專利名稱：用于對樣本成像的方法和系統(tǒng)的制作方法
用于對樣本成像的方法和系統(tǒng) 本發(fā)明涉及用于對樣本成像的方法以及樣本成像系統(tǒng)。
背景技術(shù)：
各種樣本成像方法可以從現(xiàn)有技術(shù)獲悉，例如光學(xué)顯微術(shù)(光學(xué)反射和透射顯微術(shù))、熒光顯微術(shù)以及其他方法。例如，成像可以包括掃描成像或者寬場成像。此 夕卜，例如樣本的成像可以用來診斷癌癥。已知的非侵入式方法是通過應(yīng)用DNA細(xì)胞計量 術(shù)(cytometry)對只有一些細(xì)胞的樣本進(jìn)行診斷。G. Haroske，F(xiàn). Giroud, A. Reith和 A. Bocking 在“1997ESACP consensus report on diagnostic DNA image cytometry", AnalyticalCellular Pathology 17 (1998)，189-200 中提供了綜述。該方法基于數(shù)值和 / 或結(jié)構(gòu)染色體異常(異倍性)的存在性，所述異常僅在腫瘤(瘤的)組織中可檢測。DNA 異倍性的檢測允許實(shí)現(xiàn)癌癥的非常早期的診斷，通常比活組織檢查的組織學(xué)診斷提前若干 年。一種已知的DNA樣本成像方法使用了單個波長的光。為此目的，使用公知的福爾 根(Feulgen)染色法對細(xì)胞核(DNA含量)著色。然而，該方法中的著色步驟是費(fèi)時的，因 為它基于4. 5小時福爾根染色過程。結(jié)果，通過這種方式現(xiàn)場執(zhí)行刷檢(brush biopsy)和 進(jìn)行實(shí)時測量是不可能的?？商鎿Q地，已知使用熒光DNA染色，例如對于結(jié)合到DNA具有高特異性的標(biāo)記物大 埤(DAPI)。熒光DNA染色的使用相對于福爾根染色具有某些優(yōu)點(diǎn)。例如，熒光允許具有比白 色光吸收更高的測量靈敏度。而且，大多數(shù)熒光染料具有比福爾根染色過程快得多的染色 時間；例如，大埤染色可以在數(shù)分鐘內(nèi)完成。然而，使用熒光DNA染料的一個問題是由于不可逆的光致漂白引起的熒光的褪 色。已知使用抗褪色劑來在一定程度上減緩光致漂白，然而，那僅僅是減輕了該問題，但沒 有解決該問題。此外，在熒光DNA細(xì)胞計量術(shù)中，使用與測量本身期間相同的光源和檢測技術(shù)(熒 光)來完成對適當(dāng)照射束的聚焦。這將造成熒光團(tuán)的不受控的光致漂白，并且因而導(dǎo)致DNA 細(xì)胞計量術(shù)測量中的變異系數(shù)(Coefficient of Variance, CV)增大。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明旨在解決上面提到的問題。特別地，本發(fā)明的目的是提供用于對樣本成像 的改進(jìn)的方法以及改進(jìn)的樣本成像系統(tǒng)。依照一個實(shí)施例，提供了一種用于對樣本成像的方法，該方法至少包括-利用第一標(biāo)記物材料以及利用第二標(biāo)記物材料對樣本染色；-在用于相對于樣本聚焦成像設(shè)備的聚焦步驟中采用第一標(biāo)記物材料；以及-在成像步驟中采用第二標(biāo)記物材料以及已經(jīng)在聚焦步驟中聚焦的成像設(shè)備，以 便獲取樣本的圖像。
通過這種方式，可以使用第一標(biāo)記物材料相對于樣本聚焦成像設(shè)備，其中隨后可 以使用第二標(biāo)記物材料由成像設(shè)備實(shí)現(xiàn)對樣本的精確測量(成像)。例如，成像設(shè)備的聚焦可能涉及設(shè)置該成像設(shè)備，使得該設(shè)備可以拍攝樣本的清 晰圖像，特別是可以拍攝預(yù)定樣本部分的清晰圖像，所述樣本部分例如一個或多個樣本成 分或者樣本結(jié)構(gòu)，例如以下項(xiàng)中的一個或多個分子、核酸、DNA、RNA、抗體、細(xì)胞、細(xì)胞部分、 膜、蛋白質(zhì)、組織以及生物材料。換言之，聚焦可能涉及使成像設(shè)備的一個或多個成像單元 和樣本達(dá)到相對于彼此的某種焦點(diǎn)對準(zhǔn)(in-focus)布置，使得成像設(shè)備可以獲取樣本(或 者樣本部分)的希望的焦點(diǎn)對準(zhǔn)圖像。所述方法可以包括作為聚焦步驟的一部分，確定例如與不同樣本部分有關(guān)的多個 (例如序列的)焦點(diǎn)對準(zhǔn)位置，得到包含那些焦點(diǎn)對準(zhǔn)位置的焦點(diǎn)對準(zhǔn)信息。然后，該得到 的焦點(diǎn)對準(zhǔn)信息可以用在成像序列中，該成像序列涉及相對于樣本(或者樣本部分)將成 像設(shè)備聚焦到每個焦點(diǎn)對準(zhǔn)位置并且在對應(yīng)焦點(diǎn)對準(zhǔn)位置處獲得樣本(或者樣本部分)的 圖像。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解的是，可替換地，隨后在對于下一個樣本部分應(yīng)用聚焦步驟 和對應(yīng)的成像步驟之前，可以通過對于待成像的一個樣本部分使用對應(yīng)的聚焦步驟和對應(yīng) 的成像步驟，來對不同的樣本部分成像。優(yōu)選地，成像步驟涉及對于待拍攝的每幅圖像，在相對較短的預(yù)定(優(yōu)選地固定) 時間段(例如大約10秒或更少，特別地1秒或更少的時段)期間(例如在一秒的小部分期 間)照射樣本。這在成像(即測量)步驟期間樣本的照射涉及由于第二標(biāo)記物材料接收該 輻射而引起第二標(biāo)記物材料的退化(例如光致漂白)的情況下是特別有利的。優(yōu)選地，第二標(biāo)記物材料的光學(xué)特性不同于第一標(biāo)記物材料的光學(xué)特性。例如，可以在聚焦步驟中使用不使第二標(biāo)記物材料退化的第一種類型的(照射) 輻射照射樣本以便檢測第一標(biāo)記物材料，其中在成像步驟中使用使第二標(biāo)記物材料退化的 第二種類型的(照射)輻射照射樣本以便檢測第二標(biāo)記物材料。依照一個優(yōu)選的實(shí)施例，至少所述第二標(biāo)記物材料為熒光標(biāo)記物材料(例如熒光 染料)。在一個非限制性實(shí)施例中，所述第一材料和第二標(biāo)記物材料為具有不同熒光特性的 熒光標(biāo)記物。此外，依照另一個實(shí)施例，所述第一標(biāo)記物材料和第二標(biāo)記物材料可以被設(shè)計成 對相同的樣本成分或樣本結(jié)構(gòu)加標(biāo)簽(tag)，所述樣本成分或樣本結(jié)構(gòu)例如以下項(xiàng)中的一 個或多個分子、核酸、DNA、RNA、抗體、細(xì)胞、細(xì)胞部分、蛋白質(zhì)、膜、組織以及生物材料。本 領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解的是，樣本成分的加標(biāo)簽可以包括結(jié)合到該樣本成分，與該樣本成 分相互作用和/或另一種類型的加標(biāo)簽。通過這種方式，精確地聚焦到該樣本成分或結(jié)構(gòu) 可以由聚焦步驟來實(shí)現(xiàn)，之后可以由成像步驟精確地對該樣本成分或結(jié)構(gòu)成像。所述聚焦步驟和成像步驟可以涉及利用適當(dāng)類型的輻射照射樣本，以及使用成像 設(shè)備的輻射檢測器檢測從該樣本發(fā)出的所得到的樣本輻射。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解的 是，提到的所得到的樣本輻射可以包括各種類型的輻射，這取決于用來照射該樣本的輻射 以及標(biāo)記物材料。例如，從樣本發(fā)出的輻射可以包括以下項(xiàng)中的一個或多個進(jìn)入的(照 射)輻射的反射部分，進(jìn)入的輻射的透射部分以及熒光輻射，這取決于樣本、樣本標(biāo)記物以 及照射輻射的類型。例如，聚焦步驟中使用的輻射可以特別適合與第一標(biāo)記物材料相互作用，使得成像設(shè)備可以檢測該第一標(biāo)記物材料，并且成像步驟中使用的輻射可以被選擇成與第二標(biāo)記 物材料相互作用以便檢測該第二標(biāo)記物材料。有利的是，相同的輻射檢測器用來檢測由樣 本發(fā)射或透射的所得到的輻射(即“樣本輻射”)，從而導(dǎo)致緊湊而精確的成像系統(tǒng)。本發(fā)明的一個實(shí)施例提供了一種樣本成像系統(tǒng)，該系統(tǒng)包括被配置成對樣本成像 的成像設(shè)備以及被配置成將成像設(shè)備聚焦到待成像的樣本上的聚焦單元，該系統(tǒng)包括被配 置成控制該系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)依照本發(fā)明的方法的聚焦和成像步驟的控制器。因此，可以實(shí)現(xiàn)上面 提到的優(yōu)點(diǎn)。從屬權(quán)利要求中描述了本發(fā)明的另外的有利實(shí)施例。本發(fā)明的這些和其他方面根 據(jù)示于附圖中的下面描述的非限制性實(shí)施例將是清楚明白的，并且將參照這些非限制性實(shí) 施例進(jìn)行闡述。


圖1示意性地繪出了在聚焦步驟期間的成像系統(tǒng)的實(shí)施例；圖2繪出了在成像步驟期間的實(shí)施例；圖3示出了利用圖1的系統(tǒng)獲得的圖像的實(shí)例；以及圖4示出了兩種不同標(biāo)記物材料的吸收和發(fā)射譜的曲線圖，其指示吸收和熒光與 波長的函數(shù)關(guān)系。
具體實(shí)施例方式在本申請中，相似或相應(yīng)的特征由相似或相應(yīng)的附圖標(biāo)記表示。圖1-2示意性地示出了樣本成像系統(tǒng)的非限制性實(shí)例。該系統(tǒng)包括被配置成對樣 本成像的成像設(shè)備1以及被配置成將成像設(shè)備聚焦到待成像的樣本上的聚焦單元3、6、7。 在該實(shí)施例中，聚焦單元3、6、7為成像系統(tǒng)1的組成部分。輻射束路徑由該圖中的虛線(L， E)示意性地繪出。特別地，成像設(shè)備1為熒光成像顯微鏡1，例如熒光掃描顯微鏡、熒光掃描共聚焦 顯微鏡或者不同類型的熒光顯微鏡，然而，設(shè)備1也可以是不同類型的成像設(shè)備。所述系統(tǒng)可以包括被配置成控制該系統(tǒng)的操作的控制器6。特別地，如下面將要解 釋的，控制器6被配置成控制系統(tǒng)執(zhí)行特定的聚焦和成像步驟。控制器6可以以各種不同 的方式來配置，例如包括適當(dāng)?shù)挠布?或軟件、數(shù)據(jù)處理器、微控制器、計算機(jī)和/或其他 電子器件?？刂破?可以至少被配置或被編程為提供控制器功能以執(zhí)行所提到的聚焦和成 像步驟。此外，該控制器可以被配置成控制系統(tǒng)初始化，提供用戶交互(例如通過適當(dāng)?shù)挠?戶接口)，用于存儲成像數(shù)據(jù)(即樣本圖像)和或用于其他目的。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解 的是，所述系統(tǒng)可以包括一個或多個用于存儲圖像的適當(dāng)存儲設(shè)備(例如為控制器6的一 部分或者與其分離)、用于顯示檢測的圖像的顯示器(未示出)。當(dāng)前的成像設(shè)備1設(shè)有被配置成支持樣本保持器H的支撐結(jié)構(gòu)2。樣本保持器H可 以被配置成支持各種類型的樣本S，例如生物樣本S，以及特別是包含特定樣本成分或樣本 結(jié)構(gòu)的樣本，所述樣本成分或樣本結(jié)構(gòu)例如以下項(xiàng)中的一個或多個分子、核酸、DNA、RNA、 抗體、細(xì)胞或細(xì)胞部分、(細(xì)胞)膜、蛋白質(zhì)、組織以及生物材料。所述樣本成分或結(jié)構(gòu)在圖 中通過箭頭M示意性地表示。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解的是，樣本保持器H可以以不同的方式來配置，例如由對于下面所描述方法中使用/存在的照射輻射和樣本輻射E的類型透 明的材料(玻璃、透明塑料)制成。當(dāng)前的成像設(shè)備1設(shè)有光學(xué)系統(tǒng)3和輻射檢測器4，光學(xué)系統(tǒng)3被配置成向檢測器 4透射從(支撐結(jié)構(gòu)2處的)樣本保持器支持的樣本S發(fā)射的輻射。檢測器4可以以各種方式來配置，并且可以包括目鏡、光電傳感器設(shè)備11、照相 機(jī)、成像裝置、濾波裝置、數(shù)據(jù)處理裝置和/或其他適當(dāng)?shù)臋z測器裝置。例如，可選地，可以 在相對于檢測器4的上游提供一個或多個濾波器10以便從所述輻射中濾除特定的輻射譜 部分，這取決于使用的檢測器類型以及操作期間從樣本S向檢測器發(fā)射的輻射。成像設(shè)備1可以相對于樣本S聚焦，使得設(shè)備1可以獲取樣本S的清晰圖像。如上 所述，該聚焦可能涉及使成像設(shè)備1的一個或多個成像單元和樣本S達(dá)到相對于彼此的某 種焦點(diǎn)對準(zhǔn)布置，使得成像設(shè)備(特別地，檢測器單元4或者傳感器11)可以獲取樣本(或 者樣本部分)的希望的焦點(diǎn)對準(zhǔn)圖像。在當(dāng)前實(shí)施例中，所述光學(xué)系統(tǒng)包括被定位成與樣本支撐結(jié)構(gòu)2相對的物鏡部分 或單元3。在一個實(shí)施例中，當(dāng)物鏡部分3的焦平面分別與樣本S或者樣本成分M相交時， 成像設(shè)備1相對于樣本S或樣本成分M(由支撐2處/上的保持器H支持)是焦點(diǎn)對準(zhǔn)的。 物鏡部分3和樣本S可以在雙箭頭Z指示的方向上相對于彼此移動以便聚焦設(shè)備1。在當(dāng) 前實(shí)施例中，為此目的，提供了例如包括適當(dāng)致動器或電機(jī)的驅(qū)動機(jī)構(gòu)7，該驅(qū)動機(jī)構(gòu)7被 配置成在所述方向Z(即設(shè)備1的聚焦方向)上移動樣本支撐結(jié)構(gòu)2?？商鎿Q地，物鏡部分 3可以設(shè)有用于相對于樣本S重新定位該透鏡部分3的適當(dāng)致動機(jī)構(gòu)。優(yōu)選地，所提到的驅(qū) 動機(jī)構(gòu)7可由控制器6控制。在另一個實(shí)施例中，也可以包括一個或多個致動器以便在一個或多個其他方向 (尤其是與Z方向正交的方向)上相對于彼此掃描樣本S (即樣本保持器H或者支撐2)和 透鏡單元3。輻射源組件8被提供來照射樣本S。例如，輻射源組件8可以是照明設(shè)備1的一部 分。在一個實(shí)施例中，輻射源組件8可以被設(shè)置成直接照射樣本支撐結(jié)構(gòu)2上支持的樣本。 在當(dāng)前實(shí)施例中，從源組件8發(fā)出的輻射通過物鏡部分3導(dǎo)向樣本。為此目的，提供雙色鏡 或分束器5，其設(shè)置在相對于輻射源組件8的下游并且在檢測器部分4與物鏡單元3之間。 雙色鏡或分束器5可以朝物鏡部分3反射從源部分8發(fā)出的輻射，并且可以朝檢測器4透 射從物鏡部分3發(fā)出的樣本輻射(像圖中一樣)。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解的是，所述成像 系統(tǒng)可以以許多其他方式來配置；例如，檢測器部分4和源組件8、9的位置可以互換。優(yōu)選地，在使用期間，待成像的樣本S已經(jīng)由至少第一標(biāo)記物材料和第二標(biāo)記物 材料染色。每種標(biāo)記物材料可以例如通過吸收、反射和/或光致發(fā)光(即熒光)與適當(dāng)?shù)?進(jìn)入的輻射L (在該實(shí)施例中即由物鏡單元3透射到樣本S上的照射輻射)相互作用，以便 提供或產(chǎn)生或影響得到的樣本輻射E(即從樣本S發(fā)出的輻射)。例如，該相互作用可以包 括單光子激發(fā)或者多光子激發(fā)。依照一個有利的實(shí)施例，所述第一和第二標(biāo)記物材料都是熒光標(biāo)記物材料(即熒光團(tuán))?？商鎿Q地，一種或所有兩種標(biāo)記物材料可以為非熒光標(biāo)記物材料，例如提供對樣本 的吸收染色的輻射吸收標(biāo)記物材料。在第一標(biāo)記物材料和第二標(biāo)記物材料被設(shè)計成對相同的樣本成分或者樣本結(jié)構(gòu)加標(biāo)簽的情況下，可以獲得良好的結(jié)果，所述樣本成分或樣本結(jié)構(gòu)例如以下項(xiàng)中的一個或 多個分子、核酸、DNA、RNA、抗體、細(xì)胞或細(xì)胞部分、(細(xì)胞)膜、蛋白質(zhì)、組織以及生物材料。例如，第二標(biāo)記物材料的光學(xué)特性可以不同于第一標(biāo)記物材料的光學(xué)特性。第一 標(biāo)記物材料和第二標(biāo)記物材料可以為具有不同熒光特性的熒光標(biāo)記物。例如，這些標(biāo)記物 材料的熒光輻射發(fā)射峰值可以位于不同的波長處(像圖4中一樣，參見下文)。優(yōu)選地，第一標(biāo)記物材料的主輻射吸收峰值不與第二標(biāo)記物材料的主輻射吸收峰 值重合(即具有不同的波長)。依照一個實(shí)施例，第一標(biāo)記物材料的主輻射吸收峰值的波長可以位于第二標(biāo)記物 材料的主輻射吸收峰值的波長的至少50nm以上或以下，特別地在IOOnm以上或以下，更特 別地在150nm以上或以下(像圖4中一樣，參見下文)。優(yōu)選地，特別是在第一標(biāo)記物材料為熒光材料的情況下，第一標(biāo)記物材料的主輻 射吸收峰值的波長高于第二標(biāo)記物材料的主輻射吸收峰值的波長。在這種情況下，可以以 簡單的方式防止第二標(biāo)記物材料對于從第一標(biāo)記物材料發(fā)出的熒光輻射(所述熒光輻射 通常具有比對應(yīng)熒光標(biāo)記物材料的主輻射吸收峰值更低的波長)的過早輻射吸收。在一個非限制性實(shí)例中，可以通過使用曙紅(Eosin)Y作為第一標(biāo)記物材料并且 利用大埤(4'，6-二脒基-2-苯基吲哚(4' , 6-diamidino-2-phenylindole))作為第二標(biāo) 記物材料(或者相反的情況)來對樣本S染色。圖4示出了這些標(biāo)記物材料的發(fā)射和吸收 譜。其中，A(大埤)和E(大埤)分別表示大埤的吸收譜和發(fā)射譜，而A(曙紅)和E(曙紅) 分別表示曙紅Y的吸收譜和發(fā)射譜。大埤的發(fā)射譜在360nm附近具有激發(fā)最大值，并且在 460nm處具有發(fā)射峰值；曙紅Y在525nm附近吸收，并且在 550nm處發(fā)射。在大埤的激發(fā) 最大值處，曙紅Y表現(xiàn)出近似為零的吸收?？紤]到如上所述的不同標(biāo)記物材料的應(yīng)用，當(dāng)前系統(tǒng)的源組件8優(yōu)選地設(shè)有第一 輻射源8a和第二輻射源8b，所述第一輻射源被配置成提供第一種類型的照射輻射Ll (參見 圖1)以便使得設(shè)備1能夠檢測第一標(biāo)記物材料，所述第二輻射源被配置成提供第二種類型 的照射輻射L2(參見圖2)以便使得設(shè)備1能夠檢測第二標(biāo)記物材料。例如，第一和第二源 8a、8b中的每一個都可以是激光器、白熾燈或者不同類型的輻射源。特別地，第二種類型的 照射輻射在以下項(xiàng)中的一個或多個方面不同于第一種類型的照射輻射波長、波長譜以及 頻譜帶寬。優(yōu)選地，可以由控制器9獨(dú)立地控制輻射源8a、8b，例如在希望的時間激活這些 輻射源和使其失活。依照一個實(shí)施例，在操作期間，第一和第二種類型的輻射L1、L2中一次 只有一個被引導(dǎo)到樣本S上。第一和第二源8a、8b可以是如圖所示的單獨(dú)的實(shí)體，或者它們可以彼此集成在一 起。在單獨(dú)的輻射源8a、8b的情況下，可以提供輻射定向單元9(例如包括可控可移動的反 射鏡或者適當(dāng)?shù)氖M合器)以便將來自源8a、8b中的每一個的輻射引導(dǎo)到通往樣本S的光 路上(所述路徑在當(dāng)前系統(tǒng)中經(jīng)由分束器5和物鏡單元3)。可替換地，可以提供被配置成發(fā)射寬帶頻譜輻射的單個輻射源8以發(fā)射所述頻譜 的預(yù)定部分的輻射，該單個輻射源設(shè)有可控的輻射濾波器以便調(diào)節(jié)由此發(fā)射的輻射譜。例 如，該輻射源濾波器可以被配置成經(jīng)過控制以提供第一濾波模式以及提供第二濾波模式， 所述第一濾波模式阻擋來自所述源發(fā)射的輻射的一個或多個預(yù)定輻射譜段以便提供第一 種類型的照射輻射，所述第二濾波模式透射該一個或多個預(yù)定輻射譜段以便提供第二種類型的照射輻射。如上面所提到的，聚焦步驟中使用的輻射Ll可以特別適合與第一標(biāo)記物材料相 互作用以便檢測該第一標(biāo)記物材料。成像步驟中使用的輻射L2可以被選擇成與第二標(biāo)記 物材料相互作用以便檢測該第二標(biāo)記物材料。優(yōu)選地，第一源8a發(fā)射的輻射Ll具有與第二源8b發(fā)射的輻射L2不同的頻譜。此 夕卜，第一種類型的輻射的頻譜可以部分地與第二種類型的輻射L2的頻譜重疊，這取決于標(biāo) 記物材料。在另一個實(shí)施例中，第一種類型的照射輻射(由第一輻射源8a發(fā)射)不使上面提 到的第二標(biāo)記物材料退化。然而，在一個實(shí)施例中，第二種類型的照射輻射可以導(dǎo)致第二標(biāo) 記物材料的退化。當(dāng)?shù)诙?biāo)記物材料為熒光材料時，情況可能如此(因?yàn)檫@種材料可以通 過特定波長的照射而光致漂白)。例如，所述退化可以是以下項(xiàng)中的一個或多個改變對應(yīng) 材料的光學(xué)特性，減少該材料的量，該材料的光致漂白，和/或不同類型的退化。優(yōu)選地，上面提到的輻射檢測器4被設(shè)置成檢測與第一標(biāo)記物材料有關(guān)的第一種 類型的樣本輻射El (即從樣本發(fā)出的輻射)并且被設(shè)置成檢測與第二標(biāo)記物材料有關(guān)的第 二種類型的樣本輻射E2。此外，控制器6可以被配置成處理在聚焦步驟中由成像設(shè)備1獲得的成像數(shù)據(jù) (由于檢測器4檢測第一種類型的樣本輻射El)以便確定成像設(shè)備1相對于樣本S的至少 一個焦點(diǎn)對準(zhǔn)位置?？刂破?可以適于控制成像設(shè)備1獲得所述焦點(diǎn)對準(zhǔn)位置以便執(zhí)行至 少一個后續(xù)的成像步驟。在操作期間，上述系統(tǒng)可以用在用于對樣本成像的方法中，該方法至少包括前述 利用第一標(biāo)記物材料以及利用第二標(biāo)記物材料對樣本染色。然后，如圖1中所示，在聚焦步 驟中使用第一標(biāo)記物材料(存在于樣本中，例如以便標(biāo)記特定的樣本部分M)以便相對于樣 本S(或者樣本部分)將成像設(shè)備1聚焦到焦點(diǎn)對準(zhǔn)位置。為此目的，使用適當(dāng)?shù)牡谝环N類 型的輻射Ll照射樣本S，得到從樣本S發(fā)出的第一種類型的樣本輻射El，所述樣本輻射El 由檢測器4檢測。所述照射可以是連續(xù)的樣本照射、半連續(xù)照射、脈沖式照射，或者有所區(qū) 別地，使用導(dǎo)致足夠的樣本輻射El以便對其檢測的適當(dāng)輻射劑量。此外，設(shè)備1可以被配 置成例如在檢測器4檢測到不充分的或者過量的樣本輻射El的情況下在聚焦步驟期間調(diào) 節(jié)輻射劑量。所述聚焦步驟可以涉及獲得以及存儲要在一個或多個(后續(xù)的)成像步驟中使用 的所得到的設(shè)備聚焦信息。此外，所述聚焦步驟可以涉及調(diào)節(jié)樣本S相對于透鏡單元3的位置(在Z方向上) 以便確定哪個/哪些位置是相對于一個/多個樣本部分M的焦點(diǎn)對準(zhǔn)位置。在另一個實(shí)施例中，也可以在一個或多個與Z方向正交的方向上相對于透鏡單元 3掃描樣本S，例如以便將聚焦束引導(dǎo)到不同的(隔開的)樣本部分M?？梢詧?zhí)行一個或多 個聚焦步驟，例如以便獲得有關(guān)樣本S的若干部分M的設(shè)備焦點(diǎn)對準(zhǔn)信息。在聚焦步驟期間，可以使用不使第二標(biāo)記物材料退化的第一種類型的輻射Ll (在 當(dāng)前實(shí)施例中由第一源8a提供)照射樣本S以便檢測第一標(biāo)記物材料。例如，在第一標(biāo)記 物材料為曙紅Y且第二標(biāo)記物材料為大埤的情況下，第一種類型的輻射Ll優(yōu)選地在大埤的 吸收峰值(大約360nm)附近沒有頻譜部分。在這種情況下，第一種類型的輻射Ll被配置成例如通過在525nm處包含頻譜部分(導(dǎo)致曙紅Y標(biāo)記物的逐漸退化)來激發(fā)曙紅Y (例如使用單光子激發(fā))。 接著(在已經(jīng)獲得了希望的焦點(diǎn)對準(zhǔn)信息之后)，可以相對于樣本S聚焦成像設(shè)備 1，至少使其達(dá)到至少一個提到的焦點(diǎn)對準(zhǔn)位置，參見圖2。然后，在一個或多個成像步驟中 使用第二標(biāo)記物材料(存在于樣本中)，其中成像設(shè)備1獲取樣本(或者樣本部分M)的至 少一幅圖像。為此目的，使用第二種類型的輻射L2照射樣本S以便檢測第二標(biāo)記物材料。 圖3示出了在熒光成像的情況下在成像步驟期間得到的圖像的實(shí)例。特別地，圖3示出了 具有多個由適當(dāng)熒光團(tuán)(明亮)標(biāo)記的細(xì)胞的樣本切片(section)的熒光圖像。此外，在成像步驟期間，所述照射可以是連續(xù)的樣本照射，但是優(yōu)選地為半連續(xù)或 者脈沖式照射，其使用提供足夠的樣本輻射E2以便對其檢測的適當(dāng)輻射劑量。在成像步驟期間，可以利用第二輻射L2 (在當(dāng)前實(shí)施例中由第二源8b提供)照射 樣本S，得到從樣本發(fā)出的由檢測器4檢測的第二種類型的樣本輻射E2。優(yōu)選地，在成像步驟期間，控制且固定每次曝光時間。優(yōu)選地，成像步驟期間使用 的每次照射輻射劑量(例如以拉德(Rad)(輻射吸收劑量)測量)對于要獲取的每幅圖像 是恒定的(相等的)(即相同劑量的第二輻射L2用來獲取大量圖像中的每幅圖像)。此外， 通過用支持待成像的后續(xù)樣本的新保持器代替成像的樣本S的樣本保持器H，設(shè)備1可以用 來例如以序列的方式對若干(不同的)樣本S成像。在這種情況下，優(yōu)選地，在樣本的對應(yīng) 成像步驟期間將相同輻射劑量的第二種類型的輻射L2施加到每一個樣本。例如，在第一標(biāo)記物材料為曙紅Y并且第二標(biāo)記物材料為大埤的情況下，第二種 類型的輻射L2被配置成例如通過在360nm處包含頻譜部分(隱含地導(dǎo)致大埤標(biāo)記物的逐 漸退化)來激發(fā)大埤。優(yōu)選地，成像步驟涉及對于待拍攝的每幅圖像，在相對較短的預(yù)定(優(yōu)選地固定) 時間段(例如大約10秒或更少，特別地1秒或更少的時段)期間(例如在一秒的小部分期 間)利用第二輻射類型L2照射樣本S。優(yōu)選地，在操作期間，成像設(shè)備1采用第一和第二標(biāo)記物材料自動地實(shí)現(xiàn)自聚焦 到樣本S上以及對樣本的成像。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解的是，可以由控制器6控制設(shè)備 自聚焦過程，包括圖像數(shù)據(jù)處理以獲得希望的焦點(diǎn)對準(zhǔn)位置(介于樣本S或樣本部分與成 像設(shè)備之間)、調(diào)節(jié)樣本S相對于透鏡單元3的位置(通過致動器7)、輻射源操作的激活/ 失活以及其他設(shè)備功能。在另一個實(shí)施例中，所述方法可以包括作為聚焦步驟的一部分，確定例如與不同 樣本部分M有關(guān)的多個(例如序列的)焦點(diǎn)對準(zhǔn)位置，得到包含那些焦點(diǎn)對準(zhǔn)位置的焦點(diǎn) 對準(zhǔn)信息。然后，該得到的焦點(diǎn)對準(zhǔn)信息可以用在成像序列中，該成像序列涉及相對于樣本 S (或者樣本部分M)將成像設(shè)備1聚焦到每個焦點(diǎn)對準(zhǔn)位置并且在對應(yīng)焦點(diǎn)對準(zhǔn)位置處獲 得樣本S(或者樣本部分M)的圖像?？商鎿Q地，隨后在對于下一個樣本部分應(yīng)用聚焦步驟 和對應(yīng)的成像步驟之前，可以通過對于待成像的一個樣本部分使用對應(yīng)的聚焦步驟和對應(yīng) 的成像步驟，來對不同的樣本部分M成像。例如，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解的是，在一個實(shí)施例中，由當(dāng)前方法獲得的樣本圖 像可以用來提供最終的DNA細(xì)胞計量直方圖。由上可知，在本發(fā)明的各個實(shí)施例中，不同的技術(shù)用于聚焦樣本S，優(yōu)選地使用不漂白熒光團(tuán)(即標(biāo)記物)的光源8a，并且連續(xù)地使樣本S暴露于激發(fā)光固定且受控的時隙， 所述時隙優(yōu)選地足夠收集熒光圖片。實(shí)施例可以應(yīng)用兩種成像模式在聚焦模式下，使用不影響待測量的熒光團(tuán)而是 用來使組織樣本S達(dá)到正確的聚焦位置的光，以及在成像模式二中，在短暫的時刻，對于 DNA細(xì)胞計量測量打開影響熒光團(tuán)的光并且之后立即關(guān)閉該光。優(yōu)選地，控制和固定曝光時 間，使得在可以利用成像結(jié)果獲得的最終的DNA細(xì)胞計量直方圖中，殘余光致漂白對于所 有曝光的樣本部分(例如細(xì)胞)都是相同的，并且它因而不會影響測量變異系數(shù)(CV)。此 夕卜，用于DNA細(xì)胞計量測量的熒光團(tuán)的曝光時間可以最小化為拍攝圖片所需的時間(即大 約為數(shù)秒或者更少)，光致漂白強(qiáng)烈地降低。
在另一個實(shí)施例中，不同ζ位置(即沿著Z方向的不同位置)處的多幅樣本圖像 可以由成像設(shè)備1拍攝。然后，得到的圖像可以用于聚焦步驟或模式中以便找出在哪幅圖 像中哪個細(xì)胞在焦點(diǎn)上，并且然后在成像步驟或模式中將該ζ位置的圖像用于DNA細(xì)胞計 量測量。通過這種方式，可以獲得良好的DNA細(xì)胞計量測量，其中每個細(xì)胞可以在焦點(diǎn)上， 接收相同的曝光量(輻射劑量)，以便正確地定量測量來自細(xì)胞核的熒光量。這與多光子激 發(fā)(參見下文)相結(jié)合是特別有利的。由上可知，一種選項(xiàng)是通過利用兩種不同的染料對樣本S染色而在兩種模式下使 用熒光成像一種染料用于聚焦模式，并且另一種染料用于實(shí)際的DNA細(xì)胞計量方法(例如 大埤)，從而用于該成像模式的染料在與聚焦模式下的染料截然不同的波長處受激發(fā)。因 此，通過在聚焦模式下而不是在成像模式下首先應(yīng)用激發(fā)熒光團(tuán)的波長，可以使樣本S在 焦點(diǎn)上。第一標(biāo)記物(熒光團(tuán))在聚焦模式下漂白不成問題，因?yàn)樗挥糜诙繙y量。一 旦焦點(diǎn)對準(zhǔn)，具有另一波長的輻射L2可以用來激發(fā)第二標(biāo)記物熒光團(tuán)，以便進(jìn)行DNA細(xì)胞 計量測量。另一個實(shí)施例包括應(yīng)用掃描共聚焦顯微術(shù)。除了上面的實(shí)施例之外，所述聚焦步 驟可以包括掃描并且使一個或多個感興趣細(xì)胞在焦點(diǎn)上。然后，在成像步驟期間，對于DNA 細(xì)胞計量方法可以再次掃描感興趣細(xì)胞M，在這種情況下，共聚焦照射僅在掃描希望的細(xì)胞 期間激活，并且在所述設(shè)備在感興趣細(xì)胞M之外掃描時不是激活的。通過這種方式，在掃描 期間，仍然必須測量的其他細(xì)胞在成像步驟中不被照射并且因而還沒有遭受漂白。本發(fā)明的實(shí)施例可以允許實(shí)現(xiàn)快速的基于DNA細(xì)胞計量術(shù)的癌癥檢測(數(shù)分鐘而 不是常規(guī)福爾根染色DNA細(xì)胞計量方法中的數(shù)小時)。應(yīng)用領(lǐng)域現(xiàn)在例如為癌組織切除期 間用于癌癥邊界檢測的手術(shù)支撐工具。盡管已經(jīng)參照附圖更詳細(xì)地描述了本發(fā)明的說明性實(shí)施例，但是應(yīng)當(dāng)理解的是， 本發(fā)明并不限于這些實(shí)施例。本領(lǐng)域技術(shù)人員在不脫離如權(quán)利要求書中所限定的本發(fā)明的 范圍或精神的情況下可以實(shí)現(xiàn)各種變化或修改。應(yīng)當(dāng)理解的是，在本申請中，措詞“包括/包含”并沒有排除其他的元件或步驟。此 夕卜，措詞“一”和“一個”中的每一個并沒有排除復(fù)數(shù)。權(quán)利要求書中的任何附圖標(biāo)記都不 應(yīng)當(dāng)被視為對權(quán)利要求書的范圍的限制。例如，在本申請中，聚焦步驟和成像步驟之一或二者可以包括熒光標(biāo)記物材料的 單光子激發(fā)(參見上文)。在這種情況下，照射輻射的單光子吸收提供了激發(fā)對應(yīng)熒光材料 的能量。
可替換地，聚焦步驟和成像步驟之一或二者可以包括同樣地從現(xiàn)有技術(shù)(參見例如US7170675)獲悉的熒光標(biāo)記物材料的多光子激發(fā)，例如2光子激發(fā)。在這種情況下，多 (例如2)光子的吸收提供激發(fā)熒光材料的等效于單光子激發(fā)的能量。標(biāo)記物材料的這種 類型的激發(fā)的應(yīng)用在不同Z位置(沿著Z方向)處拍攝多幅樣本圖像的情況下是特別有利 的。特別地，標(biāo)記物材料的多光子(2光子)激發(fā)通常需要相對較高的光子密度，所述高密 度可以在成像設(shè)備1的瞬時焦點(diǎn)對準(zhǔn)位置(例如使用高功率激發(fā)激光源)獲得。瞬時離焦 位置(即不同于焦點(diǎn)對準(zhǔn)Z位置的瞬時Z位置)將接收較低的光子密度，所述較低的密度 不會導(dǎo)致(對應(yīng)瞬時離焦位置處)對應(yīng)標(biāo)記物材料的激發(fā)(或者相當(dāng)程度地降低該激發(fā)的 機(jī)會)。因此，在不同Z位置處拍攝多幅樣本圖像的情況下，聚焦步驟和成像步驟優(yōu)選地包 括(對應(yīng)第一和第二熒光標(biāo)記物材料的)多光子激發(fā)。此外，在本申請中，輻射可以涉及光子輻射、粒子束輻射或者不同類型的輻射。此 夕卜，例如，熒光標(biāo)記物可以被配置成附接到特定的分子。這些標(biāo)記物可以表征為，它們非常 特別地將自身附接到例如特定類型的抗體，而不將自身附接到其他類型的抗體和其他分 子。此外，這些標(biāo)記物可以表征為，響應(yīng)于例如光子的激發(fā)，它們發(fā)射熒光輻射E1、E2。例 如，標(biāo)記物可以是有機(jī)或無機(jī)標(biāo)記物。有機(jī)標(biāo)記物通常包括芳環(huán)。實(shí)例是FITC(異硫氰酸 熒光素)、TRITC(異硫氰酸四甲基若丹明)和大埤。許多類型的有機(jī)標(biāo)記物可商業(yè)上獲得， 每種類型具有其自身的附接特性。這樣的有機(jī)標(biāo)記物目前由例如美國俄勒R州尤金市的分 子探針公司出售。
權(quán)利要求
一種用于對樣本成像的方法，至少包括-利用第一標(biāo)記物材料以及利用第二標(biāo)記物材料對樣本染色；-在用于相對于樣本聚焦成像設(shè)備的聚焦步驟中采用第一標(biāo)記物材料；以及-在成像步驟中采用第二標(biāo)記物材料以及已經(jīng)在聚焦步驟中聚焦的成像設(shè)備，以便獲取樣本的圖像。
2.依照權(quán)利要求1的方法，其中第二標(biāo)記物材料的光學(xué)特性不同于第一標(biāo)記物材料的 光學(xué)特性。
3.依照權(quán)利要求1或2的方法，其中在聚焦步驟中使用不使第二標(biāo)記物材料退化的第 一種類型的輻射照射樣本以便檢測第一標(biāo)記物材料，其中在成像步驟中使用使第二標(biāo)記物 材料退化的第二種類型的輻射照射樣本以便檢測第二標(biāo)記物材料。
4.依照前面的權(quán)利要求中任何一項(xiàng)的方法，其中至少所述第二標(biāo)記物材料為熒光標(biāo)記 物材料。
5.依照權(quán)利要求4的方法，其中所述第一標(biāo)記物材料和第二標(biāo)記物材料為具有不同熒 光特性的熒光標(biāo)記物。
6.依照前面的權(quán)利要求中任何一項(xiàng)的方法，其中第一標(biāo)記物材料的主輻射吸收峰值 的波長位于第二標(biāo)記物材料的主輻射吸收峰值的波長的至少50nm以上或以下，特別地在 IOOnm以上或以下，更特別地在150nm以上或以下。
7.依照前面的權(quán)利要求中任何一項(xiàng)的方法，其中所述第一標(biāo)記物材料和第二標(biāo)記物材 料被設(shè)計成對相同的樣本成分或樣本結(jié)構(gòu)加標(biāo)簽，所述樣本成分或樣本結(jié)構(gòu)例如以下項(xiàng)中 的一個或多個分子、核酸、DNA、RNA、抗體、細(xì)胞、膜、細(xì)胞部分、蛋白質(zhì)、組織以及生物材料。
8.依照前面的權(quán)利要求中任何一項(xiàng)的方法，其中所述聚焦步驟和成像步驟涉及利用適 當(dāng)?shù)妮椛湔丈錁颖?，以及使用成像設(shè)備的輻射檢測器檢測從該樣本發(fā)出的所得到的樣本輻 射。
9.依照前面的權(quán)利要求中任何一項(xiàng)的方法，其中成像設(shè)備采用所述第一和第二標(biāo)記物 材料自動地實(shí)現(xiàn)自聚焦到樣本上以及對樣本的成像。
10.依照前面的權(quán)利要求中任何一項(xiàng)的方法，其中第一標(biāo)記物材料的主輻射吸收峰值 的波長高于第二標(biāo)記物材料的主輻射吸收峰值的波長。
11.一種樣本成像系統(tǒng)，該系統(tǒng)包括被配置成對樣本成像的成像設(shè)備以及被配置成將 成像設(shè)備聚焦到待成像的樣本上的聚焦單元，該系統(tǒng)包括被配置成控制該系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)依照前 面的權(quán)利要求中任何一項(xiàng)的方法的聚焦和成像步驟的控制器。
12.依照權(quán)利要求11的系統(tǒng)，其中聚焦單元與成像設(shè)備集成在一起。
13.依照權(quán)利要求11或12的系統(tǒng)，包括第一輻射源和第二輻射源，所述第一輻射源被 配置成提供不使第二標(biāo)記物材料退化的第一種類型的照射輻射，所述第二輻射源被配置成 提供使第二標(biāo)記物材料退化的第二種類型的照射輻射。
14.依照權(quán)利要求11-13中任何一項(xiàng)的系統(tǒng)，所述成像設(shè)備包括輻射檢測器，該輻射檢 測器被設(shè)置成檢測與第一標(biāo)記物材料有關(guān)的從樣本發(fā)出的第一種類型的樣本輻射并且被 設(shè)置成檢測與第二標(biāo)記物材料有關(guān)的第二種類型的樣本輻射。
15.依照權(quán)利要求11-14中任何一項(xiàng)的系統(tǒng)，其中所述控制器被配置成處理在聚焦步 驟中由成像設(shè)備獲得的成像數(shù)據(jù)以便確定成像設(shè)備相對于樣本的至少一個焦點(diǎn)對準(zhǔn)位置，其中該控 制器適于控制成像設(shè)備獲得所述焦點(diǎn)對準(zhǔn)位置以便執(zhí)行成像步驟。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種用于對樣本成像的方法，該方法至少包括利用第一標(biāo)記物材料以及利用第二標(biāo)記物材料對樣本染色；在相對于樣本聚焦成像設(shè)備的聚焦步驟中采用第一標(biāo)記物材料；以及在成像步驟中采用第二標(biāo)記物材料以及已經(jīng)在聚焦步驟中聚焦的成像設(shè)備，以便獲取樣本的圖像。本發(fā)明也涉及用于對樣本成像的系統(tǒng)。
文檔編號G02B21/00GK101821608SQ200880100713
公開日2010年9月1日 申請日期2008年7月23日 優(yōu)先權(quán)日2007年7月27日
發(fā)明者B·H·W·亨德里克斯, R·W·I·德博爾 申請人:皇家飛利浦電子股份有限公司