本發(fā)明屬于光學(xué)顯微測量、合成孔徑定量相位成像技術(shù)，特別是一種混合數(shù)字全息與傅里葉疊層的顯微成像方法。

背景技術(shù)：

1、在生物醫(yī)學(xué)顯微成像領(lǐng)域，活細(xì)胞及未染色生物樣本因其內(nèi)部細(xì)微結(jié)構(gòu)的折射率和厚度不同，當(dāng)光波通過時，波長和振幅并不發(fā)生變化，僅相位發(fā)生變化，但這種相位差人眼無法觀察。在過去的幾十年里，科學(xué)家通過一些化學(xué)或者生物手段來對細(xì)胞進(jìn)行染色或標(biāo)記開發(fā)了多種熒光顯微成像方式，如寬場、共聚焦、全內(nèi)反射熒光、雙/多光子和光片熒光顯微鏡技術(shù)等。在這些技術(shù)中，附著在特定分子結(jié)構(gòu)上的熒光標(biāo)記物被短波長激光激發(fā)后輻射出長波長熒光使得無色透明的生物樣本產(chǎn)生特異性，從而進(jìn)行成像。進(jìn)入21世紀(jì)以來，人們一直存在著提高成像分辨率以觀察生物樣本亞細(xì)胞特征的需求。這種需求推動了許多獨(dú)特的亞衍射成像技術(shù)的發(fā)展，這些技術(shù)對生物熒光成像產(chǎn)生了巨大影響，通過單分子定位（如隨機(jī)光學(xué)重建顯微術(shù)（storm）和光激活定位顯微術(shù)（palm））或空間調(diào)制激發(fā)（如受激發(fā)射損耗顯微技術(shù)（sted）和結(jié)構(gòu)光照明顯微術(shù)（sim））使樣本特征的可視化遠(yuǎn)超過衍射極限。然而，這些成像技術(shù)需要熒光染料和熒光蛋白作為生物標(biāo)記，因此不適合非熒光樣本或難以被熒光標(biāo)記的樣本。此外，熒光劑的光漂白和光毒性阻礙了活細(xì)胞在長時間內(nèi)的成像。

2、近年來，定量相位成像（qpi）已經(jīng)成為生物醫(yī)學(xué)研究中一種極具價值的光學(xué)工具，得益于其獨(dú)特的能力，它可以在無需特定染色或外源對比劑（例如染料或熒光團(tuán)）的情況下成像活細(xì)胞和組織的光學(xué)厚度變化。細(xì)胞的定量相位輪廓允許確定細(xì)胞結(jié)構(gòu)和生物物理參數(shù)，且樣本操作極小。特別是在傳統(tǒng)的制備技術(shù)（如固定、染色或熒光標(biāo)記）可能影響細(xì)胞功能并限制生物學(xué)洞察力的情況下，qpi提供了一個重要的替代選擇。通過將干涉測量和全息技術(shù)的原理引入顯微鏡學(xué)，可以同時從記錄的干涉圖案中解調(diào)微觀樣本的振幅和相位信息。此外，通過物體旋轉(zhuǎn)或照明掃描，目前已經(jīng)開發(fā)出了各種光學(xué)衍射層析成像方法用以推斷生物樣品的三維折射率分布，使三維無標(biāo)記顯微鏡成為可能，并已成功應(yīng)用于研究血細(xì)胞、神經(jīng)元細(xì)胞、癌細(xì)胞、細(xì)菌等各種類型的生物樣品。然而由于干涉相位測量技術(shù)中通常采用激光作為光源，高相干光源照明下的干涉測量技術(shù)會受到光學(xué)系統(tǒng)的不完美以及環(huán)境的擾動所帶來的噪聲影響。此外，該技術(shù)成像分辨率受限于相干衍射極限，無法實(shí)現(xiàn)高分辨、高信噪比的定量相位成像。

3、不同于基于干涉的定量相位測量技術(shù)所面臨的種種問題，基于非干涉的定量相位成像技術(shù)通過采集的強(qiáng)度圖重建得到物體的相位信息，具有很好的成像信噪比，且成像分辨率可以達(dá)到非相干衍射極限（即相干衍射極限的二倍）。目前比較典型的非干涉定量相位成像技術(shù)有，光強(qiáng)傳輸方程（transport-of-intensity?equation,?tie），差分相襯成像（differential?phase?contrast,?dpc），傅里葉疊層成像（fourier?ptychographicimaging,?fpi）等。在這些技術(shù)中傅里葉疊層成像技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)大視場高分辨的相位成像，然而根據(jù)傾斜照明下相位傳遞函數(shù)分析，只有當(dāng)照明光源嚴(yán)格匹配物鏡數(shù)值孔徑的時候才可以實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確的低頻相位恢復(fù)和波前像差重建。但是這一過程在實(shí)際實(shí)驗(yàn)中實(shí)現(xiàn)起來十分困難，特別是在顯微系統(tǒng)（有限的系統(tǒng)帶寬）中使用如油侵物鏡這種高數(shù)值孔徑的物鏡，實(shí)現(xiàn)匹配條件幾乎不可能。所以如何解決干涉相位測量中的兩大難題（成像分辨率與噪聲），同時規(guī)避非干涉相位成像中所面臨的匹配照明問題，實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確的定量相位成像以及像差表征是一大技術(shù)難題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的在于提供一種混合數(shù)字全息和傅里葉疊層的合成孔徑定量相位成像方法。

2、實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的的技術(shù)方案為：一種混合數(shù)字全息與傅里葉疊層的合成孔徑定量相位成像方法，包括：

3、步驟1：采集一張垂直照明的目標(biāo)全息圖以及若干張傾斜照明的低分辨率強(qiáng)度圖；

4、步驟2：通過數(shù)字全息定量相位重建算法從采集的目標(biāo)全息圖中重構(gòu)得到復(fù)振幅；

5、步驟3，將步驟2中通過數(shù)字全息得到的復(fù)振幅的傅里葉變換填充至空頻譜正中心作為初始頻譜，采用基于自適應(yīng)步長的傅里葉疊層相位恢復(fù)算法重建物體的高頻信息，同時更新約束下的孔徑信息來估計波前像差；

6、步驟4，利用步驟3估計的波前像差對重構(gòu)得到復(fù)振幅進(jìn)行像差補(bǔ)償，將補(bǔ)償后的復(fù)振幅填充至步驟3得到的頻譜中心重新作為初始頻譜，重復(fù)執(zhí)行一次步驟3實(shí)現(xiàn)對物體信息和孔徑像差的準(zhǔn)確重建，利用相位解包裹算法獲得合成孔徑定量相位成像結(jié)果。

7、優(yōu)選地，通過合成孔徑顯微成像平臺采集垂直照明下的全息圖以及傾斜照明下的低分辨強(qiáng)度圖，所述合成孔徑顯微成像平臺包括環(huán)形排列的可編程led陣列、激光器、顯微物鏡、準(zhǔn)直透鏡、光纖分束器、分光棱鏡、第一反射鏡、第二反射鏡、成像筒鏡和相機(jī)，所述可編程led陣列的圓心和顯微物鏡光軸重合，顯微物鏡的后焦面與成像筒鏡的前焦面重合，相機(jī)的成像平面放置在成像筒鏡的后焦面；

8、激光器發(fā)射的激光通過光纖分束器分為物光波與參考光波，其中，物光波照射樣品后依次通過顯微物鏡、成像筒鏡以及第一反射鏡反射到達(dá)分光棱鏡，參考光波經(jīng)準(zhǔn)直透鏡與第二反射鏡反射后與物光波在分光棱鏡匯合，發(fā)生干涉形成全息圖，并被相機(jī)捕獲；

9、關(guān)閉激光器，依次點(diǎn)亮可編程led陣列中的led對樣品進(jìn)行傾斜照明，led發(fā)出的平面波照射樣品后依次通過顯微物鏡、成像筒鏡以及第一反射鏡反射到達(dá)分光棱鏡，并被相機(jī)捕獲低分辨率強(qiáng)度圖。

10、優(yōu)選地，可編程led陣列的照明波長和激光器波長相同。

11、優(yōu)選地，目標(biāo)全息圖的強(qiáng)度分布具體為：

12、,

13、式中，物光波表示經(jīng)物體調(diào)制后搭載的復(fù)振幅信息，為參考光波，為空間域坐標(biāo)，為物光波與參考光波的夾角，為波矢量，表示物光波復(fù)振幅的共軛。

14、優(yōu)選地，通過數(shù)字全息定量相位重建算法從采集的目標(biāo)全息圖中重構(gòu)得到復(fù)振幅的具體方法為：

15、對采集到的全息圖進(jìn)行傅里葉變換得到其對應(yīng)的頻譜，找到包含物體復(fù)振幅信息的正一級譜，采用頻域?yàn)V波的方式獲取正一級譜，并根據(jù)正一級譜最大值將頻譜移動至空頻譜中心，采用逆傅里葉變換恢復(fù)得到完整的復(fù)振幅。

16、優(yōu)選地，將步驟2中通過數(shù)字全息得到的復(fù)振幅的傅里葉變換填充至頻譜正中心作為初始頻譜，采用基于自適應(yīng)步長的傅里葉疊層相位恢復(fù)算法重建物體的高頻信息，同時更新孔徑信息來估計波前像差的具體方法為：

17、步驟31，將步驟2中通過數(shù)字全息得到的完整復(fù)振幅的傅里葉變換填充至頻譜正中心，作為初始頻譜，并利用第個照明角度的低分辨率強(qiáng)度圖對頻譜進(jìn)行更新；

18、步驟32：對孔徑函數(shù)進(jìn)行更新；

19、步驟33，令，重復(fù)步驟31、32，直至利用所有傾斜照明的低分辨率強(qiáng)度圖完成頻譜及孔徑函數(shù)更新，將更新完的頻譜作為第n次迭代的高分辨頻譜；

20、步驟34，計算第次頻譜更新的代價函數(shù)；

21、步驟35，根據(jù)代價函數(shù)自適應(yīng)改變迭代步長，并判斷更新后的步長是否滿足閾值條件，如果不滿足，則返回步驟31重復(fù)上述迭代，否則將最后一次迭代得到的孔徑函數(shù)作為估計得到的波前像差。

22、優(yōu)選地，頻譜更新公式具體為：

23、，

24、其中，為第n次的迭代步長，為正則化參數(shù)，表示第個照明角度下物體復(fù)透過率函數(shù)的傅里葉變換，表示第個照明方向下無振幅約束的傅里葉譜，表示在第n輪迭代中利用第個照明角度下傾斜照明的低分辨率強(qiáng)度圖更新后的頻譜，表示在第n輪迭代中利用第個照明角度下傾斜照明的低分辨率強(qiáng)度圖更新后的頻譜，初始時，第一輪迭代中將數(shù)字全息得到的復(fù)振幅的傅里葉變換填充至頻域正中心作為初始頻譜，將不同照明角度的強(qiáng)度圖作為振幅約束進(jìn)行頻譜更新，其中是第個照明角度所對應(yīng)的頻域坐標(biāo)，在物體復(fù)透過率函數(shù)中，代表物體的吸收，代表物體的相位，為空間域坐標(biāo)，為對應(yīng)的頻域坐標(biāo)。

25、優(yōu)選地，孔徑函數(shù)更新公式為：

26、，

27、其中，是孔徑更新步長，是正則化因子，為在第輪迭代中第個傾斜照明下進(jìn)行頻域移動后的合成頻譜，為的復(fù)共軛。

28、優(yōu)選地，第次頻譜更新的代價函數(shù)為：

29、，

30、其中，代表第個照明角度所對應(yīng)的低分辨強(qiáng)度圖，是第個照明角度下物體復(fù)透過率函數(shù)的傅里葉變換，其中是第個照明角度所對應(yīng)的頻域坐標(biāo)，代表孔徑函數(shù)。

31、優(yōu)選地，步長更新公式為：

32、，

33、式中，為第次迭代的步長，為第次迭代計算得到的代價函數(shù)。

34、本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，其顯著優(yōu)點(diǎn)：

35、（1）混合數(shù)字全息與傅里葉疊層的合成孔徑定量相位成像技術(shù)無需復(fù)雜的傾斜照明旋轉(zhuǎn)裝置以及結(jié)構(gòu)光裝置，采用環(huán)形排列的led照明極大的簡化了合成孔徑成像系統(tǒng)，提高了系統(tǒng)的穩(wěn)定性和魯棒性。

36、（2）采用傅里葉疊層重建物體高頻部分時采用了準(zhǔn)單色led照明光源采集高質(zhì)量強(qiáng)度圖，避免了高時間相干性激光光源帶來的散斑噪聲和寄生干涉，提高了成像質(zhì)量。

37、（3）基于傅里葉疊層的合成孔徑技術(shù)不同于基于干涉的合成孔徑技術(shù)，具有非干涉合成孔徑的便利性和靈活性，易于實(shí)現(xiàn)易于操作。

38、（4）數(shù)字全息重構(gòu)得到物體準(zhǔn)確的低頻信息作為傅里葉疊層的初始化估計，可以確保準(zhǔn)確的低頻相位恢復(fù)，而無需滿足嚴(yán)格的匹配照明條件。即使在顯微成像系統(tǒng)中采用高數(shù)值孔徑物鏡依然可以實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確的相位恢復(fù)，具有更好的實(shí)用性。

39、（5）數(shù)字全息重構(gòu)得到物體準(zhǔn)確的低頻信息作為傅里葉疊層的初始化估計，可以保證傅里葉疊層算法重建波前像差，而無需滿足嚴(yán)格的匹配照明條件。

40、（6）數(shù)字全息重構(gòu)得到物體準(zhǔn)確的低頻信息作為傅里葉疊層的初始化估計，在保證準(zhǔn)確的相位恢復(fù)和像差重建的同時，降低了傅里葉疊層所需的強(qiáng)度圖數(shù)量。

41、下面結(jié)合附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述。