本發(fā)明屬于光學(xué)顯微成像技術(shù)，特別是一種基于大照明數(shù)值孔徑的大視場(chǎng)高分辨率顯微成像裝置及迭代重構(gòu)方法。

背景技術(shù)：

在顯微成像領(lǐng)域，更高的分辨率一直是追求的目標(biāo)，但是在提高分辨率的同時(shí)存在一個(gè)關(guān)鍵性問(wèn)題，那就是并沒(méi)有隨分辨率一起提高的顯微鏡的空間帶寬積。從成像系統(tǒng)角度看，為了實(shí)現(xiàn)高分辨率，必須增加顯微物鏡的數(shù)值孔徑，但空間分辨率的提高與視場(chǎng)的擴(kuò)大往往是一對(duì)難以調(diào)和的矛盾。簡(jiǎn)言之，就是在低倍鏡下可以看到被檢物體的全貌，換成高倍物鏡時(shí)，就只能看到被檢物體的很小一部份。目前，為了突破分辨率與視場(chǎng)大小難以同時(shí)兼顧的矛盾，常見(jiàn)的方法是采用常規(guī)顯微鏡系統(tǒng)配合高精度機(jī)械掃描和后期空域圖像拼接方法將多個(gè)小視場(chǎng)高分辨率圖像拼接融合生成一幅大視場(chǎng)高分辨率圖像(孫西釗,王震,李攀,李建勛,王文合.適用于結(jié)核桿菌抗酸染色圖像拼接的裝置:中國(guó),2013205777012[p].2013-09-17.)。但是由于引入了機(jī)械移動(dòng)裝置，所以系統(tǒng)成像時(shí)的穩(wěn)定性和成像速度又成為一對(duì)難以調(diào)和的矛盾，提高掃描速度必將影響成像穩(wěn)定性。所以，想要突破分辨率與視場(chǎng)大小難以同時(shí)兼顧的矛盾又不引入了機(jī)械移動(dòng)裝置，必須采用近年來(lái)提出的計(jì)算成像的方法，比如基于合成孔徑的成像方法。

基于合成孔徑成像原理的掃描成像方法最早是由hoppe為了研究晶體結(jié)構(gòu)所提出的一種技術(shù)(hoppew.tracestructureanalysis,ptychography,phasetomography[j].ultramicroscopy,1982,10(3):187-198.)，并通過(guò)研究晶體和非晶體的掃描透射電子衍射顯微成像，驗(yàn)證了此方法的有效性。rodenburg和faulkner等結(jié)合相位恢復(fù)算法將此方法進(jìn)行了多次改進(jìn)(rodenburgjm.ptychographyandrelateddiffractiveimagingmethods[j].advancesinimagingandelectronphysics,2008,150:87-184.)。目前這種成像方法已在可見(jiàn)光域、x射線、電子顯微鏡等不同波段得到了實(shí)驗(yàn)證實(shí)，并發(fā)展出若干種技術(shù)以提高成像質(zhì)量以及分辨率，該技術(shù)顯示了在大幅面成像和高分辨成像方面的巨大潛力。上述傳統(tǒng)的合成孔徑成像技術(shù)是通過(guò)移動(dòng)一個(gè)全透的小孔(或待測(cè)樣品本身)使入射平面波照射到待測(cè)樣品的不同部位，即由小孔控制照明光束尺寸、幾何形狀及位置，并利用由此得到的一系列衍射強(qiáng)度圖樣重構(gòu)出待測(cè)樣品的振幅與位相信息(王雅麗,史祎詩(shī),李拓，等.可見(jiàn)光域疊層成像中照明光束的關(guān)鍵參量研究[j].物理學(xué)報(bào),2013,vol.62,no.6.064206-1-9)。合成孔徑成像術(shù)的關(guān)鍵在于：每次照射待測(cè)樣品的一個(gè)“子孔徑”也就是待測(cè)樣品的某一部分時(shí)，都要和至少一個(gè)其他的“子孔徑”發(fā)生交疊。這樣就可建立一種重構(gòu)算法，在分別重構(gòu)每“子孔徑”的復(fù)振幅時(shí)也要同時(shí)滿足其他“子孔徑”衍射分布的約束，使得最后的待測(cè)樣品的整體復(fù)振幅信息是所有“子孔徑”的共同解，從而由各個(gè)“子孔徑”拼接合成一幅大視場(chǎng)高分辨率的待測(cè)樣品的圖像。合成孔徑成像術(shù)可以說(shuō)是一種穩(wěn)健而簡(jiǎn)約的顯微成像技術(shù)，但其一直缺乏一種穩(wěn)健的圖像重構(gòu)算法。特別是當(dāng)所采集的圖像信噪比較低時(shí)，往往難以得到理想的重構(gòu)圖像，因此如何提高重構(gòu)質(zhì)量與信噪比成為了合成孔徑成像技術(shù)必須克服的一個(gè)技術(shù)難題。2013年，鄭國(guó)安將合成孔徑成像術(shù)由空域引入了頻域，提出了傅立葉疊層成像技術(shù)，也叫頻域疊層孔徑成像技術(shù)(zhengg,horstmeyerr,yangc.wide-field,high-resolutionfourierptychographicmicroscopy[j].naturephotonics,2013,7(9):739-745.)。該方法雖然能夠?qū)崿F(xiàn)大視場(chǎng)高分辨率顯微成像，空間帶寬積相比于傳統(tǒng)光學(xué)顯微技術(shù)得到了極大的提升。但是因?yàn)槠涑上裣到y(tǒng)中拋棄了聚光鏡所以照明的數(shù)值孔徑很難超過(guò)0.7，這就導(dǎo)致其重構(gòu)分辨率一般無(wú)法達(dá)到300nm。另外，由于其圖像重構(gòu)質(zhì)量會(huì)受到系統(tǒng)中各項(xiàng)系統(tǒng)誤差的影響，所以如何在不損失成像視場(chǎng)大小的前提下實(shí)現(xiàn)合成數(shù)值孔徑達(dá)到1.6，重構(gòu)圖像分辨率達(dá)到150nm的高精度大視場(chǎng)高分辨率顯微成像成為了傅立葉疊層成像技術(shù)必須克服的一個(gè)技術(shù)難題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種基于大照明數(shù)值孔徑的大視場(chǎng)高分辨率顯微成像裝置與迭代重構(gòu)方法，以不損失成像視場(chǎng)大小為前提，實(shí)現(xiàn)合成數(shù)值孔徑達(dá)到1.6，重構(gòu)圖像分辨率達(dá)到150nm的高精度大視場(chǎng)高分辨率顯微成像，極大提升傅立葉疊層成像技術(shù)的成像質(zhì)量和重構(gòu)分辨率。

實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的的技術(shù)解決方案為：一種基于大照明數(shù)值孔徑的大視場(chǎng)高分辨率顯微成像裝置，包括led陣列、載物臺(tái)、聚光鏡、顯微物鏡、成像筒鏡、相機(jī)，所述的led陣列設(shè)置在聚光鏡的前焦面上，并且led陣列的中心處于顯微物鏡的光軸上；顯微物鏡的后焦面與成像筒鏡的前焦面重合，相機(jī)的成像平面放置在成像筒鏡的后焦面上，成像時(shí)載物臺(tái)上的待測(cè)樣品調(diào)節(jié)到顯微物鏡的前焦面位置，構(gòu)成無(wú)窮遠(yuǎn)校正成像系統(tǒng)；

所述led陣列上第i個(gè)點(diǎn)亮的led單元發(fā)出的光經(jīng)過(guò)聚光鏡匯聚變成平行光照射在待測(cè)樣品上，該待測(cè)樣品被放置在載物臺(tái)上，透過(guò)待測(cè)樣品的一部分衍射光被顯微物鏡收集，并經(jīng)過(guò)成像筒鏡匯聚照射相機(jī)的成像平面，形成的光強(qiáng)圖由相機(jī)記錄下來(lái)。

一種基于大照明數(shù)值孔徑的大視場(chǎng)高分辨率顯微成像迭代重構(gòu)方法，步驟如下：

步驟一，led單元亮度標(biāo)定，將led陣列作為基于大照明數(shù)值孔徑的大視場(chǎng)高分辨率顯微成像裝置的照明光源，順次點(diǎn)亮led陣列中每一個(gè)led單元，照射空白待測(cè)樣品后使用高倍物鏡采集相對(duì)應(yīng)的圖像，并計(jì)算每個(gè)led單元在紅綠藍(lán)三個(gè)波段對(duì)應(yīng)的歸一化亮度校正系數(shù)；

步驟二，led陣列位置標(biāo)定，將分辨率板作為待測(cè)樣品，led陣列作為基于大照明數(shù)值孔徑的大視場(chǎng)高分辨率顯微成像裝置的照明光源，順次點(diǎn)亮led陣列中每一個(gè)led單元，照射待測(cè)樣品后分別采集聚焦下和離焦h距離下相對(duì)應(yīng)的圖像，然后通過(guò)亞像素配準(zhǔn)算法計(jì)算每個(gè)led單元在紅綠藍(lán)三個(gè)波段對(duì)應(yīng)的照明角度，再通過(guò)非線性回歸確定led陣列位置；

步驟三，原始圖像采集，將led陣列作為基于大照明數(shù)值孔徑的大視場(chǎng)高分辨率顯微成像裝置的照明光源，順次點(diǎn)亮led陣列中每一個(gè)led單元，照射待測(cè)樣品后采集相對(duì)應(yīng)的低分辨率原始圖像；

步驟四：原始圖像預(yù)處理，包括閾值去噪和亮度校正，首先根據(jù)相機(jī)的暗電流噪聲平均值作為閾值，對(duì)拍攝的低分辨率原始圖像進(jìn)行閾值去噪，得到去噪后低分辨率圖像，然后再將每一幅去噪后低分辨率圖像除以步驟一中獲得的歸一化亮度校正系數(shù)，得到亮度校正后的低分辨率圖像；

步驟五：高分辨率圖像初始化，將所有亮度校正后的低分辨率圖像中的低分辨率明場(chǎng)圖像相加平均，然后再通過(guò)上采樣來(lái)初始化高分辨率圖像的振幅與相位；

步驟六：迭代重構(gòu)，采用基于頻域疊層孔徑與像素合并迭代方法將所有亮度校正后的低分辨率圖像在頻域中逐一進(jìn)行合成孔徑運(yùn)算，并逐步減小更新系數(shù)，以代價(jià)函數(shù)值為判據(jù)，當(dāng)代價(jià)函數(shù)小于一個(gè)給定的閾值時(shí)，停止迭代，此時(shí)的高分辨率圖像的振幅與相位就是最終得到的大視場(chǎng)高分辨率顯微圖像。

上述基于大照明數(shù)值孔徑的大視場(chǎng)高分辨率顯微成像迭代重構(gòu)方法只適用于重構(gòu)單色圖像，若需重構(gòu)真彩色圖像，則每個(gè)led單元分別采用紅光、綠光、藍(lán)光來(lái)照明物體，然后對(duì)于每種照明波長(zhǎng)分別進(jìn)行圖像重構(gòu)，重構(gòu)的三組圖像分別作為最終的真彩色圖像的紅、綠、藍(lán)分量合成即可。

本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，其顯著優(yōu)點(diǎn)：(1)既采用了led陣列作為照明光源同時(shí)又保留了聚光鏡，這樣既保證了照明方向的編程可控，同時(shí)也保證了照明數(shù)值孔徑最高可達(dá)到1.20，從而獲得高達(dá)0.15um的重構(gòu)分辨率。(2)在裝置各項(xiàng)參數(shù)誤差經(jīng)過(guò)預(yù)先標(biāo)定的前提下，對(duì)采集的原始圖像進(jìn)行了恰當(dāng)?shù)念A(yù)處理，從而能夠非常穩(wěn)定并且準(zhǔn)確地重建出大視場(chǎng)高分辨率圖像。(3)在低倍物鏡條件下，利用基于頻域疊層孔徑與像素合并迭代算法，實(shí)現(xiàn)超大視場(chǎng)、高分辨率顯微成像，并能夠有效提高對(duì)噪聲的魯棒性。

下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述。

附圖說(shuō)明

圖1是基于可編程led陣列的顯微鏡光路示意圖。

圖2是led陣列中每個(gè)led單元的歸一化亮度，包括圖2(a)、圖2(b)、圖2(c)，其中圖2(a)、圖2(b)、圖2(c)分別是在紅色、綠色、藍(lán)色三個(gè)波段所對(duì)應(yīng)的歸一化亮度。

圖3為本發(fā)明基于大照明數(shù)值孔徑的大視場(chǎng)高分辨率顯微成像迭代重構(gòu)方法的重構(gòu)流程示意圖。

圖4(a)是10倍物鏡(數(shù)值孔徑0.4)下同時(shí)點(diǎn)亮led陣列中所有明場(chǎng)的led單元照射1951usaf分辨率板待測(cè)樣品所拍攝到的低分辨率圖像；選取圖4(a)方框中的圖像直接進(jìn)行放大，得到圖4(b1)、圖4(b2)、圖4(b3)，其中圖4(b1)、圖4(b2)、圖4(b3)分別是在紅色、綠色、藍(lán)色三個(gè)波段拍攝到的圖像。從中再選擇更小的區(qū)域直接進(jìn)行放大，又得到圖4(c1)、圖4(c2)、圖4(c3)，其中圖4(c1)、圖4(c2)、圖4(c3)分別是在紅色、綠色、藍(lán)色三個(gè)波段的圖像。選取圖4(c)中的區(qū)域進(jìn)行迭代重構(gòu)，所得的高分辨率結(jié)果如圖4(d1)、圖4(d2)、圖4(d3)所示，其中圖4(d1)、圖4(d2)、圖4(d3)分別是在紅色、綠色、藍(lán)色三個(gè)波段重構(gòu)的圖像。

具體實(shí)施方式

結(jié)合圖1，本發(fā)明基于大照明數(shù)值孔徑的大視場(chǎng)高分辨率顯微成像裝置及迭代重構(gòu)方法利用的實(shí)際硬件平臺(tái)是基于led陣列的顯微鏡。本發(fā)明基于大照明數(shù)值孔徑的大視場(chǎng)高分辨率顯微成像裝置解決了使用聚光鏡在不損失成像視場(chǎng)的前提下把分辨率提高到150nm的技術(shù)難題，包括led陣列1、載物臺(tái)2、聚光鏡3、顯微物鏡5、成像筒鏡6、相機(jī)7，所述的led陣列1設(shè)置在聚光鏡3的前焦面上，其中f為聚光鏡3的焦距，一般在10-20mm之間，并且led陣列1的中心處于顯微物鏡5的光軸上；顯微物鏡5的后焦面與成像筒鏡6的前焦面重合，相機(jī)7的成像平面放置在成像筒鏡6的后焦面上，成像時(shí)載物臺(tái)2上的待測(cè)樣品4調(diào)節(jié)到顯微物鏡5的前焦面位置，構(gòu)成無(wú)窮遠(yuǎn)校正成像系統(tǒng)。

led陣列1中包括若干個(gè)(至少261個(gè))led單元8，它們等間隔排布形成一個(gè)二維陣列。其中每個(gè)led單元均為紅綠藍(lán)三色led單元，其典型波長(zhǎng)為紅光633nm、綠光525nm和藍(lán)光465nm。每個(gè)led單元之間中心間距d典型值1-4mm。led陣列1并不需要進(jìn)行單獨(dú)加工，一般在市場(chǎng)上可直接購(gòu)置。表1給出了一個(gè)市面上可購(gòu)置的led陣列的產(chǎn)品參數(shù)。在此led陣列中，led單元共有32行、32列，一共1024個(gè)，每個(gè)led單元的亮度在2000cd/m²以上。

所述led陣列1上第i個(gè)點(diǎn)亮的led單元8發(fā)出的光經(jīng)過(guò)聚光鏡3匯聚變成平行光照射在待測(cè)樣品4上，該待測(cè)樣品4被放置在載物臺(tái)2上，透過(guò)待測(cè)樣品4的一部分衍射光被顯微物鏡5收集，并經(jīng)過(guò)成像筒鏡6匯聚照射相機(jī)7的成像平面，形成的光強(qiáng)圖由相機(jī)7記錄下來(lái)。led陣列1中每個(gè)led單元均可通過(guò)單獨(dú)點(diǎn)亮，點(diǎn)亮led單元的具體方法為現(xiàn)有常規(guī)技術(shù)，實(shí)現(xiàn)電路可以采用(但不限于)單片機(jī)、arm、或者可編程邏輯器件等現(xiàn)有技術(shù)即可實(shí)現(xiàn)，具體實(shí)現(xiàn)方法可參考相關(guān)文獻(xiàn)(如郭寶增,鄧淳苗：基于fpga的led顯示屏控制系統(tǒng)設(shè)計(jì)[j].液晶與顯示,2010,25(3):424-428)。

表1led陣列的物理參數(shù)

本發(fā)明中為了滿足重構(gòu)方法所需的最小頻域采樣率，所述的顯微物鏡5數(shù)值孔徑為naobj，且滿足其中f為聚光鏡3的焦距，d為相鄰led單元8之間的間距。為了保證重構(gòu)圖像質(zhì)量和精度，必須保證d<2mm，即必須使用led單元間距小于2毫米的led陣列。同時(shí)，為了滿足重構(gòu)算法所需的最小空域采樣率，所述的led陣列1照明波長(zhǎng)為λ，顯微物鏡5放大率為mag，像元尺寸為δxcam，且滿足

所述的相機(jī)7可以為彩色或單色相機(jī)，如果是單色相機(jī)，在成像時(shí)，led陣列1中每個(gè)led單元8分別發(fā)出紅或綠或藍(lán)單色光，用單色相機(jī)依次記錄下所有單色圖像即可；如果是彩色相機(jī)，在成像時(shí)，led陣列1中每個(gè)led單元8同時(shí)發(fā)出紅綠藍(lán)三色光，用彩色相機(jī)記錄下所有彩色圖像。

本發(fā)明中聚光鏡3和待測(cè)樣品4之間可以加入顯微鏡油，從而獲得更高的照明數(shù)值孔徑。一般的，聚光鏡3和待測(cè)樣品4之間不加入顯微鏡油，照明數(shù)字孔徑最高只有0.95。加入顯微鏡油之后，照明數(shù)字孔徑能達(dá)到1.20以上。

結(jié)合圖3，本發(fā)明利用上述裝置的基于大照明數(shù)值孔徑的大視場(chǎng)高分辨率顯微成像迭代重構(gòu)方法，步驟如下：

步驟一，led單元8亮度標(biāo)定，將led陣列1作為基于大照明數(shù)值孔徑的大視場(chǎng)高分辨率顯微成像裝置的照明光源，順次點(diǎn)亮led陣列1中每一個(gè)led單元8，照射空白待測(cè)樣品4后使用高倍物鏡采集相對(duì)應(yīng)的圖像，并計(jì)算每個(gè)led單元8在紅綠藍(lán)三個(gè)波段對(duì)應(yīng)的歸一化亮度校正系數(shù)。

在步驟一中，led陣列1作為顯微鏡的照明光源，順次點(diǎn)亮led陣列1中每一個(gè)led單元8，照射空白待測(cè)樣品4后使用高倍物鏡(典型值為40倍0.95數(shù)值孔徑的顯微物鏡)采集相對(duì)應(yīng)的圖像。整個(gè)led陣列1中共包含n個(gè)led單元，n>261，每個(gè)led單元8分別發(fā)出紅綠藍(lán)三種顏色的單色光，共計(jì)拍攝3n幅低分辨率圖像，則第i個(gè)led單元在顏色c下對(duì)空白待測(cè)樣品拍攝到的圖像記作其中i＝1,2,...,n，c＝r,g,bc＝r,g,b(表示紅綠藍(lán))，r為實(shí)空間的二維坐標(biāo)r＝(x,y)，然后計(jì)算每幅圖像的平均光強(qiáng)成為每個(gè)led單元在紅綠藍(lán)三個(gè)波段的平均亮度，其中npixel為一幅圖像中的像素總個(gè)數(shù)，led陣列1中心的led單元8所對(duì)應(yīng)的平均亮度為則每個(gè)led單元在紅綠藍(lán)三個(gè)波段對(duì)應(yīng)的歸一化亮度校正系數(shù)為

步驟二，led陣列1位置標(biāo)定，將分辨率板作為待測(cè)樣品4，led陣列1作為基于大照明數(shù)值孔徑的大視場(chǎng)高分辨率顯微成像裝置的照明光源，順次點(diǎn)亮led陣列1中每一個(gè)led單元8，照射待測(cè)樣品4后分別采集聚焦下和離焦h距離下相對(duì)應(yīng)的圖像，然后通過(guò)亞像素配準(zhǔn)算法計(jì)算每個(gè)led單元8在紅綠藍(lán)三個(gè)波段對(duì)應(yīng)的照明角度，再通過(guò)非線性回歸確定led陣列位置。

在步驟二中，以分辨率板作為待測(cè)樣品，led陣列作為顯微鏡的照明光源，順次點(diǎn)亮其中每一個(gè)led單元。首先，led陣列1照射待測(cè)樣品4后分別采集聚焦下和離焦h距離(h典型值為10到30微米)下相對(duì)應(yīng)的聚焦圖像和離焦圖像根據(jù)角譜衍射理論將led陣列1中心的led單元8對(duì)應(yīng)的聚焦圖像沿光軸數(shù)值傳播h距離，得到數(shù)值離焦圖像

然后通過(guò)亞像素配準(zhǔn)算法計(jì)算每個(gè)離焦圖像相對(duì)于數(shù)值離焦圖像的偏移量(pyx,pyy)，則第i個(gè)led單元所對(duì)應(yīng)的照明光的空間頻率矢量為

其中，(ux,uy)為沿x,y方向的空間頻率，λ為照明光的波長(zhǎng)；

最后再通過(guò)非線性回歸確定led陣列位置，公式為：

xi＝d[cos(θ)mi+sin(θ)ni]+δx

yi＝d[-sin(θ)mi+cos(θ)ni]+δy

其中，q(...)為非線性回歸法的目標(biāo)函數(shù)，(θ,δx,δy,f)為更新后的led陣列的四個(gè)位置參數(shù)，分別是旋轉(zhuǎn)誤差、x方向的平移誤差、y方向的平移誤差、焦距誤差，(θ⁰,δx⁰,δy⁰,f⁰)為初始化的led陣列位置參數(shù)，表示進(jìn)行非線性回歸運(yùn)算，d為led陣列1相鄰兩個(gè)led單元8之間間距，(xi,yi)表示第i個(gè)led單元的空間位置坐標(biāo)，λ為照明光的波長(zhǎng)，(mi,ni)為第i個(gè)的led單元對(duì)應(yīng)的行號(hào)和列號(hào)。

步驟三，原始圖像采集，將led陣列1作為基于大照明數(shù)值孔徑的大視場(chǎng)高分辨率顯微成像裝置的照明光源，順次點(diǎn)亮led陣列1中每一個(gè)led單元8，照射待測(cè)樣品4后采集相對(duì)應(yīng)的低分辨率原始圖像。

步驟四，原始圖像預(yù)處理，包括閾值去噪和亮度校正，首先根據(jù)相機(jī)7的暗電流噪聲平均值作為閾值，對(duì)拍攝的低分辨率原始圖像進(jìn)行閾值去噪，得到去噪后低分辨率圖像(包括低分辨率明場(chǎng)圖像和低分辨率暗場(chǎng)圖像)，然后再將每一幅去噪后低分辨率圖像除以步驟一中獲得的歸一化亮度校正系數(shù)，得到亮度校正后的低分辨率圖像。

在步驟四中，首先，順次點(diǎn)亮其中每一個(gè)led單元分別用紅綠藍(lán)單色光照明待測(cè)樣品4拍攝到的原始低分辨率圖像記作ii,c，熄滅所有l(wèi)ed單元拍攝到一幅暗電流噪聲圖像idark；

然后根據(jù)相機(jī)的暗電流噪聲平均值作為閾值，對(duì)拍攝的原始低分辨率圖像進(jìn)行閾值去噪，公式為

其中表示閾值去噪后低分辨率圖像，mean(...)表示求圖像平均灰度值；

再將每一幅圖除以步驟一中獲得的歸一化亮度校正系數(shù)，完成圖像亮度校正，公式為：

其中，為亮度校正后的低分辨率圖像，為閾值去噪后低分辨率圖像，為步驟一中獲得的歸一化亮度校正系數(shù)。

步驟五，高分辨率圖像初始化，將所有亮度校正后的低分辨率圖像中的低分辨率明場(chǎng)圖像相加平均，然后再通過(guò)上采樣來(lái)初始化高分辨率圖像的振幅與相位。高分辨率圖像初始化的公式為：

其中，為初始化的高分辨率復(fù)振幅圖像，up[...]表示進(jìn)行上采樣最鄰近插值，nb為明場(chǎng)圖像數(shù)量。

步驟六：迭代重構(gòu)，采用基于頻域疊層孔徑與像素合并迭代方法將所有亮度校正后的低分辨率圖像在頻域中逐一進(jìn)行合成孔徑運(yùn)算，并逐步減小更新系數(shù)，以代價(jià)函數(shù)值為判據(jù)，當(dāng)代價(jià)函數(shù)小于一個(gè)給定的閾值時(shí)(閾值的典型值可以取0.01，也可以根據(jù)經(jīng)驗(yàn)值進(jìn)行調(diào)整)，停止迭代，此時(shí)的高分辨率圖像的振幅與相位就是最終得到的大視場(chǎng)高分辨率顯微圖像。

在步驟六中：基于頻域疊層孔徑與像素合并迭代方法的公式為：

其中，f{...}表示進(jìn)行傅立葉變換，f^-1{...}表示進(jìn)行逆傅立葉變換，up[...]表示進(jìn)行上采樣最鄰近插值，down[...]表示進(jìn)行降采樣像素合并；為待測(cè)樣品的高分辨率頻譜，k表示第k輪迭代，為顯微物鏡的頻譜孔徑函數(shù)，為更新后的待測(cè)樣品的局域頻譜，γ為常數(shù)用來(lái)確保分母不為零，典型值為0.001；|...|表示求二維復(fù)數(shù)矩陣的模，|...|max表示求二維復(fù)數(shù)矩陣的模中的最大值；α^k為第k輪迭代待測(cè)樣品頻譜的更新系數(shù)，β^k為第k輪迭代顯微物鏡孔徑函數(shù)的更新系數(shù)，cost^k為代價(jià)函數(shù)，當(dāng)?shù)趉輪迭代結(jié)束時(shí)代價(jià)函數(shù)cost^k小于某一固定閾值ε(ε的典型值為0.001)，則認(rèn)為迭代已收斂，停止迭代，此時(shí)的高分辨率圖像的振幅與相位就是最終得到的大視場(chǎng)高分辨率顯微圖像。

上述重構(gòu)過(guò)程只適用于重構(gòu)單色圖像，而本發(fā)明利用上述裝置的基于大照明數(shù)值孔徑的大視場(chǎng)高分辨率顯微成像迭代重構(gòu)方法，重構(gòu)真彩色圖像的步驟如下：

步驟一，led單元8亮度標(biāo)定，將led陣列1作為基于大照明數(shù)值孔徑的大視場(chǎng)高分辨率顯微鏡成像裝置的照明光源，順次點(diǎn)亮led陣列1中其中每一個(gè)led單元8，照射空白待測(cè)樣品4后使用高倍物鏡采集相對(duì)應(yīng)的圖像，并計(jì)算每個(gè)led單元8在紅綠藍(lán)三個(gè)波段對(duì)應(yīng)的歸一化亮度校正系數(shù)；

步驟二，led陣列1位置標(biāo)定，將分辨率板作為待測(cè)樣品4，led陣列1作為基于大照明數(shù)值孔徑的大視場(chǎng)高分辨率顯微成像裝置鏡的照明光源，順次點(diǎn)亮led陣列1中其中每一個(gè)led單元8，照射待測(cè)樣品4后分別采集聚焦下和離焦h距離下相對(duì)應(yīng)的圖像，然后通過(guò)亞像素配準(zhǔn)算法計(jì)算每個(gè)led單元8在紅綠藍(lán)三個(gè)波段對(duì)應(yīng)的照明角度，再通過(guò)非線性回歸確定led陣列位置；

步驟三，原始圖像采集，將led陣列1作為基于大照明數(shù)值孔徑的大視場(chǎng)高分辨率顯微成像裝置鏡的照明光源，順次點(diǎn)亮led陣列1中其中每一個(gè)led單元8，照射待測(cè)樣品4后采集相對(duì)應(yīng)的低分辨率原始圖像；

步驟四，原始圖像預(yù)處理，包括閾值去噪和亮度校正，首先根據(jù)相機(jī)7的暗電流噪聲平均值作為閾值，對(duì)拍攝的低分辨率原始圖像原始低分辨率圖像進(jìn)行閾值去噪，得到去噪后低分辨率圖像，然后再將每一幅去噪后低分辨率圖像圖除以步驟一中獲得的歸一化亮度校正系數(shù)，得到亮度校正后的低分辨率圖像；

步驟五，高分辨率圖像初始化，將所有亮度校正后的低分辨率圖像中拍攝到的低分辨率明場(chǎng)圖像相加平均，然后再通過(guò)上采樣來(lái)初始化高分辨率圖像的振幅與相位；

步驟六，迭代重構(gòu)，采用基于像素合并的傅立葉疊層成像技術(shù)將所有亮度校正后的低分辨率圖像所采集的每一幅圖像在頻域中逐一進(jìn)行合成孔徑運(yùn)算，并逐步減小更新系數(shù)，以代價(jià)函數(shù)值為判據(jù)當(dāng)，當(dāng)代價(jià)函數(shù)其小于一個(gè)給定的閾值時(shí)，停止迭代，此時(shí)的高分辨率圖像的振幅與相位就是最終得到的大視場(chǎng)高分辨率顯微圖像。

步驟七，彩色融合，重復(fù)步驟五和步驟六，分別重建紅色、綠色和藍(lán)色波段的高分辨率圖像，然后將重構(gòu)的三幅高分辨率圖像分別作為最終的真彩色圖像的紅、綠、藍(lán)分量合成即可。

為了測(cè)試大視場(chǎng)高分辨率顯微成像的圖像迭代重構(gòu)方法，本發(fā)明選取了1951usaf分辨能力測(cè)試板進(jìn)行了成像測(cè)試。實(shí)驗(yàn)中，使用的led陣列包含261個(gè)led單元，并利用其產(chǎn)生261個(gè)不同角度的照明光，led單元之間間距為1.67mm，發(fā)出的紅光中心波長(zhǎng)為632.8nm，光譜帶寬約為20nm。系統(tǒng)所采用的顯微物鏡的數(shù)值孔徑為0.4，放大倍率為10x。同時(shí)點(diǎn)亮led陣列中所有明場(chǎng)的led單元照射待測(cè)樣品所拍攝到的低分辨率圖像如圖4(a)所示。選取圖4(a)方框中的圖像直接進(jìn)行放大，得到圖4(b)，其中圖4(b1)、圖4(b2)、圖4(b3)分別是在紅色、綠色、藍(lán)色三個(gè)波段拍攝到的圖像。從中再選擇更小的區(qū)域直接進(jìn)行放大，又得到圖4(c)，其中圖4(c1)、圖4(c2)、圖4(c3)分別是在紅色、綠色、藍(lán)色三個(gè)波段的圖像。如圖可見(jiàn)，最小可分辨的特征均為第九組第五個(gè)元素，根據(jù)1951usaf分辨能力測(cè)試板的物理參數(shù)(見(jiàn)表2)可知成像系統(tǒng)的原始成像分辨率約為0.62um。這與成像系統(tǒng)的瑞利衍射極限公式推斷的結(jié)果吻合良好。而采用本發(fā)明方法重構(gòu)后的高分辨率圖像如圖4(d)所示，其中圖4(d1)、圖4(d2)、圖4(d3)分別是在紅色、綠色、藍(lán)色三個(gè)波段重構(gòu)的圖像。如圖可見(jiàn)分辨率板中最小可分辨的特征為第十一組第五個(gè)元素。通過(guò)表2可知，經(jīng)過(guò)合成后的成像系統(tǒng)的分辨率優(yōu)于0.154um。對(duì)比其中圖4(d)和圖4(c)可以明顯看出本發(fā)明方法能夠在低數(shù)值孔徑大視場(chǎng)情況下實(shí)現(xiàn)大視場(chǎng)高分辨率成像，且重構(gòu)圖像具有良好的信噪比。

表21951usaf分辨能力測(cè)試板的物理參數(shù)