃取柱凈化后，采用氣相色譜ECD檢測檢測，外標法定量。該方法簡便、快速、靈敏、準確，能夠滿足石斛鮮條中有機氯類和擬除蟲菊酯類農(nóng)藥殘留的定性和定量分析。

為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的，通過大量研究，本發(fā)明提供的技術方案是：

一種同時測定石斛鮮條中有機氯類和擬除蟲菊酯類農(nóng)藥殘留的方法，該檢測方法由兩部分組成：

第一部分是標準曲線的建立。即用已知濃度的有機氯類和擬除蟲菊酯類農(nóng)藥進氣相色譜儀檢測分析，以溶液質(zhì)量濃度（C）為橫坐標（x），峰面積（A）為縱坐標（y）繪制標準曲線，進行定量分析。具體實施步驟為：

1、依次吸取濃度均為100 ug/ml的六六六和滴滴涕混標、三氯殺螨醇、聯(lián)苯菊酯、甲氰菊酯、氯菊酯、高效氯氰菊酯、氯氰菊酯、順式氰戊菊酯、氟氰戊菊酯、氰戊菊酯、溴氰菊酯農(nóng)藥標準溶液各500μl于50 ml棕色容量瓶中，用色譜純的正己烷定容至刻度，配制成濃度為1.0μg/ml的有機氯類和擬除蟲菊酯類農(nóng)藥混合標準儲備液。

2、用吸量管吸取步驟1中的混合標準儲備液，用正己烷逐級稀釋，配制成濃度為0.008μg/ml、0.02μg/ml、0.08μg/ml、0.1μg/ml、0.2μg/ml、0.4μg/ml的混合標準工作液。

3、色譜條件設置：色譜柱：30 m×0.32mm×0.25μm的 HP-5毛細管色譜柱；進樣口溫度：200℃；ECD檢測器溫度：320℃；升溫程序：150℃，保持2min，以6℃/min升至250℃，保持4 min，以1℃/min升至270℃，保持3 min；進樣量：1μl，分流比10：1。

4、按照步驟3所述色譜條件，準確吸取1.0μl 步驟2所述有機氯類和擬除蟲菊酯類農(nóng)藥混合標準工作液，以各農(nóng)藥組分的色譜峰保留時間定性，以溶液質(zhì)量濃度（C）為橫坐標（x），峰面積（A）為縱坐標（y）繪制標準曲線進行定量。

第二部分是石斛鮮條中有機氯類和擬除蟲菊酯類農(nóng)藥殘留的提取和檢測

1、石斛鮮條農(nóng)殘的提取：將石斛鮮條切碎成長度不超過2mm的小塊狀，制成試樣。稱取10.0 g置于100ml具塞比色管中，加入50 ml乙腈，蓋緊塞子，超聲提取30分鐘，迅速用濾紙將濾液過濾到50ml具塞量筒中，收集濾液40ml，加入5g氯化鈉，蓋上塞子，激烈震蕩1分鐘，靜置，使乙腈和水相分層，然后吸取10.0ml乙腈溶液于10ml比色管中，在氮吹儀上通氮氣蒸發(fā)近干，加入2.0ml正己烷，超聲溶解，待凈化。

2、試樣的凈化：取規(guī)格為500mg、6ml的Florisil固相萃取柱一支，裝入1g碳粉，用5.0ml丙酮與正己烷體積比1:4的混合溶液淋洗，再用5.0ml正己烷淋洗，當溶劑液面到達柱吸附層表面時，立即倒入步驟（1）所得的樣品溶液，用10ml比色管接收洗脫液，用5ml丙酮與正己烷體積比1:4的混合溶液清洗樣品管，洗液倒入固相萃取柱上，重復一次；待固相萃取柱上的洗液滴干時將盛有淋洗液的比色管置于氮吹儀上，在水浴溫度50℃下，氮吹濃縮至1~2 ml，最后用正已烷準確定容至5.0ml，旋渦混合器上混勻，用0.22μm的濾膜過濾后供氣相色譜檢測。

3、測定：待儀器穩(wěn)定后，按照第一部分3所述色譜操作條件，準確吸取1.0μl步驟2所述試樣凈化液注入色譜儀中，以色譜峰保留時間定性，峰面積代入第一部分步驟4中相應的校準曲線，計算含量。

4、計算公式：

W：樣品中某種農(nóng)藥殘留含量，單位：mg/kg；

C：待測試樣中某種農(nóng)藥濃度，單位：ug/ml，

m：稱取樣品質(zhì)量，單位：g。

測定石斛鮮條中有機氯類和擬除蟲菊酯類農(nóng)藥殘留的色譜條件與第一部分步驟（3）中的條件相同。

5、方法驗證

（1）線性范圍：測定結(jié)果表明，在上述色譜分離條件下，18種有機氯類和擬除蟲菊酯類農(nóng)藥得到很好的分離，在0.008～0.4μg/ml濃度范圍內(nèi)，線性關系良好，其相關系數(shù)均大于0.996，可以作為定量分析的依據(jù)，詳見表1。

（2）方法的檢出限、精密度和加標回收率

取不含農(nóng)藥的石斛樣品，精確添加0.05mg/kg和0.5mg/kg的混合標準溶液，按3的步驟處理，在同一分析條件下重復測定5次，獲得的色譜圖按信噪比3倍（S/N=3）條件計算方法的檢出限，結(jié)果：18種農(nóng)殘的回收率在75.3%~109.2%之間，相對標準偏差在2.9%~8.6%之間，檢出限在0.001mg/kg~0.01mg/kg之間（見表2），符合石斛鮮條多農(nóng)藥殘留分析的相關技術要求。

表2 18種農(nóng)藥精密度和回收率試驗結(jié)果

6、上述方案中有關內(nèi)容解釋

（1）所用標準物質(zhì)六六六和滴滴涕混標、三氯殺螨醇、聯(lián)苯菊酯、甲氰菊酯、氯菊酯、高效氯氰菊酯、氯氰菊酯、順式氰戊菊酯、氟氰戊菊酯、氰戊菊酯、溴氰菊酯均購于農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護科研檢測所，濃度均為100 ug/ml。

（2）所用試劑乙腈、丙酮、正己烷均為色譜純，購于天津市光復精細化工研究所，氯化鈉為分析純購于天津市風船化學試劑科技有限公司。

（3）所用材料500mg/6ml的弗羅里硅土florisil固相萃取柱購于美國安捷倫科技有限公司，石斛鮮條由本地石斛協(xié)會提供。

（4）所用儀器設備：配有ECD電子捕獲檢測器的GC-2010Plus氣相色譜儀購于日本島津公司，MTN-2800W氮吹濃縮裝置購于天津奧特賽恩斯儀器有限公司，KYT-JT-B均質(zhì)器購于北京同德創(chuàng)業(yè)科技有限公司。

（5）對于含2個及2個以上異構體的農(nóng)藥，以各異構體的峰面積之和計算該農(nóng)藥的測定值。

本發(fā)明的優(yōu)點和有益效果

雖然液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀具有較高的準確性和較低的檢出限，在農(nóng)殘檢測領域已有廣泛運用，但是其價格昂貴、操作要求高，而氣相色譜儀相對其價格適中、操作簡便，作為實驗室農(nóng)殘檢測常用儀器，目前許多縣級檢測部門都有配置。

本發(fā)明提出的石斛鮮條中有機氯類和擬除蟲菊酯類農(nóng)藥殘留的測定方法，在上述條件下各農(nóng)藥組分間分離效果好、經(jīng)加標回收和精密度計算，測定結(jié)果準確可靠，各項指標均滿足農(nóng)藥多殘留分析的要求，能夠很好的運用于石斛鮮條中多組分有機氯類和擬除蟲菊酯類農(nóng)藥殘留的定性、定量分析。

與現(xiàn)行許多國家標準方法相比，本發(fā)明前處理操作簡單，提取效率高，凈化過程使用的洗脫劑少，對環(huán)境污染小，農(nóng)藥損失率低，實用性強，具有很好的推廣使用價值。

附圖說明

圖1為本發(fā)明實施實例中18種有機氯類和擬除蟲菊酯類農(nóng)藥混合標準溶液色譜圖；

圖中，濃度均為0.2ug/ml，編號依次為：1為α-六六六；2為β-六六六；3為γ-六六六；4為δ-六六六；5為三氯殺螨醇；6為p，p'-DDE ；7為p，p'-DDD；8為o，p'-DDT；9為p，p'-DDT；10為聯(lián)苯菊酯；11為甲氰菊酯；12、13為氯菊酯；.14、15、16為高效氯氰菊酯；17、18為氯氰菊酯；19、20為順式氰戊菊酯；21為氟氰戊菊酯；22、23為氰戊菊酯；24為溴氰菊酯。

具體實施方式

下面結(jié)合附圖對本發(fā)明作進一步詳細說明，但本發(fā)明不僅僅局限于以下實施實例。

所述方法由兩部分組成，第一部分是建立標準曲線：

依次吸取濃度均為100 ug/ml的六六六和滴滴涕混標、三氯殺螨醇、聯(lián)苯菊酯、甲氰菊酯、氯菊酯、高效氯氰菊酯、氯氰菊酯、順式氰戊菊酯、氟氰戊菊酯、氰戊菊酯、溴氰菊酯農(nóng)藥標準溶液各500μl于50 ml棕色容量瓶中，用色譜純的正己烷定容至刻度，配制成濃度為1.0μg/ml的有機氯類和擬除蟲菊酯類農(nóng)藥混合標準儲備液，放于2-4℃的冰箱中備用。用吸量管吸取混合標準儲備液，用正己烷逐級稀釋，配制成濃度為0.008μg/ml、0.02μg/ml、0.08μg/ml、0.1μg/ml、0.2μg/ml、0.4μg/ml的混合標準工作液（現(xiàn)用現(xiàn)配）。在下述色譜條件下，色譜柱：30 m×0.32mm×0.25μm的 HP-5毛細管色譜柱；進樣口溫度：200℃；ECD檢測器溫度：320℃；升溫程序：150℃，保持2min，以6℃/min升至250℃，保持4 min，以1℃/min升至270℃，保持3 min；進樣量：1μl，分流比10：1，載氣為高純氮氣。準確吸取1.0μl 農(nóng)藥混合標準工作液，進氣相色譜分析檢測，以溶液質(zhì)量濃度（C）為橫坐標（x），峰面積（A）為縱坐標（y）繪制各農(nóng)藥組分標準曲線。

第二部分石斛鮮條中有機氯類和擬除蟲菊酯類農(nóng)殘的提取和檢測：

稱取切碎長度不超過2mm的石斛鮮條10.0 g于100ml具塞比色管中，加入50 ml乙腈，蓋緊塞子，超聲提取30分鐘，迅速用濾紙將濾液過濾到50ml具塞量筒中，收集濾液40ml，加入5g氯化鈉，蓋上塞子，激烈震蕩1分鐘，靜置，使乙腈和水相分層，然后吸取10.0ml乙腈溶液于10ml比色管中，在氮吹儀上通氮氣蒸發(fā)近干，加入2.0ml正己烷，超聲溶解，將溶解液倒入事先用5.0ml丙酮與正己烷體積比為1:4的混合溶液淋洗，再用5.0ml正己烷淋洗過的Florisil固相萃取柱上，下面用10ml比色管接收洗脫液，當樣液快到達柱吸附層表面時，用5ml丙酮與正己烷體積比1:4的混合溶液清洗樣品管，洗液倒入固相萃取柱上，重復一次；待固相萃取柱上的洗液滴干時將盛有淋洗液的比色管置于氮吹儀上，在水浴溫度50℃下，氮吹濃縮至1~2 ml，用正已烷準確定容至5.0ml，旋渦混合器上混勻，用0.22μm的濾膜過濾后制成待測樣。

在上述色譜條件下，準確吸取1.0μl待測液注入氣相色譜儀分析，得到樣品色譜圖，通過保留時間定性后，將峰面積代入第一部分相應農(nóng)藥校準曲線，計算出農(nóng)藥濃度值（對于含2個及2個以上異構體的農(nóng)藥，以各異構體的峰面積之和計算該農(nóng)藥的測定值），再將濃度值代入定量計算公式，求出石斛鮮條農(nóng)殘含量。

計算公式：

W：樣品中某種農(nóng)藥殘留含量（單位：mg/kg）；C：待測試樣中某種農(nóng)藥濃度（單位：ug/ml）；m：稱取樣品質(zhì)量（單位：g）。

5、方法驗證

（1）線性范圍：測定結(jié)果表明，在上述色譜分離條件下，18種農(nóng)藥得到很好的分離，在0.008～0.4μg/ml濃度范圍內(nèi)線性關系良好，其相關系數(shù)均大于0.996，可以作為定量分析的依據(jù)，詳見表1。

表1 18種農(nóng)藥保留時間、回歸方程和相關系數(shù)

（2）方法的檢出限、精密度和加標回收率

取不含農(nóng)藥的石斛樣品，精確添加0.05mg/kg和0.5mg/kg的混合標準溶液，按3的步驟處理，在同一分析條件下重復測定5次，獲得的色譜圖按信噪比3倍（S/N=3）條件計算方法的檢出限，結(jié)果：18種農(nóng)殘的回收率在75.3%~109.2%之間，相對標準偏差在2.9%~8.6%之間，檢出限在0.001mg/kg~0.01mg/kg之間（見表2），符合石斛鮮條多農(nóng)藥殘留分析的相關技術要求。

表2 18種農(nóng)藥精密度和回收率試驗結(jié)果

上述實施實例中所用農(nóng)殘標準物質(zhì)濃度均為100 ug/ml，購于農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護科研檢測所；所用試劑色譜純乙腈、色譜純丙酮、色譜純正己烷購于天津市光復精細化工研究所，分析純氯化鈉購于天津市風船化學試劑科技有限公司，所用材料500mg/6ml的 florisil固相萃取柱購于美國安捷倫科技有限公司；石斛鮮條由當?shù)厥鷧f(xié)會提供；所用儀器設備配有ECD電子捕獲檢測器的GC-2010Plus氣相色譜儀購于日本島津公司，MTN-2800W氮吹濃縮裝置購于天津奧特賽恩斯儀器有限公司，KYT-JT-B均質(zhì)器購于北京同德創(chuàng)業(yè)科技有限公司。