專利名稱：顯微鏡自聚焦裝置及相配的自聚焦用光闌的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于顯微鏡的三角形自聚焦裝置中的自聚焦用光闌或膜片，其中自聚焦用光闌包含至少一個膜片孔，可將用于自聚焦并沿自聚焦裝置的光軸方向伸展的測量束錐限制在其截面內(nèi)，同時，本發(fā)明還涉及用于顯微鏡的三角形自聚焦裝置，其包括用于產(chǎn)生自聚焦測量束的所述類型的孔徑光闌和自聚焦光學(xué)機(jī)構(gòu)，以利用該顯微鏡的物鏡通過自聚焦測量束在物上生成測量圖形。所謂測量圖形是指測量斑或測量縫或其它適當(dāng)?shù)膱D形，一般用在三角形自聚焦裝置中的散焦檢測。
背景技術(shù)：
美國專利文件US 5，136，149B1公開了一種三角形自聚焦裝置。德國專利文件DE 19537376A1對該美國專利文件進(jìn)行了討論并將其中所描述的自聚焦原理稱為“三角形”自聚焦原理。在現(xiàn)有技術(shù)中，很多顯微鏡具有三角形自聚焦裝置或自聚焦掃描裝置，它們利用了角向或傾斜的自聚焦測量束和在物上的反射或單向或者定向反射。因此，如附圖1所示， 這相當(dāng)于上述US 5，136，149B1所說的三角形自聚焦原理，其中自聚焦光源19被這樣安置 在測量束30偏轉(zhuǎn)后或者該束30通過顯微鏡物鏡10之后，自聚焦測量束按對角線或以斜角照到物平面16上。此自聚焦掃描部件還包括用于檢測束內(nèi)橫向偏移的位置敏感自聚焦檢測器28 (后面將給予說明)，和用于移動物鏡10的馬達(dá)27?；蛘撸锲矫?6也可以朝光軸方向偏移。在如圖1所示的顯微鏡自聚焦裝置中，測量束30被分束器20在點A處偏入束截面的一半內(nèi)(相對于光軸8而言)。該被偏轉(zhuǎn)的測量束30被物鏡10偏轉(zhuǎn)或折射，使它沿對角線或傾斜角α照到物平面16的反射點C上。該束30作為被反射的測量束32被反射或送回或傳送，然后再次由物鏡10偏轉(zhuǎn)并在束路徑另一側(cè)(相對于A點而言)的B點處經(jīng)過分束器20。然后該偏轉(zhuǎn)束32照射檢測器28，即位置敏感檢測器(PSD)，其輸出信號取決于束所照到或接觸的位置，因此可以用這種方法確定位置。出現(xiàn)散焦時，即在目前圖1的狀下中，物平面16偏移到平面16’ (即成像點從16 移到16’)，測量束30首先在偏轉(zhuǎn)點D偏轉(zhuǎn)，此偏轉(zhuǎn)點不僅朝光軸8的方向，而且也朝橫向或側(cè)向，相對于C點移動。如圖所示，相應(yīng)的反射束32’到達(dá)檢測器28的不同位置，同時提供相對于聚焦位置有所改變的信號。用這種方法可以測量散焦的程度并通過馬達(dá)27移動物鏡來補(bǔ)償。下面的專利說明論及以上述三角形原理為基礎(chǔ)的系統(tǒng)。德國專利文件DE 3219503Α1披露了用于光學(xué)設(shè)備(特別是反射光顯微鏡)的一種自聚焦裝置。在此裝置中提供了激光自聚焦設(shè)備，由它產(chǎn)生其中一半被光學(xué)元件遮擋的測量束錐。這個減小為其橫截面一半的測量束錐作為自聚焦測量束被耦合到反射光顯微鏡的照明束路徑內(nèi)，而且再經(jīng)過物鏡光孔和物鏡落到物上。按這種方法，此一半被遮擋的測量束-最好是在紅外(IR)波段的脈沖激光-在物上產(chǎn)生用于自聚焦的測量斑，它不妨礙顯微鏡的觀察。在散焦時此測量斑在物表面上偏移。
作為例子，遮擋一半測量束錐的光學(xué)元件可以是偏轉(zhuǎn)棱鏡，在此情況下，它的一半被引入測量束路徑中直至光軸。偏轉(zhuǎn)棱鏡的指向激光光源的該側(cè)是完全反射的，因此一半被遮擋的測量束沿光軸方向伸展直至物鏡光孔，并通過物鏡作為測量斑被聚焦在物上。在從物表面上被反射后，此被送回的(一半)自聚焦測量束還沿光軸伸展回到該偏轉(zhuǎn)棱鏡，而在其“返回路徑”中此被傳送的自聚焦測量束是在該光孔內(nèi)行進(jìn)，其中一半是與向外的路徑相反的，指向物的測量光束錐被遮擋部分就處在此向外的路徑內(nèi)。被反射的自聚焦測量束通過偏轉(zhuǎn)棱鏡被傳送到主要由差動二極管(雙二極管)組成的檢測器內(nèi)。當(dāng)系統(tǒng)處在最佳聚焦?fàn)顟B(tài)時，測量斑的像處于相對檢測器的所述雙二極管準(zhǔn)確對稱的位置。出現(xiàn)散焦時，該測量斑的像沿雙二極管中一個的方向(取決于散焦的方向)偏離中心位置。作為一級近似， 測量斑在差動二極管上的偏移量與散焦量成正比。此裝置可以通過相應(yīng)地沿ζ-方向反向調(diào)整物鏡和/或工件臺，使檢測到的散焦倒向。利用這里提出的裝置還可以設(shè)定已限定的散焦量(“偏移”)，以便能在不同的高度進(jìn)行顯微觀察，例如當(dāng)物沿ζ-方向具有不同結(jié)構(gòu)的情況下。美國專利文件US 2004/0113043A1也公開了一種使用類似測量原理的自聚焦系統(tǒng)。同樣，為了產(chǎn)生測量縫，將半遮擋的測量束引向?qū)⒁陲@微鏡下觀察的物上面。被反射的測量束被提供給電荷耦合器件(CCD)傳感器。接在下游的信號處理裝置把散焦信號送到計算部件(CPU)，由后者控制工件臺和/或物鏡以校正任何散焦。該測量縫是利用紅外光產(chǎn)生的，而測量縫的像在物的界面(蓋玻片表面，蓋玻片下面的樣品表面)處反射。被反射的測量縫通過光學(xué)裝置(其最后部分為圓柱透鏡)成像在線狀檢測器(CCD傳感器)上。相應(yīng)檢測信號和實際聚焦位置之間的相互關(guān)系在該美國專利說明書中已舉例說明。美國專利文件US 7，345，814B2公開了一種用于具有投射光照明的倒置式顯微鏡的類似自聚焦系統(tǒng)。為盡可能減少散射光，在自聚焦裝置束路徑中提供了極化分束器和 λ/4板。在這里所述的特定應(yīng)用中，該自聚焦裝置保證了在蓋玻片上的聚焦，為的是之后將顯微鏡物鏡沿ζ方向移動一個預(yù)定量(“偏移”)。為完整起見，應(yīng)當(dāng)指出，顯微鏡的自聚焦從較早的德國專利說明書2102922就已經(jīng)知道。用于顯微鏡的在不同物平面上自動聚焦的類似裝置可從奧地利專利文件 ΑΤ-353497中得到了解。上述自聚焦過程的共同特點是它們利用固定的半光圈特別是中心可變膜片工作，該膜片在從光軸至束截面邊緣的一邊被關(guān)閉。結(jié)果目標(biāo)物被自聚焦測量束在一邊照明 (三角形原理)。由這種幾何結(jié)構(gòu)產(chǎn)生的結(jié)果是在散焦過程中自聚焦標(biāo)記的像在傳感器上移動，同時散焦量與像的形心的偏心成正比(按一級近似)。檢測器的尺寸限定了物附近在Z-方向聚焦調(diào)整的最大捕捉范圍。因此，這類系統(tǒng)不大合用，尤其不適合用于尋找在散焦很大時的焦點位置?，F(xiàn)有系統(tǒng)的另一個缺點是所謂的一級反射，即這些反射最容易在光學(xué)表面(透鏡)的頂端形成，而且對測量信號具有高度破壞性的影響。當(dāng)使用蓋玻片和水溶液之間的界面作為設(shè)定聚焦的參考表面時，被一級反射削弱的信噪比變得特別明顯，因為在這個界面上的反射僅有千分之4(4%。)。其結(jié)果是自聚焦反射可能被散射光遮擋。因此，為了使散射光最小化，在上述US 7，345，814Β2中使用了帶λ/4板的極化分束器。

發(fā)明內(nèi)容
因此，我們希望提供盡可能避免現(xiàn)有系統(tǒng)上述缺點的改進(jìn)型顯微鏡三角形自聚焦系統(tǒng)，特別是按照本發(fā)明的系統(tǒng)應(yīng)該具有大的捕捉范圍，應(yīng)該限制散射光的破壞性影響，和 /或應(yīng)該適合在反射很差的樣品上自聚焦。為了解決這個問題，本發(fā)明提出了一種用于顯微鏡三角形自聚焦裝置中的自聚焦用光闌，和具有所述類型的自聚焦用光闌的自聚焦裝置。此外，本發(fā)明提出了相應(yīng)的使用至少兩個按照本發(fā)明的自聚焦用光闌的用途。按照本發(fā)明，用于顯微鏡的三角形自聚焦裝置中的自聚焦用光闌結(jié)構(gòu)如下該自聚焦用光闌包含至少一個膜片或孔闌，當(dāng)該自聚焦用光闌被插入測量束錐內(nèi)時，可將沿自聚焦裝置光軸方向伸展的測量束錐限制在它的截面內(nèi)， 光闌的膜片孔被安置在離該自聚焦裝置光軸一定距離的偏心位置，而在測量束錐一半截面內(nèi)的膜片孔能產(chǎn)生偏心的自聚焦測量束。除非另有說明，所謂“膜片孔被安置在離光軸一定距離”意味著此膜片孔的每一點離光軸的距離大于零。此外，該膜片孔是被完全位于測量束錐的一半截面內(nèi)，因此該自聚焦用光闌的膜片孔限制了沿自聚焦裝置光軸方向伸展的測量束錐的截面，使得這個被遮擋的束錐(以后稱為自聚焦測量束)不會穿越靠近光軸的區(qū)域。因而按照本發(fā)明的帶偏心膜片孔的自聚焦用光闌，將在測量束錐原來截面的一半內(nèi)產(chǎn)生不與光軸重合的偏心自聚焦測量束。被自聚焦用光闌遮擋的自聚焦測量束可能在其束錐內(nèi)包含具有發(fā)散的，收斂的，或平行的軌跡的束。因此，按照本發(fā)明提出的自聚焦用光闌不僅將測量束錐的截面限制到至多一個半圓部分，而且將另外一個半圓部分的大部分和光軸附近的面積蓋住。這樣就基本上防止了導(dǎo)致上述一級反射的靠近軸的束。所以出現(xiàn)在測量束路徑內(nèi)的光學(xué)表面(透鏡)的頂端就沒有自聚焦測量束通過其中，結(jié)果是那兒產(chǎn)生的反射沒有能照到該自聚焦裝置的檢測器。 于是測量信號的信噪比可以得到改善而有利于高精度測量。這特別有利于使用低反射度界面(例如蓋玻片和水溶液之間，或皮氏培養(yǎng)皿和水溶液之間的界面)作為設(shè)定聚焦的參考表面的自聚焦系統(tǒng)。這時反射度僅為的4/10(0. 004)，遠(yuǎn)比玻璃上的反射度(約為4% 即0.04)要低。因此迄今為止利用附加光學(xué)元件來降低反射光的傳統(tǒng)方法可以廢棄不用。如果自聚焦用光闌的膜片孔是由兩個半徑不同的圓弧形界定的圓弧段將會更好。 此段可以是在圓周方向的整個半圓段。不過在圓周方向小一些的伸展更為有利。業(yè)已證明， 橢圓形，卵形或腎臟形的自聚焦用光闌膜片孔適合于測量圖形(尤其是測量縫)的高質(zhì)量成像。如果膜片孔的形心離自聚焦裝置光軸或測量束錐的距離相當(dāng)于顯微鏡物鏡入口光孔半徑的至少一半，則可特別有效地抑制一級反射。成功防止反射現(xiàn)象的最低要求是，膜片孔形心離自聚焦裝置光軸或測量束錐的距離與物鏡的類型有關(guān)，至少為0. 5mm至1. Omm0 換句話說，如果圍繞光軸半徑至少0. 5mm至1. Omm的區(qū)域被光闌遮擋，那么大部分一級反射可在具有較小入口光孔的物鏡內(nèi)被抑制。此最大距離只受入口光孔半徑的限制。為了達(dá)到 50%以上的反射下降，離光軸的最小距離應(yīng)為顯微鏡物鏡入口光孔半徑的25%至40% (例如，對40x的物鏡為25%，對63x和IOOx的物鏡為40%左右)。另外，膜片孔最好應(yīng)處于測量束錐截面邊緣盡可能遠(yuǎn)的地方。這樣得到的自聚焦測量束是充分偏心的。這個關(guān)于膜片孔形心離光軸距離的標(biāo)準(zhǔn)同時限制膜片孔相對于測量束錐截面的尺寸。
按照另一個方案，本發(fā)明涉及用于顯微鏡的三角形自聚焦裝置，它具有自聚焦用光闌(用于限制該自聚焦裝置測量束錐的截面)和自聚焦光學(xué)裝置，以利用自聚焦用光闌產(chǎn)生的自聚焦測量束通過顯微鏡物鏡在物上生成測量圖形。這類普通三角形自聚焦裝置的基本結(jié)構(gòu)和運行模式已在本說明書的引言中詳細(xì)說明過。按照本發(fā)明，在這類自聚焦裝置中，可以選擇至少一個前面討論過的根據(jù)本發(fā)明第一種方案的自聚焦用光闌來產(chǎn)生自聚焦測量束，并將該光闌插入此自聚焦裝置的測量束路徑中。這類自聚焦裝置將提供最佳的信噪比，因而可以使用反射度極低的界面來維持聚焦。最好在這類三角形自聚焦裝置中提供至少兩個不同的自聚焦用光闌，其偏心膜片孔被安置成離該自聚焦裝置的光軸具有不同的距離，同時可從中選擇一個并插入測量束路徑內(nèi)。從前述三角形自聚焦裝置工作模式可知，“偏心較大”的光闌(即其膜片孔離光軸距離較大的光闌)較之“偏心較小”的光闌(即自聚焦測量束更靠近光軸地伸到時)，使自聚焦測量束離光軸的距離更大，并因而在物上具有更大的α角(參看前述圖1)。當(dāng)物的范圍內(nèi)出現(xiàn)散焦時，大的α角本身又導(dǎo)致檢測器上的測量圖形產(chǎn)生顯著的位移。因此，即使很小的物散焦(在ζ-方向的位移，參看圖1)也將導(dǎo)致可測量到的結(jié)果。因為這個原因， “偏心較大”的光闌有助于在重新調(diào)節(jié)聚焦設(shè)定(所謂的“保持聚焦”)時達(dá)到較高的精度， 但不利于在散焦較大時用于尋找焦點位置。實際上，當(dāng)物在ζ-方向的散焦較大的情況下， 測量圖形很可能移出檢測器的范圍，也就是說，可能會超過檢測器的最大捕捉范圍。與此相反，使用“較低偏心”的自聚焦用光闌可以在大散焦的情況下尋找焦點位置，因為偏心較小的用光闌產(chǎn)生較小的α角，從而使檢測器上測量圖形的位移比較小，因為被自聚焦掃描的物界面是移動的。所以，使用偏心較小的自聚焦用光闌(也就是膜片孔偏心較小)，以尺寸不變的檢測器尋找焦點位置的捕捉范圍，將比使用偏心較大的光闌時大得多。實際上，自聚焦往往聚焦在一定的界面上，例如樣品表面的空氣界面或樣品流體和玻璃之間的界面上。這可以由用戶通過對樣品的視覺監(jiān)測而人工實現(xiàn)，或者使用自聚焦裝置的專門聚焦搜尋功能來實現(xiàn)，此時焦點位置是通過對比檢測器輸出信號和原來記錄下來的校正曲線的信號值，從這些輸出信號確定的。實際的顯微觀察可以通過“補(bǔ)償裝置”來操作，此時由用戶將自聚焦調(diào)節(jié)到與視覺焦點不一樣的、更容易掃描的界面上(參看本說明書的開頭)。這時預(yù)先假定，這兩個焦點之間的距離已經(jīng)知道，比方說是顯微制備的蓋玻片厚度或者支托被視覺觀察的樣品的皮氏培養(yǎng)皿底座的厚度。特別是在進(jìn)行長時間顯微觀察的情況下(例如對細(xì)胞樣品的觀察)，把焦點維持在確定的界面(例如在蓋玻片與水溶液之間)上是有益的，此時由用戶選定的焦點總是在重新調(diào)整。為了搜尋界面，最好采用帶較小偏心膜片孔的自聚焦用光闌、以得到較大的捕捉范圍，而在界面附近具有較小偏心膜片孔的自聚焦光闌將產(chǎn)生較小的捕捉范圍，并因此造成較大的敏感性。在特別優(yōu)選的實施例中，至少兩個不同的自聚焦用光闌與不同的顯微鏡物鏡的不同入口光孔直徑相結(jié)合，并可根據(jù)當(dāng)前選定的物鏡入口光孔直徑選擇和用于測量束路徑中。甚至可以想到顯微鏡的每個物鏡都具有相應(yīng)的自聚焦用光闌。但是，實踐發(fā)現(xiàn)，兩個其膜片孔安置在離自聚焦裝置光軸不同距離處的自聚焦用光闌就足以覆蓋顯微鏡物鏡入口光孔直徑的正常范圍。這里考慮的顯微鏡通常其物鏡工作的放大率在IOx至ΙΟΟχ，但也可以是其它的物鏡(例如150x)。為了更好地了解自聚焦用光闌孔的偏心(如這里所述，這是更可取的選擇)與所用顯微鏡物鏡入口光孔直徑的關(guān)系，我們首先來討論顯微像在物側(cè)和像側(cè)的焦深。為了使用管狀透鏡在像平面上以高放大率使物結(jié)構(gòu)成像(用于通過目鏡觀察的中間像)，在顯微成像中使用較高放大率和較大數(shù)值孔徑的物鏡。管狀透鏡的焦距比物鏡的焦距要大很多倍。雖然物范圍內(nèi)的焦深隨著物鏡放大率的增加和數(shù)值孔徑的增加而減小，而且只是在0. 5 至10 λ (所用光的波長)的總范圍內(nèi)，但對同樣的物鏡在像范圍內(nèi)(例如在檢測器表面上) 的焦深隨著物鏡放大率增加而增加，而且在大得多的范圍內(nèi)(1000至5000 λ)變化。粗略估計焦點設(shè)定的精度為焦深的1/3。物鏡入口光孔直徑正比于數(shù)值孔徑與物鏡焦距之乘積。雖然普通顯微鏡物鏡的數(shù)值孔徑總是隨著放大率增加而增加，但在另一方面，焦距的減小更明顯，所以物鏡入口光孔直徑隨著放大率增加而下降。因此，對于低放大率顯微鏡物鏡使用較大的偏心光闌比對高放大率顯微鏡物鏡更有利。我們已經(jīng)說過，偏心較大的光闌(膜片孔離光軸距離大)具有小的捕捉范圍，但由于在檢測器處的靈敏度，這時能進(jìn)行高精度的聚焦設(shè)定或焦點調(diào)節(jié)(所謂的“固定聚焦”)，這對低放大率物鏡也同樣需要，對此前面我們已經(jīng)詳細(xì)解釋過。另一方面，具有較小入口光孔直徑的高放大率顯微鏡物鏡使用偏心較小的自聚焦光闌則應(yīng)該更有利。由于低偏心的膜片孔具有較高的捕捉范圍，它們適合于用于搜尋焦點的位置。如上面詳細(xì)說明過的那樣，這又與高放大率物鏡的聚焦準(zhǔn)確性具有非常大的容差相一致。業(yè)已證明，對于這里所考慮的放大率在IOx至IOOx的顯微鏡物鏡，提供兩個不同的偏心自聚焦用光闌插入測量束路徑或引入測量束錐內(nèi)就足夠了。如果各膜片孔的形心離自聚焦裝置光軸或測量束錐的距離至少相差一倍尤其有利。不言而喻，此要求原則上不限于只有兩個光闌的情況。對于準(zhǔn)確的自聚焦測量，如將所述至少兩個自聚焦用光闌安置在測量束錐內(nèi)，使得它們的膜片孔形心處在同一條垂直于自聚焦裝置光軸的線上，將會有所幫助，因為這樣一來物結(jié)構(gòu)將被帶兩個自聚焦用光闌的自聚焦測量束從同一方向照射。因此，自聚焦測量束在檢測器上的縫像可以按同樣的方式得到評估。自聚焦用光闌最好具有相同大小的面積，以便接收到同樣的信號強(qiáng)度。實際上，可以把所提供的各種自聚焦用光闌的聚焦信號的校正曲線儲存起來。為此目的，對每個自聚焦用光闌進(jìn)行目標(biāo)物上的聚焦(通過調(diào)節(jié)顯微鏡工件臺的高度或物鏡實現(xiàn)“ζ-調(diào)節(jié)”)并將把檢測器信號和各ζ-位置聯(lián)系起來的相應(yīng)信號曲線記錄在檢測器上。 這樣可以讓客戶按照信號強(qiáng)度、對比度等將焦點位置和相應(yīng)選定的光闌儲存起來。如果兩個自聚焦用光闌的膜片孔在它們在測量束錐截面上的投影內(nèi)不重疊，也是很有利的。特別是，當(dāng)各膜片孔的形心離光軸的距離相差一倍時，就得到離光軸的偏心很不相同的自聚焦用光闌。自動選取適當(dāng)?shù)墓怅@并將它用于測量束路徑內(nèi)作為顯微鏡物鏡或它的入口光孔直徑的函數(shù)是很方便的。為此，所用的物鏡將由它們在機(jī)械化或自動化顯微鏡中的特性來檢驗。實踐業(yè)已證明，使用偏心較大的自聚焦用光闌，其用于“較低物鏡放大率”(即在
8IOx至63x之間，顯然也包括各中間值)比用于“較高物鏡放大率”(特別是在63x至IOOx 之間或更高，顯然也包括各中間值)更有利。因此，舉例來說，當(dāng)實現(xiàn)從20x物鏡放大率到 IOOx物鏡放大率轉(zhuǎn)換時，或者例如從40x物鏡放大率到150x物鏡放大率轉(zhuǎn)換時，改變自聚焦用光闌，并因此改變自聚焦測量束的偏心，也是有利的。上述特征和后面將要說明的特征，不僅可以用于所述的特定組合，而且可用于其它的一些組合或單獨使用，這都沒有超出本發(fā)明的范圍。下面將參照附圖通過實例對本發(fā)明作詳細(xì)的說明。


圖1示意性地示出了按照現(xiàn)有技術(shù)的三角形自聚焦裝置實例；圖加示意性地示出了光闌的第一個實例，其具有較高偏心；圖2b示意性地示出了光闌的第二個實例，其稍有偏心；圖3是通過按照本發(fā)明的三角形自聚焦裝置的整個光束路徑示意圖；圖4是通過與自聚焦裝置相關(guān)的倒置式顯微鏡的光束路徑示意圖；圖5表示不同物鏡的一級反射相對強(qiáng)度與光孔半徑的關(guān)系。
具體實施例方式在本說明書引言部分我們已經(jīng)詳細(xì)討論了按圖1的三角形自聚焦裝置。圖加和2b顯示了兩個這類不同的自聚焦用光闌5和6，它們適宜替代性地用于顯微鏡三角形自聚焦裝置中，以將用作自聚焦并沿著自聚焦裝置光軸方向的測量束錐34限制在其截面內(nèi)。為此自聚焦用光闌5包含高度偏心的膜片孔3，而自聚焦用光闌6包含稍有偏心的膜片孔4。兩個膜片孔3和4中的每一個偏心成離自聚焦裝置的光軸18或測量束錐具有一定的距離，使得每個膜片孔3或4處在該光軸18的外面。此外，為進(jìn)行三角形自聚焦測量，每個膜片孔3，4是處于測量束錐截面17的一半內(nèi)。自聚焦用光闌5和6的準(zhǔn)確外部結(jié)構(gòu)在圖2中未顯示，因為它們可能有不同的形式。例如，它們可以安置在光闌或膜片滑板上，后者可以被推入束路徑內(nèi)。或者也可以把它們安裝在旋轉(zhuǎn)杠桿上。通過旋轉(zhuǎn)此相關(guān)的杠桿就可以把自聚焦用光闌引入測量束錐內(nèi)。光闌5和6覆蓋測量束錐的除各膜片孔3 或4區(qū)域以外的整個截面17，所以在通過光闌5或6之后就得到偏心的自聚焦測量束。圓形區(qū)域1和2表示各顯微鏡物鏡入口光孔的截面，該物鏡最好和各光闌5或6 —起使用。自聚焦用光闌5和6的兩個實施例分別具有橢圓形結(jié)構(gòu)的膜片孔3或4，后者被安置在光闌5或6的邊緣，所以膜片孔3和4的橫向長度大于該特定膜片孔的徑向長度。這樣在保持偏心不變的同時該膜片孔的面積增加了。由于表面較大，在從檢測器出口處的信號強(qiáng)度比圓形膜片孔要大。這將改善信噪比，特別是對于在焦點處反射很差的樣品或界面。 膜片孔3和4的形心離光軸18的各自距離至少相差一倍。此外，膜片孔3和4在它們的投影內(nèi)不與測量束錐的截面17重疊。這樣可保證能使用兩個自聚焦用光闌，它們的膜片孔3 和4被安置在束截面內(nèi)很不相同的偏心位置。這是在三角形自聚焦裝置中使用所示的自聚焦用光闌5和6的主要優(yōu)點，后面我們會詳細(xì)說明。圖3示出了使用圖2所示兩個自聚焦用光闌5或6中的一個的自聚焦裝置21 (在本例中是自聚焦用光闌5)。與圖1的自聚焦裝置中相同的元件被冠以同樣的附圖標(biāo)記。從照明縫22(它可以由發(fā)光二極管(LED)等產(chǎn)生，其前面有集光器和縫闌)開始，測量束錐34 沿著自聚焦裝置21的光軸18伸展。安置在光軸18中心上的是例如如圖2所示的自聚焦用光闌5。在此應(yīng)該指出，自聚焦用光闌5也可以是例如膜片輪或膜片滑板的一部分。這類用于代替或改變膜片或光闌的機(jī)械結(jié)構(gòu)大家都知道，因此不是這里討論的主題。照明光學(xué)裝置23連同聚焦透鏡M將照明縫成像在照明場膜片沈內(nèi)。自聚焦測量束36通過所謂的移動式光學(xué)裝置25 (包括可沿光軸移動的聚焦透鏡M和另一個移動式透鏡3 被引導(dǎo)到顯微鏡的物鏡10。二色分束器20將顯微鏡成像束路徑42從這里所示的自聚焦裝置束路徑分離到管41內(nèi)。自聚焦測量束36到達(dá)目標(biāo)物平面16并將測量圖形 (在本場合下是測量縫)成像到目標(biāo)物上。當(dāng)測量縫的像清晰時，則自聚焦測量束36處于聚焦?fàn)顟B(tài)。從圖3可以看出，帶膜片孔3的自聚焦用光闌5在沿光軸18伸展的測量束錐34 的一半截面17內(nèi)產(chǎn)生自聚焦測量束36，此自聚焦測量束36偏心地離光軸18伸展。于是自聚焦測量束36不再通過光軸18區(qū)域而是靠近此光軸。所以，在移動式光學(xué)裝置25或物鏡 10等上面的一級反射大大減小，而且不進(jìn)入檢測器觀。返回或送回的即被物反射的自聚焦測量束36’接著通過分束器20和移動式光學(xué)系統(tǒng)25照到偏轉(zhuǎn)棱鏡33，如圖3所示意性地顯示的那樣。偏轉(zhuǎn)棱鏡33使自聚焦測量束36’ 被反射至自聚焦裝置21的檢測器側(cè)(與照明邊相反的一側(cè))。與檢測器光路四一起，返回的自聚焦測量束36’又在檢測器觀上形成縫的像，在這種情況下設(shè)有二維的CCD相機(jī)。 也可以使用線性CXD矩陣。紅外波段特別適合于用作自聚焦測量束的光譜波段，因此人眼看不見物16上的測量縫。但是，自聚焦測量束也可以用在可見光譜波段。散射光利用接插在檢測器觀前面的只有與自聚焦測量束對應(yīng)的波長才能透過的光譜過濾器31被濾掉。自然，檢測器觀的靈敏度也必須在這個波段范圍之內(nèi)。利用圖3所示的設(shè)備可以產(chǎn)生三角形自聚焦裝置21，它能將焦點維持在例如反射度很低的界面上。由于一級反射被抑制，信噪比高到足以保持焦點長時間穩(wěn)定，即使反射度低至千分之幾的范圍。為了初步設(shè)定顯微鏡上的聚焦(參見后面圖4)，舉例來說，用戶可通過目測聚焦至蓋玻片與含水樣本之間的界面上。這樣在檢測器觀上得到的測量縫位置被作為“零線” 記錄下來。這是位置敏感的檢測器觀(例如CCD芯片)的強(qiáng)度信號，它將測量縫的像表示為檢測器觀在一個方向上的強(qiáng)度曲線。當(dāng)信號很弱時，也可以將曲線相加幾次，以大幅提高信噪比。此強(qiáng)度曲線在測量縫的位置處具有峰值，在它的左側(cè)或右側(cè)此峰值的一半被定義為聚焦信號。由于自聚焦用光闌5的膜片孔3是在自聚焦用光闌上相對于光軸18偏心安置的， 此自聚焦測量縫造成樣品的對角線或角向照明。其結(jié)果是峰值的兩側(cè)稍有不同，由于其中之一通常是多少處在陰影中，很難確定最大值的一半是多少。因此，在開始測量之前，用戶最好選擇將用哪一側(cè)來獲取信號。自然，也可以提供自動信號評估，從檢測器觀的強(qiáng)度信號中自動確定“較好”的一側(cè)。一旦超過聚焦信號的某個閾值，自聚焦裝置可以調(diào)節(jié)聚焦位置，這可用于找出具有最佳聚焦信號的焦點，或者設(shè)定或萬一樣品和物鏡之間的距離改變時(例如由顯微鏡受熱的影響或樣品變化-諸如細(xì)胞分裂，細(xì)胞遷移等-引起的變化)自動重調(diào)聚焦。
對于視覺清晰的像，也即通過視覺聚焦，自聚焦測量縫可能仍然沒有聚焦。因此， 為了得到清晰的縫像，在保持視覺聚焦的同時，即不改變樣品界面和物鏡之間的距離z，可將聚焦透鏡M沿軸向移動，直至檢測器觀的聚焦信號超過閾值或達(dá)到預(yù)定的最佳值。在這種情況下顯微鏡上的視覺聚焦等同于自聚焦裝置的測量縫聚焦。對于所使用的每個物鏡，技術(shù)數(shù)據(jù)如放大率、干或濕物鏡和數(shù)值孔徑等被儲存在自聚焦裝置的執(zhí)行裝置中。如果需要，可以提供有關(guān)允許的ζ值的附加信息，也即物鏡相對于樣品的距離。這可防止物鏡前面的透鏡不小心置于樣品上，以防損壞樣品。此外，所用蓋玻片的厚度可以儲存在自聚焦裝置的執(zhí)行裝置中，用于有計劃的研究。按照這種方法，在另一種初始設(shè)定中，蓋玻片遠(yuǎn)離物的一面被選作測量縫焦點的位置(蓋玻片的厚度約為170 μ m左右)，而顯微鏡視覺焦點是在蓋玻片下面，也即在該界面上。為此，按照前面所述設(shè)定視覺焦點和測量縫焦點。通過相當(dāng)于已知蓋玻片厚度的確定量沿光軸移動聚焦透鏡24，則測量縫焦點的位置被移至與視覺焦點相反的蓋玻片那面。這樣得到的好處是自聚焦測量縫被聚焦在玻璃-空氣界面上，在那兒能實現(xiàn)較強(qiáng)的反射，結(jié)果可產(chǎn)生具有較好調(diào)節(jié)特性的較強(qiáng)聚焦信號。在選擇了適當(dāng)?shù)某跏荚O(shè)定之后進(jìn)行顯微觀察，在觀察過程中通過自聚焦裝置21 保持測量縫焦點不變，從而也保證視覺焦點維持不變。尤其優(yōu)選的實施例是將自聚焦用光闌5，6選擇成顯微鏡物鏡入口光孔直徑的函數(shù)，此顯微鏡是與三角形自聚焦裝置一起使用，這在本說明書的概論部分已經(jīng)說明過。對此我們將參照圖4的具體實施例簡單描述顯微鏡的束路徑。圖4表示常用于細(xì)胞觀察的那類倒置式研究顯微鏡的束路徑。倒置式顯微鏡可方便地用于觀察皮氏培養(yǎng)皿中的樣品。它們尤其適于在顯微觀察過程中處理細(xì)胞，因為可以自由地進(jìn)入上部物空間。對倒置式顯微鏡和觀察(活)細(xì)胞過程的普通顯微鏡的進(jìn)一步詳情可參考此課題的一般文獻(xiàn)。圖4示出了倒置式顯微鏡40的物鏡10。物鏡光孔(或物鏡入口光孔)的標(biāo)號為11且處于整個物鏡10的后部(遠(yuǎn)離物的一邊)，實際上物鏡包含多個透鏡元件，作為例子這里只示意地顯示了其中一個透鏡元件。物鏡10和管狀透鏡12，13 — 起在像平面14上產(chǎn)生第一個中間像。與物鏡光孔11共軛的是中間光孔11’。第二中間像由移動式光學(xué)裝置12’，13’產(chǎn)生在平面15上，并由人眼通過目鏡觀察。自然也可以不用人眼觀察而裝上照相機(jī)或其它類型的像檢測器。圖4中也用標(biāo)號20表示二色分束器。它用于，舉例來說，將自聚焦測量束36耦合到自聚焦裝置21內(nèi)，或者將從物反射的自聚焦測量束36’從自聚焦裝置21耦合出來，如圖3所示?？紤]三角形自聚焦的基本原理時(參看對圖1的說明)并同時觀察圖2和3可以看出，當(dāng)使用偏心較小的光闌6時，對于預(yù)定的物鏡10和預(yù)定的檢測器觀尺寸，物平面16 的散焦在檢測器觀上引起的移動比使用偏心較大的光闌5時要小得多。因此，捕捉范圍， 即可被檢測器觀記錄的最大散焦，對偏心較小的光闌6要比偏心較大的光闌5高許多倍。在下文指定的條件下，對以下作為例子所選擇的物鏡，得到下面典型的捕捉范圍-對20x干物鏡從界面以下-50μ m至以上200 μ m左右，也即聚焦在樣品內(nèi)；-對40x干物鏡從界面以下-20μ m至以上80 μ m左右，也即聚焦在樣品內(nèi)；-對40x油物鏡從界面以下-20μ m至以上80 μ m左右，也即聚焦在樣品內(nèi)；
-對IOOx油物鏡從界面以下-20μ m至以上30 μ m左右，也即聚焦在樣品內(nèi)?，F(xiàn)在將考慮40x/0. 85的物鏡對物鏡光孔內(nèi)自聚焦測量束不同偏心度所能實現(xiàn)的靈敏度。該物鏡具有數(shù)值孔徑NumAp = 0.85。在具有多個無窮遠(yuǎn)物鏡的系統(tǒng)中(物鏡焦距 5mm ；Leica =參考焦距200mm)，以及，檢測器焦距100mm，CXD芯片寬度3mm，平均自聚焦波長Lambda = 546nm,在物鏡光孔內(nèi)自聚焦測量束偏心度例如2mm和4mm，我們得到下面的焦深DF的方程式DF = Lambda/ (NumAp)2 = 546nm/0. 852 = 0. 75 μ m物在ζ-方向散焦為準(zhǔn)確的一個焦深DF，當(dāng)自聚焦測量束在物鏡光孔內(nèi)有2mm偏心時，在檢測器上產(chǎn)生13 μ m的橫向偏移。物在ζ-方向散焦為準(zhǔn)確的一個焦深DF，但當(dāng)自聚焦測量束在物鏡光孔內(nèi)有4mm偏心時，在檢測器上得到40 μ m的橫向偏移。當(dāng)使用40x干式物鏡和其膜片孔3離光軸18的偏心為4mm的自聚焦用光闌時，在物空間得到士 ^ym的捕捉范圍。如使用同樣的40x干式物鏡和其膜片孔離光軸的偏心只有2mm的光闌時，則可達(dá)到大得多的捕捉范圍士 88μπι。因此，對上述40χ干式物鏡，通過將正確的自聚焦用光闌與適當(dāng)偏心的膜片孔相結(jié)合可得到大的捕捉范圍，而且與此同時，在用于自聚焦的界面附近的重要區(qū)域可達(dá)到很高的靈敏度，也即通過調(diào)節(jié)可實現(xiàn)很高的聚焦穩(wěn)定性。圖5表示從本申請者自己的研究領(lǐng)域選作例子的三個物鏡的一級反射的相對反射強(qiáng)度。此相對反射強(qiáng)度用與以mm為單位的光孔半徑的關(guān)系來表示。它是無量綱的，而且在透鏡頂點處被標(biāo)準(zhǔn)化為1 ( = 100% )。該圖示出了放大率分別為40x，63x和IOOx的物鏡的三條曲線。IOOx的物鏡的相對反射強(qiáng)度下降最陡峭，而其它兩個物鏡的相對反射強(qiáng)度下降較平緩。所顯示的曲線還表示了入口光孔，它們是從各曲線端點得到的。因此，對這兒所用的IOOx物鏡的入口光孔半徑是差不多2. 5mm以上，所以入口光孔直徑是大概5mm以上。這里顯示的63x物鏡相應(yīng)具有IOmm左右的入口光孔直徑，而這里顯示的40x物鏡具有12mm 左右的入口光孔直徑。根據(jù)圖5所示對作為例子使用的物鏡的曲線，可以選擇自聚焦用光闌膜片孔的形心應(yīng)該處在的離測量束錐光軸的距離例如，對所示100X物鏡，如光孔半徑為Imm左右，則相對反射強(qiáng)度下降至0. 4即40%。因此，此處將膜片孔形心離光軸的距離設(shè)置為Imm以使反射強(qiáng)度下降60%是有道理的。倘若打算只使用相對反射強(qiáng)度小于0. 4的光孔區(qū)域來自聚焦，那么對于40x物鏡， 大約25%光孔半徑的中心區(qū)域?qū)⒉坏貌槐环艞?，而對?3X物鏡，將要損失大約40%的中心區(qū)域，對于100X物鏡，將要損失大約30-40%的光孔半徑。與此相反，如自聚焦照明是處于約2mm光孔半徑處，則對于幾種不同的物鏡，與光孔中心區(qū)域相比，所產(chǎn)生的反射下降只有它的1/2. 5至1/4。附圖標(biāo)記一覽1,2 入口光孔截面3,4膜片孔5,6 光闌0078]
0079]
0080] 0081] 0082]
0083]
0084]
0085]
0086]
0087]
0088]
0089]
0090]
0091]
0092]
0093]
0094]
0095]
0096]
0097]
0098]
0099]
0100] 0101] 0102]
0103]
0104]
0105]
0106]
0107]
0108]
0109]
0110] 0111] 0112]
0113]
0114]
8 光軸
10物鏡
11物鏡光孔，入口光孔 11 中間光孔
12，13 管狀透鏡 12’，13’移動式光學(xué)裝置 14，15 像平面
目標(biāo)物平面測量束錐截面光軸
自聚焦光源分束器，二色分束器自聚焦裝置照明縫
照明光學(xué)裝置聚焦透鏡移動式光學(xué)裝置照明場膜片馬達(dá)
自聚焦檢測器檢測器光路測量束光譜過濾器已傳送測量束偏轉(zhuǎn)棱鏡測量束錐移動式透鏡自聚焦測量束被反射的自聚焦測量束倒置式顯微鏡管
顯微鏡成像束路徑偏轉(zhuǎn)點
16，16'
17
18
19
20 21 22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32,32'
33
34
35
36 36，
40
41
42 A
B，B，偏轉(zhuǎn)點
C 偏轉(zhuǎn)點 D 偏轉(zhuǎn)點 α 角度
權(quán)利要求
1.用于顯微鏡GO)的三角形自聚焦裝置中的自聚焦用光闌(5，6)，其中自聚焦用光闌(5，6)包含至少一個膜片孔(3，4)，利用該膜片孔可將用于自聚焦并沿自聚焦裝置 (21)的光軸(18)方向伸展的測量束錐(34)限制在其截面內(nèi)，其特征在于該自聚焦用光闌(5，6)的膜片孔(3，4)被安置在離該自聚焦裝置的光軸(18) 有一定距離的偏心位置，其中偏心的自聚焦測量束(36)通過在測量束錐(34)的一半截面 (17)內(nèi)的膜片孔(3,4)產(chǎn)生。
2.如權(quán)利要求1所述的自聚焦用光闌，其特征在于膜片孔(3，4)被兩個半徑不同的圓弧所限定。
3.如權(quán)利要求1所述的自聚焦用光闌，其中膜片孔(3，4)是橢圓形、卵形或腎臟形。
4.如權(quán)利要求1至3所述的自聚焦用光闌，其特征在于膜片孔(3，4)的形心離自聚焦裝置的光軸(18)的距離至少等于由顯微鏡物鏡決定的入口光孔(1，2)半徑的一半， 更準(zhǔn)確說是至少等于測量束錐(34)截面(17)半徑的一半。
5.如權(quán)利要求1至4所述的自聚焦用光闌，其特征在于膜片孔(3，4)的形心離自聚焦裝置光軸(18)的距離至少為0. 5至1. Omm。
6.如權(quán)利要求1至5之一所述的自聚焦用光闌，其特征在于膜片孔(3，4)的形心離自聚焦裝置的光軸(18)的距離為顯微鏡物鏡(10)入口光孔(1，2)半徑的25%至40%。
7.顯微鏡00)的具有自聚焦用光闌(5，6)的三角形自聚焦裝置(21)，它包含至少一個膜片孔(3，4)，用于限制沿該自聚焦裝置的光軸(18)方向伸展的測量束錐(34)的截面以及產(chǎn)生自聚焦測量束(36)，此三角形自聚焦裝置具有自聚焦光學(xué)裝置Q5J6)，用于通過自聚焦測量束(36)利用顯微鏡00)的物鏡(10)在目標(biāo)物上產(chǎn)生測量圖形，其特征在于至少一個按照權(quán)利要求1至6中任意一條的自聚焦用光闌(5，6)被選擇來產(chǎn)生自聚焦測量束(36)。
8.如權(quán)利要求7所述的自聚焦裝置，其特征在于選擇至少兩個不同自聚焦用光闌(5， 6)中的一個，光闌的膜片孔(3，4)被安置在離該自聚焦裝置的光軸(18)不同的距離。
9.如權(quán)利要求8所述的自聚焦裝置，其特征在于所述至少兩個不同自聚焦用光闌(5， 6)與不同顯微鏡物鏡(10)的入口光孔(1，2)的不同直徑相結(jié)合，根據(jù)已選定的物鏡(10) 的入口光孔直徑來選擇各產(chǎn)生自聚焦測量束(36)的光闌。
10.如權(quán)利要求8或9所述的自聚焦裝置，其特征在于提供至少兩個自聚焦用光闌 (5，6)，光闌的膜片孔(3,4)的形心離自聚焦裝置(21)的光軸(18)的各自距離至少相差一倍。
11.如權(quán)利要求8至10之一所述的自聚焦裝置，其特征在于該至少兩個自聚焦用光闌(5，6)被這樣安置，使得其膜片孔(3，4)的形心處在垂直于自聚焦裝置的光軸(18) 的同一直線上。
12.如權(quán)利要求8至11之一所述的自聚焦裝置，其特征在于兩個自聚焦用光闌(5，6) 的膜片孔(3，4)在測量束路徑(34)的截面上的投影中不相重疊。
13.如權(quán)利要求8至12之一所述的自聚焦裝置，其特征在于提供了正好兩個自聚焦用光闌(5，6)。
14.如權(quán)利要求7至13之一的自聚焦裝置，其特征在于自聚焦用光闌的選擇是根據(jù)顯微鏡GO)中所用的物鏡(10)進(jìn)行的。
15.根據(jù)權(quán)利要求1至6之一的至少兩個自聚焦用光闌(5，6)的用途，用于具有可更換和/或可轉(zhuǎn)換的物鏡(10)的這類自聚焦裝置(21)，此光闌的膜片孔(3，4)被安置在離三角形自聚焦裝置(21)的光軸(18)的不同的距離處。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于顯微鏡(40)的三角形自聚焦裝置(21)中的自聚焦用光闌(5，6)，其中孔徑光闌(5，6)包含至少一個膜片孔(3，4)，利用該膜片孔可將用于自聚焦并沿自聚焦裝置(21)光軸(18)方向伸展的測量束錐(34)限制在其截面內(nèi)，其中自聚焦用光闌(5，6)的膜片孔(3，4)被安置在離該自聚焦裝置(21)光軸(18)有一定距離的偏心位置，其中偏心的自聚焦測量束(36)通過在測量束錐(34)的一半截面(17)內(nèi)的膜片孔(3，4)產(chǎn)生。
文檔編號G02B7/30GK102313976SQ20111017059
公開日2012年1月11日 申請日期2011年6月23日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月23日
發(fā)明者R·克魯格 申請人:徠卡顯微系統(tǒng)復(fù)合顯微鏡有限公司