一種實現(xiàn)遠場超分辨成像的方法和裝置制造方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種實現(xiàn)遠場超分辨成像的方法和裝置。該方法首先將激發(fā)光和STED光同時耦合進入單模光纖以實現(xiàn)合束效果，然后將經(jīng)過合束的激發(fā)光和STED光依次通過起偏器和雙波長波片，調(diào)制成偏振方向相互垂直的線偏振光，再采用液晶偏振轉(zhuǎn)換器，將激發(fā)光和STED光分別轉(zhuǎn)換為徑向偏振光和角向偏振光。實現(xiàn)該方法的裝置包括：激發(fā)光源、STED光源、準直透鏡、起偏器、雙波長波片、液晶偏振轉(zhuǎn)換器、二向色鏡、高數(shù)值孔徑物鏡、三維納米位移臺、聚焦透鏡以及光強探測器。本發(fā)明通過單模光纖的耦合作用以及高數(shù)值孔徑下徑向偏振光和角向偏振光不同的聚焦特性，使得聚焦于樣品表面的圓形激發(fā)光斑和環(huán)狀STED光斑自動重合，從而有效降低STED超分辨成像的實現(xiàn)難度。
【專利說明】一種實現(xiàn)遠場超分辨成像的方法和裝置
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于超分辨成像領域，具體涉及一種實現(xiàn)遠場超分辨成像的方法和裝置?！颈尘凹夹g】
[0002]衍射極限一直是超分辨成像領域無法回避的一個問題，由于衍射極限的存在，很長時間以來，傳統(tǒng)超分辨顯微成像技術的分辨力都被限制在200nm以上。隨著科學技術的持續(xù)發(fā)展以及對微觀世界認識的逐漸深入，人們對于超衍射極限的超分辨顯微成像技術越發(fā)渴求。為了突破衍射極限的限制，研究人員沿著不同的途徑展開了深入研究，在不懈努力之下，各種超分辨顯微成像技術被相繼提出，STED顯微技術便是其中的典型代表之一。
[0003]STED顯微技術由德國人Stefan Hell于1994年率先提出，其原理是在普通光學顯微鏡中引入一束STED光束，通過適當?shù)奈幌嗾{(diào)制使STED光束在熒光樣品表面聚焦為環(huán)狀光斑，調(diào)節(jié)環(huán)狀光斑的位置使其與激發(fā)光斑重合，通過受激發(fā)射損耗過程，使激發(fā)光斑外緣區(qū)域的熒光分子不再發(fā)射熒光，從而有效減小激發(fā)光斑的面積，也即減小成像系統(tǒng)的點擴散函數(shù)，提高系統(tǒng)的成像分辨力。STED顯微技術具有超高分辨力、遠場成像、工作于可見光波段等顯著特點，因此極其適用于生物活體成像。然而要想實現(xiàn)STED顯微成像確并非易事，STED顯微成像系統(tǒng)中，為了獲得超高的分辨力，普遍選用數(shù)值孔徑為1.4左右的高數(shù)值孔徑物鏡，因此聚焦于樣品表面的激發(fā)光斑和STED光斑尺寸均在500nm以下，此時要調(diào)節(jié)兩光斑位置重合對光路系統(tǒng)的調(diào)節(jié)精度要求非常高，此外，由于光斑尺寸都在亞波長量級，而普通的成像設備如CCD等都達不到如此高的分辨率，因此在調(diào)節(jié)過程中無法對兩光斑的位置進行實時監(jiān)控，這又從另一方面增加了光路調(diào)節(jié)的難度。
[0004]基于上述原因，我們提出一種實現(xiàn)遠場超分辨成像的方法和裝置，該方法和裝置首先將激發(fā)光和STED光同時耦合進入單模光纖，然后再依次通過準直透鏡、起偏器、雙波長波片以及液晶偏振轉(zhuǎn)換器，獲得徑向偏振的激發(fā)光和角向偏振的STED光，由于高數(shù)值孔徑下徑向偏振光和角向偏振光聚焦光斑存在巨大差異，因此最終在樣品表面可以得到自然重合的圓形激發(fā)光斑和環(huán)形STED光斑，從而有效降低STED成像系統(tǒng)的光路調(diào)節(jié)難度，為快速、簡便的實現(xiàn)STED超分辨成像提供有利保障。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明解決的主要技術問題是:針對STED成像系統(tǒng)中，聚焦的激發(fā)光斑和STED光斑尺寸均為亞波長量級這一事實，以及由此帶來的光路調(diào)節(jié)的技術難點，我們提出了一種實現(xiàn)遠場超分辨成像的方法和裝置，在降低系統(tǒng)光路調(diào)節(jié)難度的同時，可以保證成像的高分辨力。
[0006]本發(fā)明提供的實現(xiàn)遠場超分辨成像的方法，包括以下步驟:
[0007](I)將激發(fā)光和STED光同時耦合進入單模光纖，在光纖出射端形成雙波長光束出射；
[0008](2)采用消色差透鏡使單模光纖出射的雙波長光束同時準直；[0009](3)將準直光束依次通過起偏器和雙波長波片，其中雙波長波片對激發(fā)光為全波片，對STED光為半波片，通過調(diào)節(jié)雙波長波片使其光軸與起偏器透光方向夾角為45°，可以得到偏振方向互相垂直的激發(fā)光束和STED光束；
[0010](4)將所述偏振方向互相垂直的激發(fā)光束和STED光束通過液晶偏振轉(zhuǎn)換器，調(diào)節(jié)偏振轉(zhuǎn)換器，可以得到徑向偏振的激發(fā)光束和角向偏振的STED光束；
[0011](5)將所述徑向偏振的激發(fā)光束和角向偏振的STED光束通過高數(shù)值孔徑物鏡聚焦，在樣品表面分別聚焦為圓形光斑和環(huán)形光斑；
[0012](6)調(diào)節(jié)STED光束光強，使STED光對激發(fā)光斑面積的壓縮效果達到最佳狀態(tài)，控制掃描臺移動，采用光強探測器采集每一掃描點位的光強信息，通過后期數(shù)據(jù)處理，獲得超分辨力的成像結果。
[0013]本發(fā)明提供的實現(xiàn)上述方法的裝置，包括:用于產(chǎn)生激發(fā)光的激光光源；用于產(chǎn)生STED光的激光光源；用于耦合所述激發(fā)光和STED光的單模光纖；用于準直單模光纖出射光束的消色差透鏡；用于將準直光束變?yōu)榫€偏振光的起偏器；用于將激發(fā)光和STED光調(diào)制為偏振方向相互垂直的線偏振光的雙波長波片；用于將偏振方向相互垂直的激發(fā)光和STED光分別轉(zhuǎn)換為徑向偏振光和角向偏振光的液晶偏振轉(zhuǎn)換器；用于透射激發(fā)光和STED光，且將信號光反射入光強探測器的二向色鏡；用于聚焦激發(fā)光和STED光的數(shù)值孔徑為I?1.4的物鏡；用于固定樣品以及對樣品實現(xiàn)掃描成像的納米位移臺；用于將信號光聚焦于光強探測器的聚焦透鏡；用于探測樣品所發(fā)出信號光的光強探測器。
[0014]本發(fā)明與現(xiàn)有技術相比的優(yōu)點:
[0015](I)相對于現(xiàn)有技術需要調(diào)節(jié)激發(fā)光斑和STED光斑重合，本發(fā)明中兩光斑在樣品表面自然重合，因此系統(tǒng)光路調(diào)節(jié)難度低，也更利于STED超分辨成像的實現(xiàn)；
[0016](2)現(xiàn)有技術中，受到外界機械振動，溫度變化等影響，原本重合的激發(fā)光斑和STED光斑可能會出現(xiàn)相對位置偏移，而本發(fā)明中兩光斑始終保持重合，因此抗外界干擾能力更強；
[0017](3)本發(fā)明中采用的液晶偏振轉(zhuǎn)換器可以寬波段工作，即使改變激發(fā)光和STED光波長也同樣有效，因此系統(tǒng)靈活性很強，在改變工作波長的情況下無需更換偏振轉(zhuǎn)換器。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0018]圖1為本發(fā)明的實現(xiàn)遠場超分辨成像的方法和裝置的裝置示意圖。
[0019]圖2是實施例中激發(fā)光束和STED光束經(jīng)起偏器后的偏振狀態(tài)示意圖。
[0020]圖3是實施例中經(jīng)雙波長波片進一步調(diào)制后激發(fā)光束和STED光束的偏振狀態(tài)示意圖。
[0021]圖4是實施例中經(jīng)液晶偏振轉(zhuǎn)換器進一步調(diào)制后激發(fā)光束和STED光束的偏振狀態(tài)示意圖。
[0022]圖5是高數(shù)值孔徑下徑向偏振光的聚焦光斑數(shù)值計算結果。
[0023]圖6是高數(shù)值孔徑下角向偏振光的聚焦光斑數(shù)值計算結果。
【具體實施方式】
[0024]下面結合附圖和實施例來詳細說明本發(fā)明，但以下的實施例僅限于解釋本發(fā)明，本發(fā)明的保護范圍不限于此。
[0025]如圖1所示的實現(xiàn)遠場超分辨成像的方法和裝置的裝置包括:1.激發(fā)光源；
2.STED光源；3.單模光纖；4.消色差準直透鏡；5.起偏器；6.雙波長波片；7.液晶偏振轉(zhuǎn)換器；8.二向色鏡；9.高數(shù)值孔徑物鏡；10.三維納米位移臺；11.聚焦透鏡；12.光強探測器。
[0026]上述激發(fā)光源和STED光源根據(jù)熒光樣品分別選用波長為λ i和λ 2的激光器，并根據(jù)入1和λ 2的具體數(shù)值選擇工作波段同時覆蓋兩種波長的單模光纖。將兩光源發(fā)射的光束同時耦合進入單模光纖，單模光纖出射端將形成雙波長光束出射。
[0027]上述消色差準直透鏡選用消色差雙膠合透鏡，焦距選擇依據(jù)為可以使單模光纖出射的光束準直為直徑6~8毫米的平行光束。
[0028]上述起偏器選用薄膜偏光片，雙波長平行光束通過薄膜偏光片以后變?yōu)槠穹较蛳嗤木€偏振光，偏振態(tài)如圖2所不。
[0029]采用對X1為全波片對λ 2為半波片的雙波長波片，調(diào)整其光軸使其光軸與薄膜偏光片透光軸夾角為45° ,通過雙波長波片后,激發(fā)光和STED光的偏振狀態(tài)如圖3所不。
[0030]上述液晶偏振轉(zhuǎn)換器選用瑞士 ARCoptix公司的產(chǎn)品，根據(jù)液晶偏振轉(zhuǎn)換器的原理，偏振方向相互垂直的激發(fā)光束和STED光束可以被分別轉(zhuǎn)換為徑向偏振光和角向偏振光，偏振態(tài)如圖4所7]^。
[0031]選用對λ I為50%透過50%反射，對λ2為99%透過的二向色鏡，激發(fā)光束和STED光束通過二向色鏡后，進入1.4ΝΑ的高數(shù)值孔徑物鏡，選用復消色差物鏡以達到最佳的消色差效果。物鏡對激發(fā)光束和STED光束的聚焦效果可以通過如下所示的Debye積分公式進行計算:
[0032]
【權利要求】
1.一種實現(xiàn)遠場超分辨成像的方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)將激發(fā)光和STED光同時耦合進入單模光纖，在光纖出射端形成雙波長光束出射； (2)采用消色差透鏡使單模光纖出射的雙波長光束同時準直； (3)將準直光束依次通過起偏器和雙波長波片，其中雙波長波片對激發(fā)光為全波片，對STED光為半波片，通過調(diào)節(jié)雙波長波片使其光軸與起偏器透光方向夾角為45°，可以得到偏振方向互相垂直的激發(fā)光束和STED光束； (4)將所述偏振方向互相垂直的激發(fā)光束和STED光束通過液晶偏振轉(zhuǎn)換器，調(diào)節(jié)偏振轉(zhuǎn)換器得到徑向偏振的激發(fā)光束和角向偏振的STED光束； (5)將所述徑向偏振的激發(fā)光束和角向偏振的STED光束通過高數(shù)值孔徑物鏡聚焦，在樣品表面分別聚焦為圓形光斑和環(huán)形光斑； (6)調(diào)節(jié)STED光束光強，使STED光對激發(fā)光斑面積的壓縮效果達到最佳狀態(tài)，控制三維納米位移臺移動，采用光強探測器采集每一掃描點位的光強信息，通過后期數(shù)據(jù)處理，獲得超分辨力的成像結果。
2.如權利要求1所述的實現(xiàn)遠場超分辨成像的方法，其特征在于，步驟(1)將激發(fā)光和STED光同時耦合進入單模光纖，從單模光纖出射的兩種波長的光束具有很高的重合度，可視為從同一激光器出射。
3.如權利要 求1所述的實現(xiàn)遠場超分辨成像的方法，其特征在于，經(jīng)單模光纖出射的光束通過消色差透鏡準直，對兩種波長的光束都可以達到很高的準直度。
4.如權利要求1所述的實現(xiàn)遠場超分辨成像的方法，其特征在于，步驟(3)中，采用起偏器和雙波長波片，將激發(fā)光和STED光調(diào)制為偏振方向相互垂直的線偏振光。
5.如權利要求4所述的實現(xiàn)遠場超分辨成像的方法，其特征在于，所述的雙波長波片，對激發(fā)光為全波片，對STED光為半波片。
6.如權利要求1所述的實現(xiàn)遠場超分辨成像的方法，其特征在于，步驟(4)中，通過液晶偏振轉(zhuǎn)換器，將偏振方向相互垂直的激發(fā)光和STED光分別轉(zhuǎn)換為徑向偏振光和角向偏振光。
7.如權利要求1所述的實現(xiàn)遠場超分辨成像的方法，其特征在于，步驟(5)采用數(shù)值孔徑為I~1.4的高數(shù)值孔徑物鏡對激發(fā)光束和STED光束進行聚焦。
8.用于實現(xiàn)權利要求1~6任一項所述方法的裝置，其特征在于包括:用于產(chǎn)生激發(fā)光的激光光源；用于產(chǎn)生STED光的激光光源；用于耦合所述激發(fā)光和STED光的單模光纖；用于準直單模光纖出射光束的消色差透鏡；用于將準直光束變?yōu)榫€偏振光的起偏器；用于將激發(fā)光和STED光調(diào)制為偏振方向相互垂直的線偏振光的雙波長波片；用于將偏振方向相互垂直的激發(fā)光和STED光分別轉(zhuǎn)換為徑向偏振光和角向偏振光的液晶偏振轉(zhuǎn)換器；用于透射激發(fā)光和STED光，且將信號光反射入光強探測器的二向色鏡；用于聚焦激發(fā)光和STED光的數(shù)值孔徑為I~1.4的物鏡；用于固定樣品以及對樣品實現(xiàn)掃描成像的三維納米位移臺；用于將信號光聚焦于光強探測器的聚焦透鏡；用于探測樣品所發(fā)出信號光的光強探測器。
9.如權利要求8所述裝置，其特征在于，所述消色差準直透鏡可以為雙膠合透鏡，也可以為集成式的準直器。
10.如權利要求8所述裝置，其特征在于，所述起偏器包括但不限于薄膜偏振片。
11.如權利要求8所述裝置，其特征在于，所述液晶偏振轉(zhuǎn)換器是基于液晶材料的徑向/角向偏振轉(zhuǎn)換設備。
12.如權利要求8所述裝置，其特征在于，所述高數(shù)值孔徑物鏡的數(shù)值孔徑為1~1.4。
【文檔編號】G02B27/58GK103901629SQ201410166064
【公開日】2014年7月2日 申請日期:2014年4月23日 優(yōu)先權日:2014年4月23日
【發(fā)明者】羅先剛, 王長濤, 趙澤宇, 王彥欽, 胡承剛, 蒲明薄, 王炯, 黃成 , 劉玲, 羅云飛 申請人:中國科學院光電技術研究所