一種超高密度超分辨光學(xué)閃爍顯微成像系統(tǒng)及方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種超高密度超分辨光學(xué)閃爍顯微成像系統(tǒng)及方法，它包括：激發(fā)光源，提供激發(fā)光；第一會(huì)聚透鏡，對(duì)來自激發(fā)光源的激發(fā)光聚光；第一二向色鏡，反射來自第一會(huì)聚透鏡的激發(fā)光；物鏡，透射來自第一二向色鏡的激發(fā)光；載物臺(tái)，設(shè)置生物樣品，生物樣品在激發(fā)光激發(fā)下發(fā)射熒光，并通過物鏡發(fā)射到第一二向色鏡；第二二向色鏡，對(duì)來自第一二向色鏡的熒光分光；第二會(huì)聚透鏡，對(duì)被第二二向色鏡反射的熒光聚光；第一CCD相機(jī)，對(duì)來自第二會(huì)聚透鏡的熒光成像；第三二向色鏡，對(duì)被第二二向色鏡透射的熒光分光；第三會(huì)聚透鏡，對(duì)被第三二向色鏡反射的熒光聚光；第二CCD相機(jī)，對(duì)來自第三會(huì)聚透鏡的熒光成像；第四會(huì)聚透鏡，對(duì)被第三二向色鏡透射的熒光聚光；以及第三CCD相機(jī)，對(duì)來自第四會(huì)聚透鏡的熒光成像。
【專利說明】一種超高密度超分辨光學(xué)閃爍顯微成像系統(tǒng)及方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種光學(xué)成像系統(tǒng)及方法，特別是關(guān)于一種基于聯(lián)合生物標(biāo)記的超高 密度超分辨光學(xué)閃爍顯微成像系統(tǒng)及方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 超分辨光學(xué)顯微技術(shù)利用對(duì)熒光發(fā)射在空間或時(shí)間上的調(diào)制，實(shí)現(xiàn)了突破光學(xué)衍 射極限的顯微成像。超分辨光學(xué)閃爍顯微成像技術(shù)（S0FI)通過熒光團(tuán)自身發(fā)射熒光在時(shí) 間上的閃爍特性，計(jì)算不同熒光團(tuán)所發(fā)射的熒光信號(hào)的時(shí)間自相關(guān)或空間互相關(guān)函數(shù)，獲 得空間分辨率的提升。在傳統(tǒng)的超分辨光學(xué)閃爍顯微成像中，分辨率提高的多少與所計(jì)算 的互相關(guān)累積量的階數(shù)有關(guān)，階數(shù)越高，所得到的分辨率提升也會(huì)越多。此外，熒光團(tuán)生物 標(biāo)記密度的高低直接影響到重建的生物結(jié)構(gòu)的連續(xù)性和完整性，但是，隨著互相關(guān)累積量 階數(shù)的增加，高標(biāo)記密度的圖像重建會(huì)誘發(fā)嚴(yán)重的偽影，導(dǎo)致最終圖像出現(xiàn)明顯的殘缺和 不連續(xù)的結(jié)構(gòu)，降低了成像的質(zhì)量，這一數(shù)學(xué)問題限制了高階閃爍顯微成像在生命科學(xué)研 究中的應(yīng)用。
[0003] 現(xiàn)有的方法只能通過適當(dāng)降低生物標(biāo)記的密度來減少高階閃爍顯微成像所誘發(fā) 的偽影，但降低標(biāo)記密度所帶來的問題是會(huì)造成生物結(jié)構(gòu)標(biāo)記不完整，難以真實(shí)、完整地反 映所研究的生物結(jié)構(gòu)的細(xì)節(jié)信息。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 針對(duì)上述問題，本發(fā)明的目的是提供一種基于聯(lián)合生物標(biāo)記的超高密度超分辨光 學(xué)閃爍顯微成像系統(tǒng)及方法，該方法能夠有效降低在超高標(biāo)記密度下高階閃爍顯微成像的 偽影，更加真實(shí)地還原出所研究的生物樣品的完整結(jié)構(gòu)和細(xì)節(jié)信息。
[0005] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取以下技術(shù)方案：一種超高密度超分辨光學(xué)閃爍顯微 成像系統(tǒng)，其特征在于，它包括：一激發(fā)光源，用以提供一束激發(fā)光；一第一會(huì)聚透鏡，對(duì)來 自所述激發(fā)光源的所述激發(fā)光進(jìn)行聚光，并且來自所述激發(fā)光源的所述激發(fā)光穿透所述第 一會(huì)聚透鏡；一第一二向色鏡，反射來自所述第一會(huì)聚透鏡的所述激發(fā)光；一物鏡，透射來 自所述第一二向色鏡的所述激發(fā)光；一載物臺(tái)，其上設(shè)置有生物樣品，并且來自所述物鏡 的所述激發(fā)光照射在所述生物樣品上，所述生物樣品在來自所述物鏡的所述激發(fā)光的激發(fā) 下會(huì)發(fā)射熒光，所述熒光通過所述物鏡發(fā)射到所述第一二向色鏡，所述第一二向色鏡透射 來自所述物鏡的所述熒光；一第二二向色鏡，對(duì)來自所述第一二向色鏡的所述熒光進(jìn)行分 光，一部分來自所述第一二向色鏡的所述熒光被所述第二二向色鏡反射，另一部分來自所 述第一二向色鏡的所述熒光被所述第二二向色鏡透射；一第二會(huì)聚透鏡，對(duì)被所述第二二 向色鏡反射的所述熒光進(jìn)行聚光，并且來自所述第二二向色鏡的所述熒光穿透所述第二會(huì) 聚透鏡；一第一 C⑶相機(jī)，用于對(duì)來自所述第二會(huì)聚透鏡的所述熒光進(jìn)行成像；一第三二向 色鏡，對(duì)被所述第二二向色鏡透射的所述熒光進(jìn)行分光，一部分來自所述第二二向色鏡的 所述熒光被所述第三二向色鏡反射，另一部分來自所述第二二向色鏡的所述熒光被所述第 三二向色鏡透射；一第三會(huì)聚透鏡，對(duì)被所述第三二向色鏡反射的所述熒光進(jìn)行聚光，并且 來自所述第三二向色鏡的所述熒光穿透所述第三會(huì)聚透鏡；一第二CCD相機(jī)，用于對(duì)來自 所述第三會(huì)聚透鏡的所述熒光進(jìn)行成像；一第四會(huì)聚透鏡，對(duì)被所述第三二向色鏡透射的 所述熒光進(jìn)行聚光，并且來自所述第三二向色鏡的所述熒光穿透所述第四會(huì)聚透鏡；以及 一第三CCD相機(jī)，用于對(duì)來自所述第四會(huì)聚透鏡的所述熒光進(jìn)行成像。
[0006] 所述第一 C⑶相機(jī)、第二C⑶相機(jī)和第三C⑶相機(jī)具有相同的像素?cái)?shù)，并且單個(gè)像 素大小相同。
[0007] -種超高密度超分辨光學(xué)閃爍顯微成像方法，包括以下步驟：1)使用三種不同熒 光發(fā)射波長(zhǎng)的量子點(diǎn)聯(lián)合標(biāo)記生物樣品中的同一細(xì)胞結(jié)構(gòu)；2)將經(jīng)過標(biāo)記的生物樣品放 置并固定在超高密度超分辨光學(xué)閃爍顯微成像系統(tǒng)的載物臺(tái)上；3)調(diào)節(jié)物鏡與生物樣品 之間的距離，使生物樣品位于物鏡的焦點(diǎn)上，使成像系統(tǒng)滿足光學(xué)顯微系統(tǒng)的物象共軛關(guān) 系；4)開啟激發(fā)光源器，調(diào)節(jié)激發(fā)光的輸出功率，并同時(shí)通過多個(gè)數(shù)字成像設(shè)備觀察采集 到的熒光圖像，當(dāng)觀察到明顯的熒光強(qiáng)度閃爍現(xiàn)象時(shí)，穩(wěn)定激發(fā)光的輸出功率；5)用多個(gè) 數(shù)字成像設(shè)備同時(shí)采集三種量子點(diǎn)獨(dú)立發(fā)射的熒光信號(hào)；6)對(duì)采集的三個(gè)通道的圖像時(shí) 間序列分別使用高精度的漂移校正算法進(jìn)行漂移校正；7)用經(jīng)平衡補(bǔ)償后的超分辨閃爍 顯微成像算法對(duì)漂移校正后的三個(gè)通道的閃爍熒光圖像進(jìn)行分別處理；8)將處理后的三 個(gè)通道的超分辨圖像進(jìn)行合并融合，即可得到生物樣品的超高分辨率、高保真度的圖像。
[0008] 所述第一二向色鏡選用能夠反射來自所述第一會(huì)聚透鏡的激發(fā)光并且透射所標(biāo) 記的三種量子點(diǎn)發(fā)射的熒光的波長(zhǎng)；所述第二二向色鏡選用能夠反射其中一種量子點(diǎn)的熒 光并且透射另外兩種量子點(diǎn)的熒光的波長(zhǎng)；所述第三二向色鏡選用能夠反射所述第二二向 色鏡所透射的兩種量子點(diǎn)中一種量子點(diǎn)的熒光且透射另外一種量子點(diǎn)的熒光的波長(zhǎng)。
[0009] 本發(fā)明由于采取以上技術(shù)方案，其具有以下優(yōu)點(diǎn)：1、本發(fā)明由于采用三種不同熒 光發(fā)射波長(zhǎng)的量子點(diǎn)標(biāo)記生物樣品的同一細(xì)胞結(jié)構(gòu)，通過分別使用超分辨閃爍顯微成像算 法進(jìn)行處理，并將處理后的圖像合并融合，有效地抑制了在超高標(biāo)記密度下高階閃爍顯微 成像所產(chǎn)生的偽影和不連續(xù)性。2、本發(fā)明中采用的三種不同熒光發(fā)射波長(zhǎng)的量子點(diǎn)作為生 物標(biāo)記物，其可以由同一光源激發(fā),大大降低了系統(tǒng)的復(fù)雜性和成本。3、本發(fā)明中標(biāo)記的三 種量子點(diǎn)的熒光波長(zhǎng)完全分離且光譜無重疊，只需設(shè)置適當(dāng)?shù)亩蛏R就能將三種量子點(diǎn) 的熒光信號(hào)完全分離，無需后期使用相關(guān)算法進(jìn)行光譜分離，提高了系統(tǒng)的可操作性。4、本 發(fā)明由于設(shè)置有三個(gè)C⑶相機(jī)，可以實(shí)現(xiàn)同時(shí)對(duì)三個(gè)通道的熒光圖像同步采集，大大提高 了系統(tǒng)成像的速度。本發(fā)明可以廣泛應(yīng)用于生物樣品的熒光成像過程中。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0010] 圖1是本發(fā)明超高密度超分辨光學(xué)閃爍顯微成像系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)示意圖；
[0011] 圖2是本發(fā)明方法中生物樣本聯(lián)合標(biāo)記的示意圖。

【具體實(shí)施方式】
[0012] 下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)的描述。
[0013] 如圖1所示，本發(fā)明提出了一種超高密度超分辨光學(xué)閃爍顯微成像系統(tǒng)，它包括 一激發(fā)光源1、三個(gè)二向色鏡2、3、4、一物鏡5、一載物臺(tái)6、四個(gè)會(huì)聚透鏡7、8、9、10和三個(gè) CCD 相機(jī) 11、12、13。
[0014] 激發(fā)光源1用以提供一束激發(fā)光。會(huì)聚透鏡7設(shè)置在激發(fā)光所行經(jīng)的光路上，并 對(duì)激發(fā)光源1所發(fā)出的激發(fā)光進(jìn)行聚光。二向色鏡2反射來自會(huì)聚透鏡7的激發(fā)光，反射 后的激發(fā)光通過物鏡5照射在載物臺(tái)6上的生物樣品14上。生物樣品14在激發(fā)光的激發(fā) 下會(huì)發(fā)射熒光，熒光通過物鏡5發(fā)射到二向色鏡2。二向色鏡2透射來自物鏡5的熒光。二 向色鏡3設(shè)置在來自二向色鏡2的透射熒光的光路上，并對(duì)來自二向色鏡2的熒光進(jìn)行分 光，一部分熒光被二向色鏡3反射，一部分熒光被二向色鏡3透射。會(huì)聚透鏡8設(shè)置在來自 二向色鏡3的反射熒光的光路上，并對(duì)來自二向色鏡3的反射熒光進(jìn)行聚光使反射熒光在 C⑶相機(jī)11上成像。二向色鏡4設(shè)置在來自二向色鏡3的透射熒光的光路上，并對(duì)來自二 向色鏡3的透射熒光進(jìn)行再次分光，一部分熒光被二向色鏡4反射，一部分熒光被二向色鏡 4透射。會(huì)聚透鏡9設(shè)置在來自二向色鏡4的反射熒光的光路上，并對(duì)來自二向色鏡4的 反射熒光進(jìn)行聚光使反射熒光在C⑶相機(jī)12上成像。會(huì)聚透鏡10設(shè)置在來自二向色鏡4 的透射熒光的光路上，并對(duì)來自二向色鏡4的透射熒光進(jìn)行聚光使透射熒光在CCD相機(jī)13 上成像。
[0015] 本發(fā)明的每個(gè)(XD相機(jī)分別對(duì)生物樣品14進(jìn)行100幀左右的成像。將三個(gè)(XD 相機(jī)11、12、13采集到的圖像分別通過超分辨閃爍顯微成像算法處理，并將處理后的圖像 合并，最終可以獲得生物樣品內(nèi)部結(jié)構(gòu)的高分辨率、高質(zhì)量的圖像。
[0016] 上述實(shí)施例中，激發(fā)光源1可采用激光器。
[0017] 上述實(shí)施例中，物鏡5可以選用數(shù)值孔徑大于1. 4的物鏡，以便C⑶相機(jī)11、12、13 能夠采集到盡可能高分辨率的寬場(chǎng)圖像，便于后期利用超分辨閃爍顯微成像算法實(shí)現(xiàn)對(duì)空 間分辨率的進(jìn)一步提升，突破光學(xué)衍射極限。
[0018] 上述實(shí)施例中，三個(gè)C⑶相機(jī)11、12、13應(yīng)具有相同的像素?cái)?shù)，且單個(gè)像素大小應(yīng) 一致，以確保采集到圖像具有相同大小的區(qū)域和分辨率，以便對(duì)三組圖像進(jìn)行合并融合。
[0019] 上述實(shí)施例中，采用的是倒置熒光顯微鏡的方式對(duì)生物樣品14進(jìn)行成像，也可以 采用正置式熒光顯微鏡的方式，兩者的區(qū)別僅是將光路進(jìn)行上下翻轉(zhuǎn)，即當(dāng)采用正置式熒 光顯微鏡時(shí)，生物樣品14設(shè)置在物鏡5的下部，當(dāng)采用倒置式熒光顯微鏡時(shí)，生物樣品14 設(shè)置在物鏡5的上部（如圖1所示）。
[0020] 基于上述超高密度超分辨光學(xué)閃爍顯微成像系統(tǒng)，本發(fā)明還提出了一種超高密度 超分辨光學(xué)閃爍顯微成像方法，該方法包括以下步驟：
[0021] 1)使用三種不同熒光發(fā)射波長(zhǎng)的量子點(diǎn)15、16、17聯(lián)合標(biāo)記生物樣品14中的同一 細(xì)胞結(jié)構(gòu)18。
[0022] 2)將經(jīng)過標(biāo)記的生物樣品14放置并固定在載物臺(tái)6上。
[0023] 3)精細(xì)調(diào)節(jié)物鏡5與生物樣品14之間的距離，使得生物樣品14位于物鏡5的焦 點(diǎn)上，使成像系統(tǒng)滿足光學(xué)顯微系統(tǒng)的物象共軛關(guān)系。
[0024] 4)開啟激發(fā)光源1，調(diào)節(jié)激發(fā)光的輸出功率，并同時(shí)通過C⑶相機(jī)11、12、13觀察 采集到的熒光圖像，當(dāng)觀察到明顯的熒光強(qiáng)度閃爍現(xiàn)象時(shí)，穩(wěn)定激發(fā)光的輸出功率。
[0025] 5)設(shè)置合適的(XD相機(jī)曝光時(shí)間（通常設(shè)置為10?30毫秒），用三個(gè)(XD相機(jī) 11、12、13同時(shí)采集三種量子點(diǎn)獨(dú)立發(fā)射的熒光信號(hào)，采集的幀數(shù)各為100幀。
[0026] 6)對(duì)采集的三個(gè)通道的圖像時(shí)間序列分別使用高精度的漂移校正算法進(jìn)行漂移 校正。
[0027] 7)用經(jīng)平衡補(bǔ)償后的超分辨閃爍顯微成像算法對(duì)漂移校正后的三個(gè)通道共300 幀閃爍熒光圖像進(jìn)行分別處理。
[0028] 8)將處理后的三個(gè)通道的超分辨圖像進(jìn)行合并融合，即可得到生物樣品14的超 高分辨率、高保真度的圖像。
[0029] 上述各實(shí)施例中，如圖2所示，生物樣品14標(biāo)記了三種量子點(diǎn)15、16、17,三種量子 點(diǎn)15、16、17均標(biāo)記于同一細(xì)胞結(jié)構(gòu)18上。其中，量子點(diǎn)15的熒光發(fā)射中心波長(zhǎng)為525nm， 量子點(diǎn)16的突光發(fā)射中心波長(zhǎng)為625nm，量子點(diǎn)17的突光發(fā)射中心波長(zhǎng)為705nm，三種量 子點(diǎn)可由同一個(gè)波長(zhǎng)的激發(fā)光進(jìn)行激發(fā)，且其熒光發(fā)射光譜不存在重疊區(qū)域。
[0030] 上述各實(shí)施例中，二向色鏡2、3、4應(yīng)當(dāng)針對(duì)所標(biāo)記的不同量子點(diǎn)選用合適的波 長(zhǎng)。二向色鏡2應(yīng)反射來自會(huì)聚透鏡7的激發(fā)光，透射所標(biāo)記的三種量子點(diǎn)15、16、17發(fā)射 的突光；二向色鏡3應(yīng)反射其中一種量子點(diǎn)的突光，透射另外兩種量子點(diǎn)的突光；二向色鏡 4應(yīng)反射二向色鏡3所透射的兩種量子點(diǎn)中一種量子點(diǎn)的熒光，透射另外一種量子點(diǎn)的熒 光；最終將三種量子點(diǎn)的熒光有效地分離開。
[0031] 上述實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明，凡是在本發(fā)明技術(shù)方案的基礎(chǔ)上進(jìn)行的等同變換 和改進(jìn)，均不應(yīng)排除在本發(fā)明的保護(hù)范圍之外。
【權(quán)利要求】
1. 一種超高密度超分辨光學(xué)閃爍顯微成像系統(tǒng)，其特征在于，它包括： 一激發(fā)光源，用以提供一束激發(fā)光； 一第一會(huì)聚透鏡，對(duì)來自所述激發(fā)光源的所述激發(fā)光進(jìn)行聚光，并且來自所述激發(fā)光 源的所述激發(fā)光穿透所述第一會(huì)聚透鏡； 一第一二向色鏡，反射來自所述第一會(huì)聚透鏡的所述激發(fā)光； 一物鏡，透射來自所述第一二向色鏡的所述激發(fā)光； 一載物臺(tái)，其上設(shè)置有生物樣品，并且來自所述物鏡的所述激發(fā)光照射在所述生物樣 品上，所述生物樣品在來自所述物鏡的所述激發(fā)光的激發(fā)下會(huì)發(fā)射熒光，所述熒光通過所 述物鏡發(fā)射到所述第一二向色鏡，所述第一二向色鏡透射來自所述物鏡的所述熒光； 一第二二向色鏡，對(duì)來自所述第一二向色鏡的所述熒光進(jìn)行分光，一部分來自所述第 一二向色鏡的所述熒光被所述第二二向色鏡反射，另一部分來自所述第一二向色鏡的所述 熒光被所述第二二向色鏡透射； 一第二會(huì)聚透鏡，對(duì)被所述第二二向色鏡反射的所述熒光進(jìn)行聚光，并且來自所述第 二二向色鏡的所述熒光穿透所述第二會(huì)聚透鏡； 一第一 CCD相機(jī)，用于對(duì)來自所述第二會(huì)聚透鏡的所述熒光進(jìn)行成像； 一第三二向色鏡，對(duì)被所述第二二向色鏡透射的所述熒光進(jìn)行分光，一部分來自所述 第二二向色鏡的所述熒光被所述第三二向色鏡反射，另一部分來自所述第二二向色鏡的所 述熒光被所述第三二向色鏡透射； 一第三會(huì)聚透鏡，對(duì)被所述第三二向色鏡反射的所述熒光進(jìn)行聚光，并且來自所述第 三二向色鏡的所述熒光穿透所述第三會(huì)聚透鏡； 一第二CCD相機(jī)，用于對(duì)來自所述第三會(huì)聚透鏡的所述熒光進(jìn)行成像； 一第四會(huì)聚透鏡，對(duì)被所述第三二向色鏡透射的所述熒光進(jìn)行聚光，并且來自所述第 三二向色鏡的所述熒光穿透所述第四會(huì)聚透鏡；以及 一第三CCD相機(jī)，用于對(duì)來自所述第四會(huì)聚透鏡的所述熒光進(jìn)行成像。
2. -種基于如權(quán)利要求1所述的超高密度超分辨光學(xué)閃爍顯微成像系統(tǒng)的成像方法， 包括以下步驟： 1) 使用多種不同熒光發(fā)射波長(zhǎng)的量子點(diǎn)聯(lián)合標(biāo)記生物樣品中的同一細(xì)胞結(jié)構(gòu)； 2) 將經(jīng)過標(biāo)記的生物樣品放置并固定在所述超高密度超分辨光學(xué)閃爍顯微成像系統(tǒng) 的載物臺(tái)上； 3) 調(diào)節(jié)物鏡與生物樣品之間的距離，使生物樣品位于物鏡的焦點(diǎn)上，使成像系統(tǒng)滿足 光學(xué)顯微系統(tǒng)的物象共軛關(guān)系； 4) 開啟激發(fā)光源，調(diào)節(jié)激發(fā)光的輸出功率，并同時(shí)通過多個(gè)相機(jī)觀察采集到的熒光圖 像，當(dāng)觀察到明顯的熒光強(qiáng)度閃爍現(xiàn)象時(shí)，穩(wěn)定激發(fā)光的輸出功率； 5) 對(duì)采集的三個(gè)通道的圖像時(shí)間序列分別使用高精度的漂移校正算法進(jìn)行漂移校 正； 6) 用經(jīng)平衡補(bǔ)償后的超分辨閃爍顯微成像算法對(duì)漂移校正后的三個(gè)通道的閃爍熒光 圖像進(jìn)行分別處理； 7) 將處理后的三個(gè)通道的超分辨圖像進(jìn)行合并融合，即可得到生物樣品的超高分辨 率、高保真度的圖像。
3.如權(quán)利要求2所述的一種超高密度超分辨光學(xué)閃爍顯微成像方法，其特征在于，所 述第一二向色鏡選用能夠反射來自所述第一會(huì)聚透鏡的激發(fā)光并且透射所標(biāo)記的三種量 子點(diǎn)發(fā)射的熒光的波長(zhǎng)；所述第二二向色鏡選用能夠反射其中一種量子點(diǎn)的熒光并且透射 另外兩種量子點(diǎn)的熒光的波長(zhǎng)；所述第三二向色鏡選用能夠反射所述第二二向色鏡所透射 的兩種量子點(diǎn)中一種量子點(diǎn)的突光且透射另外一種量子點(diǎn)的突光的波長(zhǎng)。
【文檔編號(hào)】G02B21/36GK104122662SQ201410401642
【公開日】2014年10月29日 申請(qǐng)日期:2014年8月15日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月15日
【發(fā)明者】曾志平, 陳軒澤, 席鵬 申請(qǐng)人:北京大學(xué)