本發(fā)明屬于光學(xué)測量、成像技術(shù)，特別是一種基于光強傳輸方程的環(huán)形光照明高分辨率定量相位顯微成像方法。

背景技術(shù)：

相位恢復(fù)是光學(xué)測量與成像的一個重要技術(shù)，無論在生物醫(yī)學(xué)還是工業(yè)檢測領(lǐng)域，相位成像技術(shù)都在發(fā)揮著重要的作用?？v觀光學(xué)測量技術(shù)近半個世紀的進展，最經(jīng)典的相位測量方法為非干涉測量方法。然而，干涉測量法的缺點也十分明顯：(1)干涉測量一般需要高度相干性的光源(如激光)，從而需要較為復(fù)雜的干涉裝置；(2)額外的參考光路的引入導(dǎo)致對于測量環(huán)境的要求變得十分苛刻；(3)高相干性的光源引入的相干散斑噪聲限制了成像系統(tǒng)的空間分辨率與測量精度。

不同于干涉測量方法，另一類非常重要的相位測量技術(shù)并不需要借助干涉，它們統(tǒng)稱為相位恢復(fù)。由于直接測量光波場的相位分布非常困難，而測量光波場的振幅/強度十分容易。因此，可以將利用強度分布來恢復(fù)(估算)相位這一過程視為一個數(shù)學(xué)上的“逆問題”，即相位恢復(fù)問題。相位恢復(fù)的方法還可細分為迭代法與直接法。基于光強傳輸方程的相位恢復(fù)是一種較為典型的直接相位恢復(fù)方法。光強傳輸方程是一個二階橢圓偏微分方程，闡明了沿著光軸方向上光強度的變化量與垂直于光軸的平面上光波相位的定量關(guān)系。在已知光強軸向微分和聚焦面光強分布的情況下，通過數(shù)值求解光強傳輸方程可直接獲取相位信息。相比與干涉法與迭代相位恢復(fù)法，其主要優(yōu)點包括：(1)非干涉，僅僅通過測量物面光強直接求解相位信息，不需要引入額外參考光；(2)非迭代，通過直接求解微分方程獲得相位；(3)可以很好的應(yīng)用于白光照明，如傳統(tǒng)明場顯微鏡中的科勒照明(illumination)；(4)無需相位解包裹，直接獲取相位的絕對分布，不存在一般干涉測量方法中的2π相位包裹問題；(5)無須復(fù)雜的光學(xué)系統(tǒng)，對于實驗環(huán)境沒有苛刻的要求，振動不敏感。

求解光強傳輸方程最主要的問題就是得到在聚焦面處光強的軸向微分，該軸向微分可通過光強的數(shù)值有限差分獲得。而如何選擇適當(dāng)?shù)碾x焦距離來求取光強的軸向微分，這其中存在一個噪聲與分辨率的權(quán)衡問題。研究表明，當(dāng)離焦距離過小或過大時，最后重構(gòu)的相位圖像中會出現(xiàn)較多的云霧狀低頻噪聲或高頻信息丟失非常嚴重。為了解決這個問題，許多研究者提出多平面(>2)的強度測量方法對軸向微分進行估計。為了更方便地分析基于光強傳輸方程的相位重構(gòu)方法，研究者引入了相襯傳遞函數(shù)(CTF)(文獻[1]E.D.Barone-Nugent,A.Barty,K.A.Nugent,“Quantitative phase-amplitude microscopy I:optical microscopy,”Journal of Microscopy 206,194-203(2002).文獻[2]T.E.Gureyev,A.Pogany,D.M.Paganin,S.W.Wilkins,“Linear algorithms for phase retrieval in the Fresnel region，”O(jiān)ptics Communications 231,53-70(2004).)。以上研究表明，在小離焦情況下，隨著空間頻率的減小，相襯傳遞函數(shù)迅速地減小到0，這也就解釋了基于光強傳輸方程的相位重構(gòu)方法對低頻噪聲的高敏感性。在大離焦的情況下，較高空間頻率區(qū)域的光強傳輸方程傳遞函數(shù)響應(yīng)與相干情況下的CTF差值變大，這就導(dǎo)致了最終的重構(gòu)相位高頻信息丟失嚴重，細小特征模糊。

下面對光強傳輸方程進行較為詳細的背景介紹。

考慮一個沿著z軸傳播的單色相干近軸光波場，其復(fù)振幅U(x)為其中j是虛數(shù)單位，φ(x)為所要恢復(fù)的相位分布。光強傳輸方程可以表示為

其中表示橫向梯度算子，·表示點乘算子。表示光強的軸向微分，該軸向微分可通過有限差分近似獲得。一般情況下通過引入輔助函數(shù)方程可以被轉(zhuǎn)化成以下的泊松方程：

通過求解第一個泊松方程，可以解得輔助函數(shù)ψ(x)，再通過求解第二個泊松方程即可求得待測物體的定量相位。對于觀察樣品為未染色的細胞和生物組織來說，其光強沿橫向變化很小，光強傳輸方程可以被簡化為一個泊松方程：

至此，以上兩步泊松方程的解法可總結(jié)為傅里葉空間中的逆拉普拉斯算子(1/πλ|u|²)。該算子可以看作是光強傳輸方程的響應(yīng)或傳遞函數(shù)，而逆拉普拉斯算子不管是低頻還是高頻響應(yīng)都非常差，這就影響了重構(gòu)相位的信噪比以及可達到的最大成像分辨率。因此，這其中就存在低頻噪聲與高頻模糊兩個主要問題。為了解決這個問題，許多研究者提出多平面(>＝2)的強度測量來估計軸向微分(文獻[3]M.Beleggia,M.A.Schofield,V.V.Volkov,Y.Zhu,“On the transport of intensity technique for phase retrieval，”Ultramicroscopy 102，37-49(2004).文獻[4]C.Zuo,Q.Chen,Y.Yu,A.Asundi,“Transport-of-intensity phase imaging using Savitzky-Golay differentiation filter-theory and applications,”O(jiān)ptic Express 21,5346-5362(2013).文獻[5]C.Zuo,Q.Chen,L.Huang,A.Asundi,“Phase discrepancy analysis and compensation for fast Fourier transform based solution of the transport of intensity equation,”O(jiān)ptics Express 22(14),17172-17186(2014).)。這些方法都是通過對相位傳遞函數(shù)中的某些空間頻率進行選擇、組合或最小二乘擬合，以達到傳遞函數(shù)的最優(yōu)化。然而隨著測量平面的增加，這就延長了數(shù)據(jù)獲取和處理的時間，限制了系統(tǒng)的成像速度，即成像系統(tǒng)的通量。

此外，光強傳輸方程的局限是僅僅給出了拍攝強度圖像的相位，而不是真實物體的相位，這是因為在方程中并沒有包含成像系統(tǒng)的參數(shù)。通過使相干CTF推廣到部分相干下的弱物體光學(xué)傳遞函數(shù)(WOTF)，光強傳輸方程的應(yīng)用范圍擴展到了部分相干領(lǐng)域。通過引入包含成像系統(tǒng)參數(shù)的弱物體光學(xué)傳遞函數(shù)，光強傳輸方程實現(xiàn)了在部分相干情況下物體的相位恢復(fù)。雖然部分相干照明有益于提高定量相位成像的分辨率，但是其相位重構(gòu)的好壞主要還是依賴于WOTF的形式。在傳統(tǒng)的部分相干成像中，可以通過提升圓形照明光的數(shù)值孔徑來增大WOTF的截止頻率，以達到提高成像分辨率的目的。如圖2(a)至圖2(d)，傳統(tǒng)圓形光照明時隨著相干系數(shù)s(s為照明數(shù)值孔徑與物鏡數(shù)值孔徑的比值)的變大，WOTF的截止頻率也隨之變大。但當(dāng)照明數(shù)值孔徑接近于物鏡數(shù)值孔徑時，WOTF在各空間頻率的響應(yīng)變差，導(dǎo)致強度圖像對比度逐漸減，也就無法實現(xiàn)準確的相位重構(gòu)。因此，傳統(tǒng)方法利用圓形光源照明中存在低頻云霧狀噪聲與高頻模糊難以同時兼顧的矛盾，其相位重構(gòu)的準確性差。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種基于光強傳輸方程的環(huán)形光照明高分辨率定量相位顯微成像方法，可有效解決云霧狀低頻噪聲與高頻模糊難以兼顧的矛盾，大大提高了重構(gòu)相位的空間分辨率，且對噪聲具有較好的魯棒性。

實現(xiàn)本發(fā)明目的的技術(shù)解決方案為：一種基于光強傳輸方程的環(huán)形光照明高分辨率定量相位顯微成像方法，首先設(shè)計一個環(huán)形光闌，然后基于部分相干成像方法，引入弱物體近似，利用環(huán)形光闌以及明場顯微鏡的參數(shù)計算出弱物體光學(xué)傳遞函數(shù)WOTF，最后利用相機采集三幅強度圖像并通過反卷積求解光強傳輸方程得到定量相位圖。

本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，其顯著優(yōu)點：(1)能顯著提高成像空間截止頻率到相干成像系統(tǒng)衍射極限的2倍，從而提高相位重構(gòu)的空間分辨率，而且額外的高頻部分有利于相位細節(jié)的恢復(fù)。(2)能使相位對比度提高2倍以上，使低頻和高頻的成分顯著提高，由此解決低頻噪聲與高頻模糊的矛盾，且對低頻噪聲具有較好的魯棒性。(3)無需對傳統(tǒng)明場顯微鏡進行復(fù)雜的改造，即可賦予其高分辨率定量相位成像的能力。

下面結(jié)合附圖對本發(fā)明作進一步詳細描述。

附圖說明

圖1是本發(fā)明基于光強傳輸方程的環(huán)形光照明高分辨率定量相位顯微成像方法步驟流程示意圖。

圖2是傳統(tǒng)圓形光照明時不同相干系數(shù)s和不同離焦距離下WOTF(虛部)的響應(yīng)曲線。(a)s＝0.1；(b)s＝0.4；(c)s＝0.75；(d)s＝0.99。

圖3(a)是所拍攝的微透鏡陣列的全息圖。

圖3(b)是數(shù)字全息重構(gòu)得到的相位圖。

圖3(c)是基于本發(fā)明方法恢復(fù)得到的相位圖。

圖3(d)是相位橫截面對比，分別對應(yīng)圖3(b)和圖3(c)中的標(biāo)線區(qū)域。

圖4是對頰上皮細胞樣品進行了定量相位成像的實驗結(jié)果示意圖。圖4(a)是本發(fā)明重構(gòu)出的定量相位圖；圖4(b)是頰上皮細胞樣品厚度的偽彩色三維顯示圖。圖4(c)～(e)是圖4(a)中所選三個區(qū)域的局部放大圖。圖4(f)是圖4(e)中箭頭所標(biāo)出的截面相位曲線圖。

圖5是對BMSC人體骨髓基質(zhì)細胞樣品進行定量相位成像的實驗結(jié)果示意圖。圖5(a1)是相干系數(shù)為1的環(huán)形光照明下離焦距離為0.5μm沿光軸方向采集3幅光強圖像后恢復(fù)的相位圖；圖5(b1)～(e1)分別是相干系數(shù)為0.22、0.44、0.78、0.99的圓形光照明下離焦距離為0.5μm沿光軸方向采集3幅光強圖像后恢復(fù)的相位圖；圖5(a2)～(e2)分別是圖5(a1)中對應(yīng)區(qū)域的局部放大圖；圖5(a3)～(e3)分別是圖5(a2)～(e2)中箭頭所標(biāo)出的截面的相位曲線圖。

圖6是環(huán)形光闌的結(jié)構(gòu)示意圖。

具體實施方式

結(jié)合圖1，本發(fā)明基于光強傳輸方程的環(huán)形光照明高分辨率定量相位顯微成像方法，具體實施步驟如下：

步驟一，設(shè)計一個環(huán)形光闌。該環(huán)形光闌可由3D打印機打印，也可以通過玻璃或金屬材料黑色陽極電鍍工藝制成(與傳統(tǒng)相差板加工工藝相同)，還可以由可編程LED或LCD編碼實現(xiàn)。所設(shè)計的環(huán)形光闌主要有兩個參數(shù)：一個是環(huán)形光闌的外徑r，另一個是圓環(huán)寬度△s。該環(huán)形光闌的環(huán)形區(qū)域透光，中心為黑色不透光區(qū)域，該中心黑色不透光區(qū)域具有較高的遮光率并且整個環(huán)形光闌具有良好的熱穩(wěn)定性，環(huán)形光闌的外徑r等于明場顯微鏡的物鏡光瞳半徑，如圖6所示。考慮到圓環(huán)寬度△s對透光強弱的影響，一般取外徑r的5％～15％，本發(fā)明舉例時選取10％(即△s＝10％r)，將該環(huán)形光闌放置在明場顯微鏡的聚光鏡孔徑光闌處，并將伯特蘭透鏡放入明場顯微鏡的目鏡觀察筒的筒鏡中，通過目鏡觀察物鏡后焦面以確保環(huán)形光闌內(nèi)切于物鏡光曈。

步驟二，基于部分相干成像的(方法)原理，引入弱物體近似，利用環(huán)形光闌以及明場顯微鏡的參數(shù)計算出弱物體光學(xué)傳遞函數(shù)(WOTF)，即弱物體光學(xué)傳遞函數(shù)的公式為：

其中，u和u'是傅里葉空間的二維坐標(biāo)，k是波數(shù)，λ是明場顯微鏡的照明光波長，S(u)表示環(huán)形光闌平面光源的光強分布，|P(u)|表示明場顯微鏡的物鏡光曈函數(shù)，Δz表示明場顯微鏡沿光軸的離焦距離，WOTF為求出的弱物體光學(xué)傳遞函數(shù)。其中該傳遞函數(shù)的虛部為弱物體的相位傳遞函數(shù)。

所設(shè)計的環(huán)形光闌的數(shù)學(xué)表達式為：

其中，為頻率坐標(biāo)，該頻率坐標(biāo)被歸一化到相干衍射極限(NA_obj/λ，NA_obj表示物鏡數(shù)值孔徑，λ表示系統(tǒng)照明光波長)，s₁和s₂分別表示環(huán)形光闌內(nèi)圈和外圈的數(shù)值孔徑(根據(jù)所設(shè)計的光闌s₂＝1，s₁＝90％)，表示環(huán)形光闌平面光源的光強分布，表示明場顯微鏡的物鏡光曈函數(shù)。根據(jù)明場顯微鏡的照明波長λ以及離焦距離Δz(這里可以對Δz選取不同的值，但該量不宜過大，一般取2μm以內(nèi))代入弱物體光學(xué)傳遞函數(shù)公式(1)中，計算出在特定離焦距離和照明波長下該環(huán)形光闌的弱物體光學(xué)傳遞函數(shù)。

步驟三，利用相機沿光軸拍攝三幅強度圖像，并通過反卷積求解光強傳輸方程得到定量相位圖，具體步驟如下：

第一步，通過手動調(diào)焦或電控離焦控制相機同步采集欠焦、聚焦、過焦三幅光強圖像，分別記作I_△z(x)，I₀(x)與I_-Δz(x)，它們的離焦距離分別是Δz，0，-Δz。

第二步，對三幅光強圖像進行傅里葉變換，分別記作與將以及步驟二中計算得出的弱物體光學(xué)傳遞函數(shù)(WOTF)代入方程(4)中，通過反卷積求出相位的傅里葉變換

第三步，對進行逆傅里葉變換即可求得定量相位φ(x),從而實現(xiàn)了高分辨率定量相位的顯微成像。

綜合以上步驟可知，本發(fā)明通過設(shè)計一個環(huán)形光闌，并求得由環(huán)形光闌以及明場顯微鏡參數(shù)決定的弱物體光學(xué)傳遞函數(shù)，從而使得傳遞函數(shù)各頻率的響應(yīng)顯著提高。由于最終重構(gòu)相位中的低頻和高頻成分增多，其可有效的解決傳統(tǒng)圓形照明時低頻云霧狀噪聲與高頻模糊難以兼顧的矛盾。與此同時，由于使用高數(shù)值孔徑的環(huán)形照明，這就增大明場顯微鏡的截止頻率，其可顯著提高明場顯微鏡的成像分辨率。此外，本方法無需對傳統(tǒng)明場顯微鏡進行復(fù)雜的改造，可賦予明場顯微鏡高分辨率定量相位成像的能力。

下面給出本發(fā)明在微光學(xué)元件上的實驗結(jié)果。樣品是一間距為300μm的平凸石英微透鏡陣列(MLA300-7AR,Thorlabs)。實驗中，光強軸向微分信號是通過兩幅±1μm距離的過焦與欠焦光強分布采用中心有限差分得到的。圖3(a)給出了所拍攝的微透鏡陣列的全息圖。圖3(c)給出了本發(fā)明重構(gòu)出的定量相位。注意盡管相位的范圍已經(jīng)超過了2π，光強傳輸方程仍可以直接恢復(fù)出絕對相位且不需要相位解包裹。為了驗證本發(fā)明方法的準確性，將結(jié)果與數(shù)字全息顯微鏡成像結(jié)果進行對比(λ＝632.8nm，60x，NA＝0.85)，如圖3(b)所示。本發(fā)明還從兩者結(jié)果中選取了一條截面曲線進行定量比較，如圖3(d)所示。兩條曲線符合的很好，誤差有可能是由于噪聲的影響以及數(shù)字全息重構(gòu)中定義最佳聚焦面的不準確性。

本發(fā)明對頰上皮細胞樣品進行了定量相位成像，使用的油浸顯微物鏡(UPLSAPO 100X,Olympus)放大率為100倍，數(shù)值孔徑為1.4，照明光的中心波長為550nm。如圖4所示，圖4(a)是本發(fā)明重構(gòu)出的定量相位圖。圖4(b)是頰上皮細胞樣品厚度的偽彩色三維顯示圖。圖4(c)～(e)是圖4(a)中所選三個區(qū)域的局部放大圖。圖4(f)是圖4(e)中箭頭所標(biāo)出的截面相位曲線圖。從圖4(f)可以看出，最小可分辨的球形結(jié)構(gòu)間距為208nm(相當(dāng)于2.66的有效數(shù)值孔徑)，這意味著在定量相位成像中橫向分辨率至少可達到208nm。從實驗結(jié)果可以看出，由本發(fā)明恢復(fù)的相位在重建分辨率上得到了很大的提升(達到2倍物鏡數(shù)值孔徑的分辨率)。

此外，本發(fā)明還選取了BMSC人體骨髓基質(zhì)細胞樣品進行了定量相位成像，使用的顯微物鏡(UPLSAPO 40X,Olympus)放大率為40倍，數(shù)值孔徑為0.9，照明光的中心波長為550nm。如圖5所示，圖5(a1)是相干系數(shù)為1的環(huán)形光照明下離焦距離為0.5μm沿光軸方向采集3幅光強圖像后恢復(fù)的相位圖。圖5(b1)～(e1)分別是相干系數(shù)為0.22、0.44、0.78、0.99的圓形照明下離焦距離為0.5μm沿光軸方向采集3幅光強圖像后恢復(fù)的相位圖。圖5(a2)～(e2)分別是圖5(a1)中對應(yīng)區(qū)域的局部放大圖。圖5(a3)～(e3)分別是圖5(a2)～(e2)中箭頭所指截面的相位曲線圖。對比這五個不同照明模式下恢復(fù)的相位圖結(jié)果可以看出使用環(huán)形光照明恢復(fù)出的相位比任一種圓形光照明的結(jié)果都好。本發(fā)明重構(gòu)的相位圖背景更均勻，在去除低頻噪聲的基礎(chǔ)下，高頻細節(jié)得到最大程度的保留。由此證明本發(fā)明能夠有效的解決低頻云霧噪聲與高頻模糊難以兼顧的矛盾，對低頻噪聲具有較好的魯棒性。