一種微納照明下的多重散射超分辨顯微方法與裝置的制造方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及超分辨顯微領(lǐng)域，尤其涉及一種微納照明下的多重散射超分辨顯微方 法與裝置。
【背景技術(shù)】
[0002] 由阿貝衍射極限理論可知，常規(guī)遠場光學(xué)顯微鏡的極限分辨率可表示為
其中λ為所用照明光的波長，NA為所用顯微物鏡的數(shù)值孔徑。因此，在可見光 波段，光學(xué)顯微鏡的分辨率被限制在200納米左右。然而，隨著生物醫(yī)學(xué)等技術(shù)的發(fā)展，研 究人員們已經(jīng)開始對生物組織和細胞在納米尺度上進行分析，所觀察的樣品性質(zhì)也多種多 樣，因此需要一種對樣品的普適性強的可以突破常規(guī)衍射極限的新技術(shù)，來實現(xiàn)超分辨顯 微。
[0003] 衍射極限限制分辨率也可以從傅利葉頻譜的角度進行分析，即二維物體都是由一 系列角譜按照相應(yīng)的權(quán)重疊加而成的。其中高頻分量對應(yīng)的是物體的細節(jié)信息，但由于光 波的波矢有限，無法承載這些高頻信息到達遠場，而只能以倏逝波的形式在近場存在。所謂 的超分辨即將這些高頻信息從近場提取出來。比如SNOM技術(shù)，是通過近場探針與樣品表面 相互作用來提取近場信息。再比如SIL技術(shù)，是通過大折射率固體浸沒使光波波矢增加，使 近場更多的高頻信息可以從倏逝波的形式變?yōu)樾胁▊鞯竭h場。但以上技術(shù)或者需要昂貴的 設(shè)備和復(fù)雜的后續(xù)處理，或者對應(yīng)的分辨率相對有限。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明從一種全新的角度出發(fā)，提出利用微納照明下的多重散射效應(yīng)來提取近場 信息。該方法簡易、快捷、可靠，通過微納光源與樣品結(jié)構(gòu)相互作用，使樣品的頻譜發(fā)生縮 放，高頻變?yōu)榈皖l傳到遠場，在樣品表面以下形成一放大的虛像，并得到λ/10以上的分辨 率。在本發(fā)明的多重散射超分辨顯微方法中，包括如何使微納光源與待分辨結(jié)構(gòu)相互作用、 如何得到所有方向的高頻分量、如何對輸出結(jié)果進行處理。
[0005] -種微納照明下的多重散射超分辨顯微方法，包括以下步驟：
[0006] 1)利用微納光源作用于具有單一空間頻率的微納結(jié)構(gòu)樣品（如光柵），使微納結(jié) 構(gòu)樣品內(nèi)部發(fā)生多重散射；
[0007] 2)通過顯微鏡對微納結(jié)構(gòu)樣品進行光場成像，并對像進行頻譜分析，得到所述微 納光源的頻移量；
[0008] 3)更換不同的具有單一空間頻率的微納結(jié)構(gòu)樣品，重復(fù)步驟1)和步驟2)中的操 作，利用微納光源在各空間頻率下的頻移量建立頻移數(shù)據(jù)庫；
[0009] 4)利用所述的微納光源觀察待測樣品，并對出射光的方向進行360度的掃描或?qū)?待測樣品進行360度的照射，在掃描或照射過程中應(yīng)用與步驟2)中相同的顯微鏡進行成 像，得到相應(yīng)的頻移圖像；
[0010] 5)根據(jù)所述的頻移數(shù)據(jù)庫，對頻移圖像進行頻譜還原和重構(gòu)，得到待測樣品的超 分辨顯微圖像。
[0011] 多重散射是指樣品中的每一散射點都可以作為發(fā)射球面波的子波源，發(fā)射的子球 面波相互疊加后重新分布于物體中，之后每一點再作為子波源對新的光場產(chǎn)生散射，如此 循環(huán)下去，最終得到穩(wěn)定存在的散射場。多重散射場會將物體高頻信息傳達到遠場。然而， 一般的光學(xué)顯微照明方式會引入相當多的噪聲，使由多重散射所加載的高頻信息完全被淹 沒，難以提取。微納結(jié)構(gòu)由于尺度上與光波長可比擬，它所提供的照明則可以有效地壓制噪 聲，使多重散射對高頻信息的加載和提取變得簡單易操作，且具有分辨率高、實時成像、裝 置簡單、處理方便、信噪比好等特點，可以很好地應(yīng)用于熒光及非熒光樣品的檢測之中。
[0012] 在本發(fā)明中，微納光源有多種實施方式，在這里我們提供幾種優(yōu)選的實施方式：
[0013] 優(yōu)選的，所述的微納光源為內(nèi)部定向傳輸有耦合光的平板波導(dǎo)，其厚度小于1微 米，所述的微納結(jié)構(gòu)樣品和待測樣品置于或嵌入所述的平板波導(dǎo)表面。
[0014] 優(yōu)選的，所述的微納光源為內(nèi)部通有耦合光的微納光纖，其直徑小于1微米，所述 微納光纖的出射光用于照亮所述的微納結(jié)構(gòu)樣品和待測樣品。
[0015] 并列優(yōu)選的，所述的微納光源為受外界激發(fā)產(chǎn)生自發(fā)輻射的納米線，微納結(jié)構(gòu)樣 品和待測樣品被納米線的出射光照亮，或者所述的納米線環(huán)繞樣品并沿樣品輪廓進行彎 曲。
[0016] 其中，微納光纖和平板波導(dǎo)為被動發(fā)光的微納裝置，需要將外界光耦合到其中并 保證傳播，半導(dǎo)體納米線可主動發(fā)光，需要搭建激發(fā)光路使其自發(fā)輻射。采用平板波導(dǎo)，微 納光源與待觀察結(jié)構(gòu)相互作用，需使微納波導(dǎo)表面與待觀察結(jié)構(gòu)緊密貼合；若采用微納光 纖或納米線，需調(diào)整微納光源的出射方向及其與樣品之間的距離，才能使樣品內(nèi)部發(fā)生有 效散射。
[0017] 納米線作為微納光源進行觀察時，要求納米線表面形貌良好，直徑在1微米以下， 可根據(jù)樣品對納米線直徑的選擇進行適當調(diào)整。納米線的材料可以是單一半導(dǎo)體材料比如 CdS、CdSe、GaN、ZnO,也可以是摻雜、引入缺陷或多元半導(dǎo)體材料。
[0018] 同時，本發(fā)明還提供了一種微納照明下的多重散射超分辨顯微裝置，包括：
[0019] 微納光源，用于使樣品內(nèi)部發(fā)生多重散射，抑制噪聲；
[0020] 顯微鏡，用于對發(fā)生多重散射后的樣品進行光場成像，得到頻移圖像；
[0021] CXD :用于能顯微鏡成像進行拍照；
[0022] 計算機，用于對頻移圖像進行頻譜分析，建立頻移數(shù)據(jù)庫；以及后續(xù)樣品圖的還原 和重構(gòu)，得到超分辨顯微圖像。
[0023] 優(yōu)選的，所述的微納光源為內(nèi)部定向傳輸有f禹合光的平板波導(dǎo)，所述樣品置于或 嵌入所述的平板波導(dǎo)表面，該平板波導(dǎo)的底部依次設(shè)有反射層和波導(dǎo)襯底，也可以選擇合 適材料既充當反射層也充當襯底；襯底及其上微納波導(dǎo)、樣品結(jié)構(gòu)放在顯微鏡的載物臺上。 耦合光在可見或近紫外波段，平板波導(dǎo)厚度要在1微米以下，可從幾百納米到幾十納米不 等。厚度變小，分辨率會變高，但同時波導(dǎo)的傳導(dǎo)能力會變差，可能會限制到觀察的空間范 圍。
[0024] 襯底的選擇可以透明也可以不透明，它的作用主要是支撐微納裝置。但在需要為 波導(dǎo)提供反射面且反射層就由襯底本身來充當?shù)那闆r下，最好選擇與波導(dǎo)層折射率差大的 材料作為襯底。
[0025] 并列優(yōu)選的，所述的微納光源為內(nèi)部通有耦合光的微納光纖，直徑小于1微米，顯 微鏡的載物臺上設(shè)有襯底，所述的樣品置于或嵌入襯底表面。
[0026] 微納光纖作為一種一維微納結(jié)構(gòu)，方便轉(zhuǎn)移和操縱。微納光纖通光后，使其端頭與 待觀察結(jié)構(gòu)靠近，并調(diào)整端頭和結(jié)構(gòu)之間的距離及光注入的方向，使得光場以盡可能大的 橫向分量，盡可能小的場變形注入到結(jié)構(gòu)上，同樣在結(jié)構(gòu)內(nèi)部發(fā)生多重散射，疊加后的總光 場傳到遠場被顯微物鏡、目鏡成像，構(gòu)成一個位于二維物體表面下方的放大的虛像。由于 通過這種方法引入的倏逝波方向比較純粹，因此有效地避免了不同空間高頻分量之間的串 擾。
[0027] 當通在光纖里的光頻較為單一時，比如激光，那么光場在樣品結(jié)構(gòu)上發(fā)生多重散 射的過程中會有較為明顯的干涉效應(yīng)，在得到最終的超分辨圖像過程中，需要通過圖像處 理消除產(chǎn)生的干涉條紋，如果選擇通寬波段的光進行照明，則可得到更為清晰干凈的圖像。
[0028] 并列優(yōu)選的，所述的微納光源為受外界激發(fā)產(chǎn)生自發(fā)輻射的納米線，所述顯微鏡 的顯微物鏡和顯微目鏡之間設(shè)有半透半反鏡，用于照明光與激發(fā)光之間的光路切換。
[0029] 將納米線通過分子間作用力或更為穩(wěn)固的粘合工藝使其與可三維移動的精密裝 置連接，將顯微鏡的照明光換成激發(fā)波段的光以激發(fā)納米線發(fā)生自發(fā)輻射，從納米線端頭 出射的寬范圍熒光在樣品結(jié)構(gòu)上多重散射。這樣省去了需要將照明微納光纖與外界激光耦 合相連的麻煩，使微納光纖操縱起來更加自由。
[0030] 以上兩種優(yōu)選方法無需對觀察樣品進行處理，而只需要靈活地操縱通光或自身發(fā) 光的微納光纖，調(diào)整其位置與方向?qū)悠愤M行掃描，最終便可得到包含各個方向高頻信息 的超分辨圖像。
[0031] 進一步優(yōu)選的，所述的納米線和樣品放置在襯底波導(dǎo)層上，且該納米線環(huán)繞樣品 沿樣品輪廓彎曲布置，該襯底波導(dǎo)層的底部為反射層或反射層和襯底層。
[0032] 在這種情況中，納米線與多層襯底結(jié)合引入雙重光路。將納米線置于硅基亞波長 二氧化硅層襯底上，并引入激發(fā)光使納米線發(fā)生自發(fā)輻射，此時襯底上分布于納米線周圍 的結(jié)構(gòu)由于受到納米線微納光源的照明，沿照明光方向的高頻信息便可實現(xiàn)超分辨。同時 襯底表面仍會有一層倏逝波的存在，方向與納米線熒光方向一致。由于納米線材料的折射 率高，表面倏逝波的橫向分量往往也較大，橫向分量的增大可以有效地對分辨率進行提高。
[0033] 沿著納米線熒光方向的倏逝波分量處于絕對優(yōu)勢，如果通過調(diào)整納米線的方位來 調(diào)控倏逝波方向，使其方向與超過衍射極限的高頻分量的方向一致，就可以實現(xiàn)相應(yīng)高頻 分量的超分辨。
[0034] 本方案中的核心元件納米線的直徑設(shè)置為200nm-400nm，具有非常大的表面積與 體積比，非常柔軟，而其長度則可高達幾十微米甚至幾百微米，因此可以根據(jù)所要觀察的物 體的輪廓而隨意彎曲成最適宜觀察的形狀，從而實現(xiàn)精細物體的高分辨全貌觀察。
[0035] 本方案中的多層襯底要求放置樣品的波導(dǎo)層厚度在1微米以下。
[0036] 利用微納光纖與納米線之間的相互作用力，可以方便地實現(xiàn)納米線的空間轉(zhuǎn)移和 彎曲，而且由于納米線與襯底之間較強的相互吸引力，使得納米線被彎曲后無需再借助任 何其它的外力使其保持相應(yīng)的形狀，從而使得超分辨觀察變得非常方便、簡易、可靠性高、 穩(wěn)定性強。
[0037] 另外，本發(fā)明也可以采用納米線粘合工藝，將納米線圍成一個圓以提供所有二維 方向上的照明，并與一三維精密移動裝置連接，以對樣品進行大范圍掃描全貌成像。
[0038] 本發(fā)明具有以下有益的技術(shù)效果：
[0039] 1、實現(xiàn)了二維超分辨，分辨能力在λ /10以上；
[0040] 2、對樣品的類型沒有特殊要求，既可以是熒光樣品也可以是非熒光樣品；
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