專利名稱：熒光顯微鏡的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及熒光顯微鏡。
具體地，本發(fā)明涉及一種熒光顯微鏡，其包含外殼，帶有被設(shè) 計成發(fā)出激發(fā)光的激發(fā)光源；濾光器件，將激發(fā)光與由熒光物質(zhì)生成 的熒光分開；物鏡；基片座；位置敏感光檢測器；和用于位置敏感光 檢測器的成像透鏡。
背景技術(shù)：
這種類型的熒光顯微鏡廣泛應(yīng)用在研究熒光樣本或樣品的熒光 研究中。如果需要，本身不發(fā)熒光的樣本可以配有熒光物質(zhì)。如果用 適當光(通常但不排他地是可見光或紫外光)照射這樣的樣本或樣品， 樣本中的熒光物質(zhì)將被波長比激發(fā)光長的熒光點亮。熒光的強度往往 很低，這意味著，幾乎在所有情況下，都可以借助于濾光片濾出激發(fā) 光。然后，原則上，弱熒光是唯一可見的圖像。
實際上，人們常常對微生物進行熒光研究。這通常牽涉到較高的 放大率，物鏡上最好大于50倍直到100倍，和總共大約1000倍，以 便能夠通過肉眼檢查。除此之外，使用的基片的典型尺寸是，例如， 直徑25毫米。這樣的尺寸常常是必需的，例如，在微生物樣本的情 況中，其中，應(yīng)該讓一定量的樣本液體經(jīng)過基片，以便獲得集中在基 片上的、隨后要研究的微生物顆粒。在該過程中，樣本液體經(jīng)過基片 中的細孔眼，顆粒保留在基片的表面上。
已知熒光顯微鏡的缺點是測量時間可以變得非常長。例如，在所 希望分辨能力小于1微米和基片具有25毫米的直徑，以及測量時間 為每個圖像幾秒的微生物研究的情況下，總測量時間達到多個小時甚 至一天也并不罕見。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供在保持分辨能力的同時使測量時間短得多 的熒光顯微鏡。
這個目的是通過根據(jù)本發(fā)明的熒光顯微鏡達到的，該熒光顯微鏡 包含含有基于晶片的過濾膜的基片，其中，過濾膜由適合光刻處理技 術(shù)的材料制成，過濾膜包含通過光刻引入的連續(xù)孔眼的圖案。
具體地，過濾膜是借助于晶片制造的。事實是可以使這樣的晶片 特別平坦，以便可以使呈現(xiàn)晶片表面形狀的過濾膜同樣格外平坦，尤
其是平坦到對于提供1微米或更小分辨能力(例如，0.5微米)的熒 光顯微鏡的設(shè)置，實質(zhì)上可以銳聚焦地成像整個基片表面。這意味著 在例如3毫米的直徑上，基片應(yīng)該平坦到0.5微米內(nèi)。
光刻技術(shù)一方面提供了提供這樣平坦基片的技術(shù)，另一方面使得 可能將非常多、輪廓分明的孔眼引入基片中。可以想到，對于例如， O.l-l微米的孔眼尺寸，孑L隙率是5-20。/。，甚至高達40%。其結(jié)果 是，正如下文更詳細說明的那樣，可以有利地使基片小得多。此外， 與這種類型的基片(孔眼尺寸小于0.19微米)有關(guān)的濾液將是無菌的。
由硅制成的這種類型的過濾膜由fluXXion提供。來自fluXXion 的硅過濾膜具有非常薄的附加優(yōu)點，并且，由于輪廓分明的大量孔眼， 還具有非常高的透過率。其結(jié)果是，可以提供在仍然具有相同總透過 率的同時，具有明顯比迄今為止習(xí)慣使用的基片小的尺度的基片。例 如，可以用具有具體地說小于10毫米(例如，3毫米)的直徑的桂過 濾膜取代具有25毫米的直徑的現(xiàn)有技術(shù)基片。這意味著處在樣本液 體中的待研究材料以比針對現(xiàn)有技術(shù)基片高得多的濃度經(jīng)過過濾膜。 實際上，這也意味著需要研究小得多的區(qū)域。例如，要研究的區(qū)域從 25毫米直徑的面積減小到3毫米直徑的面積意味著節(jié)省了大約50倍 的時間。
就此而言，基片，即，過濾膜無需由硅制成，而是如上所述，可 以由適合光刻技術(shù)的材料制成。具體地說，基片實質(zhì)上由硅、硅化合物、藍寶石、硅酸鹽玻璃或它們的組合組成。這樣的材料具有確鑿的 對這些技術(shù)適應(yīng)性、良好的機械特性、良好的耐化學(xué)性、和低的固有
熒光性?？上氲浇M合材料包括例如所謂的SoS，即藍寶石上外延硅。
更具體地說，基片實質(zhì)上包含硅。這種元素極其適合光刻處理， 并且已經(jīng)開發(fā)出最佳的相關(guān)技術(shù)。
具體地說，基片的表面可以摻雜一種或多種元素，以便提高一種 或多種特性，尤其是硬度或耐化學(xué)性。基片具有滲氮或滲碳表面是有 利的。使硅基片局部地滲氮或滲碳分別產(chǎn)生非常硬和耐用氮化硅或碳 化硅層，從而進一步提高了機械特性。
在有利實施例中，基片實質(zhì)上包含碳化硅或二氧化硅。取代僅僅 使表面滲碳，整個基片也可以實質(zhì)上由碳化硅制成， 一種替代物是石 英(二氧化硅)。
在現(xiàn)有技術(shù)焚光顯微鏡中經(jīng)常發(fā)生的另一個問題是基片可能發(fā) 熒光。這意味著在熒光測量結(jié)果中存在背景信號或噪聲。這種背景信 號可以干擾待研究材料的真實測量結(jié)果。因此，最好提供不發(fā)熒光或 只在低水平上發(fā)熒光的基片。這個目的是通過實質(zhì)上包含上述材料的 基片達到的。
在基片表面的至少 一側(cè)上涂敷金屬層是有利的。這樣的措施保證 了基片更加低的固有熒光性。這提供了通過光刻在根據(jù)本發(fā)明的基片 上精確地生成孔眼的優(yōu)點。在這樣做的時候，常常使用其殘留物可以 引發(fā)熒光的化學(xué)制品。這些殘留物現(xiàn)在與"真正，，基片一起被薄金屬層 屏蔽。這樣金屬層的一個例子是汽相沉積鉻層，但也可以是其它金屬。
另一重要點涉及基片上的銳聚焦。畢竟，由于基片無需處在顯微 鏡的銳聚焦面上，因此即使使用完全平坦的基片，仍然有必要依次使 基片的每個新研究部分變成銳聚焦。事實上，可以為每個位置確定與 銳聚焦面有關(guān)的高度。但是，對于完全或至少足夠平坦的基片，對銳 聚焦點進行3點測量就足夠了，從而確定與顯微鏡銳聚焦面有關(guān)的基 片位置。然后，可以使基片傾斜，以便的確處在顯微鏡的銳聚焦面上。 接著， 一個可替代選項是為所希望銳聚焦校正的每個位置進行簡單計算，然后，如果需要，可以自動進行該計算。隨著基片移動，接著可 以自動控制銳聚焦。在這個實施例中，平坦的基片也節(jié)省了大量聚焦 時間。
在一個有利的實施例中，熒光顯微鏡包含聚焦照射系統(tǒng)，該聚焦 照射系統(tǒng)具有被設(shè)計成發(fā)出聚焦光的聚焦光源，其中，聚焦光的光路 和熒光的光路同軸地經(jīng)由物鏡通向基片。因此，在使用熒光顯微鏡期 間，這牽涉到在聚焦操作期間使光照射在基片上。聚焦光從基片到檢 測器的光路部分與熒光的光路部分相同。換句話說，可以利用聚焦光 和熒光兩者產(chǎn)生基片的圖像。這提供了將熒光圖像與基片的普通光學(xué) 圖像、以及樣本或樣品一起相關(guān)聯(lián)的選項。這對于解釋熒光圖像和例
如剝離它們的假像(artefact)是有益的。
在這樣的布置中，聚焦光原則上可以包含普通可見光。如果需要， 聚焦光只包含一部分可見光謙。有利地，聚焦光實質(zhì)上包含激發(fā)光之 外的波長區(qū)中的光，畢竟，該光將被直接將激發(fā)光引向基片的鏡等反 射掉。例如，聚焦光實質(zhì)上包含波長接近或等于熒光波長的光，或甚 至實質(zhì)上包含熒光。
熒光顯微鏡最好進一步包含部分透過聚焦光的鏡，該鏡以將來自 基片的光引向光檢測器的方式放置在聚焦光的光路中。這提供了經(jīng)由 物鏡提供聚焦光的選項。換句話說，聚焦光經(jīng)由與應(yīng)用于收集用于形 成聚焦圖像的反射聚焦光的光學(xué)部件相同的光學(xué)部件被照射到基片 上。這里，重要的是基片完全平坦，最好是像例如硅晶體過濾膜那 樣的鏡。此外，這樣還具有在觀看樣本或樣品的時候，只用聚焦光照 射在那個瞬間觀看的部分的優(yōu)點。這對于樣品或樣本的常常迅速光誘 發(fā)褪色或類似引起的熒光物質(zhì)的擊穿是有益的。另一個優(yōu)點是在與發(fā) 出熒光的一側(cè)相同的那一側(cè)上供應(yīng)聚焦光。此外，透明基片是另一個 選項。但是，這對于晶片過濾膜不是非常有效，因為，事實上，這經(jīng) 由連續(xù)孔眼形成了具有非常小數(shù)值孔徑、由此非常大焦深的光學(xué)元 件。這又意味著從下面對聚焦光進行銳聚焦變得困難，就成像光學(xué)部 件和相機而言，"銳度，，與樣品或樣本的聚焦有關(guān)。畢竟，這些光學(xué)部件具有比過濾膜中的連續(xù)孔眼的有效數(shù)值孔徑小得多的數(shù)值孔徑。
但是，應(yīng)該注意到，聚焦光也可以經(jīng)由一些其它光路供應(yīng)，例如， 通過比如全部圍繞物鏡供應(yīng)聚焦光的聚焦光源傾斜地入射到基片上。 在這個實施例中，本發(fā)明也提供了一些優(yōu)點，因為對于所選的光學(xué)設(shè) 置，工作距離一般大于現(xiàn)有技術(shù)熒光顯微鏡中的工作距離，并且肯定 大于浸潤式光學(xué)顯微鏡。下面將更詳細說明這些點。
當將應(yīng)用像素的相機用作位置敏感檢測器時，所謂的像素分辨率 最好至少與熒光顯微鏡的光學(xué)分辨率一樣好，以便保留通過相機檢測 的光學(xué)圖像當中的盡可能多信息。像素分辨率簡單地是像素尺寸除以
放大倍數(shù)，最好在1/3x光學(xué)分辨率與lx光學(xué)分辨率之間，即，像素 分辨率最好至少與光學(xué)分辨率(信息保持力) 一樣好，但最好至多好 3倍，即，1/3x光學(xué)分辨率。畢竟，即使"更好，，的像素分辨率也只能 產(chǎn)生更高有效分辨率的假象，因為實際上在提供的光學(xué)圖像中不存在 那種信息。
光學(xué)分辨率(即，不大于所需的)，;較小的放大率可能就足夠了。
這帶來了可以減少所要求的像素數(shù)量或至少測量的像場與像素數(shù)量 之間的關(guān)系合適的主要優(yōu)點。所述像素數(shù)量不僅決定相機的價格和復(fù) 雜性，而且，最重要的是，決定讀出速度?？商娲?，可以只使用預(yù) 設(shè)為記錄圖像的CCD (電荷耦合器件)的有限個像素，不超過取得所 希望分辨率所需的像素。在這兩種情況中，少的像素數(shù)量意味著高的 讀出速度，因此實現(xiàn)更迅速的測量。
舉例來說，所希望分辨率是0.5微米，使用波長為530納米的綠 光。然后，相應(yīng)數(shù)值孔徑為至少0.40。對于5微米的像素尺寸和0.5x 光學(xué)分辨率，即，0.25微米的所希望像素分辨率，這導(dǎo)致了總共20 倍(x)的相機放大倍數(shù)。在實際中，接著的可行選項是選擇，例如， f - 10毫米的物鏡和f = 200毫米的成像透鏡。這些數(shù)值是使顯微鏡的 結(jié)構(gòu)變得緊湊，同時使工作距離仍然是大約2厘米的焦距。顯然，與 其它熒光波長、像素尺寸、像素分辨率與光學(xué)分辨率之比(最好在1:1與1:3之間)、物鏡和成像透鏡的焦距一樣，其它所希望分辨率也是 可以的，顯然，可選地，成像透鏡是復(fù)合透鏡系統(tǒng)。
在上述方式下，可以保證物鏡的強度或放大倍數(shù)可以降低，而總 放大率與小像素尺寸結(jié)合仍然足以取得所希望的分辨能力。另外的優(yōu) 點是物鏡的數(shù)值孔徑(NA)無需保持特別大，這意味著大放大率的 浸潤是沒有必要的。
事實上，當使用相機取代肉眼時，根據(jù)所希望分辨率確定顯微鏡 要求的NA的估計值，然后根據(jù)像素尺寸和所希望像素分辨率確定所 要求的放大倍數(shù)。
具有相對小NA (有利的是0.45和更小)的透鏡的主要優(yōu)點是焦 深相對較大。這又意味著不要求或至少不經(jīng)常要求更新基片的銳聚 焦，甚至可以在不調(diào)整顯微鏡的情況下仍然完整測量相對較厚的基 片。
這提供了一些優(yōu)點，尤其當與非常平坦的晶片過濾膜結(jié)合時，因 為現(xiàn)在可以利用單次銳聚焦操作實現(xiàn)完整測量基片。事實上，晶片過
濾膜形成二維基片，允許銳聚焦在基片表面上的薄膜中的小孔上，同 時使樣品或樣本直接位于那個表面上。
浸潤在例如水或油中總是帶來各自浸潤液體的蒸發(fā)，這常常不是 所希望的。此外，可能以與不同樣品發(fā)生交叉污染的形式發(fā)生污染， 這是更嚴重的缺點。這不僅可以由例如混入微生物或其它材料的浸潤 液體的蒸發(fā)引起，而且可以由上述材料經(jīng)由浸潤液體從一個樣品轉(zhuǎn)移
到另一個樣品引起。給定物鏡的小的放大倍數(shù)，本發(fā)明提供了設(shè)置大 工作距離因此防止污染的簡單方式。
有利的是，部分透射鏡包含一個鏡或所謂的圓點分束器，聚焦光 的反射系數(shù)與透射系數(shù)之比至少是IO (有利的是，至少是IOO)。最 好，熒光的反射系數(shù)與透射系數(shù)之比至少是100。在聚焦光同軸入射
的情況下，存在光學(xué)元件，其首先部分透射聚焦光，然后將它部分反 射到檢測器，或如果交換檢測器和聚焦光源的位置，則反過來操作。 本發(fā)明進一步涉及利用根據(jù)前面權(quán)利要求的任何一項所述的熒光相機檢測基片上的樣品的熒光的方法，該方法包含用激發(fā)光照射 基片上的樣品，和檢測來自樣品的熒光。通過使用根據(jù)本發(fā)明的熒光 顯微鏡，尤其是硅晶片基片，可以在熒光測量中顯著節(jié)省時間。此夕卜， 沒有或幾乎沒有由基片引起的熒光。
具體地說，只有當使樣品聚焦時，聚焦光源才實質(zhì)上發(fā)出聚焦光。 其結(jié)果是，基片上的樣品或樣本褪色較少。借助于最好與激發(fā)輻射同 軸的聚焦光的照射，可以交替選擇在必要時產(chǎn)生可見光圖像的聚焦光 圖像、和熒光圖像，這些圖像之間的關(guān)聯(lián)可以容易地取得。在如果要 求通過更新銳聚焦重新定位基片的情況下，可以在短(聚焦)時間內(nèi) 簡單地開關(guān)聚焦光源。
而且，聚焦光源發(fā)出非常少的光，或至少非常少的光到達樣品或 樣本。聚焦光原則上局限到允許銳聚焦所需的亮級，因此使樣品或樣 本上的褪色或其它不利效應(yīng)達到最小化。顯然，如果樣品不受此影響， 所述光亮級可以較高，因此使銳聚焦更迅速和/或更準確。
在特定實施例中，從基片上的樣品的許多分區(qū)的每一個中檢測熒 光，然后根據(jù)在分區(qū)中檢測的熒光確定相關(guān)圖像信息，分區(qū)是從樣品 中隨機選擇的，如果當前測量的來自所有分區(qū)的相關(guān)圖像信息總體上 超過預(yù)定置信水平閾值，則中斷熒光的測量。因此，可以更進一步縮 短測量時間。然后，應(yīng)該事先選擇指示在哪一點上特定樣品或樣本被 測量到足夠置信水平的閾值。簡單的例子是要求存在要證實的特定微 生物。此處，畢竟，檢測到那種微生物的一個或許多個個體就足夠了。 顯然，選擇(正當)標準值作為闊值也是可以的，這足以確定是否超 過標準等。以這種方式把超過閾值的檢測包含進來可以通過例如最好
是自動模式識別裝備來實現(xiàn)。
本發(fā)明還提供了用在根據(jù)本發(fā)明的熒光顯微鏡中的基片，它包含 由適合光刻處理技術(shù)的材料制成的基于晶片過濾膜，其中，過濾膜包 含通過光刻引入的連續(xù)孔眼的圖案，在基片表面的至少一側(cè)上涂敷金 屬層。由于金屬層，可以有效地抑制基片材料的殘余固有熒光。就基 片的基本材料和金屬層中金屬的類型而論，可以使用上文已經(jīng)描述過的材料。
本發(fā)明還提供了制造根據(jù)本發(fā)明的基片的方法，它包含如下步
驟提供基于晶片過濾膜，通過光刻技術(shù)提供帶有孔眼的過濾膜，然 后在過濾膜的至少一側(cè)上涂敷金屬層。如上文所述，孔眼可以具有， 例如，0.1到l微米之間的直徑，但不排除其它直徑或形狀。應(yīng)該注 意到，首先汽相沉積金屬層，此后引入孔眼也是可以的，這樣就具有 在孔眼內(nèi)部沒有金屬的優(yōu)點。但是，在那種情況下，金屬可能千擾光 刻步驟，而且可能保留殘余光刻化學(xué)制品，這帶來了殘余熒光的風(fēng)險。 此外，根據(jù)本發(fā)明的熒光顯微鏡、方法和基片使熒光測量加速。 此外，所述加速來源于晶片過濾膜的使用，所述晶片過濾膜是通過與 已知基片相比在小得多、因此可以更迅速測試的表面區(qū)上提供同等有 效的過濾器導(dǎo)致加速的。此外，平坦的過濾器不需要反復(fù)銳聚焦。三 點測量就足夠了，所需的任何隨后控制都能夠自動實現(xiàn)。而且，使用 了提供比肉眼更好的分辨能力的相機，因此允許使用的透鏡的數(shù)值孔 徑較小。這意味著使用較便宜的透鏡，以及在許多情況下，再也沒有 必要浸潤。除此之外，至少，如果就所希望光學(xué)分辨能力而言，相機 的像素不太大，較小的放大倍數(shù)就足夠了，從而允許應(yīng)用較長的焦距， 導(dǎo)致較大的工作距離。這又有利于防止浸潤引起的污染。另外， 一旦 觀察的統(tǒng)計結(jié)果給出這樣做的原因，就停止測量是有益的?？傊?據(jù)本發(fā)明的熒光顯微鏡、方法和基片可以用于非常迅速地、可靠地、 和以非接觸方式測量熒光。


下面參照

本發(fā)明，附圖的單個圖形是根據(jù)本發(fā)明的熒光 顯微鏡的橫截面的示意性描述。
圖1用橫截面示出了根據(jù)本發(fā)明的熒光顯微鏡。
具體實施例方式
熒光顯微鏡一般用標號1表示，它包含帶有安裝在上面的相機12的外殼10。配備在外殼10中的是激發(fā)光源14，以及第一透鏡16、 激發(fā)濾光片18和分色鏡20。
在圖1中配備在外殼10底部的是物鏡22，經(jīng)由物鏡22可以照 射基片24?；?4容納在基片座26中，而28指示x-y-z基片平移臺。
標號30指示局部透射鏡或分束器，32指示發(fā)射濾光片，34指示 成像透鏡。
指示在外殼10頂部的是聚焦光源36和聚焦透鏡38。
根據(jù)本發(fā)明的熒光顯微鏡1的外殼10是實質(zhì)上不透光外殼。外 殼10原則上可以由像金屬和/或塑料那樣的任何材料制成。排列在外 殼10中的是大量光學(xué)和其它部件。
激發(fā)光源14處在外殼10中，提供激發(fā)光。激發(fā)光源原則上可以 包含適合這種用途的任何光源，例如一個或多個LED (發(fā)光二極管)、 (高壓)水銀燈、激光器等。激發(fā)光源14的激發(fā)光的波長作為要研 究的熒光材料的函數(shù)來選擇，但一般說來，是波長相對較短的光。常 用波長處在綠光到(且包括)近紫外光的區(qū)域中，但不排除其它波長。 在這種情況下，例如，激發(fā)光源14是藍色LED光源。
激發(fā)光源14發(fā)出的光經(jīng)過第一透鏡16，第一透鏡16被設(shè)計成 形成例如均勻性足夠高的適當激發(fā)光束。該光束還經(jīng)過設(shè)計成濾出不 想要部分光的激發(fā)濾光片18。具體地，這涉及到激發(fā)光當中與熒光相 對應(yīng)的部分光。激發(fā)光中這樣的小部分畢竟可能干擾隨后的熒光測 量。必要時，還可以設(shè)置激發(fā)濾光片18以去除一部分幅度大于或小 于激發(fā)光或熒光的光。因此，盡量防止來源于與熒光測量無關(guān)的光的 可能噪聲。視使用什么類型的激發(fā)光和/或熒光而定，本領(lǐng)域的普通技 術(shù)人員可以容易地選擇適當濾光片。必要時，激發(fā)濾光片可以包含2 個或更多個分濾光片。
雖然在當前情況中，激發(fā)光源被顯示成在外殼10內(nèi)，但也可以 將激發(fā)光源安裝在外殼10的外部，必要時，在激發(fā)光源14與外殼10 之間提供不透光耦合一也參見下文討論的與相機12的耦合。
如此準直和濾光的激發(fā)光經(jīng)由分色鏡20以及經(jīng)由物鏡22朝基片24照射。分色鏡20被設(shè)計成例如反射盡可能多的激發(fā)光，而使得來 自基片24的熒光高透射率地經(jīng)過。如本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員所知， 通過適當堆疊介電層，可以容易地實現(xiàn)這一切。
物鏡22可以是例如標準顯微鏡物鏡，具有在例如10倍到45倍 之間的放大倍數(shù)。數(shù)值孔徑可以在例如0.2與0.5之間。工作距離可 以是例如幾毫米甚至可以直到幾厘米。應(yīng)該注意到，這個工作距離足 以允許基片24的非接觸測量。
基片24原則上可以是適合這種用途的任何基片，例如，玻璃片 等。對于微生物測量，具體地說，常常使用配有許多小孔眼的基片。 在測量之前，例如，使包含要研究的微生物等的樣本經(jīng)過基片，要研 究的材料保留下來，而液體可以從基片中的孔眼排出。用于這些測試 的典型基片包含例如聚合物基片。但是，有利的是，基片24包含例 如硅膜過濾器。例如，fluXXion銷售的這種類型的硅膜過濾器由硅制 成，所述硅不發(fā)熒光或只在非常低的水平上發(fā)熒光，其結(jié)果是，不會 干擾任何熒光測量。而且，這種類型的硅過濾膜是以如用在半導(dǎo)體技 術(shù)中的硅晶片為基礎(chǔ)制成的。因此，硅過濾膜也非常平坦，這意味著， 在與熒光顯微鏡的光軸垂直的布置中，完全可以不用調(diào)整地獲得清晰 圖像，即便在高放大率下。此外，由于限定在非常窄的有限空間內(nèi)的 大量孔眼，這種類型的硅過濾膜的另一個優(yōu)點是滲透率非常高。這意 味著過濾膜在過濾期間可以具有高度可選擇性，并且還意味著基片24 的尺度可以保持非常小，但仍然允許在實際習(xí)慣的時間長度內(nèi)過濾相 同數(shù)量的樣本液體。具有例如3毫米的橫截面的硅過濾膜足以滿足這 種用途，當然其它尺度也是可以的。
基片24容納在包含基片平移臺28 (只示出輪廓)的基片座26 中。基片平移臺28用于沿著位于熒光顯微鏡1的圖像平面內(nèi)的方向 (這里也稱為x和y方向)，和另外為了銳聚焦，沿著與上述方向垂 直的方向(這里也稱為z方向)平移基片24。另外，基片平移臺可以 設(shè)計成使基片24圍繞x和/或y軸，以使基片表面位于熒光顯微鏡1 的銳聚焦面內(nèi)的方式傾斜。由于高度平坦的硅過濾膜能夠通過三點測量在銳聚焦平面內(nèi)完全對準，這后一種特征是有利的。而且，基片如 此平坦，以及在根據(jù)本發(fā)明的熒光顯微鏡中焦深如此大，以致于在整
個x， y平移內(nèi)整個基片都保持在焦深內(nèi)。然后，可以簡單地將z值 i殳置成x和y的函數(shù)，例如，x和y的線性組合。
入射在攜帶待研究材料的基片24上的激發(fā)光源14的激發(fā)光將能 夠在那里引起熒光。如此生成的熒光又經(jīng)由物鏡22進入外殼10中， 在外殼10中該熒光實質(zhì)上經(jīng)過分色鏡20。然后，熒光落在部分透射 鏡30上，從而被反射到相機12。但是，它首先經(jīng)過設(shè)計成實質(zhì)上只 讓熒光透過的發(fā)射濾光片32。更一般地說，發(fā)射濾光片32的用途是 提高熒光與其它光(尤其是激發(fā)光)的比率。原則上，讓發(fā)射濾光片 32只將激發(fā)輻射鎖定在較大范圍上就足夠了，但發(fā)射濾光片32也可 以用于選擇特定類型的熒光。畢竟，除要研究的那些之外的其它材料 都可能發(fā)熒光，尤其是基片。但是，如果將硅過濾膜用作基片24,這 種類型的熒光通?？珊雎圆挥?。
接著，讓具有，例如，530納米的波長的熒光經(jīng)過成像透鏡34。 相機12可以是具有10微米或更小的像素尺寸的CCD相機等。在具 體例子中，像素尺寸是，例如，4.65微米，像素分辨率與光學(xué)分辨率 之間的期望比至少是2倍。對于，例如大約0.5微米的所要求光學(xué)分 辨能力，像素分辨率是例如0.23微米，所需的放大倍數(shù)是大約20。 例如，物鏡22具有10毫米的焦距和0.42的NA，和成像透鏡34具 有200毫米的焦距。給定這樣的組合，還實現(xiàn)了一個優(yōu)點，即物鏡22 上的足夠大工作距離。
作為CCD相機12的可替代物，也可以使用例如CMOS (互補 金屬氧化物半導(dǎo)體)相機，或例如照相底板。CCD相才幾或CMOS相 機具有可以用電子手段處理圖像的優(yōu)點，并且，如前所述，它們具有 比肉眼好的有效光學(xué)分辨率。為此，可以將相機12與例如配有圖像 處理和/或圖像識別裝備和/或軟件(未示出)的計算機連接。
應(yīng)該注意到，如圖l所示的熒光輻射的光路，即，經(jīng)由部分透射 鏡30到相機的光路是針對聚焦光源36選擇的。在缺乏聚焦光源36的情況下，相機也可以位于所述聚焦光源36的位置中，其結(jié)果是， 部分透射鏡30實際上變成多余的。但是，描繪在圖1中的熒光顯微 鏡l的確包含聚焦光源36。它的用途是應(yīng)用足夠數(shù)量的光，以便能夠 以簡單方式在熒光顯微鏡l的銳聚焦面中定位基片24。為此，聚焦光 源36發(fā)出例如白光或綠光，尤其是透過發(fā)射濾光片32和明顯透過分 色鏡20的光。因此，聚焦光源36發(fā)出的光的顏色取決于來自激發(fā)光 源14的光的顏色和熒光的顏色。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以容易地 選擇所有這些方面。聚焦光源36又可以是，例如，LED光源，或可 替代地，(卣素)白熾燈或(高壓)汞汽燈。其它光源同樣可以。有 利的是，可以使用LED光源，其優(yōu)點包括迅速開關(guān)從而不需要機 械快門、旋鏡等，以及長的服務(wù)壽命和由高內(nèi)在效率、相對窄的帶寬 引起的有效照射，這意味著濾光片和基片需要應(yīng)付相對低的功率。此 外，在激發(fā)光源包含LED光源的情況中，這些優(yōu)點同樣存在。
聚焦透鏡38的用途是獲取有助于銳聚焦的足夠均勻光束。另一 個優(yōu)點是在也稱為對準的聚焦過程中，基片24，要研究的可能存在材 料，尤其是標記細菌不會褪色。褪色將對隨后進行的熒光測量產(chǎn)生負 面影響。為了防止褪色，在聚焦期間只使用聚焦光源36。在到達基片 24時，選擇激發(fā)光與來自聚焦光源36的光之間的高光強比也是有益 的。當將上述LED光源用于激發(fā)光源14和聚焦光源36時，例如， 可以容易地取得2000:1的激發(fā)光與對準光之比。在部分透射鏡30與 聚焦透鏡38之間，可以可選地放置能夠?qū)嵸|(zhì)上對應(yīng)于發(fā)射濾光片32 的第二發(fā)射濾光片。在這樣的情況下，可以容易地取得10000:1的比 率。給定這樣的比率，可以可靠地避免待研究材料由聚焦光引起的褪 色。平坦、小基片的使用具有只需進行少數(shù)次鏡聚焦的優(yōu)點。
與術(shù)語"透鏡"的使用有關(guān)的一般注釋是，在所有情況下，這個透 鏡也可以是復(fù)合透鏡，即，包含多個光學(xué)元件。而且，原則上，發(fā)射 濾光片32和激發(fā)濾光片18相對于相關(guān)透鏡，即，成像透鏡34和照 射透鏡16的位置可以反轉(zhuǎn)。
所述的實施例應(yīng)該當作非限制性例子。本發(fā)明的保護范圍由所附 權(quán)利要求書限定。
權(quán)利要求
1.一種熒光顯微鏡，包含帶有設(shè)計成發(fā)出激發(fā)光的激發(fā)光源的外殼；將激發(fā)光與由熒光物質(zhì)生成的熒光分開的濾光器件；物鏡；基片座；位置敏感光檢測器；和用于該位置敏感光檢測器的成像透鏡，還包含基片，該基片含有由適合光刻處理技術(shù)的材料制成的基于晶片的過濾膜，其中，該過濾膜包含通過光刻引入的連續(xù)孔眼的圖案。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的熒光顯微鏡，其中，所述基片實質(zhì)上 由硅、硅化合物、藍寶石、硅酸鹽玻璃或它們的組合組成。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的熒光顯微鏡，其中，所述基片實質(zhì)上 包含硅。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的熒光顯微鏡，其中，所述基片含有滲 氮或滲碳表面。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的熒光顯微鏡，其中，所述基片實質(zhì)上 包含碳化硅或二氧化硅。
6. 根據(jù)權(quán)利要求2到5的任何一項所述的熒光顯微鏡，其中， 在所迷基片表面的至少 一側(cè)上涂敷有金屬層。
7. 根據(jù)前面權(quán)利要求的任何一項所述的熒光顯微鏡，包含銳 聚焦控制系統(tǒng)，被設(shè)計成用于輸入所述基片在三個非共線點上的聚焦 距離，所述銳聚焦控制系統(tǒng)根據(jù)該聚焦距離確定銳聚焦面。
8. 根據(jù)前面權(quán)利要求的任何一項所述的熒光顯微鏡，進一步包 含聚焦照射系統(tǒng)，其含有被設(shè)計成發(fā)出聚焦光的聚焦光源，其中， 所述聚焦光的光路和熒光的光路同軸地經(jīng)由所述物鏡通向所述基片。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的熒光顯微鏡，進一步包含部分透過 聚焦光、且以將來自所述基片的光引向所述光檢測器的方式被放置在 所述聚焦光的光路中的鏡。
10. 根據(jù)權(quán)利要求8或9所述的熒光顯微鏡，進一步包含位于 所述部分透射鏡與所述聚焦光源之間、且具有比熒光輻射低的激發(fā)光 透射率的濾光片。
11. 一種利用根據(jù)前面權(quán)利要求的任何一項所述的熒光相機來檢測基片上的樣品的熒光的方法，包含 用激發(fā)光照射基片上的樣品；和 檢測來自該樣品的熒光。
12. 根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中，只有當使所述樣品聚 焦時，所述聚焦光源才實質(zhì)上發(fā)出聚焦光。
13. 根據(jù)權(quán)利要求11-12的任何一項所述的方法，其中，從所 述基片上的樣品的許多分區(qū)的每一個中檢測熒光，然后根據(jù)在分區(qū)中 檢測到的焚光確定相關(guān)圖像信息，所述分區(qū)是從所述樣品中隨機選擇 的，其中，如果當前測量的來自所有分區(qū)的相關(guān)圖像信息總體上超過 預(yù)定置信水平閾值，則中斷熒光的測量。
14. 一種用在根據(jù)權(quán)利要求1 - 10的任何一項所述的熒光顯微鏡 中的基片，包含由適合光刻處理技術(shù)的材料制成的基于晶片的過濾 膜，其中，該過濾膜包含通過光刻引入的連續(xù)孔眼的圖案，在該基片 表面的至少一側(cè)上涂敷有金屬層。
15. —種制造根據(jù)權(quán)利要求14所述的基片的方法，包含如下步 驟提供基于晶片的過濾膜，通過光刻技術(shù)為該過濾膜提供孔眼，然 后在該過濾膜的至少 一側(cè)上涂敷金屬層。
全文摘要
本發(fā)明提供了熒光顯微鏡和用它測量熒光的方法。該顯微鏡包含高度平坦和不發(fā)熒光的硅晶片過濾膜。此外，它具有非常高的孔眼密度，以便小的表面區(qū)域就足夠用于有效測量。此外，將相機用作位置敏感檢測器使得可以利用更好的光學(xué)分辨率，這意味著可以在較大工作距離上應(yīng)用具有較小數(shù)值孔徑和較小放大倍數(shù)的光學(xué)部件。所有這些因素加在一起提供了能夠比現(xiàn)有熒光顯微鏡更迅速測量的熒光顯微鏡。
文檔編號G02B21/16GK101292187SQ200680036643
公開日2008年10月22日 申請日期2006年10月3日 優(yōu)先權(quán)日2005年10月3日
發(fā)明者F·H·A·G·費伊 申請人:C.C.M.控股有限公司