本發(fā)明涉及光學(xué)顯微成像領(lǐng)域，具體涉及基于徑向偏振調(diào)制的干涉式結(jié)構(gòu)光照明顯微鏡系統(tǒng)與方法。

背景技術(shù)：

傳統(tǒng)的光學(xué)顯微成像技術(shù)空間分辨率受到阿貝瑞利極限的限制，空間分辨率最高只能達(dá)到半波長，制約了其在亞細(xì)胞水平觀測中的應(yīng)用。雖然電子顯微鏡和原子力顯微鏡可以達(dá)到亞納米的分辨率，但是其只能對非活性離體細(xì)胞樣品進(jìn)行觀測的缺點(diǎn)限制了其在生物領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用。近幾十年，伴隨著熒光探針技術(shù)的發(fā)展，一系列超分辨光學(xué)顯微成像方法被提出，使得光學(xué)顯微鏡的空間分辨率突破了阿貝瑞利極限。其中最具代表性的技術(shù)包括光激活定位熒光顯微技術(shù)(photo-activationlocalizationmicroscopy，簡稱palm)、隨機(jī)光學(xué)重構(gòu)熒光顯微技術(shù)(stochasticopticalreconstructionmicroscopy，簡稱storm)、受激輻射損耗熒光顯微技術(shù)(stimulatedemissiondepletionmicroscopy，簡稱sted)和結(jié)構(gòu)光照明熒光顯微技術(shù)(structuredilluminationmicroscopy，簡稱sim)。

由于sim是成像速度最快的超分辨成像技術(shù)，自該技術(shù)出現(xiàn)伊始，就受到了廣泛關(guān)注。sim的基本原理如下：顯微物鏡的空間分辨率取決于它能采集到的最大空間頻率f0，f0取決于顯微物鏡的光學(xué)傳遞函數(shù)(opticaltransferfunction，簡稱otf)，f0＝2na/λ，其中na表示顯微物鏡的數(shù)值孔徑，λ表示成像光波的波長。當(dāng)樣品包含的高頻信息f>f0時(shí)，樣品的細(xì)節(jié)將難以被分辨。如果使用空間頻率為f1的正弦條紋結(jié)構(gòu)光照明樣品，則會產(chǎn)生空間頻率為fm＝|f-f1|的低頻莫爾條紋。莫爾條紋實(shí)際上是樣品與結(jié)構(gòu)光的拍頻信號，它包含有樣品超衍射分辨的高頻信息f。當(dāng)fm<f0時(shí)，莫爾條紋可以在顯微物鏡下觀察到，通過解碼，可以提取出樣品的超分辨率信息，重組出樣品的高分辨率圖像。

為保證結(jié)構(gòu)照明顯微系統(tǒng)otf的各向同性，實(shí)驗(yàn)中需要旋轉(zhuǎn)照明光場在多個(gè)方向上對稱地照明樣品。通常在每一個(gè)成像平面旋轉(zhuǎn)3個(gè)方向，兩兩夾角互為60度。如圖1所示，圖1a為普通顯微鏡的otf，圖1b為單一方向上頻譜進(jìn)行擴(kuò)展，圖1c為三個(gè)方向頻譜得到擴(kuò)展。從頻域來看，結(jié)構(gòu)光照明拓展了顯微系統(tǒng)的otf，將物鏡能收集到的最大空間頻率從f0提高到了f0+f1。因此f1越大，sim顯微的空間分辨率就越高。但是結(jié)構(gòu)照明光場的空間頻率f1同樣受衍射極限限制，即f1≤f0，所以線性sim顯微技術(shù)至多可以將光學(xué)顯微系統(tǒng)的空間分辨率提高一倍。

由sim超分辨成像的基本原理可知，其成像系統(tǒng)需要滿足以下條件：

(1)產(chǎn)生空間頻率接近光學(xué)成像系統(tǒng)衍射極限的結(jié)構(gòu)照明光場，以實(shí)現(xiàn)最大的頻譜擴(kuò)展；(2)產(chǎn)生多個(gè)不同方向的結(jié)構(gòu)光照明光場，以實(shí)現(xiàn)接近各向同性的頻譜擴(kuò)展。滿足條件的方式通常是采用兩束線偏振激光干涉產(chǎn)生的干涉條紋來實(shí)現(xiàn)。圖2a至圖2c為條紋方向和兩束激光偏振態(tài)的關(guān)系，其中點(diǎn)表示兩束激光，箭頭為所需的偏振態(tài)。若要產(chǎn)生圖示三個(gè)不同方向的干涉條紋，兩束激光的空間分布需如圖圓點(diǎn)所示。由于干涉條紋周期與兩光束夾角有關(guān)，其夾角越大條紋周期越小。然而，大角度干涉時(shí)條紋對比度和兩束線偏光的偏振方向密切相關(guān)，只有當(dāng)兩束線偏光偏振方向與兩光束的干涉條紋方向平行時(shí)，條紋對比度才最大，其余偏振方向都會導(dǎo)致條紋對比度的降低。條紋對比度對于軟件解碼十分重要，低條紋對比度會導(dǎo)致軟件解碼產(chǎn)生偽影，甚至無法恢復(fù)圖像。綜上所述，為了實(shí)現(xiàn)更高分辨率和更準(zhǔn)確的恢復(fù)圖像，必須對線偏光的偏振方向進(jìn)行精確控制。

對于偏振方向的控制，通常有兩種方法。第一種方法是利用相位延遲器對光的相位進(jìn)行改變。相位延遲片由雙折射材料加工而成，使通過它的兩個(gè)互相正交的偏振分量產(chǎn)生相位偏移，可用來調(diào)整光束的偏振狀態(tài)。通過使用兩個(gè)液晶相位延遲器，在其上分別加載不同電壓，控制液晶分子長軸取向，可以改變光束通過相位延遲器的相位延遲。對所需的不同方向偏振態(tài)，通過調(diào)整電壓值調(diào)整相位延遲，進(jìn)而改變偏振，實(shí)現(xiàn)偏振控制。這一方法的缺點(diǎn)在于液晶相位延遲器為有源器件，需要隨光束方向變化而同步改變所加電壓值，增加了系統(tǒng)的控制難度。另外，由于需要使用兩個(gè)液晶相位延遲器和一個(gè)1/4波片，系統(tǒng)的總光能量透過率將小于90％。第二種偏振控制方法是利用偏振片直接改變光的偏振態(tài)。眾所周知，偏振片由二向色性材料制成，當(dāng)光波通過偏振片時(shí)，其中與偏振片透光軸方向一致的光分量可以無損失透過，而與透光軸方向垂直的光分量則被強(qiáng)烈吸收，因此可以用偏振片轉(zhuǎn)換光的偏振態(tài)。應(yīng)用中采用分區(qū)組合偏振片，由12個(gè)偏振片膠合成比薩餅形狀，其中每一個(gè)小扇形代表一塊偏振片，其透光軸方向沿切線方向分布。實(shí)驗(yàn)時(shí)先將入射的線偏振激光通過1/4波片調(diào)制為圓偏振光，當(dāng)兩束圓偏光入射分區(qū)組合偏振片后，出射線偏光的偏振方向即可以調(diào)制為所需的偏振方向，即與兩光束的干涉條紋方向平行，從而實(shí)現(xiàn)sim系統(tǒng)的偏振控制。然而對于圓偏振光而言，只有一半的光能透過偏振片，所以理論上圓偏光通過偏振片的光能量透過率為50％，如果再考慮到材料的吸收特性，透過率往往低于40％，常常導(dǎo)致亮度不足。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了解決現(xiàn)有sim成像系統(tǒng)偏振控制方法操作復(fù)雜、透過率低的問題，本發(fā)明提供一種基于徑向偏振調(diào)制的干涉式結(jié)構(gòu)光照明顯微鏡系統(tǒng)與方法。

本發(fā)明解決上述問題的技術(shù)方案是：

一種基于徑向偏振調(diào)制的干涉式結(jié)構(gòu)光照明顯微鏡系統(tǒng)，包括可調(diào)控的光柵結(jié)構(gòu)單元、第一透鏡、空間濾波器、渦旋半波片、雙色鏡、顯微物鏡、筒鏡和數(shù)字相機(jī)；可調(diào)控的光柵結(jié)構(gòu)單元包括偏振分束器、半波片和空間光調(diào)制器；半波片和空間光調(diào)制器依次設(shè)置在偏振分束器的第一出射光路上；第一透鏡、空間濾波器、渦旋半波片、雙色鏡和顯微物鏡依次設(shè)置在偏振分束器的與第一出射光路垂直的第二出射光路上；所述渦旋半波片0°快軸方向?yàn)樗椒较?；筒鏡、數(shù)字相機(jī)依次設(shè)置在雙色鏡的垂直于所述第二出射光路的光路上。

進(jìn)一步地，還包括設(shè)置在渦旋半波片和雙色鏡之間光路上的共焦系統(tǒng)。共焦系統(tǒng)產(chǎn)生的中繼光路使激光匯聚到顯微物鏡后焦面上，減小系統(tǒng)的設(shè)置尺寸。

進(jìn)一步地，所述共焦系統(tǒng)包括沿光路依次設(shè)置的第二透鏡和第三透鏡。

進(jìn)一步地，還包括設(shè)置在雙色鏡和顯微物鏡之間光路上的反射鏡，顯微物鏡設(shè)置在雙色鏡的上方。反射鏡可調(diào)整光路使激光沿豎直方向傳播，使得可以使用倒置物鏡以便觀測樣品。

進(jìn)一步地，空間光調(diào)制器為反射式鐵電液晶空間光調(diào)制器。

一種基于徑向偏振調(diào)制的干涉式結(jié)構(gòu)光照明顯微鏡成像方法，包括以下步驟：

1)激光器發(fā)出的水平線偏振光照射到可調(diào)控的光柵結(jié)構(gòu)單元上，產(chǎn)生垂直線偏振的多級衍射光束；

2)將匯聚的多級衍射光束進(jìn)行阻擋零級和高級衍射光并保留±1級衍射光的處理；

3)被保留的垂直線偏振±1級衍射光通過渦旋半波片改變偏振態(tài)，所述渦旋半波片0°快軸方向?yàn)樗椒较?，形成所需的偏振方向，即與兩光束的干涉條紋方向平行，從而實(shí)現(xiàn)sim系統(tǒng)的偏振控制；

4)改變偏振態(tài)的±1級衍射光進(jìn)入顯微物鏡干涉形成所需的結(jié)構(gòu)照明光場，對樣品進(jìn)行照明；

5)樣品受激發(fā)出熒光，過濾掉熒光中包含的其它波長光，處理后的熒光被收集形成圖像。

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)為：

1、本發(fā)明的核心是用渦旋半波片控制光束偏振方向。與普通的偏振控制技術(shù)相比，本發(fā)明光能利用率很高(接近100％)，適用于低功率半導(dǎo)體激光器作為光源，便于結(jié)構(gòu)照明光學(xué)顯微系統(tǒng)的集成。

2、本發(fā)明采用的渦旋半波片為單一的無源器件，只要放入合適的位置即可使用，不需要額外的控制單元，降低了系統(tǒng)的復(fù)雜度，有利于結(jié)構(gòu)照明光學(xué)顯微系統(tǒng)的推廣。

3、本發(fā)明所使用的激光功率密度很低，對生物組織的破壞以及激光漂白效應(yīng)非常小。在超分辨熒光顯微成像領(lǐng)域，本發(fā)明所采用的結(jié)構(gòu)照明光學(xué)顯微技術(shù)是一種寬場顯微技術(shù)，與單分子定位成像技術(shù)、受激發(fā)射損耗成像技術(shù)等相比，具有弱的光漂白以及光損傷效應(yīng)。

附圖說明

圖1a為普通顯微鏡的otf示意圖；

圖1b為單一方向上頻譜進(jìn)行擴(kuò)展的otf示意圖；

圖1c為sim從三個(gè)方向擴(kuò)展otf的示意圖；

圖2a為60°干涉條紋方向和兩束激光偏振態(tài)的關(guān)系圖；

圖2b為0°干涉條紋方向和兩束激光偏振態(tài)的關(guān)系圖；

圖2c為-60°干涉條紋方向和兩束激光偏振態(tài)的關(guān)系圖；

圖3為渦旋半波片快軸空間分布結(jié)構(gòu)示意圖；

圖4a為需要產(chǎn)生的60°干涉條紋示意圖；

圖4b為用渦旋半波片產(chǎn)生60°干涉條紋時(shí)入射光的偏振態(tài)(垂直線偏振)和位置分布示意圖；

圖4c為渦旋半波片的快軸空間分布及一對60°入射光(垂直線偏振)在渦旋半波片上的入射位置示意圖；

圖4d為經(jīng)過渦旋半波片后一對60°出射光的偏振態(tài)分布示意圖；

圖4e為需要產(chǎn)生的0°干涉條紋示意圖；

圖4f為用渦旋半波片產(chǎn)生0°干涉條紋時(shí)入射光的偏振態(tài)(垂直線偏振)和位置分布示意圖；

圖4g為渦旋半波片的快軸空間分布及一對0°入射光(垂直線偏振)在渦旋半波片上的入射位置示意圖；

圖4h為經(jīng)過渦旋半波片后一對0°出射光的偏振態(tài)分布示意圖；

圖4i為需要產(chǎn)生的-60°干涉條紋示意圖；

圖4j為用渦旋半波片產(chǎn)生-60°干涉條紋時(shí)入射光的偏振態(tài)(垂直線偏振)和位置分布示意圖；

圖4k為渦旋半波片的快軸空間分布及一對-60°入射光(垂直線偏振)在渦旋半波片上的入射位置示意圖；

圖4l為經(jīng)過渦旋半波片后一對-60°出射光的偏振態(tài)分布示意圖；

圖5為本發(fā)明系統(tǒng)結(jié)構(gòu)示意圖。

附圖標(biāo)記：1-入射激光，2-偏振分束器，3-半波片，4-空間光調(diào)制器，5-第一透鏡，6-空間濾波器，7-渦旋半波片，8-第二透鏡，9-第三透鏡，10-雙色鏡，11-反射鏡，12-顯微物鏡，13-載物臺，14-筒鏡，15-數(shù)字相機(jī)。

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合附圖和具體實(shí)施例對本發(fā)明的內(nèi)容作進(jìn)一步的詳細(xì)描述：

本發(fā)明提供了一種使用徑向偏振調(diào)制實(shí)現(xiàn)偏振控制的結(jié)構(gòu)光照明顯微鏡系統(tǒng)及方法，該系統(tǒng)具有操作簡單(使用無源器件)、光能利用率高(接近100％)的優(yōu)點(diǎn)，可以方便高效地實(shí)現(xiàn)偏振控制。

如圖5所示，一種基于徑向偏振調(diào)制的干涉式結(jié)構(gòu)光照明顯微鏡系統(tǒng)，包括偏振分束器2、半波片3、空間光調(diào)制器4、第一透鏡5、空間濾波器6、渦旋半波片7、共焦系統(tǒng)、雙色鏡10、顯微物鏡12、筒鏡14和數(shù)字相機(jī)15；其中，偏振分束器2、半波片3、空間光調(diào)制器4構(gòu)成一個(gè)可調(diào)控的光柵結(jié)構(gòu)單元。半波片3和空間光調(diào)制器4依次設(shè)置在偏振分束器2的第一出射光路上；第一透鏡5、空間濾波器6、渦旋半波片7、共焦系統(tǒng)、雙色鏡10和顯微物鏡12依次設(shè)置在偏振分束器2的與第一出射光路垂直的第二出射光路上；渦旋半波片0°快軸方向?yàn)樗椒较?；筒鏡14、數(shù)字相機(jī)15依次設(shè)置在雙色鏡10的垂直于所述第二出射光路的光路上；共焦系統(tǒng)包括沿光路依次設(shè)置的第二透鏡8和第三透鏡9，共焦系統(tǒng)產(chǎn)生的中繼光路使激光匯聚到顯微物鏡12后焦面上，減小了系統(tǒng)的設(shè)置尺寸。空間光調(diào)制器為反射式鐵電液晶空間光調(diào)制器。

將顯微物鏡12設(shè)置在雙色鏡10的上方，系統(tǒng)還包括設(shè)置在雙色鏡10和顯微物鏡12之間光路上的反射鏡11。反射鏡11可調(diào)整光路使激光沿豎直方向傳播，使得可以使用倒置物鏡以便觀測樣品。

渦旋半波片是一種特殊的半波片，通常用來產(chǎn)生徑向偏振光或方位角偏振光，其快軸方向隨波片上方位角變化而變化。如圖3所示，渦旋半波片上每一點(diǎn)的快軸方向不同，以特定方式旋轉(zhuǎn)分布。本發(fā)明利用渦旋半波片對不同位置入射線偏振光的偏振方向旋轉(zhuǎn)不同的方向，對光束進(jìn)行偏振調(diào)制，使出射光束偏振態(tài)調(diào)整至所需方向。圖4a至4l是使用渦旋半波片進(jìn)行偏振控制的原理示意圖，如果需要產(chǎn)生方向如圖4a所示干涉條紋，首先將兩束入射線偏光的偏振方向調(diào)節(jié)為圖4b雙箭頭所示垂直方向，灰色圓斑為兩光束的入射位置，圖4c中的單箭頭代表零級渦旋半波片的快軸方向。當(dāng)兩光束通過渦旋半波片調(diào)制后，出射光的偏振方向?yàn)閳D4d中灰色圓斑位置處的雙箭頭方向，即為所需的偏振方向。同理，其余兩個(gè)方向的偏振控制原理如圖4e至圖4l，從而實(shí)現(xiàn)sim偏振控制。

一種基于徑向偏振調(diào)制的干涉式結(jié)構(gòu)光照明顯微鏡成像方法，包括以下步驟：

1)激光器發(fā)出的水平線偏振光照射到可調(diào)控的光柵結(jié)構(gòu)單元上，產(chǎn)生垂直線偏振的多級衍射光束；

2)將匯聚的多級衍射光束進(jìn)行阻擋零級和高級衍射光并保留±1級衍射光的處理；

3)被保留的垂直線偏振±1級衍射光通過渦旋半波片改變偏振態(tài)，所述渦旋半波片0°快軸方向?yàn)樗椒较?，形成所需的偏振方向，即與兩光束的干涉條紋方向平行，從而實(shí)現(xiàn)sim系統(tǒng)的偏振控制；

4)改變偏振態(tài)的±1級衍射光進(jìn)入顯微物鏡干涉形成所需的結(jié)構(gòu)照明光場，對樣品進(jìn)行照明；

5)樣品受激發(fā)出熒光，過濾掉熒光中包含的其它波長光，處理后的熒光被收集形成圖像。

系統(tǒng)工作過程：激光器發(fā)出的水平線偏振光由1入射，首先經(jīng)過一個(gè)偏振分束器2和半波片3，垂直入射到反射式鐵電液晶空間光調(diào)制器上，其中半波片3的快軸方向與水平方向夾角為81.6°。在空間光調(diào)制器上加載光柵結(jié)構(gòu)圖像，使入射光經(jīng)其衍射后返回，再次通過半波片3，由偏振分束器2反射后變?yōu)榇怪逼窆?，進(jìn)入第一透鏡5。使用空間濾波器6阻擋零級和高級衍射光，保留±1級衍射光透過，通過渦旋半波片7改變保留的±1級衍射光的偏振態(tài)，改變偏振態(tài)的衍射光再通過第二透鏡8和第三透鏡9組成的共焦系統(tǒng)，最后通過雙色鏡10和反射鏡11進(jìn)入顯微物鏡12。兩束光干涉形成結(jié)構(gòu)照明光場，照明置于載物臺13上的樣品，樣品受激發(fā)出熒光經(jīng)過顯微物鏡12，再經(jīng)過反射鏡11，被雙色鏡10反射至筒鏡14，由數(shù)字相機(jī)15收集?？刂瓶臻g光調(diào)制器4，使其分別加載九幅不同相位和不同方向的條紋圖樣，并依次拍攝收集。對收集到的九幅圖像進(jìn)行處理得到最終的超分辨圖像。

本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于本發(fā)明的具體實(shí)施方式，對于本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員而言，在本發(fā)明的啟示下，能夠從本發(fā)明公開內(nèi)容中直接導(dǎo)出聯(lián)想一些原理和結(jié)構(gòu)相同的基本變形，或現(xiàn)有技術(shù)中常用公知技術(shù)的替代，以及特征相同的相互不同組合、相同或相似技術(shù)效果的技術(shù)特征簡單改換，都屬于本發(fā)明技術(shù)的保護(hù)范圍。