專(zhuān)利名稱(chēng)：用于具有共焦激發(fā)平面的廣視場(chǎng)多光子顯微的方法及系統(tǒng)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明一般涉及熒光顯微術(shù)，具體地涉及在共焦平面提供廣視場(chǎng)多光子激發(fā)。
背景技術(shù)：
光學(xué)顯微術(shù)一直被用來(lái)檢查太小而用肉眼無(wú)法清楚地看到的物體。光學(xué)顯微術(shù)包括提供入射光束到樣品上并通過(guò)放大鏡觀察來(lái)自該樣品的光。熒光顯微術(shù)是另一種類(lèi)型的顯微術(shù)，其中用熒光材料標(biāo)記感興趣的樣品，然后用一定的波長(zhǎng)光照射樣品，該波長(zhǎng)光提供的單光子能級(jí)足以激發(fā)熒光材料發(fā)出發(fā)射光。通過(guò)收集發(fā)射光而不是激發(fā)光來(lái)檢測(cè)樣品的圖像。熒光顯微術(shù)可實(shí)施作為標(biāo)準(zhǔn)的廣視場(chǎng)顯微術(shù)或共焦顯微術(shù)。
在廣視場(chǎng)熒光顯微術(shù)中，諸如弧光燈的激發(fā)光源提供平行或準(zhǔn)平行的激發(fā)光束，該激發(fā)光束被會(huì)聚到樣品的預(yù)期焦平面上。焦平面處的圖像由所有由特定物鏡的點(diǎn)擴(kuò)散特性包圍的光產(chǎn)生。因?yàn)辄c(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)不能確定單個(gè)焦平面，所以熒光材料的激發(fā)發(fā)生在預(yù)期焦平面之上和之下，并且不能分辨出樣品的卷信息?？梢圆捎猛ǔ７Q(chēng)為解卷積顯微術(shù)的計(jì)算方法，來(lái)從在不同焦平面處獲得的一堆圖像中計(jì)算樣品內(nèi)特定平面的光，該計(jì)算方法利用物鏡的點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)的一種模型。這可以通過(guò)說(shuō)明來(lái)自每個(gè)片段的光對(duì)其它片段的影響，從而近似一個(gè)規(guī)定厚度的共焦圖像片段這樣的方式完成。廣視場(chǎng)解卷積共焦熒光顯微術(shù)的實(shí)施類(lèi)似于光學(xué)共焦顯微鏡法，然而在許多情況下，由于背景發(fā)射導(dǎo)致的差對(duì)比度所產(chǎn)生的圖像噪聲的影響，或由于在實(shí)際試驗(yàn)條件下，用于物鏡的點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)可能偏離它的相應(yīng)模型，因此結(jié)果得到的圖像發(fā)生失真。而且，這些問(wèn)題使得難于構(gòu)造樣品的3-D再現(xiàn)。
在共焦熒光顯微術(shù)中，激發(fā)光束被聚焦在樣品的焦點(diǎn)。在激發(fā)光具有的波長(zhǎng)足以提供熒光材料的單光子激發(fā)的情況下，激發(fā)發(fā)生在以焦點(diǎn)為中心的砂漏束腰中，該砂漏束腰近似于物鏡的點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)。但是，與廣視場(chǎng)熒光顯微術(shù)不同，通過(guò)對(duì)激發(fā)源和發(fā)射圖像使用塞孔，可以獲得共焦。由于只有來(lái)源于焦平面的平行光線才可以穿過(guò)塞孔，因此不具有平行光線(或焦平面之外)的光子會(huì)被該塞孔阻擋，不能到達(dá)探測(cè)器。因此，該塞孔阻擋了來(lái)自焦點(diǎn)之上和之下的發(fā)射光，從而可以提供不被焦平面之上和之下的信息失真的清晰圖像。但是，由于發(fā)射針孔提供的是僅來(lái)自于激光束焦點(diǎn)的圖像數(shù)據(jù)，因此必須在樣品上面沿著x和y方向光柵掃描共焦系統(tǒng)的激發(fā)激光束，而且必須在每個(gè)x，y位置收集熒光發(fā)射的強(qiáng)度。從該數(shù)據(jù)，可在計(jì)算機(jī)中構(gòu)造樣品的圖像片段。通過(guò)改變焦平面，可以獲得幾個(gè)圖像，并且可在計(jì)算機(jī)中重新構(gòu)造獲得的圖像堆，以獲得樣品的三維(3-D)再現(xiàn)。
廣視場(chǎng)和共焦熒光顯微術(shù)存在的一個(gè)共同問(wèn)題是熒光材料的單光子激發(fā)發(fā)生在數(shù)據(jù)圖像被實(shí)際收集所處的焦點(diǎn)之上和之下。這種不必要的激發(fā)將導(dǎo)致特定焦平面之上和之下的材料出現(xiàn)“漂白”，當(dāng)該特定焦平面隨后作為新焦平面的一部分被激發(fā)時(shí)，該特定焦平面將具有降低的發(fā)射特性。而且，位于焦平面之上和之下的組織的反復(fù)激發(fā)可能會(huì)損傷該組織，這對(duì)于活樣品的圖像生成是特別不希望的。
近年來(lái)，出現(xiàn)了一種用于減少漂白和組織損傷問(wèn)題的新光學(xué)切片技術(shù)--多光子熒光顯微術(shù)。這種類(lèi)型的顯微術(shù)使用的是具有比激發(fā)熒光材料所需波長(zhǎng)更長(zhǎng)波長(zhǎng)的脈沖照明光源。例如，需要500nm激發(fā)波長(zhǎng)的染料將用在1000nm工作的激光源照明，使得由于染料在1000nm不吸收光，樣品中不產(chǎn)生單光子激發(fā)。但是，使用脈沖高功率激發(fā)激光器可以在焦點(diǎn)處提供足夠高的光子強(qiáng)度，使得至少兩個(gè)光子被熒光材料(基本同時(shí)地)吸收。這種長(zhǎng)波長(zhǎng)的雙光子吸收提供的激發(fā)能量等于較短波長(zhǎng)的單光子吸收，并致使激發(fā)局限在焦點(diǎn)處。因此，利用多光子激發(fā)，圍繞著焦點(diǎn)的熒光材料將不被激發(fā)，從而消除了對(duì)塞孔的需要，并將因反復(fù)激發(fā)而產(chǎn)生的漂白和組織損傷問(wèn)題減至最小。
圖6示出了美國(guó)專(zhuān)利No.5,034,613中公開(kāi)的多光子掃描顯微系統(tǒng)。如圖中所示，掃描顯微鏡10包括聚焦諸如激光器的光源16產(chǎn)生的入射光14到物面18的物鏡12。由入射光束14提供的照明充滿通常用24表示的會(huì)聚圓錐，該圓錐進(jìn)入樣品以到達(dá)在物面18處的焦平面并形成焦點(diǎn)26。從激光器16到物面18的光路徑包括激光器16產(chǎn)生的光直接入射到其上的分色鏡28。分光鏡28向下偏轉(zhuǎn)該光到達(dá)反射鏡30，反射鏡30接著通過(guò)曲面反射鏡36和38將該光引導(dǎo)到一對(duì)掃描反射鏡32和34。反射鏡32和34可繞相互垂直的軸旋轉(zhuǎn)，以便沿垂直的X和Y軸在物面上移動(dòng)入射光14，因此利用入射光束可以掃描固定的樣品。來(lái)自掃描反射鏡的光穿過(guò)目鏡40，通過(guò)物鏡12聚焦到物面18。
由物面18中樣品產(chǎn)生的熒光通過(guò)顯微鏡10傳回，返回入射光束14的光路徑，并因此穿過(guò)物鏡12和目鏡40，掃描反射鏡34和32以及曲面反射鏡38和36，并且被反射鏡30反射回分光鏡28。樣品中熒光材料發(fā)射的光是包含在該樣品中的熒光團(tuán)的特定波長(zhǎng)，因此能夠穿過(guò)分色鏡28而不被向激光器16反射回來(lái)，并沿著通常以44表示的光路徑傳播。熒光42因此穿過(guò)阻擋濾光器46并被平面反射鏡48，50和52反射到諸如光電倍增管54的適當(dāng)探測(cè)器。雖然不為多光子顯微術(shù)所需要，但在收集光學(xué)系統(tǒng)44中可以設(shè)置可調(diào)的共焦針孔56，以將焦平面之上和之下的會(huì)聚和發(fā)散錐體內(nèi)發(fā)出激發(fā)的背景熒光減至最少。

發(fā)明內(nèi)容
盡管多光子熒光顯微系統(tǒng)具有上述優(yōu)點(diǎn)，但是本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)這種類(lèi)型的現(xiàn)有系統(tǒng)包括諸如圖8中所示的復(fù)雜和昂貴的激發(fā)光束掃描機(jī)構(gòu)。而且，對(duì)焦點(diǎn)激發(fā)光束的掃描通常會(huì)導(dǎo)致圖像獲取速度對(duì)于視頻速率而言太慢，而對(duì)于樣品成像而言又太高。
因此，本發(fā)明的一個(gè)目的是消除現(xiàn)有技術(shù)的多光子熒光顯微術(shù)存在的上述問(wèn)題。
本發(fā)明的另一目的是提供一種多光子顯微術(shù)的方法及系統(tǒng)，其中可以減少或消除激發(fā)光源在樣品上的掃描。
本發(fā)明的再一個(gè)目的是減少樣品的圖像獲取時(shí)間。
這些和/或其它目的將通過(guò)用于具有共焦平面的廣視場(chǎng)多光子顯微術(shù)的方法及系統(tǒng)來(lái)提供。根據(jù)發(fā)明的一個(gè)方面，廣視場(chǎng)顯微鏡包括配置成固定其內(nèi)有熒光材料的樣品的平臺(tái)，和配置成產(chǎn)生基本平行的激發(fā)光束的多光子激發(fā)光源，該基本平行的激發(fā)光束具有的單光子能量低于在樣品內(nèi)包含的熒光材料的單光子激發(fā)所需的吸收能量。無(wú)限校正物鏡被光學(xué)耦合到該多光子激發(fā)光源，并被配置成聚焦基本平行的激發(fā)光束到樣品上，以便熒光材料的多光子激發(fā)同時(shí)在樣品的預(yù)定區(qū)域上發(fā)生。聚焦透鏡被配置成將從該樣品的該預(yù)定區(qū)域發(fā)出的發(fā)射光同時(shí)聚焦到圖像探測(cè)器的至少兩個(gè)像素上。
根據(jù)另一方面，廣視場(chǎng)顯微鏡包括固定其內(nèi)有熒光材料的樣品的裝置，和產(chǎn)生基本平行的激發(fā)光束的裝置，該基本平行的激發(fā)光束具有的單光子能量低于在該樣品內(nèi)包含的熒光材料的單光子激發(fā)所需的吸收能量。該方面還包括光學(xué)耦合到多光子激發(fā)光源的裝置，其用于接收基本平行的激發(fā)光束并將該激發(fā)光聚焦到樣品上，以便熒光材料的多光子激發(fā)同時(shí)在樣品的預(yù)定區(qū)域上發(fā)生。將從該樣品的該預(yù)定區(qū)域發(fā)出的發(fā)射光同時(shí)聚焦到圖像探測(cè)器的至少兩個(gè)像素上的裝置。
本發(fā)明的另一個(gè)方面包括橫跨一共焦平面提供廣視場(chǎng)激發(fā)的方法。該方法包括固定其內(nèi)有熒光材料的樣品，產(chǎn)生基本平行的激發(fā)光束，該基本平行的激發(fā)光束具有的單光子能量低于在樣品內(nèi)包括的熒光材料的單光子激發(fā)所需的吸收能量，并施加基本平行的激發(fā)光束到無(wú)限校正物鏡，該無(wú)限校正物鏡聚焦該激發(fā)光到該樣品上，以便在該樣品的預(yù)定區(qū)域上同時(shí)發(fā)生熒光材料的多光子激發(fā)。將從該樣品的該預(yù)定區(qū)域發(fā)出的發(fā)射光同時(shí)聚焦到圖像探測(cè)器的至少兩個(gè)像素上。
本發(fā)明的再一個(gè)方面包括具有廣視場(chǎng)顯微鏡的柔性顯微鏡。該廣視場(chǎng)顯微鏡包括配置成固定其內(nèi)有熒光材料的樣品的平臺(tái)，和配置成產(chǎn)生基本平行的激發(fā)光束的多光子激發(fā)光源，該基本平行的激發(fā)光束具有的單光子能量低于在樣品內(nèi)包括的熒光材料的單光子激發(fā)所需的吸收能量。無(wú)限校正物鏡被光學(xué)耦合到該多光子激發(fā)光源，并被配置成聚焦基本平行的激發(fā)光束到樣品上，以便熒光材料的多光子激發(fā)同時(shí)在樣品的預(yù)定區(qū)域上發(fā)生。聚焦透鏡被配置成將從該樣品的該預(yù)定區(qū)域發(fā)出的發(fā)射光同時(shí)聚焦到圖像探測(cè)器的至少兩個(gè)像素上。光纖耦合到該廣視場(chǎng)顯微鏡上，光學(xué)部件固定器附接在該光纖末端上。至少該廣視場(chǎng)顯微鏡的無(wú)限校正物鏡包括在該光學(xué)部件固定器內(nèi)，并且該廣視場(chǎng)顯微鏡的所有沒(méi)包括在該光學(xué)部件固定器內(nèi)的部件包括在光耦合到該光纖的相反末端的外部單元內(nèi)。
本發(fā)明的另一個(gè)方面包括廣視場(chǎng)顯微鏡，該廣視場(chǎng)顯微鏡具有配置成固定其內(nèi)有熒光材料的樣品的平臺(tái)，和配置成產(chǎn)生基本平行的激發(fā)光束的多光子激發(fā)光源，該基本平行的激發(fā)光束具有的單光子能量低于在樣品內(nèi)包括的熒光材料的單光子激發(fā)所需的吸收能量。無(wú)限校正物鏡被光學(xué)耦合到該多光子激發(fā)光源，并被配置成聚焦基本平行的激發(fā)光束到樣品上，以便熒光材料的多光子激發(fā)同時(shí)在樣品的預(yù)定區(qū)域上發(fā)生。聚焦透鏡被配置成將從該樣品的該預(yù)定區(qū)域發(fā)出的發(fā)射光聚焦到像平面上，以便通過(guò)雙目目鏡可以觀察該像平面。


通過(guò)參考下面結(jié)合附圖考慮的詳細(xì)描述，將容易地獲得并更好地理解本發(fā)明更完整的評(píng)價(jià)及其許多附加優(yōu)點(diǎn)，其中圖1是根據(jù)本發(fā)明一實(shí)施例的多光子顯微系統(tǒng)的系統(tǒng)圖；圖2是根據(jù)本發(fā)明另一實(shí)施例的多光子顯微系統(tǒng)的系統(tǒng)圖；圖3是根據(jù)本發(fā)明再一實(shí)施例的多光子顯微系統(tǒng)的系統(tǒng)圖；圖4是根據(jù)本發(fā)明再一實(shí)施例的多光子顯微系統(tǒng)的系統(tǒng)圖；圖5是根據(jù)本發(fā)明的具有多光子顯微系統(tǒng)的柔性顯微鏡的系統(tǒng)圖；圖6是現(xiàn)有的多光子掃描顯微系統(tǒng)；圖7是現(xiàn)有技術(shù)的廣視場(chǎng)多光子顯微系統(tǒng)的系統(tǒng)圖；圖8是現(xiàn)有技術(shù)的去相關(guān)多焦點(diǎn)多光子系統(tǒng)的系統(tǒng)圖。
具體實(shí)施例方式
如上所述，現(xiàn)有的多光子熒光顯微系統(tǒng)包括通過(guò)激發(fā)光源對(duì)樣品的掃描。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，在多光子顯微術(shù)中使用掃描主要是由于人們廣泛地感覺(jué)只需要激發(fā)樣品的小焦點(diǎn)。而在現(xiàn)有的多光子顯微鏡中，小激發(fā)區(qū)域?qū)?yīng)于顯微探測(cè)器的單個(gè)像素，從而必須橫跨視場(chǎng)，一個(gè)像素接一個(gè)像素地掃描激發(fā)光束。對(duì)需要橫跨樣品掃描的小區(qū)域多光子激發(fā)區(qū)域的感覺(jué)同樣阻止了通過(guò)雙目目鏡的圖像探測(cè)的使用，因?yàn)閽呙璧膱D像在觀察之前必須通過(guò)計(jì)算機(jī)重新構(gòu)造。但是，本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，通過(guò)同時(shí)激發(fā)樣品的較大區(qū)域，可以減少或消除對(duì)激發(fā)光源掃描的需要。這種系統(tǒng)已經(jīng)被研究來(lái)提供用于多光子顯微術(shù)的超短脈沖激發(fā)激光器的有效的功率使用。例如，Wide-field Multi-photonand Temporally Decorrelated Multifocal Multi-photon Microscopy，by Fittinghoff，Wiseman and Squier，Optics Express，Vol.7，273-280，9 October 2000(下文中，稱(chēng)為Fittinghoff等人)公開(kāi)了兩種系統(tǒng)，該兩種系統(tǒng)能夠?qū)悠返膹V區(qū)域提供同時(shí)激發(fā)，以允許激發(fā)激光功率的有效使用。
圖7示出了Fittinghoff等人公開(kāi)的廣視場(chǎng)多光子顯微鏡。如該圖所示，激發(fā)光束705由聚焦透鏡710聚焦，然后穿過(guò)分色鏡720并通過(guò)物鏡730，該物鏡730將該激發(fā)光施加到樣品740的焦平面。激發(fā)光束705由20飛秒、800nm脈沖激光光源提供。樣品發(fā)射的光束745返回穿過(guò)物鏡730并被分色鏡720反射射向鏡筒透鏡750。鏡筒透鏡750聚焦發(fā)射光束745到電荷耦合探測(cè)器760，生成圖像。雖然廣視場(chǎng)多光子顯微鏡能夠產(chǎn)生樣品的相對(duì)大區(qū)域的同時(shí)激發(fā)，但是Fittinghoff等人提及的解釋是該系統(tǒng)具有差的軸向分辨率，并因此導(dǎo)致樣品沿軸向的非常長(zhǎng)區(qū)域發(fā)生激發(fā)。這導(dǎo)致如上述背景技術(shù)中描述的廣視場(chǎng)顯微系統(tǒng)的情況一樣的共焦損失，從而將產(chǎn)生差的圖像并不能產(chǎn)生3-D顯微所需要的清晰切片。因此，F(xiàn)ittinghoff等人指出，雖然廣視場(chǎng)多光子方法可以同時(shí)激發(fā)大區(qū)域，但是其不能提供用于清晰片段和3-D成像的共焦激發(fā)平面。
圖8示出了Fittinghoff等人公開(kāi)的去相關(guān)多焦多光子系統(tǒng)，去相關(guān)多焦多光子系統(tǒng)用于對(duì)樣品的線性區(qū)域提供同時(shí)激發(fā)，同時(shí)允許3-D成像。如該圖所示，激光束805輸入到標(biāo)準(zhǔn)具810，該標(biāo)準(zhǔn)具810將該光束分成將被引導(dǎo)到透鏡820的單個(gè)焦點(diǎn)光束陣列815。標(biāo)準(zhǔn)具810可被一系列將輸入激光束分成等功率焦點(diǎn)光束陣列的分束器代替。透鏡820然后引導(dǎo)多焦光束陣列815通過(guò)第一反射鏡830，透鏡840，第二反射鏡850并到達(dá)透鏡860。如圖8中的箭頭所示，反射鏡830和850在彼此正交的方向可以移動(dòng)，以提供多焦陣列掃描。從透鏡860開(kāi)始，該多焦光束陣列穿過(guò)分色鏡870到達(dá)物鏡880，該物鏡880將該多焦光束陣列施加到平臺(tái)890的樣品上，以便每個(gè)陣列光束激發(fā)樣品的小區(qū)域，例如單個(gè)像素大小。樣品的光發(fā)射返回穿過(guò)物鏡880到達(dá)分色鏡870，該分色鏡870反射發(fā)射光到達(dá)透鏡895，該透鏡895聚焦該發(fā)射光到電荷耦合探測(cè)器898上，該探測(cè)器898的單個(gè)像素收集來(lái)自各自發(fā)射光束的光。雖然這種多焦光束陣列的使用在圖7的廣視場(chǎng)系統(tǒng)基礎(chǔ)上提供了改進(jìn)的軸向分辨率，但是必須掃描多焦光束陣列，這是費(fèi)時(shí)的并且需要上述發(fā)明的背景技術(shù)中描述的復(fù)雜而又昂貴的掃描機(jī)構(gòu)。此外，還需要復(fù)雜的光學(xué)系統(tǒng)將光源的單個(gè)光束分成多個(gè)平行光束。
因此，F(xiàn)ittinghoff等人斷定，廣視場(chǎng)多光子顯微鏡缺少美國(guó)專(zhuān)利5,034,613中最初描述的標(biāo)準(zhǔn)多光子焦點(diǎn)掃描系統(tǒng)的內(nèi)在切片，而單獨(dú)的聚焦激發(fā)光束陣列的掃描可以被用來(lái)提供樣品的清晰圖像切片。然而，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ittinghoff等人公開(kāi)的廣視場(chǎng)多光子顯微系統(tǒng)其差的軸向分辨率和圖像畸變是由脈沖激光激發(fā)光束的展寬導(dǎo)致的。具體地，脈沖的展寬降低了激發(fā)光的光子強(qiáng)度，這將導(dǎo)致減少的多光子激發(fā)以及激發(fā)區(qū)域的軸向分辨率的損失。認(rèn)識(shí)到該問(wèn)題后，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，在Fittinghoff等人的圖7的系統(tǒng)中出現(xiàn)的不期望的脈沖展寬是由于激發(fā)激光脈沖光束在到達(dá)物鏡之前穿過(guò)光學(xué)部件導(dǎo)致的。
特別地，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)提供聚焦的激發(fā)光束到物鏡會(huì)導(dǎo)致圖7的系統(tǒng)提供差的圖像片段。換句話說(shuō)，由于透鏡的色散特性和/或光束的會(huì)聚，在到達(dá)物鏡之前穿過(guò)圖7的聚焦透鏡710的脈沖激發(fā)激光束會(huì)導(dǎo)致脈沖光束的脈沖展寬。類(lèi)似地，穿過(guò)圖6中分色鏡620的脈沖激發(fā)激光束同樣導(dǎo)致產(chǎn)生減少的軸向分辨率和畸變圖像片段的脈沖展寬。此外，穿過(guò)聚焦透鏡和反射鏡的光束可以導(dǎo)致激發(fā)光束的衰減，其進(jìn)一步減少了焦平面的多光子激發(fā)。在認(rèn)識(shí)到圖7中系統(tǒng)的這些問(wèn)題后，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，與Fittinghoff等人提及的結(jié)論相反，在維持清晰圖像片段和3-D顯微術(shù)所需的軸向分辨率的同時(shí)，廣視場(chǎng)多光子顯微系統(tǒng)能夠?qū)崿F(xiàn)樣品的大區(qū)域的同時(shí)激發(fā)。
現(xiàn)在參考剩余附圖，其中在幾幅圖中相同的附圖標(biāo)記表示相同或相應(yīng)的部分，圖1示出了根據(jù)本發(fā)明一實(shí)施例的廣視場(chǎng)多光子顯微系統(tǒng)。如該圖所示，脈沖激光激發(fā)源10提供激發(fā)光束，該激發(fā)光束被擴(kuò)束器20擴(kuò)展成將被施加到分色鏡30的基本平行的激發(fā)光束25。因此，在圖1的實(shí)施例中，激發(fā)光源10和擴(kuò)束器20起到配置成產(chǎn)生基本平行的激發(fā)光束的多光子激發(fā)光源的作用。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該知道，各種已知構(gòu)造都可用來(lái)提供基本平行的激發(fā)光束，例如圖2中的弧光燈。
分色鏡30將基本平行的激發(fā)光束25反射進(jìn)入物鏡裝置40，該物鏡裝置40將激發(fā)光施加到固定在平臺(tái)50上的樣品1000上。在圖1的實(shí)施例中，物鏡40沿著激發(fā)光束的軸向是可移動(dòng)的，以改變位于樣品1000上的激發(fā)光束的焦平面，如箭頭53所示。樣品吸收激發(fā)光的至少2個(gè)光子，促使該樣品發(fā)出發(fā)射光，該發(fā)射光返回穿過(guò)物鏡40，分色鏡30和發(fā)射濾光器60到鏡筒透鏡70。鏡筒透鏡70聚焦發(fā)射光55到像平面80，在那里探測(cè)器90可以檢測(cè)樣品1000一個(gè)區(qū)域的圖像1010。
脈沖激光激發(fā)光源10提供具有預(yù)定波長(zhǎng)的超短激光脈沖，該超短激光脈沖具有的單光子能級(jí)不足以導(dǎo)致樣品的激發(fā)。由于可將多種具有不同激發(fā)特性的熒光材料添加到樣品，所以激光激發(fā)光源10的工作波長(zhǎng)取決于樣品的熒光發(fā)射特性。因此，激光激發(fā)光源10可在大約700nm到大約1100nm范圍操作并優(yōu)選在該范圍是可調(diào)諧的。激光激發(fā)光源10的短脈沖可在皮秒，飛秒或更短的脈沖持續(xù)范圍內(nèi)，并可具有高達(dá)100Mhz的脈沖重復(fù)率。在一實(shí)施例中，激光激發(fā)光源10可實(shí)施成由Spectra-Physics ofMountain View Califormia制造的可調(diào)諧鈦藍(lán)寶石鎖模激光器。但是，可以利用任何提供用于多光子激發(fā)的短脈沖激發(fā)源的激光器。
如上所述，擴(kuò)束器20被配置成將激發(fā)激光束擴(kuò)展成基本平行的激發(fā)光束。這里所用的術(shù)語(yǔ)基本平行的激發(fā)光束指的是該光束不穿過(guò)設(shè)計(jì)成會(huì)聚該光束光線的光學(xué)裝置。在一實(shí)施例中，擴(kuò)束器將脈沖激發(fā)光束擴(kuò)展到其原始束寬的100倍。本發(fā)明者認(rèn)識(shí)到，可以在仍舊允許橫跨樣品平面的多光子同時(shí)激發(fā)的同時(shí)，實(shí)現(xiàn)激光的這種擴(kuò)展。而且，如上所述，減少的脈沖展寬和功率損耗有助于保持激光束的多光子激發(fā)特性。因此，擴(kuò)束器20優(yōu)選地被設(shè)計(jì)成提供減少的脈沖激光束的功率損耗和脈沖展寬。
擴(kuò)束器同樣優(yōu)選地被設(shè)計(jì)成能夠橫跨擴(kuò)展光束區(qū)域提供具有均勻特性的基本均勻的擴(kuò)展光束。具體地，脈沖激發(fā)光源的脈沖展寬應(yīng)該被最小化，且在橫跨擴(kuò)展光束區(qū)域上應(yīng)該是基本恒定的。相似地，激發(fā)光的強(qiáng)度在橫跨擴(kuò)展光束區(qū)域上應(yīng)該是基本恒定的。本發(fā)明人已經(jīng)認(rèn)識(shí)到這種均勻性可以在橫跨樣品的廣視場(chǎng)激發(fā)區(qū)域上提供均勻的多光子激發(fā)特性。然而，商用的擴(kuò)束器通常提供的擴(kuò)展光束橫跨光束區(qū)域具有非均勻的脈沖展寬和/或功率損耗。實(shí)際上，這可能是阻止使用擴(kuò)束器來(lái)擴(kuò)展多光子激發(fā)系統(tǒng)的脈沖激光源的因素。
本發(fā)明人在已經(jīng)認(rèn)識(shí)到減少的脈沖展寬和均勻的激發(fā)光束特性對(duì)廣視場(chǎng)多光子纖維術(shù)的重要性的基礎(chǔ)上，還認(rèn)識(shí)到從商用擴(kuò)束器產(chǎn)生的非均勻擴(kuò)展光束是由于這種擴(kuò)束器被設(shè)計(jì)成使進(jìn)入該擴(kuò)束器的不同部分激光束傳播穿過(guò)不同數(shù)量的擴(kuò)束器介質(zhì)(例如，玻璃)而造成的。具體地，由于脈沖展寬和光衰減受到激光束必須傳播穿過(guò)的介質(zhì)的數(shù)量的影響，所以例如擴(kuò)展光束的外圍部分比擴(kuò)展光束的中間部分可能具有不同的脈沖展寬和衰減特性。因此，本發(fā)明的擴(kuò)束器專(zhuān)門(mén)設(shè)計(jì)成允許激光束在擴(kuò)展光束的每一點(diǎn)傳播穿過(guò)基本相同數(shù)量的玻璃(或其它擴(kuò)束器材料)。
擴(kuò)束器20產(chǎn)生的基本未聚焦平行激發(fā)光束施加到分色鏡30，該分色鏡30被設(shè)計(jì)成反射某一波長(zhǎng)范圍而通過(guò)另一不同的波長(zhǎng)范圍。多光子熒光顯微系統(tǒng)的特性是激發(fā)光具有與樣品的熒光發(fā)射波長(zhǎng)基本不同的波長(zhǎng)。例如，提供的激發(fā)波長(zhǎng)通常是樣品的熒光發(fā)射所需波長(zhǎng)(即大約是單個(gè)光子能量的一半)的大約兩倍。當(dāng)在少于樣品內(nèi)熒光材料的特征衰減時(shí)間的時(shí)間周期內(nèi)有兩個(gè)或多個(gè)激發(fā)光子激發(fā)樣品時(shí)，樣品被激發(fā)到如同被更高能量的單光子激發(fā)到的能級(jí)，因此發(fā)射波長(zhǎng)高于(能量低于)單光子激發(fā)波長(zhǎng)的發(fā)射光子。該發(fā)射波長(zhǎng)取決于熒光染料的物理化學(xué)特性。多光子激發(fā)可以通過(guò)激發(fā)光是激發(fā)波長(zhǎng)3x倍的3光子激發(fā)類(lèi)似地實(shí)現(xiàn)。更多倍激發(fā)波長(zhǎng)同樣可以用于實(shí)現(xiàn)更高倍的多光子激發(fā)。
因此，在圖1所示的本發(fā)明實(shí)施例中，分色鏡30反射較長(zhǎng)波長(zhǎng)的激發(fā)光而通過(guò)較短波長(zhǎng)的發(fā)射光。分色鏡是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的光學(xué)部件。而且，任何已知的能夠?qū)崿F(xiàn)分色鏡相同功能的光學(xué)部件可用來(lái)取代反射鏡30。
物鏡40是一個(gè)無(wú)限校正物鏡裝置，其具有用于接收來(lái)自分色鏡30的基本未聚焦平行激發(fā)光束的后面透鏡部分42，和用于聚焦該激發(fā)光束到樣品的焦平面上的前面透鏡部分44。通過(guò)利用上述擴(kuò)束器20，無(wú)限校正物鏡40優(yōu)選地被設(shè)計(jì)成提供最小功率衰減和減少的超短激發(fā)激光脈沖展寬。而且，無(wú)限校正物鏡40可以提供多種不同的數(shù)值孔徑(NA)和放大能力特性。表1提供了無(wú)限校正物鏡40可提供的示意性NA和放大能力特性的列表。
表1

本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該明白，其它NA和放大能力的透鏡可被用來(lái)實(shí)現(xiàn)特定應(yīng)用所需的分辨率和放大率。
無(wú)限校正物鏡40的前面透鏡部分44會(huì)聚激發(fā)光到平面區(qū)域上，以使橫跨焦平面預(yù)定區(qū)域上存在充分的光子密度，以促使在對(duì)應(yīng)于焦平面的預(yù)定區(qū)域的相對(duì)大區(qū)域內(nèi)熒光材料的多光子同時(shí)激發(fā)。這種相對(duì)大區(qū)域允許通過(guò)諸如雙目目鏡的光學(xué)探測(cè)器觀察圖像。除此之外，樣品大區(qū)域的同時(shí)激發(fā)允許對(duì)顯微圖像探測(cè)器上的至少兩個(gè)像素進(jìn)行同時(shí)檢測(cè)。但是，不同于上述現(xiàn)有技術(shù)的廣視場(chǎng)多光子顯微系統(tǒng)，圖1的實(shí)施例提供了清晰圖像切片所期望的軸向分辨率，這將在下文中描述。因此，固定樣品的平臺(tái)50優(yōu)選地是相對(duì)于物鏡沿光束的軸向可動(dòng)的，如圖1中的箭頭53所示。這種相對(duì)移動(dòng)提供了在樣品的不同深度的激發(fā)平面的聚焦，所以可以實(shí)施樣品的3-D成像。
平臺(tái)50的相對(duì)移動(dòng)可通過(guò)相對(duì)于固定的物鏡40沿著軸向移動(dòng)平臺(tái)來(lái)提供，或相對(duì)于固定的平臺(tái)50移動(dòng)物鏡40來(lái)提供。同樣，還可以既提供平臺(tái)50的移動(dòng)又提供物鏡40的移動(dòng)。而且，平臺(tái)50和/或物鏡的移動(dòng)可通過(guò)手動(dòng)或自動(dòng)的移動(dòng)機(jī)構(gòu)實(shí)現(xiàn)，這些機(jī)構(gòu)對(duì)于顯微技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員是熟知的。例如，可以通過(guò)電動(dòng)機(jī)或齒輪傳動(dòng)裝置，或壓電執(zhí)行組件提供軸向移動(dòng)。這種自動(dòng)的移動(dòng)可被計(jì)算機(jī)控制，如顯微技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的那樣。
從樣品的預(yù)定激發(fā)區(qū)域收集的發(fā)射光返回穿過(guò)無(wú)限校正物鏡40的前面透鏡部分44，并從后面透鏡部分42射出，作為被引導(dǎo)向分色鏡30的基本平行的光束。如上所述，分色鏡30被設(shè)計(jì)成反射激發(fā)光25的波長(zhǎng)并通過(guò)發(fā)射光55的波長(zhǎng)。因此，分色鏡30起到從激發(fā)光25中分離發(fā)射光55的作用。發(fā)射濾光器60阻擋除發(fā)射波長(zhǎng)以外的波長(zhǎng)，并將濾光后的平行發(fā)射光束施加到聚焦透鏡70。由于發(fā)射光束是基本平行的，所以聚焦透鏡70被提供來(lái)會(huì)聚該發(fā)射光束到像平面80上，以便可以探測(cè)并觀察樣品的圖像。該聚焦透鏡可以是管筒透鏡，或其它任何將平行的發(fā)射光束聚焦到焦平面80上的已知透鏡。在圖1所示的實(shí)施例中，焦平面80與探測(cè)裝置90相對(duì)應(yīng)。探測(cè)裝置90可以是簡(jiǎn)單的光學(xué)探測(cè)器，例如圖1中所示的雙目目鏡，攝像機(jī)，冷卻CCD相機(jī)，電子轟擊CCD相機(jī)或任何其它用于探測(cè)圖像的已知裝置。
圖1的廣視場(chǎng)多光子顯微系統(tǒng)提供了橫跨焦平面的同時(shí)多光子激發(fā)，其具有比圖7中所示的那種現(xiàn)有技術(shù)系統(tǒng)改進(jìn)的軸向分辨率。如上所述，本發(fā)明人認(rèn)識(shí)到，圖7系統(tǒng)中的軸向分辨率損失是由于施加到物鏡上的聚焦激發(fā)光束引起的。因此，不同于圖7的系統(tǒng)，圖1的本發(fā)明的激發(fā)光束是作為基本平行光束施加到物鏡40的。在優(yōu)選的實(shí)施例中，基本平行的激發(fā)光束是通過(guò)利用擴(kuò)束器擴(kuò)展脈沖激光的束寬而提供的，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，這仍舊提供了足夠的能量以橫跨相對(duì)大區(qū)域焦平面產(chǎn)生激發(fā)。將基本平行的光束施加到物鏡上減少了激發(fā)光源的脈沖展寬，這允許橫跨樣品中的平面產(chǎn)生共焦激發(fā)。脈沖展寬的減少還同樣由被分色鏡30向物鏡反射而不像圖7的系統(tǒng)那樣穿過(guò)反射鏡的激發(fā)光束來(lái)提供。而且，通過(guò)除去激發(fā)光束穿過(guò)的2個(gè)光學(xué)部件(圖7中的聚焦透鏡和分色鏡)，可以減少激發(fā)光的衰減，從而允許沿著焦平面的更大樣品激發(fā)。
通過(guò)提供激發(fā)的共焦平面，本發(fā)明的廣視場(chǎng)顯微系統(tǒng)減少了對(duì)激發(fā)光束掃描的需要。在優(yōu)選實(shí)施例中，激發(fā)平面覆蓋期望的觀察平面，以致于根本不需要掃描機(jī)構(gòu)，例如圖1中的實(shí)施例。但是，當(dāng)期望的圖像觀察區(qū)域太大而不能同時(shí)發(fā)生多光子激發(fā)時(shí)，一些沿著xy方向的廣視場(chǎng)系統(tǒng)的掃描可被用來(lái)提供改進(jìn)的圖像，這些圖像被組合來(lái)提供覆蓋樣品期望區(qū)域的圖像切片。例如，樣品的同時(shí)多光子激發(fā)區(qū)域覆蓋顯微鏡探測(cè)器的至少兩個(gè)像素區(qū)域是足夠的。當(dāng)利用諸如雙目目鏡的光學(xué)探測(cè)器時(shí)，同時(shí)多光子激發(fā)區(qū)域覆蓋用戶通過(guò)目鏡可以觀察的區(qū)域是足夠的。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以容易地實(shí)現(xiàn)同時(shí)激發(fā)區(qū)域的調(diào)整。例如，通過(guò)改變擴(kuò)束器中光學(xué)元件的相對(duì)位置可以實(shí)現(xiàn)調(diào)整。除了減少掃描外，由于背景熒光的減少而產(chǎn)生改進(jìn)的對(duì)比度，本發(fā)明可以生成改進(jìn)的圖像切片，并可以相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)的廣視場(chǎng)系統(tǒng)進(jìn)一步減少漂白和組織損傷問(wèn)題。
更進(jìn)一步，本發(fā)明的廣視場(chǎng)顯微系統(tǒng)可以提供改進(jìn)的圖像獲取時(shí)間。特別的，激發(fā)光束掃描的減少或消除允許更多時(shí)間用于曝光，這將產(chǎn)生更快速的獲取時(shí)間。而且，雖然圖像獲取時(shí)間與分布在本發(fā)明的廣視場(chǎng)系統(tǒng)的寬區(qū)域上的焦點(diǎn)處的光束強(qiáng)度有關(guān)，但是廣視場(chǎng)系統(tǒng)提供的效率上的改進(jìn)可以不需要或只需要增加一點(diǎn)同時(shí)觀察寬區(qū)域所需的曝光時(shí)間。特別地，通常衰減現(xiàn)有技術(shù)的焦點(diǎn)多光子顯微系統(tǒng)的激發(fā)光源，以避免樣品的組織損傷。本發(fā)明的廣視場(chǎng)多光子顯微系統(tǒng)可使用激發(fā)光源的全功率，并將該功率分布在較大的平面區(qū)域之上，以使該區(qū)域之上的平均功率仍舊低于組織損傷的閾值功率。因此，大區(qū)域的曝光時(shí)間并不需要被增加超過(guò)現(xiàn)有的小區(qū)域曝光時(shí)間，因?yàn)檫@種通常使用衰減光束的小區(qū)域曝光是本發(fā)明所避免的。
即使假定本發(fā)明沒(méi)有提供任何效率改進(jìn)，但是本發(fā)明的減少或無(wú)掃描顯微鏡產(chǎn)生的圖像獲取時(shí)間也將較小地增加超過(guò)或沒(méi)有增加超過(guò)利用在相同的區(qū)域上掃描較高的功率斑點(diǎn)的現(xiàn)有點(diǎn)掃描技術(shù)所需的圖像獲取時(shí)間。例如，利用現(xiàn)有掃描顯微鏡掃描1000×1000像素圖像可能需要1秒(每個(gè)像素曝光1微秒)。在本發(fā)明中，該光束可擴(kuò)展到利用1秒曝光時(shí)間收集發(fā)射光，而曝光整個(gè)1000×1000像素圖像。在該利用擴(kuò)展光束的情況下，每個(gè)像素接受1,000,000次較低的激發(fā)能量，而曝光時(shí)間增加1,000,000倍，因此凈成像結(jié)果是相同的。
圖2是根據(jù)本發(fā)明另一個(gè)實(shí)施例的廣視場(chǎng)多光子顯微系統(tǒng)的系統(tǒng)圖。在圖2的實(shí)施例中，利用弧光燈210提供激發(fā)光。如圖1中描述的激光光源，弧光燈210提供具有足夠?qū)е聵悠芳ぐl(fā)的單光子能級(jí)的預(yù)定波長(zhǎng)的激發(fā)光。然而，弧光燈210產(chǎn)生具有不需要擴(kuò)束器的寬束寬的基本未聚焦的平行激發(fā)光束。弧光燈210優(yōu)選是高功率弧光燈，其產(chǎn)生具有允許當(dāng)激發(fā)光束被聚焦到樣品的焦平面時(shí)的多光子激發(fā)的足夠功率的基本平行光束。以與圖1的實(shí)施例相同的方法，將基本未聚焦的平行激發(fā)光束施加到樣品，并收集來(lái)自樣品的發(fā)射光，因此沒(méi)有重復(fù)對(duì)剩余光學(xué)部件的討論。
圖3是根據(jù)本發(fā)明另一實(shí)施例的廣視場(chǎng)多光子顯微系統(tǒng)。如圖中所示，本發(fā)明的實(shí)施例包括設(shè)置在物鏡70和像平面80之間的中間像平面中的塞孔375。塞孔375提高了激發(fā)平面的共焦性，以便可以獲得樣品的更清晰的圖像切片和3-D圖像。雖然圖3中所示的與超短脈沖激發(fā)光源有關(guān)，但是塞孔375可以和例如相對(duì)于圖2描述的弧光燈一起使用。塞孔375可被實(shí)施成可沿著xy方向掃描的可移動(dòng)的孔。在另一實(shí)施例中，塞孔375可實(shí)施為具有通過(guò)旋轉(zhuǎn)掃描發(fā)射面的多個(gè)針孔的尼普科夫圓盤(pán)。旋轉(zhuǎn)尼普科夫圓盤(pán)和xy掃描塞孔對(duì)于共焦顯微領(lǐng)域的技術(shù)人員都是熟知的。以與圖1的實(shí)施例相同的方法，將基本未聚焦的平行激發(fā)光束施加到樣品，并收集來(lái)自樣品的發(fā)射光，因此沒(méi)有重復(fù)對(duì)剩余光學(xué)部件的討論。
圖4是根據(jù)本發(fā)明再一實(shí)施例的廣視場(chǎng)多光子顯微系統(tǒng)。在圖4的實(shí)施例中，通過(guò)產(chǎn)生分別具有第一和第二波長(zhǎng)的激發(fā)光的兩個(gè)光源410和420提供激發(fā)光。光源410和420可以實(shí)施成圖1中描述的超短脈沖激光器10，或圖2中描述的弧光燈210。而且，其它具有不同波長(zhǎng)的光源可以添加到圖4中省略號(hào)表示的系統(tǒng)中。光源410和420產(chǎn)生的激發(fā)光通過(guò)光束組合器430結(jié)合成具有至少兩種激發(fā)光波長(zhǎng)的單激發(fā)光束440。因此，圖4的系統(tǒng)可用于多熒光成像，其中不同波長(zhǎng)的激光脈沖被施加到利用具有根本不同的發(fā)射特性的不同熒光材料標(biāo)記的樣品。
光束組合器包括配置成將光源410和420的激發(fā)光彼此疊加的光學(xué)部件。例如，光束組合器可以是分色鏡，該分色鏡通過(guò)與光束440軸向?qū)?zhǔn)的光源410產(chǎn)生的第一波長(zhǎng)，而反射定位成與光束440的軸正交的光源420產(chǎn)生的第二波長(zhǎng)。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以實(shí)施其它已知的光束組合器。如圖上述的實(shí)施例，具有至少兩種波長(zhǎng)的激發(fā)光束440是基本未聚焦的平行光束。因此，雖然圖4中沒(méi)有示出，但是當(dāng)光源被實(shí)施成超短脈沖激光器時(shí)，如圖1所描述的利用擴(kuò)束器擴(kuò)展光束。
通過(guò)與圖1-3中所描述的基本相似的光學(xué)系統(tǒng)，將基本未聚焦的平行激發(fā)光束施加到樣品。但是，在圖4的實(shí)施例中，樣品包括對(duì)應(yīng)于激發(fā)光束的每種波長(zhǎng)的熒光材料。因此，樣品中不同熒光材料的多光子激發(fā)同時(shí)發(fā)生，以提供用來(lái)對(duì)比樣品的不同部分的不同波長(zhǎng)發(fā)射光。這種發(fā)射光由物鏡收集，并被以與上述基本相同的方法送到探測(cè)器。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員應(yīng)該明白，諸如圖4實(shí)施例中的分色鏡的光學(xué)部件應(yīng)該設(shè)計(jì)成適應(yīng)包括在激發(fā)和發(fā)射光束中的波長(zhǎng)范圍。而且，圖3中描述的塞孔可實(shí)施到圖4的實(shí)施例中。
對(duì)于本發(fā)明具有設(shè)置在平臺(tái)上的樣品之下的激發(fā)源和透鏡系統(tǒng)的顯微鏡，已經(jīng)描述了圖1-4的實(shí)施例。然而，本發(fā)明的廣視場(chǎng)多光子顯微系統(tǒng)可被實(shí)施成直立顯微鏡，其具有平臺(tái)之上的激發(fā)系統(tǒng)和平臺(tái)之上的透鏡系統(tǒng)。而且，本發(fā)明的廣視場(chǎng)多光子顯微系統(tǒng)可與焦點(diǎn)系統(tǒng)結(jié)合實(shí)施。具體地，聚焦光束可被施加到樣品和用于激光消融掃描的光柵，而廣視場(chǎng)光束可用于多光子激發(fā)和檢測(cè)。而且，根據(jù)本發(fā)明的多廣視場(chǎng)激發(fā)光束可以平行地排列在類(lèi)似于參看圖8所述的現(xiàn)有技術(shù)系統(tǒng)的構(gòu)造中。然而，需要注意的是，本發(fā)明的這種實(shí)施不需要掃描廣視場(chǎng)光束陣列。這些系統(tǒng)可被具有這里所描述的本發(fā)明知識(shí)的本領(lǐng)域普通技術(shù)人員容易地實(shí)施。
再進(jìn)一步，本發(fā)明的廣視場(chǎng)多光子顯微系統(tǒng)可以實(shí)施成例如用于活的有機(jī)體內(nèi)成像的柔性顯微鏡。圖5示出了利用本發(fā)明的廣視場(chǎng)多光子激發(fā)技術(shù)的柔性顯微鏡。如圖中所示，該系統(tǒng)包括耦合到光纖520的外部單元510，該光纖520在遠(yuǎn)離該外部單元的光纖末端具有物鏡530。在優(yōu)選實(shí)施例中，該物鏡530只包括對(duì)應(yīng)于相對(duì)于圖1描述的前面透鏡的聚焦透鏡。在該實(shí)施例中，無(wú)限校正物鏡，管筒透鏡，激發(fā)光源以及其它任何光學(xué)部件都設(shè)置在外部單元510中。但是，無(wú)限校正透鏡和其它光學(xué)部件可被實(shí)施成光纖的物鏡單元，以減少脈沖激發(fā)激光束的脈沖展寬。而且，光纖520可被實(shí)施成多個(gè)單個(gè)光纖，并可被封裝在導(dǎo)管中。
優(yōu)選實(shí)施例的例子例1.根據(jù)本發(fā)明，可改進(jìn)具有機(jī)械化Z焦點(diǎn)電動(dòng)機(jī)和外熒光設(shè)備的ZeissAxiovert135(Carl Zeiss，德國(guó))廣視場(chǎng)顯微鏡以用于2-光子廣視場(chǎng)熒光。物鏡包括Zeiss 10X，20X，40X，63X和100X Plan-neofluar和Plan-Apcromat，其物鏡具有的NA在0.4-1.4的范圍內(nèi)。熒光濾光器滑動(dòng)器中的一個(gè)位置包含專(zhuān)門(mén)的濾光器，以適應(yīng)2-光子激發(fā)和發(fā)射。分色鏡及激發(fā)和發(fā)射濾光器在激發(fā)側(cè)沒(méi)有包含濾光器，而是包含由Chroma Technology Corporation，Rockingham，VT生產(chǎn)的反射波長(zhǎng)為700nm以上的光而通過(guò)波長(zhǎng)為700nm以下的光的專(zhuān)門(mén)分色鏡。根據(jù)染料和脈沖激光器照明的波長(zhǎng)，可以使用450nm到700nm之間的各種帶通發(fā)射濾光器。移去弧光燈和外部照明路徑中的光學(xué)部件，并利用在700-1100nm范圍可調(diào)諧的光譜物理學(xué)(Mountain View，CA)可調(diào)MaiTai飛秒激光器取代弧光燈照明系統(tǒng)。
能夠維持激光束的相干性和橫跨擴(kuò)展光束的激光飛秒脈寬的均勻性的常規(guī)設(shè)計(jì)的擴(kuò)束器設(shè)置在激光器的出口和顯微激發(fā)光路的入口之間。將Hamamatsu(Japan)Orca-ER冷卻CCD相機(jī)安裝在顯微鏡上，記錄熒光圖像。使用諸如Universal Imaging MetaMorph(Downingtown，PA)或ScanalyticsIPLab(Fall Church，VA)的軟件來(lái)控制顯微鏡的焦點(diǎn)、相機(jī)并獲取圖像。使用單獨(dú)的計(jì)算機(jī)控制MaiTai激光器，選擇激光特性和2-光子激發(fā)的波長(zhǎng)。圖像獲取軟件通過(guò)一些線路與控制MaiTai激光器的計(jì)算機(jī)進(jìn)行通信，選擇激發(fā)波長(zhǎng)。
使用2-光子顯微鏡，對(duì)來(lái)自生長(zhǎng)于安裝在阿托氟石(Attofluor)不銹鋼蓋玻片固定器(Molecular Probes(分子探針)，Eugene OR)中的25mm玻璃蓋玻片上的活細(xì)胞的熒光圖像進(jìn)行成像。在活細(xì)胞的情況下，例如，胞內(nèi)鈣被在裝載有比率染料fura-2AM(激發(fā)705nm和760nm，發(fā)射500nm-520nm)或fluo-4AM(激發(fā)970nm，發(fā)射520nm)的細(xì)胞內(nèi)成像。從來(lái)自多種細(xì)胞類(lèi)型和組織的人工培養(yǎng)的細(xì)胞和組織部分中準(zhǔn)備的載玻片通過(guò)使該載玻片與特殊抗血清反應(yīng)，并利用熒光標(biāo)記的第二抗體可用于特殊抗原的成像，以檢測(cè)載玻片上的原始抗體。利用Alexa350，Alexa488和Alexa546標(biāo)記的次級(jí)抗體被用來(lái)檢測(cè)原始抗體。這些染料可用飛秒激光器產(chǎn)生的700nm，976nm和1092nm的光分別或同時(shí)激發(fā)。多帶通發(fā)射濾光器(Chroma61003m)被用來(lái)監(jiān)測(cè)每一波長(zhǎng)處的發(fā)射。
例子2.
根據(jù)本發(fā)明，可改進(jìn)通道HT高容量篩選(Pathway HT High ContentScreening)顯微鏡(Atto Bioscience，Inc)以用于2-光子廣視場(chǎng)熒光。物鏡包括Zeiss 10X，20X，40X，63X和100X Plan-neofluar和Plan-Apcromat，和Olympus 20X 0.75NA和60X 1.4NA物鏡。分色鏡及激發(fā)和發(fā)射濾光器輪在激發(fā)側(cè)不包含任何濾片器，而是包括Chroma Technology Corporation，Rockingham，VT生產(chǎn)的反射波長(zhǎng)為700nm以上的光而通過(guò)波長(zhǎng)為700nm以下的光的專(zhuān)門(mén)分色鏡。根據(jù)染料和脈沖激光器照明的波長(zhǎng)，可以使用450nm到700nm之間的各種帶通發(fā)射濾光器。用在700-1100nm范圍內(nèi)可調(diào)諧的光譜物理學(xué)(Mountain View，CA)可調(diào)MaiTai飛秒激光器取代弧光燈和用于燈的外部照明路徑中的其他光學(xué)部件。
能夠維持激光束的相干性和橫跨擴(kuò)展光束的激光飛秒脈寬的均勻性的常規(guī)設(shè)計(jì)的擴(kuò)束器設(shè)置在激光器的出口與顯微激發(fā)光路的入口之間。裝置中的Hamamatsu(Japan)Orca-ER冷卻CCD相機(jī)可以記錄熒光圖像。該裝置固有的軟件可用來(lái)控制顯微鏡的焦點(diǎn)、物鏡位置，相機(jī)以及獲取圖像。使用單獨(dú)的計(jì)算機(jī)控制MaiTai激光器，以選擇激光特性和2-光子激發(fā)的波長(zhǎng)。圖像獲取軟件通過(guò)串行線與控制MaiTai激光器的計(jì)算機(jī)通信，選擇激發(fā)波長(zhǎng)。
使用2-光子顯微鏡，對(duì)來(lái)自生長(zhǎng)于安裝在阿托氟石(attofluor)不銹鋼蓋玻片固定器(Molecular Probes(分子探針)，Eugene OR)中的25mm玻璃蓋玻片上的活細(xì)胞的熒光圖像進(jìn)行成像。在活細(xì)胞的情況下，例如，胞內(nèi)鈣被在裝載有比率染料fura-2AM(激發(fā)705nm和760nm，發(fā)射500nm-520nm)或fluo-4AM(激發(fā)970nm，發(fā)射520nm)的細(xì)胞內(nèi)成像。通過(guò)用于高產(chǎn)量或高容量藥品篩選的本發(fā)明，根據(jù)它們的熒光發(fā)射可以監(jiān)測(cè)多級(jí)板內(nèi)的標(biāo)記有熒光染料的固定或活的細(xì)胞。從來(lái)自各種細(xì)胞類(lèi)型和組織的人工培養(yǎng)的細(xì)胞和組織部分中制備的載玻片，通過(guò)使該載玻片與特殊抗血清反應(yīng)，并利用熒光標(biāo)記的第二抗體，可以用于特殊抗原的成像，以檢測(cè)載玻片上的原始抗體。利用Alexa 350，Alexa 488和Alexa 546標(biāo)記的次級(jí)抗體可被用來(lái)檢測(cè)原始抗體。這些染料利用飛秒激光器產(chǎn)生的700nm，976nm和1092nm光進(jìn)行激發(fā)。多帶通發(fā)射濾光器(Chroma 61003m)被用來(lái)監(jiān)測(cè)每一波長(zhǎng)處的發(fā)射。
顯然，根據(jù)上面的教導(dǎo)，本發(fā)明的許多改進(jìn)和改變都是可能的。因此，應(yīng)當(dāng)理解的是，在所附權(quán)利要求的范圍之內(nèi)，本發(fā)明可以以與這里具體描述不同的方式進(jìn)行實(shí)施。
權(quán)利要求
1.一種廣視場(chǎng)顯微鏡，包括配置成固定其內(nèi)有熒光材料的樣品的平臺(tái)；配置成產(chǎn)生基本平行的激發(fā)光束的多光子激發(fā)光源，該激發(fā)光束具有的單光子能量低于所述熒光材料的單光子激發(fā)所需的吸收能量；無(wú)限校正物鏡，其光學(xué)耦合到該多光子激發(fā)光源并被配置成將基本平行的激發(fā)光束聚焦到樣品上，以使熒光材料的多光子激發(fā)在樣品的預(yù)定區(qū)域上同時(shí)發(fā)生；配置成將從該樣品的所述預(yù)定區(qū)域發(fā)出的發(fā)射光同時(shí)地聚焦到圖像探測(cè)器的至少兩個(gè)像素上的聚焦透鏡。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的廣視場(chǎng)顯微鏡，其中所述顯微鏡不配置成沿著橫跨該樣品的x或y方向掃描該基本平行的激發(fā)光束。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的廣視場(chǎng)顯微鏡，還包括分色鏡，該分色鏡被配置成向該無(wú)限校正物鏡反射該激發(fā)光，并通過(guò)其向聚焦透鏡傳送該發(fā)射光。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的廣視場(chǎng)顯微鏡，其中該分色鏡包括配置成反射相對(duì)長(zhǎng)波長(zhǎng)激發(fā)光而通過(guò)相對(duì)較短波長(zhǎng)發(fā)射光的表面。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的廣視場(chǎng)顯微鏡，還包括設(shè)置在該分色鏡和聚焦透鏡之間的光路中的發(fā)射濾光器。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的廣視場(chǎng)顯微鏡，還包括配置成調(diào)整該無(wú)限校正物鏡和固定在該平臺(tái)上的該樣品之間的距離的移動(dòng)系統(tǒng)。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的廣視場(chǎng)顯微鏡，其中該平臺(tái)是固定的，而物鏡裝置沿著任一或所有X，Y，和Z維移動(dòng)。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的廣視場(chǎng)顯微鏡，其中物鏡裝置是固定的，而該平臺(tái)沿著任一或所有X，Y，和Z維移動(dòng)。
9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的廣視場(chǎng)顯微鏡，其中該移動(dòng)系統(tǒng)包括手工移動(dòng)系統(tǒng)。
10.根據(jù)權(quán)利要求6所述的廣視場(chǎng)顯微鏡，其中該移動(dòng)系統(tǒng)包括機(jī)械移動(dòng)系統(tǒng)。
11.根據(jù)權(quán)利要求6所述的廣視場(chǎng)顯微鏡，其中該移動(dòng)系統(tǒng)包括計(jì)算機(jī)控制的移動(dòng)系統(tǒng)。
12.根據(jù)權(quán)利要求6所述的廣視場(chǎng)顯微鏡，其中該移動(dòng)系統(tǒng)包括壓電移動(dòng)系統(tǒng)。
13.根據(jù)權(quán)利要求1所述的廣視場(chǎng)顯微鏡，其中檢測(cè)裝置包括攝像機(jī)。
14.根據(jù)權(quán)利要求1所述的廣視場(chǎng)顯微鏡，其中檢測(cè)裝置包括冷卻CCD相機(jī)。
15.根據(jù)權(quán)利要求1所述的廣視場(chǎng)顯微鏡，其中檢測(cè)裝置包括電子轟擊CCD相機(jī)。
16.根據(jù)權(quán)利要求1所述的廣視場(chǎng)顯微鏡，其中該多光子激發(fā)光源包括配置成發(fā)射激發(fā)光的激光器；以及配置成將激發(fā)光形成比該激光器提供的光束具有更寬光束直徑的基本平行光束的擴(kuò)束器。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的廣視場(chǎng)顯微鏡，其中該激光器包括被配置成提供皮秒、飛秒或更短脈沖持續(xù)時(shí)間的脈沖激光光源，以及該擴(kuò)束器被配置成提供基本沒(méi)有脈沖展寬的脈沖激光。
18.根據(jù)權(quán)利要求16所述的廣視場(chǎng)顯微鏡，其中該激光器包括被配置成提供皮秒、飛秒或更短脈沖持續(xù)時(shí)間的脈沖激光光源，以及該擴(kuò)束器被配置成提供擴(kuò)展的脈沖激光束，該擴(kuò)展的脈沖激光束具有橫跨該擴(kuò)展的脈沖激光束的區(qū)域的基本均勻特性。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的廣視場(chǎng)顯微鏡，其中該擴(kuò)束器被配置成對(duì)所有脈沖光束的光提供基本等量的擴(kuò)束器介質(zhì)。
20.根據(jù)權(quán)利要求16所述的廣視場(chǎng)顯微鏡，其中該擴(kuò)束器被配置成擴(kuò)展激光束直徑100倍。
21.根據(jù)權(quán)利要求16所述的廣視場(chǎng)顯微鏡，其中該激光器包括在大約700nm和大約1100nm之間可調(diào)諧的可調(diào)諧激光器。
22.根據(jù)權(quán)利要求16所述的廣視場(chǎng)顯微鏡，其中該激光器被配置成輸出具有800nm波長(zhǎng)的光。
23.根據(jù)權(quán)利要求1所述的廣視場(chǎng)顯微鏡，其中該多光子激發(fā)光源包括具有在大約300nm和2000nm之間的波長(zhǎng)輸出的弧光燈。
24.根據(jù)權(quán)利要求23所述的廣視場(chǎng)顯微鏡，其中該弧光燈是可調(diào)諧的。
25.根據(jù)權(quán)利要求1所述的廣視場(chǎng)顯微鏡，其中該多光子激發(fā)光源包括配置成產(chǎn)生具有第一波長(zhǎng)的激發(fā)光的第一激發(fā)光發(fā)生器；配置成產(chǎn)生具有第二波長(zhǎng)的激發(fā)光的第二激發(fā)光發(fā)生器；以及配置成將該第一和第二發(fā)生器的激發(fā)光組合成包括第一和第二波長(zhǎng)的基本未聚焦的平行激發(fā)光束的光束組合器。
26.根據(jù)權(quán)利要求25所述的廣視場(chǎng)顯微鏡，其中光發(fā)生器包括脈沖至少一個(gè)的激光器和弧光燈。
27.根據(jù)權(quán)利要求25所述的廣視場(chǎng)顯微鏡，其中該光束組合器包括分色鏡。
28.根據(jù)權(quán)利要求1所述的廣視場(chǎng)顯微鏡，其中該無(wú)限校正物鏡包括配置成聚焦光束的前面透鏡部分；以及配置成維持光束基本平行的后面透鏡部分。
29.根據(jù)權(quán)利要求1所述的廣視場(chǎng)顯微鏡，其中該無(wú)限校正物鏡裝置包括具有4倍放大率和0.10數(shù)值孔徑(NA)的物鏡。
30.根據(jù)權(quán)利要求1所述的廣視場(chǎng)顯微鏡，其中該無(wú)限校正物鏡包括具有10倍放大率和0.25NA的物鏡。
31.根據(jù)權(quán)利要求1所述的廣視場(chǎng)顯微鏡，其中該無(wú)限校正物鏡包括具有20倍放大率和0.75NA的物鏡。
32.根據(jù)權(quán)利要求1所述的廣視場(chǎng)顯微鏡，其中該無(wú)限校正物鏡包括具有32倍放大率和0.40NA的物鏡。
33.根據(jù)權(quán)利要求1所述的廣視場(chǎng)顯微鏡，其中該無(wú)限校正物鏡包括具有40倍放大率和1.4NA的物鏡。
34.根據(jù)權(quán)利要求1所述的廣視場(chǎng)顯微鏡，其中該無(wú)限校正物鏡包括具有40倍放大率和1.25NA的物鏡。
35.根據(jù)權(quán)利要求1所述的廣視場(chǎng)顯微鏡，其中該無(wú)限校正物鏡包括具有60倍放大率和1.4NA的物鏡。
36.根據(jù)權(quán)利要求1所述的廣視場(chǎng)顯微鏡，其中該無(wú)限校正物鏡包括具有63倍放大率和1.4NA的物鏡。
37.根據(jù)權(quán)利要求1所述的廣視場(chǎng)顯微鏡，其中該無(wú)限校正物鏡包括具有100倍放大率和1.4NA的物鏡。
38.根據(jù)權(quán)利要求1所述的廣視場(chǎng)顯微鏡，其中該無(wú)限校正物鏡包括具有100倍放大率和1.3NA的物鏡。
39.根據(jù)權(quán)利要求1所述的廣視場(chǎng)顯微鏡，其中該系統(tǒng)包括直立顯微鏡或倒轉(zhuǎn)顯微鏡。
40.根據(jù)權(quán)利要求1所述的廣視場(chǎng)顯微鏡，其中該多光子激發(fā)光源被配置成產(chǎn)生基本未聚焦的平行激發(fā)光束，該基本未聚焦的平行激發(fā)光束具有的光子能量只有在該熒光材料基本同時(shí)吸收2個(gè)或更多個(gè)光子時(shí)才致使樣品激發(fā)。
41.根據(jù)權(quán)利要求40所述的廣視場(chǎng)顯微鏡，其中該多光子激發(fā)光源被配置成產(chǎn)生基本未聚焦的平行激發(fā)光束，該基本未聚焦的平行激發(fā)光束具有的光子能量只有在該熒光材料基本同時(shí)吸收3個(gè)或更多個(gè)光子時(shí)才致使樣品激發(fā)。
42.根據(jù)權(quán)利要求1所述的廣視場(chǎng)顯微鏡，還包括配置成將多個(gè)檢測(cè)的圖像組成樣品的三維圖像的計(jì)算機(jī)。
43.根據(jù)權(quán)利要求1所述的廣視場(chǎng)顯微鏡，還包括配置成調(diào)整所述基本平行的激發(fā)光束的束寬的調(diào)整裝置。
44.根據(jù)權(quán)利要求43所述的廣視場(chǎng)顯微鏡，其中所述調(diào)整裝置包括配置成改變擴(kuò)束器中的光學(xué)元件的相對(duì)位移的機(jī)構(gòu)。
45.一種廣視場(chǎng)顯微鏡，包括固定其內(nèi)有熒光材料的樣品的裝置；產(chǎn)生基本平行的激發(fā)光束的裝置，該基本平行的激發(fā)光束具有的單光子能量低于該樣品內(nèi)包含的熒光材料其單光子激發(fā)所需的吸收能量；光學(xué)耦合到多光子激發(fā)光源上的裝置，其用于接收基本平行的激發(fā)光束，并將該激發(fā)光聚焦到樣品上，以便熒光材料的多光子激發(fā)在樣品的預(yù)定區(qū)域上同時(shí)發(fā)生；以及將從該樣品的該預(yù)定區(qū)域產(chǎn)生的發(fā)射光同時(shí)聚焦到圖像探測(cè)器的至少兩個(gè)像素上的裝置。
46.根據(jù)權(quán)利要求45所述的廣視場(chǎng)顯微鏡，還包括向無(wú)限校正物鏡反射該激發(fā)光而通過(guò)該發(fā)射光到聚焦透鏡的裝置。
47.根據(jù)權(quán)利要求46所述的廣視場(chǎng)顯微鏡，還包括用于對(duì)該發(fā)射光濾光的裝置，該用于濾光的裝置設(shè)置在反射裝置和聚焦裝置之間的光路中。
48.根據(jù)權(quán)利要求45所述的廣視場(chǎng)顯微鏡，還包括固定該樣品的裝置；以及相對(duì)于用于接收該基本未聚焦平行光束的裝置移動(dòng)該樣品的裝置。
49.根據(jù)權(quán)利要求45所述的廣視場(chǎng)顯微鏡，還包括探測(cè)聚焦在像平面上的圖像的裝置。
50.根據(jù)權(quán)利要求49所述的廣視場(chǎng)顯微鏡，還包括將多個(gè)檢測(cè)的圖像組合成樣品的三維圖像的裝置。
51.一種橫跨共焦平面提供廣視場(chǎng)激發(fā)的方法，該方法包括固定其內(nèi)有熒光材料的樣品；產(chǎn)生基本平行的激發(fā)光束，該基本平行的激發(fā)光束具有的單光子能量低于在該樣品內(nèi)包含的熒光材料的單光子激發(fā)所需的吸收能量；施加基本平行的激發(fā)光束到無(wú)限校正物鏡，該無(wú)限校正物將該激發(fā)光聚焦到該樣品上，以便熒光材料的多光子激發(fā)在樣品的預(yù)定區(qū)域上同時(shí)發(fā)生；以及將從該樣品的所述預(yù)定區(qū)域發(fā)出的發(fā)射光同時(shí)聚焦到圖像探測(cè)器的至少兩個(gè)像素上。
52.根據(jù)權(quán)利要求51所述的方法，還包括監(jiān)測(cè)用于高產(chǎn)量或高容量藥品篩選的熒光發(fā)射的多阱(multi-well)板內(nèi)的標(biāo)記有熒光染料的固定或活的細(xì)胞。
53.根據(jù)權(quán)利要求49所述的方法，還包括向該無(wú)限校正物鏡反射激發(fā)光，并通過(guò)該發(fā)射光到聚焦透鏡。
54.根據(jù)權(quán)利要求50所述的方法，還包括聚焦該發(fā)射光到像平面上。
55.根據(jù)權(quán)利要求50所述的方法，還包括在該像平面之前在沿著聚焦發(fā)射光束的會(huì)聚點(diǎn)濾光該發(fā)射光。
56.根據(jù)權(quán)利要求50所述的方法，還包括通過(guò)相對(duì)于該無(wú)限校正物鏡移動(dòng)該樣品聚焦共焦激發(fā)平面。
57.根據(jù)權(quán)利要求50所述的方法，還包括檢測(cè)聚焦在該像平面上的圖像。
58.根據(jù)權(quán)利要求47所述的方法，還包括將多個(gè)檢測(cè)的圖像組合成樣品的三維圖像。
59.一種柔性顯微鏡，包括廣視場(chǎng)顯微鏡，包括配置成固定其內(nèi)有熒光材料的樣品的平臺(tái)；配置成產(chǎn)生基本平行的激發(fā)光束的多光子激發(fā)光源，該基本平行的激發(fā)光束具有的單光子能量低于所述熒光材料的單光子激發(fā)所需的吸收能量；光學(xué)耦合到該多光子激發(fā)光源并被配置成聚焦基本平行的激發(fā)光束到樣品上，以便熒光材料的多光子激發(fā)在樣品的預(yù)定區(qū)域上同時(shí)發(fā)生的無(wú)限校正物鏡；配置成將從該樣品的所述預(yù)定區(qū)域發(fā)出的發(fā)射光同時(shí)聚焦到圖像探測(cè)器的至少兩個(gè)像素上的聚焦透鏡；耦合到所述廣視場(chǎng)顯微鏡的光纖；以及附接在該光纖末端的光學(xué)部件固定器，其中至少所述廣視場(chǎng)顯微鏡的無(wú)限校正物鏡包括在所述光學(xué)部件固定器內(nèi)，且該廣視場(chǎng)顯微鏡的所有沒(méi)包括在該光學(xué)部件固定器內(nèi)的部件包括在光學(xué)耦合到該光纖的相反末端的外部單元內(nèi)。
60.一種廣視場(chǎng)顯微鏡，包括配置成固定其內(nèi)有熒光材料的樣品的平臺(tái)；配置成產(chǎn)生基本平行的激發(fā)光束的多光子激發(fā)光源，該基本平行的激發(fā)光束具有的單光子能量低于所述熒光材料的單光子激發(fā)所需的吸收能量；光學(xué)耦合到該多光子激發(fā)光源并被配置成聚焦基本平行的激發(fā)光束到樣品上，以便熒光材料的多光子激發(fā)在樣品的預(yù)定區(qū)域上同時(shí)發(fā)生的無(wú)限校正物鏡；配置成將從該樣品的所述預(yù)定區(qū)域發(fā)出的發(fā)射光聚焦到像平面的聚焦透鏡，以使所述像平面可通過(guò)雙目目鏡觀察。
61.一種廣視場(chǎng)顯微鏡，包括配置成固定其內(nèi)有熒光材料的樣品的平臺(tái)；配置成產(chǎn)生基本平行的激發(fā)光束的多光子激發(fā)光源，該基本平行的激發(fā)光束具有的單光子能量低于所述熒光材料的單光子激發(fā)所需的吸收能量；光學(xué)耦合到該多光子激發(fā)光源并被配置成聚焦基本平行的激發(fā)光束到樣品上，以便熒光材料的多光子激發(fā)在樣品的預(yù)定區(qū)域上同時(shí)發(fā)生的無(wú)限校正物鏡；配置成將從該樣品的所述預(yù)定區(qū)域發(fā)出的發(fā)射光聚焦到像平面的聚焦透鏡，以使所述像平面可通成像探測(cè)器陣列觀察。
全文摘要
一種廣視場(chǎng)顯微鏡，包括固定其內(nèi)有熒光材料的樣品的平臺(tái)(50)，產(chǎn)生基本平行的激發(fā)光束(25)的多光子激發(fā)光源(10)，該基本平行的激發(fā)光束(25)具有的單光子能量低于該熒光材料的單光子激發(fā)所需的吸收能量。
文檔編號(hào)G02B21/00GK101019060SQ200580015752
公開(kāi)日2007年8月15日 申請(qǐng)日期2005年5月17日 優(yōu)先權(quán)日2004年5月19日
發(fā)明者加里·布魯克 申請(qǐng)人:加里·布魯克