本發(fā)明涉及光學(xué)成像技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種基于環(huán)形離軸照明焦面共軛的非熒光成像光切片方法和裝置，特別涉及環(huán)形偏離物鏡光軸照明樣品的離軸光束焦面共軛光學(xué)切片顯微術(shù)。

背景技術(shù)：

廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)、材料學(xué)等領(lǐng)域的傳統(tǒng)寬場(chǎng)顯微鏡，由于具有較大的景深，較難獲取樣品內(nèi)部三維結(jié)構(gòu)的顯微圖像。光切片顯微術(shù)，是一種獲取樣品內(nèi)部三維結(jié)構(gòu)圖像的顯微術(shù)，進(jìn)一步擴(kuò)展了顯微鏡的應(yīng)用范圍。光切片技術(shù)可分為熒光成像技術(shù)和非熒光成像技術(shù)，目前使用最多的是借助于熒光成像的光切片技術(shù)，例如掃描共焦熒光顯微術(shù)、結(jié)構(gòu)光照明熒光顯微術(shù)、選擇平面照明熒光顯微術(shù)。但是，對(duì)于非熒光樣品，只可利用樣品對(duì)照明光的散射光進(jìn)行成像，由于信噪比相對(duì)較弱，比熒光成像的光切片技術(shù)更難實(shí)現(xiàn)。利用掃描共焦顯微術(shù)也可對(duì)非熒光樣品進(jìn)行光切片成像。掃描共焦顯微術(shù)利用照明針孔和探測(cè)針孔的共軛物象關(guān)系，進(jìn)行共焦的點(diǎn)照明和點(diǎn)探測(cè)成像，也就是使得來(lái)自照明針孔發(fā)射出的光聚焦在樣品焦平面的某個(gè)點(diǎn)上，該點(diǎn)所散射的光成像在探測(cè)針孔上，該點(diǎn)以外的任何散射光均被探測(cè)針孔阻擋，通過(guò)逐點(diǎn)掃描焦面處的樣品層，從而獲得比傳統(tǒng)顯微術(shù)更高的軸向分辨率，實(shí)現(xiàn)光切片成像。顯然，逐點(diǎn)掃描的成像方式耗時(shí)，對(duì)動(dòng)態(tài)物體成像非常不利，因此，對(duì)生物活體的光切片成像有局限性。結(jié)構(gòu)光照明顯微術(shù)也可以對(duì)非熒光樣品進(jìn)行光切片成像，但由于是采用結(jié)構(gòu)光照明，照明裝置相對(duì)復(fù)雜。另外，利用熒光成像，需對(duì)樣品進(jìn)行熒光標(biāo)記，而熒光標(biāo)記可能存在生物毒性，從而對(duì)樣品產(chǎn)生影響；激發(fā)熒光的激發(fā)光，波長(zhǎng)較短，對(duì)樣品也可能存在光毒性。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的第一個(gè)目的是為了解決現(xiàn)有技術(shù)中的上述缺陷，提供一種基于環(huán)形離軸照明焦面共軛的非熒光成像光切片方法，可有效避免掃描共焦顯微術(shù)的逐點(diǎn)成像方式，提高光切片成像速度，以及避免熒光成像方法可能對(duì)樣品產(chǎn)生的生物毒性和光毒性。

本發(fā)明的另一個(gè)目的是為了解決現(xiàn)有技術(shù)中的上述缺陷，提供一種基于環(huán)形離軸照明焦面共軛的非熒光成像光切片裝置。

本發(fā)明的第一個(gè)目的可以通過(guò)采取如下技術(shù)方案達(dá)到：

一種基于環(huán)形離軸照明焦面共軛的非熒光成像光切片方法，所述方法包括下列步驟：

一個(gè)大數(shù)值孔徑的物鏡和一個(gè)管鏡構(gòu)成一個(gè)無(wú)限遠(yuǎn)校正光學(xué)系統(tǒng)，物鏡的物方焦面與管鏡的像方焦面形成一對(duì)物象共軛面，非熒光樣品內(nèi)的一個(gè)層面和物鏡的物方焦面重合，一環(huán)形分布光源發(fā)出的光束偏離物鏡光軸照明樣品，在管鏡的像方焦面處形成明視場(chǎng)圖像，通過(guò)一臺(tái)數(shù)碼相機(jī)拍攝管鏡像方焦面處的圖像；

環(huán)形分布光源由m個(gè)子光源組成，每個(gè)子光源發(fā)出的光束均以傾角θ偏離物鏡光軸照明樣品；

每個(gè)子光源照明樣品在管鏡的像方焦面形成一幅圖像，點(diǎn)亮所有子光源同時(shí)照明樣品，將在管鏡的像方焦面形成由m個(gè)子光源單獨(dú)照明樣品的疊加圖像i(x,y)：i(x,y)＝i1(x,y)+i2(x,y)+…+im(x,y)，相機(jī)拍攝該圖像，獲得樣品內(nèi)一個(gè)層面的光切片圖像；

樣品臺(tái)在平移器的控制下，帶動(dòng)樣品在物鏡的光軸方向移動(dòng)，使得樣品內(nèi)不同的層面和物鏡物方焦面重合，獲得樣品內(nèi)多個(gè)層面的光切片圖像；

其中，m為整數(shù)，m≥4；傾角θ為照射樣品的光束與物鏡光軸之間的夾角，范圍為：30°≤θ＜90°；i1(x,y)、i2(x,y)、…、im(x,y)分別為每個(gè)子光源單獨(dú)照明樣品時(shí)在管鏡像方焦面上形成的圖像，(x,y)為相機(jī)光敏面的像素點(diǎn)坐標(biāo)。

進(jìn)一步地，將環(huán)形分布光源的m個(gè)子光源分成n組，每次點(diǎn)亮其中一組光源照明樣品，相機(jī)依次拍攝每次照明樣品時(shí)所形成的圖像，將獲得的n幅圖像：i1(x,y)、i2(x,y)、…、in(x,y)，利用這n幅圖像進(jìn)行消除離焦像處理，獲得樣品內(nèi)一個(gè)層面的光切片圖像i(x,y)，消除離焦像處理的算法，可優(yōu)選：n幅圖像線性疊加算法i(x,y)＝i1(x,y)+i2(x,y)+…+in(x,y)，或提取n幅圖像相同坐標(biāo)像素點(diǎn)最大值算法i(x,y)＝max[i1(x,y),i2(x,y),…,in(x,y)]；其中n為范圍：2≤n≤m的整數(shù)，max[]為取最大值運(yùn)算符。

進(jìn)一步地，所述環(huán)形分布光源，由一個(gè)或幾個(gè)光源在一旋轉(zhuǎn)機(jī)構(gòu)的控制下，繞物鏡4光軸旋轉(zhuǎn)形成，光源每旋轉(zhuǎn)一個(gè)方位角δφ，相機(jī)同步拍攝一幅圖像，將旋轉(zhuǎn)一周拍攝到的圖像進(jìn)行線性疊加，獲得樣品內(nèi)一個(gè)層面的光切片圖像；方位角δφ范圍：0＜δφ≤90°。

本發(fā)明的第二個(gè)目的可以通過(guò)采取如下技術(shù)方案達(dá)到：

一種基于環(huán)形離軸照明焦面共軛的非熒光成像光切片裝置，所述裝置依次由環(huán)形分布光源、物鏡、管鏡和相機(jī)構(gòu)成一無(wú)限遠(yuǎn)校正光路，樣品置于樣品臺(tái)上，樣品臺(tái)在平移器的控制下可沿物鏡光軸平移；物鏡和管鏡的光軸相同，且通過(guò)環(huán)形分布光源的圓環(huán)中心；環(huán)形分布光源發(fā)出光束偏離物鏡光軸以傾角θ照射樣品，相機(jī)的光敏面和管鏡的像方焦面重合；計(jì)算機(jī)控制平移器的移動(dòng)和相機(jī)的圖像拍攝。

進(jìn)一步地，所述環(huán)形分布光源由m個(gè)子光源組成，且均勻分布形成一圓環(huán)形，每個(gè)子光源發(fā)出的光束均以傾角θ偏離物鏡光軸照明樣品。

進(jìn)一步地，所述物鏡的數(shù)值孔徑na要足夠大，使得光源偏離物鏡光軸照明樣品時(shí)，在管鏡像方焦面處形成明視場(chǎng)圖像，范圍：0.75≤na＜2.0。

進(jìn)一步地，所述環(huán)形分布光源與所述樣品之間設(shè)置有折射率匹配鏡，所述折射率匹配鏡為半球面平凸透鏡或圓錐透鏡，透鏡的底面和封裝有樣品的載玻片粘合在一起。

進(jìn)一步地，所述環(huán)形分布光源由兩個(gè)設(shè)置在一個(gè)半圓環(huán)上的子光源組成，半圓環(huán)設(shè)置在一旋轉(zhuǎn)平臺(tái)上，旋轉(zhuǎn)平臺(tái)的轉(zhuǎn)軸和物鏡光軸重合，兩子光源對(duì)稱分布在所述物鏡的光軸兩側(cè)，在旋轉(zhuǎn)平臺(tái)的控制下，繞所述物鏡的光軸旋轉(zhuǎn)，形成環(huán)形偏離物鏡光軸照明樣品；

一臺(tái)計(jì)算機(jī)同時(shí)控制所述平移器的移動(dòng)、所述旋轉(zhuǎn)平臺(tái)的轉(zhuǎn)動(dòng)和所述相機(jī)的同步拍攝。

本發(fā)明相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)具有如下的優(yōu)點(diǎn)及效果：

(1)掃描共焦顯微術(shù)是點(diǎn)對(duì)點(diǎn)的共焦成像，而本發(fā)明是面對(duì)面的共焦成像，成像速度更快，方便用于動(dòng)態(tài)樣品成像。

(2)避免熒光成像可能對(duì)樣品產(chǎn)生的生物毒性和光毒性。

(3)相對(duì)結(jié)構(gòu)光照明顯微術(shù)，本發(fā)明照明裝置簡(jiǎn)單。

(4)操作簡(jiǎn)單、方便實(shí)用。

附圖說(shuō)明

圖1是實(shí)施例二中公開(kāi)的基于環(huán)形離軸照明焦面共軛的非熒光成像光切片裝置的結(jié)構(gòu)示意圖；

圖2是焦面處樣品層在下側(cè)離軸光束照明下的成像示意圖；

圖3是焦面處樣品層在上側(cè)離軸光束照明下的成像示意圖；

圖4是焦面內(nèi)離焦樣品層在下側(cè)離軸光束照明下，管鏡像方焦面成像示意圖；

圖5是焦面內(nèi)離焦樣品層在上側(cè)離軸光束照明下，管鏡像方焦面成像示意圖；

圖6是焦面外離焦樣品層在下側(cè)離軸光束照明下，管鏡像方焦面成像示意圖；

圖7是焦面外離焦樣品層在上側(cè)離軸光束照明下，管鏡像方焦面成像示意圖；

圖8是實(shí)施例三中公開(kāi)的基于環(huán)形離軸照明焦面共軛的非熒光成像光切片裝置的結(jié)構(gòu)示意圖；

圖9是實(shí)施例三中獲得的骨骼肌樣品的一個(gè)光切片圖像；

圖10是普通寬場(chǎng)顯微獲得的骨骼肌樣品的顯微圖像；

圖11是實(shí)施例四中公開(kāi)的基于環(huán)形離軸照明焦面共軛的非熒光成像光切片裝置的結(jié)構(gòu)示意圖；

圖12是實(shí)施例四中獲得的肺支氣管樣品的一個(gè)光切片圖像；

圖13是普通寬場(chǎng)顯微獲得的肺支氣管樣品的顯微圖像；

圖中：1-環(huán)形分布光源，2-折射率匹配鏡，3-樣品臺(tái)，4-物鏡，6-管鏡，7-相機(jī)，8-平移器，9-計(jì)算機(jī)，10-旋轉(zhuǎn)平臺(tái)。

具體實(shí)施方式

為使本發(fā)明實(shí)施例的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚，下面將結(jié)合本發(fā)明實(shí)施例中的附圖，對(duì)本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實(shí)施例是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例?；诒景l(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒(méi)有作出創(chuàng)造性勞動(dòng)前提下所獲得的所有其他實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。

實(shí)施例一

傳統(tǒng)明視場(chǎng)光學(xué)顯微鏡，由于受到衍射的限制，軸向可分辨距離一般大于600納米，其參與成像的光束主要以物鏡光軸附近的近軸光束為主。為了提高顯微成像軸向分辨率，獲取超薄光切片，本發(fā)明提出采用大數(shù)值孔徑物鏡，利用大傾角偏離物鏡光軸的光束進(jìn)行成像。在各種傳統(tǒng)顯微成像系統(tǒng)中，參與成像的光束都以近軸光束為主，這是本發(fā)明與傳統(tǒng)顯微成像技術(shù)的最大區(qū)別。盡管暗場(chǎng)顯微鏡采用離軸照明方式，其目的是使得照明光束的直射光不能進(jìn)入物鏡成像，保證背景是一個(gè)暗場(chǎng)來(lái)突顯微弱散射光所成的圖像，但這些用于成像的散射光仍然是以近軸光束為主。

本實(shí)施例公開(kāi)了一種基于環(huán)形離軸照明焦面共軛的非熒光成像光切片方法，所述方法包括下列步驟：

一個(gè)大數(shù)值孔徑的物鏡4和一個(gè)管鏡6構(gòu)成一個(gè)無(wú)限遠(yuǎn)校正光學(xué)系統(tǒng)，物鏡4的物方焦面與管鏡6的像方焦面形成一對(duì)物象共軛面，非熒光樣品內(nèi)的一個(gè)層面和物鏡4的物方焦面重合，一環(huán)形分布光源1發(fā)出的光束偏離物鏡4光軸照明樣品，通過(guò)一臺(tái)數(shù)碼相機(jī)7拍攝管鏡6的像方焦面處的圖像；

其中，環(huán)形分布光源1由m個(gè)子光源組成，且均勻分布形成一圓環(huán)形，每個(gè)子光源發(fā)出的光束均以傾角θ離軸照明樣品；子光源為led光源或激光光源，但不限于這兩種光源，子光源發(fā)出的光束可以直接照射樣品，也可先通過(guò)光纖傳輸再照射樣品。

每個(gè)子光源照明樣品在管鏡6的像方焦面形成一幅圖像，點(diǎn)亮所有子光源同時(shí)照明樣品，將在管鏡6的像方焦面形成由m個(gè)子光源單獨(dú)照明的疊加圖像i(x,y)：i(x,y)＝i1(x,y)+i2(x,y)+…+im(x,y)，相機(jī)拍攝圖像，獲得樣品內(nèi)一個(gè)層面的光切片圖像；

樣品臺(tái)3在平移器8的控制下，帶動(dòng)樣品在物鏡4的光軸方向移動(dòng)，使得樣品內(nèi)不同的層面和物鏡物方焦面重合，獲得樣品內(nèi)多個(gè)層面的光切片圖像；

其中，m為整數(shù)，m≥4；傾角θ為照射樣品的光束與物鏡光軸之間的夾角，范圍為：30°≤θ＜90°；i1(x,y)、i2(x,y)、…、im(x,y)分別為每個(gè)光源單獨(dú)照明樣品時(shí)在管鏡像方焦面上形成的圖像，(x,y)為相機(jī)光敏面的像素點(diǎn)坐標(biāo)。

物鏡4采用大數(shù)值孔徑的物鏡，物鏡4的數(shù)值孔徑na的范圍在0.75≤na＜2.0。

將環(huán)形分布光源的m個(gè)子光源分成n組，每次點(diǎn)亮其中一組光源照明樣品，相機(jī)依次拍攝每次照明樣品時(shí)所形成的圖像，將獲得的n幅圖像：i1(x,y)、i2(x,y)、…、in(x,y)，利用這n幅圖像進(jìn)行消除離焦像處理，獲得樣品內(nèi)一個(gè)層面的光切片圖像i(x,y)，消除離焦像處理的算法，可優(yōu)選：n幅圖像線性疊加算法i(x,y)＝i1(x,y)+i2(x,y)+…+in(x,y)，或提取n幅圖像相同坐標(biāo)像素點(diǎn)最大值算法i(x,y)＝max[i1(x,y),i2(x,y),…,in(x,y)]；其中n為范圍：2≤n≤m的整數(shù)，max[]為取最大值運(yùn)算符。

將一個(gè)或幾個(gè)光源在一旋轉(zhuǎn)機(jī)構(gòu)的控制下，繞物鏡4光軸旋轉(zhuǎn)，形成環(huán)形離軸照明，光源每旋轉(zhuǎn)一個(gè)方位角δφ，相機(jī)同步拍攝一幅圖像，將旋轉(zhuǎn)一周拍攝到的圖像進(jìn)行線性疊加，獲得樣品內(nèi)一個(gè)層面的光切片圖像；方位角δφ范圍：0＜δφ≤90°。

用載玻片封裝的樣品，環(huán)形分布光源1發(fā)出的離軸光束先透過(guò)一個(gè)折射率匹配鏡2再照射樣品。

對(duì)于一個(gè)無(wú)限遠(yuǎn)校正光路系統(tǒng)，物鏡4的物方焦面與管鏡6的像方焦面具有物象共軛關(guān)系，相機(jī)7置于管鏡6的像方焦面，在環(huán)形大傾角的離軸光束照明樣品下，獲取物鏡4的物方焦面處樣品層的圖像，圖1為本發(fā)明的裝置示意圖。

根據(jù)阿貝相干成像理論，在相干照明模式下，照明光束照明到樣品后發(fā)生衍射，直透光方向?yàn)榱慵?jí)衍射光束方向(或零級(jí)角譜光束方向)。在物鏡光軸方向的照明光束其零級(jí)衍射光束仍然在光軸方向；在離軸光束照明下，其零級(jí)衍射光束也偏離光軸方向。零級(jí)衍射光束確定了成像系統(tǒng)對(duì)樣品在管鏡像方焦面所成像的位置。圖2、圖3、圖4、圖5、圖6和圖7分別給出了樣品層處于物鏡焦面和離焦面時(shí)，在管鏡像方焦面所成像的情況。圖2和圖3分別表示焦面處的樣品層在兩束對(duì)稱的離軸光束照明下，管鏡像方焦面所成像情況；圖4和圖5分別表示焦面內(nèi)的離焦樣品層在兩束對(duì)稱的離軸光束照明下，管鏡像方焦面所成像情況；圖6和圖7分別表示焦面外的離焦樣品層在兩束對(duì)稱的離軸光束照明下，管鏡像方焦面所成像情況。從圖2和圖3可看出，對(duì)焦面處的樣品層，由于物鏡物方焦面與管鏡像方焦面的物象共軛關(guān)系，不同傾角的離軸光束照明所成像的位置是相同的，也就是，像是重疊的；從圖4和圖5、圖6和圖7可看出，對(duì)離焦樣品層，不論在焦面內(nèi)還是在焦面外，其像面不在管鏡像方焦面，相機(jī)在管鏡的像方焦面拍攝到的像是模糊的，并且不同傾角的離軸光束照明所成像在管鏡像方焦面的位置是不相同的，也就是像是錯(cuò)開(kāi)的。離焦圖像的錯(cuò)開(kāi)方向和照明光束的方向有關(guān)；圖像錯(cuò)開(kāi)量與離軸光束的傾角有關(guān)，也和離焦距離有關(guān)，還和顯微放大倍數(shù)(或管鏡和物鏡的焦距比)有關(guān)：傾角越大，錯(cuò)開(kāi)量越大；離焦距離越大，錯(cuò)開(kāi)量越大；放大倍數(shù)越大，錯(cuò)開(kāi)量也越大。本發(fā)明根據(jù)這一成像特性，采用環(huán)形不同方向、大傾角的離軸光束照明樣品，對(duì)每個(gè)離軸光束所形成的圖像進(jìn)行消除離焦像處理。例如，共有m個(gè)子光源構(gòu)成的360度環(huán)形分布光源，每個(gè)子光源單獨(dú)照明所形成的圖像分別為：i1(x,y)、i2(x,y)、…、im(x,y)，將這些圖像進(jìn)行線性疊加，得到圖像i(x,y)：i(x,y)＝i1(x,y)+i2(x,y)+…+im(x,y)，那么疊加后的結(jié)果是，焦面處樣品層的圖像得到增強(qiáng)(因?yàn)椴煌较蛘彰鞯膱D像位置相同)，而離焦處樣品層的圖像將會(huì)變得更加模糊甚至消失(因?yàn)椴煌较蛘彰鞯膱D像位置錯(cuò)開(kāi)的)，這樣就可獲得一個(gè)更加清晰的焦面處樣品層圖像，軸向分辨率得到提高，即i(x,y)為一個(gè)樣品層的光切片圖像；也可以提取這些圖像相同坐標(biāo)像素點(diǎn)最大值i(x,y)＝max[i1(x,y),i2(x,y),…,im(x,y)]，重建一幅消除了離焦像的圖像i(x,y)，也即獲得了一個(gè)樣品層的光切片圖像。由于本發(fā)明采用的是焦面共軛成像，不像掃描共焦顯微術(shù)的焦點(diǎn)共軛成像，無(wú)需逐點(diǎn)掃描成像，相對(duì)于掃描共焦顯微術(shù)，本發(fā)明將大大提高成像速度。

需要說(shuō)明的是，盡管是離軸照明，但仍然是明視場(chǎng)成像，故物鏡4的數(shù)值孔徑要足夠大，要保證照明光束的直射光能進(jìn)入物鏡4參與成像。大數(shù)值孔徑物鏡4，可允許的離軸照明光束傾角θ越大，光切片效果就會(huì)越好。

使用折射率匹配鏡2的原因是，如果樣品封裝在載玻片和蓋玻片之間，光源發(fā)出的光束由空氣經(jīng)載玻片再照明樣品，由于空氣和載玻片的折射率不匹配，盡管光束入射到載玻片的入射角很大，但光束進(jìn)入載玻片后發(fā)生折射，使得離軸照明樣品光束的離軸傾角將大幅降低，不利于提高軸向分辨率。通過(guò)使用折射率匹配鏡2，可以確保最終照明光束以一個(gè)較大的離軸傾角照射樣品。

實(shí)施例二

如附圖1所示，本實(shí)施例公開(kāi)了一種基于環(huán)形離軸照明焦面共軛的非熒光成像光切片裝置，依次由環(huán)形分布光源1、物鏡4、管鏡6和相機(jī)7構(gòu)成一無(wú)限遠(yuǎn)校正光路，環(huán)形分布光源1發(fā)出的離軸光束以傾角θ照射樣品，樣品置于樣品臺(tái)3上，樣品臺(tái)3位于環(huán)形光源1和物鏡4之間，樣品臺(tái)3在平移器8的控制下可沿物鏡4的z方向光軸平移；物鏡4和管鏡6的光軸相同，且通過(guò)環(huán)形分布光源1的圓環(huán)中心；相機(jī)7的光敏面和管鏡6的像方焦面重合；計(jì)算機(jī)9控制平移器8的移動(dòng)和相機(jī)7的圖像拍攝。

環(huán)形分布光源1和樣品之間設(shè)置有折射率匹配鏡2，折射率匹配鏡2采用折射率匹配液和承載樣品的載玻片連接，環(huán)形分布光源1發(fā)出的離軸光束透過(guò)折射率匹配鏡2以傾角θ照射樣品。

折射率匹配鏡2為一平凸球面透鏡或圓錐透鏡，但不限于這兩種透鏡，透鏡的底平面與載玻片連接。

實(shí)施例三

如圖8所示，本實(shí)施例公開(kāi)了另一種基于環(huán)形離軸照明焦面共軛的非熒光成像光切片裝置，該裝置采用一個(gè)60倍、數(shù)值孔徑1.49的物鏡4和一個(gè)焦距200mm的管鏡6組成一個(gè)無(wú)限遠(yuǎn)校正光學(xué)系統(tǒng)。由80個(gè)白光led光源均勻分布在一個(gè)直徑132mm的環(huán)形鋁合金內(nèi)面組成一個(gè)環(huán)形分布光源1，每個(gè)led功率相同為0.15瓦。電源控制器將80個(gè)光源同時(shí)點(diǎn)亮，每個(gè)led光源發(fā)出的光束同時(shí)照明一個(gè)用作折射率匹配鏡2的半球面平凸透鏡，半球面平凸透鏡為k9玻璃材料、球面半徑為10mm。半球面平凸透鏡的底面通過(guò)香柏油和封裝有樣品的載玻片粘合在一起，固定在一個(gè)樣品臺(tái)3上。一個(gè)三維(x,y,z方向)平移臺(tái)和一個(gè)一維(z方向)納米平移臺(tái)構(gòu)成平移器8，樣品臺(tái)3在平移器8的控制下，使得半球面平凸透鏡的中心軸和物鏡4光軸重合，并將樣品置于物鏡4的物方焦面處。調(diào)整環(huán)形分布光源1的位置，使得物鏡光軸通過(guò)環(huán)形分布光源1的圓環(huán)中心。樣品臺(tái)3在平移器8的控制下，在光軸z方向以納米級(jí)精度移動(dòng)，使樣品中不同層面和物鏡物方焦面重合。一臺(tái)計(jì)算機(jī)9控制平移器8的移動(dòng)和相機(jī)7的同步拍攝。調(diào)整好裝置后，點(diǎn)亮所有l(wèi)ed光源，將樣品內(nèi)的一個(gè)層面和物鏡的焦面重合，相機(jī)拍攝所成的圖像。圖9為利用這個(gè)裝置拍攝到的一個(gè)骨骼肌樣品的光切片圖像，作為對(duì)比，圖10給出了普通尼康倒置寬場(chǎng)顯微鏡拍攝到的圖像。比較圖9和圖10，可看出圖10中的一些離焦像在圖9中已消失，圖9的軸向分辨率已大幅提高，獲得了光切片效果。

實(shí)施例四

如圖11所示，本實(shí)施例公開(kāi)了另一種基于環(huán)形離軸照明焦面共軛的非熒光成像光切片裝置，該裝置采用一個(gè)60倍、數(shù)值孔徑1.49的物鏡4和一個(gè)焦距200mm的管鏡6組成一個(gè)無(wú)限遠(yuǎn)校正光學(xué)系統(tǒng)。

二個(gè)功率分別為0.13瓦、波長(zhǎng)520nm的led光源，設(shè)置在一個(gè)半圓環(huán)上，半圓環(huán)半徑為78.05mm，并對(duì)稱分布在物鏡4的光軸兩側(cè)，每個(gè)led光源發(fā)出的中心光線和物鏡光軸的夾角為71.3度，相交于物鏡4的光軸。半圓環(huán)設(shè)置在旋轉(zhuǎn)平臺(tái)10上，在旋轉(zhuǎn)平臺(tái)10的控制下，繞物鏡光軸旋轉(zhuǎn)，構(gòu)成環(huán)形分布光源1，形成環(huán)形離軸照明。一個(gè)三維(x,y,z方向)平移臺(tái)和一個(gè)一維(z方向)納米平移臺(tái)構(gòu)成平移器8，樣品臺(tái)3在平移器8的控制下，將樣品置于物鏡4的物方焦點(diǎn)處，并且可以控制樣品臺(tái)3在z方向以納米級(jí)精度移動(dòng)，以拍攝樣品中不同層面的光切片圖像。一臺(tái)計(jì)算機(jī)9控制平移器8的移動(dòng)、旋轉(zhuǎn)平臺(tái)10的轉(zhuǎn)動(dòng)和相機(jī)7的同步拍攝。點(diǎn)亮的環(huán)形分布光源1在旋轉(zhuǎn)平臺(tái)10的帶動(dòng)下，每旋轉(zhuǎn)一個(gè)方位角δφ，相機(jī)7同步拍攝一幅圖像，將旋轉(zhuǎn)一周拍攝到的圖像進(jìn)行線性疊加，獲得樣品內(nèi)一個(gè)層面的光切片圖像。圖12為利用這個(gè)裝置拍攝到的一個(gè)肺支氣管樣品的光切片圖像，作為對(duì)比，圖13給出了普通尼康倒置寬場(chǎng)顯微鏡拍攝到的圖像。對(duì)比圖13，圖12的切片效果明顯。

上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡(jiǎn)化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。