專利名稱：人免疫功能重建鼠子宮內(nèi)膜異位癥模型及建模方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及子宮內(nèi)膜異位癥模型及模型的建立方法
背景技術(shù)：
EM是一種常見的良性婦科疾病，多發(fā)生于生育年齡婦女；近年來，其發(fā)病率有明顯上升趨勢，迄今為止，關(guān)于內(nèi)異癥的發(fā)病機(jī)制尚不明確，需依靠腹腔鏡檢查或手術(shù)病理組織學(xué)檢查確診，且藥物治療和術(shù)后復(fù)發(fā)率較高。
EM模型可以通過狒狒、家兔、獼猴和大鼠同源自體內(nèi)膜移植來建立，但由于這些動物的內(nèi)膜和人的內(nèi)膜存在系統(tǒng)發(fā)生和生化特征方面的巨大差異，這類模型有諸多局限。
NOD-SCID小鼠即非肥胖性糖尿病嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷小鼠，為先天性T、B淋巴細(xì)胞聯(lián)合免疫缺陷動物，可以克服異種間的免疫排斥反應(yīng)，接受人類正常和腫瘤組織移植，移植后的組織仍保持原有的組織形態(tài)及生化特征，更接近人類疾病的病理變化；但是由于NOD-SCID鼠的免疫缺陷，不能進(jìn)行免疫調(diào)控，而且正常人的分泌期子宮內(nèi)膜并不容易獲得。
上述原因的存在，極大地限制了對于該疾病的研究。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明是為避免上述現(xiàn)有技術(shù)所存在的不足，提供一種人免疫功能重建鼠子宮內(nèi)膜異位癥模型，并提供該模型的建模方法，為研究子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)病機(jī)制、治療及預(yù)防策略提供基礎(chǔ)。
本發(fā)明解決技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是本發(fā)明人免疫功能重建鼠子宮內(nèi)膜異位癥模型的特點(diǎn)是將早孕人外周血單個核細(xì)胞(PBMC)輸入非肥胖性糖尿病嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷(NOD-SCID)小鼠體內(nèi)，重建人的免疫功能；將同一人蛻膜組織種植在所述(NOD-SCID)小鼠體內(nèi)建立的人免疫功能重建鼠子宮內(nèi)膜異位癥模型。
本發(fā)明所述模型建模方法的特點(diǎn)是按如下步驟操作a、外周血處理外周血采自妊娠婦女，分離外周血單個核細(xì)胞(PBMC)，作臺盼藍(lán)計(jì)數(shù)，用培養(yǎng)液(RPMI1640)調(diào)至2×107～2×108個細(xì)胞/毫升的細(xì)胞濃度，呈懸液；b、蛻膜取自行人工流產(chǎn)術(shù)的同一婦女，妊娠45-50天，婦檢證實(shí)無先兆流產(chǎn)征象，術(shù)后見明顯絨毛，蛻膜組織新鮮；所取蛻膜置入培養(yǎng)液(RPMI1640)無菌瓶，隨即置于冰盒；取小鼠(NOD-SCID)，6-8周齡，性成熟，雌性；c、接種前處理所取蛻膜用2-6℃磷酸緩沖鹽溶液(PBS)洗去血塊和黏液，于無菌培養(yǎng)皿內(nèi)剪成小塊，分裝在盛有培養(yǎng)液(RPMI1640)的無菌管內(nèi)為備用標(biāo)本；d、種植小鼠采用直線加速器全身照射；照射后輸注已備好的外周血單個核細(xì)胞(PBMC)懸液，按每只小鼠所需細(xì)胞總數(shù)在1×107～1×108注射外周血單個核細(xì)胞(PBMC)懸液0.2-0.8毫升；隨后麻醉小鼠，待小鼠麻醉后固定于操作板上，消毒備皮，并做小口，將已備標(biāo)本種植于體內(nèi)，無菌絲線縫合即成。
子宮內(nèi)膜就組織學(xué)觀察可以分為3期其一為增生期，內(nèi)膜細(xì)胞增生，內(nèi)膜逐漸生長變厚；其二為分泌期，子宮內(nèi)膜繼續(xù)增厚，內(nèi)膜細(xì)胞分泌糖原；其三為月經(jīng)期，內(nèi)膜組織變性、壞死、出血；受精卵著床后，子宮內(nèi)膜迅速發(fā)生蛻膜變，此時(shí)子宮內(nèi)膜稱蛻膜；本發(fā)明模形因選取早孕人蛻膜組織建立人免疫功能重建NOD-SCID鼠子宮內(nèi)膜異位癥動物模型，因而具備如下優(yōu)點(diǎn)1、蛻膜組織屬于正常生理妊娠的一部分，穩(wěn)定可靠，不受其他疾病因素的影響。
2、采用妊娠40-50天的蛻膜組織，不受子宮內(nèi)膜周期性變化的影響。
3、機(jī)體免疫系統(tǒng)對蛻膜呈現(xiàn)免疫豁免狀態(tài)，由此導(dǎo)致子宮內(nèi)膜容易異位種植，為造模提供了更好的理論依據(jù)。
4、蛻膜比增生期內(nèi)膜厚，易刮取，獲取組織較多，可以一次種植多只NOD-SCID鼠。
5、人工流產(chǎn)是避孕失敗的有效補(bǔ)救措施，蛻膜取自人工流產(chǎn)婦女，其來源豐富。
6、小鼠具有人的免疫功能，能夠進(jìn)行子宮內(nèi)膜異位癥免疫方面的研究。
NOD-SCID小鼠即非肥胖性糖尿病嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷小鼠，為先天性T、B淋巴細(xì)胞聯(lián)合免疫缺陷動物，可以克服異種間的免疫排斥反應(yīng)，接受人類正常和腫瘤組織移植，移植后的組織仍保持原有的組織形態(tài)及生化特征，更接近人類疾病的病理變化；此類小鼠雖然T、B淋巴細(xì)胞缺陷，而造血功能正常，對放射線極為敏感，全身照射可以清除小鼠內(nèi)源性造血系統(tǒng)而不損傷其骨髓微環(huán)境，后者可以支持人類造血干細(xì)胞的生長，所以可以在NOD-SCID小鼠中重建人的免疫功能；NOD-SCID小鼠遺傳背景明確，體內(nèi)微生物可控制，模型性狀顯著且穩(wěn)定，質(zhì)量和規(guī)格可選擇，價(jià)格適中，來源豐富；本發(fā)明NOD-SCID小鼠具有人的免疫功能，移植后的蛻膜仍保持子宮內(nèi)膜的組織形態(tài)，模型性狀顯著且穩(wěn)定，觀察周期短，實(shí)驗(yàn)結(jié)果具有較大的臨床參考意義。


圖1為本發(fā)明移植物HE染色×200
具體實(shí)施例方式本實(shí)施例中人免疫功能重建鼠子宮內(nèi)膜異位癥模型是將早孕人外周血單個核細(xì)胞PBMC輸入非肥胖性糖尿病嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷NOD-SCID小鼠體內(nèi)，重建人的免疫功能；將同一人蛻膜組織種植在所述NOD-SCID小鼠體內(nèi)建立的人免疫功能重建鼠子宮內(nèi)膜異位癥模型。
模型的建立按如下步驟操作1、外周血處理外周血采自妊娠婦女，分離外周血單個核細(xì)胞PBMC，作臺盼藍(lán)計(jì)數(shù)，用培養(yǎng)液RPMI1640調(diào)至2×107～2×108個細(xì)胞/毫升的細(xì)胞濃度，呈懸液。
2、取材蛻膜取自行人工流產(chǎn)術(shù)的同一婦女，妊娠45-50天，婦檢證實(shí)無先兆流產(chǎn)征象，術(shù)后見明顯絨毛，蛻膜組織新鮮；所取蛻膜置入5毫升RPMI1640培養(yǎng)液無菌瓶，隨即置于冰盒；具體實(shí)施中，PMRI1640培養(yǎng)液中可含有100U/ml青霉素和100U/ml鏈霉素，用于預(yù)防小鼠感染。
取NOD-SCID，6-8周齡，性成熟，雌性。
3、接種前處理所取蛻膜用2-6℃磷酸緩沖鹽溶液PBS洗去血塊和黏液，于無菌培養(yǎng)皿內(nèi)剪成1×2毫米小塊，分裝在盛有RPMI1640培養(yǎng)液的無菌管內(nèi)為備用標(biāo)本。
4、種植小鼠采用直線加速器全身照射，按照劑量率1戈瑞-1.5戈瑞，照射時(shí)間為2-3分鐘，照射總劑量為2戈瑞-3戈瑞進(jìn)行操作；要求照射達(dá)到清除小鼠內(nèi)源性造血系統(tǒng)而不損傷其骨髓微環(huán)境，如照射劑量過小，就可能沒有將小鼠內(nèi)源性造血系統(tǒng)全部清除，不利于免疫功能重建；如果照射劑量過大，則可能損傷小鼠骨髓微環(huán)境，導(dǎo)致其死亡。
照射后輸注已備好的外周血單個核細(xì)胞PBMC懸液，腹腔或尾靜脈注射外周血單個核細(xì)胞PBMC懸液0.2-0.8毫升，具體可以按每只0.5毫升PBMC懸液注射，其中含PBMC數(shù)為5×107；隨后，以氯胺酮100毫克/千克腹腔注射麻醉小鼠，待小鼠麻醉后固定于操作板上，將已備標(biāo)本種植于其體內(nèi)，包括種植在其皮下或腹腔內(nèi)。具體實(shí)施中，可以是對其腹部進(jìn)行消毒備皮，并做一只0.5厘米長小口，將已備標(biāo)本種植于皮下，無菌絲線縫合即成，皮下種植更有利于觀察。
關(guān)于輸注的細(xì)胞濃度由于每只小鼠輸注的外周血單個核細(xì)胞PBMC是一定的，體積太小(低于0.1毫升)，則細(xì)胞濃度太大，可能會堵塞注射器針孔，影響注射；如體積太大(超過1毫升)，可能會引起小鼠死亡。
關(guān)于輸注的細(xì)胞數(shù)量如果輸入細(xì)胞過少，可能會導(dǎo)致免疫功能重建失敗；如果輸入細(xì)胞過多，可能會導(dǎo)致小鼠死亡。
分組NOD-SCID鼠分組A組為8只小鼠，照射后輸注外周血、種植蛻膜；B組為8只小鼠，照射后種植蛻膜，未輸注外周血；C組4只小鼠，為不作任何處理的空白對照。
移植后處理移植4周，小鼠頸椎脫臼處死，取小鼠肝、脾、胸腺、淋巴結(jié)、外周血、腹腔液細(xì)胞懸液測定人CD3、CD19、HLA-ABC陽性細(xì)胞比例；取出腹部皮下病灶，10％福爾馬林固定，乙醇逐級脫水，常規(guī)石蠟包埋，做HE染色。
結(jié)果1、NOD-SCID鼠存活及生長情況A組有4只于照射后第5天和8天死亡，另4只存活至28天后被處死；B組8只先后于照射后7天內(nèi)死亡；C組4只均存活，可以排除飼養(yǎng)條件引起的感染。
2、外周血移植后人源性細(xì)胞測定外周血移植4周后，采用人特異單克隆抗體CD3-CY、CD19-FITC、HLA-ABC-PE測定小鼠骨髓、肝臟、脾臟、胸腺、淋巴結(jié)、外周血、腹腔液的人源性細(xì)胞情況。結(jié)果顯示肝臟CD3+細(xì)胞占16.33％-31.75％、HLA-ABC陽性細(xì)胞占17.56％-32.98％，脾臟CD3+細(xì)胞占3.84％-5.37％、HLA-ABC陽性細(xì)胞占4.06％-5.53％，淋巴結(jié)CD3+細(xì)胞占5.03％-5.15％、HLA-ABC陽性細(xì)胞占5.21％-5.36％，外周血CD3+細(xì)胞占2.47％-6.05％、HLA-ABC陽性細(xì)胞占4.25％-7.16％，腹腔液CD3+細(xì)胞占25.85％-51.43％、HLA-ABC陽性細(xì)胞占71.35％-87.80％，胸腺CD3+細(xì)胞6.05％-9.26％、HLA-ABC陽性細(xì)胞占6.50％-9.64％，骨髓CD3+細(xì)胞、HLA-ABC陽性細(xì)胞所占比例＜1％。各器官組織中CD19+細(xì)胞比例＜1％。說明重建人免疫功能是成功的。
3、蛻膜移植物病理第4周從小鼠腹部皮下取出病灶，常規(guī)石蠟包埋，HE染色，鏡檢見到子宮內(nèi)膜腺體和間質(zhì)(附圖所示)。說明移植后蛻膜的形態(tài)結(jié)構(gòu)沒有發(fā)生改變。
權(quán)利要求
1.一種人免疫功能重建鼠子宮內(nèi)膜異位癥模型，其特征是將早孕人外周血單個核細(xì)胞(PBMC)輸入非肥胖性糖尿病嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷(NOD-SCID)小鼠體內(nèi)，重建人的免疫功能；將同一人蛻膜組織種植在所述(NOD-SCID)小鼠體內(nèi)建立的人免疫功能重建鼠子宮內(nèi)膜異位癥模型。
2.一種權(quán)利要求1所述模型的建立方法，其特征是按如下步驟操作a、外周血處理外周血采自妊娠婦女，分離外周血單個核細(xì)胞(PBMC)，作臺盼藍(lán)計(jì)數(shù)，用培養(yǎng)液(RPMI1640)調(diào)至2×107～2×108個細(xì)胞/毫升的細(xì)胞濃度，呈懸液；b、蛻膜取自行人工流產(chǎn)術(shù)的同一婦女，妊娠45-50天，婦檢證實(shí)無先兆流產(chǎn)征象，術(shù)后見明顯絨毛，蛻膜組織新鮮；所取蛻膜置入培養(yǎng)液(RPMI1640)無菌瓶，隨即置于冰盒；取小鼠(NOD-SCID)，6-8周齡，性成熟，雌性；c、接種前處理所取蛻膜用2-6℃磷酸緩沖鹽溶液(PBS)洗去血塊和黏液，于無菌培養(yǎng)皿內(nèi)剪成小塊，分裝在盛有培養(yǎng)液(RPMI1640)的無菌管內(nèi)為備用標(biāo)本d、種植小鼠采用直線加速器全身照射；照射后輸注已備好的外周血單個核細(xì)胞(PBMC)懸液，按每只小鼠所需細(xì)胞總數(shù)在1×107～1×108注射外周血單個核細(xì)胞(PBMC)懸液0.2-0.8毫升；隨后麻醉小鼠，待小鼠麻醉后固定于操作板上，消毒備皮，并做小口，將已備標(biāo)本種植于體內(nèi)，無菌絲線縫合即成。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述模型的建立方法，其特征是在所述步驟d中，所述小鼠直線加速器進(jìn)行全身照射，按照劑量率1戈瑞-1.5戈瑞，照射時(shí)間為2-3分鐘，照射總劑量為2戈瑞-3戈瑞。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述方法，其特征是所述步驟b的培養(yǎng)液(PMRI1640)中含有100U/ml青霉素和100U/ml鏈霉素。
全文摘要
人免疫功能重建鼠子宮內(nèi)膜異位癥模型及建模方法，其特征是將早孕人外周血單個核細(xì)胞輸入非肥胖性糖尿病嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷小鼠體內(nèi)，重建人的免疫功能；將同一人蛻膜組織種植在所述小鼠體內(nèi)建立的人免疫功能重建鼠子宮內(nèi)膜異位癥模型。建模方法的特征是外周血和蛻膜皆取自同一行人工流產(chǎn)術(shù)的婦女，婦檢證實(shí)無先兆流產(chǎn)征象，術(shù)后見明顯絨毛，蛻膜組織新鮮；將外周血單個核細(xì)胞輸入小鼠體內(nèi)，蛻膜接種在小鼠腹部皮下，無菌絲線縫合即成；本發(fā)明NOD－SCID小鼠具有人的免疫功能，移植后的組織仍保持子宮內(nèi)膜的組織形態(tài)，模型性狀顯著且穩(wěn)定，觀察周期短，實(shí)驗(yàn)結(jié)果具有較大的臨床參考意義。
文檔編號G09B23/00GK1648966SQ20051003768
公開日2005年8月3日 申請日期2005年1月10日 優(yōu)先權(quán)日2005年1月10日
發(fā)明者凌斌, 王群華, 陳崢崢, 趙衛(wèi)東, 祝懷平, 周穎, 沈國棟, 許恬怡, 姚鳳球, 朱園園, 陳敏 申請人:安徽省立醫(yī)院