巨大芽孢桿菌及其應用、微生物降解劑及其制備方法和應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及微生物領域，具體涉及巨大芽孢桿菌及其應用、微生物降解劑及其制備方法和應用，其中巨大芽孢桿菌為巨大芽孢桿菌TDB-2（ Bacillusmegaterium TDB-2），保藏編號為CCTCC NO：M 2012352，可應用于三唑磷的降解；微生物降解劑以巨大芽孢桿菌TDB-2為活性成分，其制備方法具體包括以下步驟：將巨大芽孢桿菌TDB-2按平板培養(yǎng)法培養(yǎng)至單菌落出現；取單菌落接入種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對數生長期，得到菌液；將菌液按1～3%接種量接種到生產培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對數生長期，分裝制得微生物降解劑。本發(fā)明的巨大芽孢桿菌TDB-2可以高效降解三唑磷，具有高效、無毒、環(huán)保等優(yōu)勢。
CCTCC NO: M 2012352
2012.09.16
【專利說明】巨大芽孢桿菌及其應用、微生物降解劑及其制備方法和應用

【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及微生物【技術領域】，尤其涉及一種巨大芽孢桿菌及其在降解三唑磷中的應用，還涉及以該巨大芽孢桿菌為活性成分的微生物降解劑及其制備方法和在降解三唑磷中的應用。

【背景技術】
[0002]三唑磷是一種廣譜的中等毒性有機磷殺蟲劑，在我國廣泛的應用于糧食、油料和蔬菜的主要蟲害的防控。長期大量的使用三唑磷，不但導致農產品中三唑磷殘留，從而對人類健康造成潛在危險，而且施用的三唑磷農藥，隨雨水的沖刷等因素影響，流失到生態(tài)環(huán)境中，危害非靶標生物，進而影響整個生態(tài)環(huán)境。然而，基于我國農業(yè)生產實際，三唑磷的投入量會繼續(xù)上升。因此，如何消除三唑磷在生態(tài)環(huán)境中的殘留污染，成為一個非常重要的環(huán)境問題。
[0003]三唑磷殘留的修復技術中，最具潛力的方法是生物修復，包括植物修復和微生物修復。植物修復技術具有花費較少、對環(huán)境安全等優(yōu)點，但是，由于植物自身特點，需要合適生長條件、生長速率較低，因此，導致其修復效率較低。三唑磷微生物修復領域雖然具有較大的發(fā)展前景，但目前存在的技術難題是:降解菌資源篩選相對較少，且一些降解菌資源本身存在安全性問題，限制了三唑磷微生物修復技術的實際應用。


【發(fā)明內容】

[0004]本發(fā)明要解決的技術問題是克服現有技術的不足，提供一種生產成本低，降解效率高且生產工藝簡潔、成本低、無二次污染的巨大芽孢桿菌菌株及其在降解三唑磷中的應用，另外提供以巨大芽孢桿菌為活性成分的微生物降解劑及其制備方法和在降解三唑磷方面的應用，具有降解效率高、無二次污染等優(yōu)勢。
[0005]為解決上述技術問題，本發(fā)明提供了一種巨大芽孢桿菌，前述巨大芽孢桿菌為巨大芽孢桿菌TDB-2 {Bacillus megaterium TDB-2)，保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCC NO:M 2012352。保藏單位地址位于中國武漢大學，保藏日期為2012年9月16日，該菌株被命名為巨大芽抱桿菌TDB-2 {BadIlus mega terium TDB-2)。
[0006]作為一個總的技術構思，本發(fā)明還提供了一種以前述巨大芽孢桿菌TDB-2為活性成分的微生物降解劑。
[0007]作為一個總的技術構思，本發(fā)明還提供了一種前述微生物降解劑的制備方法，包括以下步驟:
51、將巨大芽孢桿菌TDB-2按平板培養(yǎng)法培養(yǎng)至單菌落出現；
52、取前述單菌落接入種子培養(yǎng)基中經振蕩培養(yǎng)至對數生長期，得到菌液；
53、將前述菌液按I?3%接種量接種到生產培養(yǎng)基中經振蕩培養(yǎng)至對數生長期，分裝制得微生物降解劑。
[0008]進一步的，前述微生物降解劑中巨大芽孢桿菌TDB-2的濃度為18?19 cfu/mL,優(yōu)選為 19 cfu/mL。
[0009]進一步的，前述步驟SI中前述平板培養(yǎng)法采用MSY固體培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度為30°C?35°C，振蕩速度為100?150 rpm。
[0010]進一步的，前述步驟S2中前述種子培養(yǎng)基為MSY液體培養(yǎng)基，前述培養(yǎng)溫度為30°C?35°C，振蕩速度為100?150 rpm。
[0011]進一步的，前述步驟S3中前述生產培養(yǎng)基為MSY液體培養(yǎng)基，前述培養(yǎng)溫度為30°C?35°C，振蕩速度為100?150 rpm。
[0012]進一步的，前述MSY固體培養(yǎng)基包括0.2g/L的K2HPO4、0.8g/L的KH2PO4、0.2g/L的MgS04、0.lg/L 的 CaSO4.2Η20、0.0033g/L 的 NaMoO4.2Η20、1.5g/L 的酵母膏、3g/L 的 NaCl和15g/L的瓊脂；前述MSY液體培養(yǎng)基包括0.2g/L的K2HP04、0.8 g/L的KH2P04、0.2g/L的MgS04、0.lg/L 的 CaSO4.2Η20、0.0033g/L 的 NaMoO4.2Η20、1.5g/L 的酵母膏和 3g/L 的 NaCl。
[0013]作為一個總的技術構思，本發(fā)明還提供了一種前述巨大芽孢桿菌在降解三唑磷中的應用。
[0014]作為一個總的技術構思，本發(fā)明還提供了一種前述微生物降解劑或前述制備方法制備得到的微生物降解劑在降解三唑磷中的應用。
[0015]上述制備方法的全流程時間一般為5?8天左右，培養(yǎng)結束后，菌體數量可達到2億個/ml以上。
[0016]與現有技術相比，本發(fā)明的優(yōu)點在于:
(I)本發(fā)明的巨大芽孢桿菌TDB-2，具有多種抑制病原物活性物質，是一種抑制多種作物病害、促進作物生長的益生菌，安全、無毒、環(huán)保，生產周期短、適用于工業(yè)化生產，生產成本低。
[0017](2)本發(fā)明的巨大芽孢桿菌TDB-2能夠促進作物生長、具有抑制病害以及殺蟲活性，可應用于高濃度三唑磷農藥的降解，還可用于田間作物的生產，可部分的替代農用化學品投入，在農業(yè)生產中糧食、水果、蔬菜等生產中具有廣泛的應用價值。
[0018](3)本發(fā)明的微生物降解劑，以巨大芽孢桿菌TDB-2為活性成分，可通過簡潔快速的生產工藝制備得到，高效、無毒、環(huán)保，具有生產周期短、從菌種到制劑僅需要5?8天，使用簡便，去除效果好等優(yōu)點，能夠有效用于工業(yè)廢水和農業(yè)生產中三唑磷農藥殘留的微生物修復。
[0019](4)本發(fā)明的微生物降解劑，可以降解高濃度三唑磷農藥，因此可應用于含三唑磷農藥廢水的處理，使用方便、節(jié)約勞動成本。
[0020]巨大芽孢桿菌TDB-2 {Bacillus megaterium TDB-2),保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCC NO:M 2012352。保藏單位地址位于中國武漢大學，保藏日期為2012年9月16日，該菌株被命名為巨大芽孢桿菌TDB-2 {Bacillus megaterium TDB-2)。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0021]為使本發(fā)明實施例的目的、技術方案和優(yōu)點更加清楚，下面將結合本發(fā)明實施例中的附圖，對本發(fā)明實施例中的技術方案進行清楚、完整的描述。
[0022]圖1為本發(fā)明巨大芽孢桿菌TDB-2菌株的革蘭氏染色圖。
[0023]圖2為實施例3中三唑磷標準樣品的氣象色譜圖。
[0024]圖3為實施例3中菌劑降解三唑磷效率及生物量圖。

【具體實施方式】
[0025]以下結合說明書附圖和具體優(yōu)選的實施例對本發(fā)明作進一步描述，但并不因此而限制本發(fā)明的保護范圍。
[0026]以下實施例中所采用的材料和儀器均為市售。
[0027]實施例1
一種巨大芽孢桿菌TDB-2 {Bad Ilus mega teri um TDB-2)菌株,保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(簡稱CCTCC)，保藏編號為CCTCC NO:M 2012352，保藏單位地址位于中國武漢大學，保藏日期為2012年9月16日，該菌株被命名為巨大芽孢桿菌TDB-2 {Bacillusmegaterium TDB-2)。
[0028]前述巨大芽孢桿菌TDB-2，具有以下主要特征:
G+，個體形態(tài)為桿狀，內生芽孢，不膨大，接觸酶反應陽性，能液化明膠、水解淀粉，V-P反應陰性，吲哚反應和過氧化氫酶反應陰性，葡萄糖產酸不產氣。最適生長溫度為30?35°C，最適生長pH值為7?8，16S rDNA序列長度為1442 bp，在Genbank中的登錄號為JX393073。
[0029]參見圖1，從圖1中可知巨大芽孢桿菌TDB-2的個體形態(tài)為桿狀，內生芽孢，不膨大，被革蘭氏染色液染成紫色，為革蘭氏陽性菌。
[0030]實施例1的巨大芽孢桿菌是通過以下方法篩選得到:
(1)取采自湖南省的農田灌溉溝渠中底泥，放入MSY液體培養(yǎng)基(MSY液體培養(yǎng)基組分:0.2g/L K2HPO4,0.8g/L KH2PO4,0.2g/L MgSO4,0.lg/L CaSO4.2Η20，0.0033g/L NaMoO4.2Η20，0.005g/L，酵母膏和3g/L NaCl，pH 7.1)，在35±2°C，轉速為120 rpm條件下振蕩培養(yǎng)至菌液渾濁(培養(yǎng)時間一般為16?24 h，本實施例的培養(yǎng)時間為20 h)；
(2)取步驟(I)制備得到的菌液200μ L，然后涂布到MSY固體培養(yǎng)基中(MSY固體培養(yǎng)基成分:0.2g/L K2HPO4, 0.8g/L KH2PO4,0.2g/L MgSO4,0.lg/L CaSO4.2Η20，0.0033g/LNaMoO4.2H20,1.5g/L 酵母膏，3g/L NaCl，15g/L 瓊脂，pH 值為 7.1)，在 35±2°C下倒置培養(yǎng)至菌落出現；
(3 )挑取菌落形態(tài)不同的菌，分別接種到含MSY液體培養(yǎng)基中，篩選得到巨大芽孢桿菌TDB-2。
[0031]實施例1中，MSY固體培養(yǎng)基的pH值在7.0?7.2之間均能達到相同或相似的技術效果。
[0032]實施例2
一種微生物降解劑，包括實施例1的巨大芽孢桿菌TDB-2和輔料。
[0033]微生物降解劑中巨大芽孢桿菌TDB-2的濃度一般為18?19 cfu/mL,本實施例中巨大芽孢桿菌TDB-2的濃度為19 cfu/mL,輔料為水或其他微生物降解劑中常用的輔料。
[0034]實施例2的微生物降解劑采用以下方法制備得到:
S1、將巨大芽孢桿菌TDB-2接種于MSY固體培養(yǎng)基(MSY固體培養(yǎng)基成分:0.2g/LK2HPO4,0.8g/L KH2PO4,0.2g/L MgSO4,0.lg/L CaSO4.2Η20，0.0033g/L NaMoO4.2H20,1.5g/L酵母膏，3g/L NaCl，15g/L瓊脂，pH值為7.1)，按平板培養(yǎng)法在30°C?35°C培養(yǎng)至單菌落出現。
[0035]S2、取前述單菌落接入150 mL的MSY液體培養(yǎng)基(MSY液體培養(yǎng)基組分:0.2g/L K2HPO4,0.8 g/L KH2PO4,0.2g/L MgSO4,0.lg/L CaSO4.2Η20，0.0033 g/L NaMoO4.2H20,0.005g/L，酵母膏和3g/L NaCl，pH 7.1)中以30°C?35°C振蕩培養(yǎng)至對數生長期，得到菌液；振蕩速度為150 rpm。
[0036]S3、將前述菌液按I %接種量(接種量在I?3%范圍內均能達到相同或相似的技術效果)接種到5 L的MSY液體培養(yǎng)基(MSY液體培養(yǎng)基組分:0.2g/L K2HPO4,0.8 g/LKH2PO4,0.2g/L MgSO4,0.lg/L CaSO4.2Η20，0.0033g/L NaMoO4.2Η20，0.005g/L,酵母膏和3g/L NaCl，pH 7.1)中以30°C?35°C振蕩培養(yǎng)至對數生長期，振蕩速度為150 rpm，分裝制得微生物降解劑。
[0037]上述制備方法的全流程時間一般為5?8天左右，培養(yǎng)結束后，菌體數量可達到2億個/ml以上。
[0038]實施例2僅為本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，在本發(fā)明中，振蕩速度在100?150 rpm均可實施，MSY固體培養(yǎng)基的pH值在7.0?7.2之間，MSY液體培養(yǎng)基的pH值在7.0?7.2之間，均能達到相同或相似的技術效果。
[0039]實施例3:巨大芽孢桿菌TDB-2在降解三唑磷中的應用。
[0040](I)將巨大芽孢桿菌TDB-2在MSY液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)成菌液，菌液中巨大芽孢桿菌TDB-2 的濃度為 19 cfu/mL ；
(2)將含有三唑磷的廢水添加到MSY液體培養(yǎng)基中混勻得到混合溶液，其中三唑磷的濃度為50 mg/L。將步驟(I)中制備得到的菌液按1% (v/v)接種到混合溶液中，以30°C?35°C進行振蕩培養(yǎng)(振蕩速度為150 rpm，在實際應用過程中，振蕩速度為100?150 rpm均可實施)9小時，每隔I小時取樣，用氣象色譜法(Agilent 6890N)測定三唑磷含量。
[0041]測定前用已知濃度的三唑磷標準樣品定性定量，以不加巨大芽孢桿菌TDB-2的實驗培養(yǎng)基為對照(相當于三唑磷未處理，濃度不變)。所有處理重復三次。
[0042]參見圖2，其中三唑磷在色相色譜峰圖中的特異保留時間為21.01 min，峰面積為對應標準樣品的濃度對應的峰面積；根據樣品的色相色譜峰圖中出峰的保留時間定性三唑磷，峰面積與標準樣品峰面積的比值，乘以標準樣品的濃度，即可換算得到的樣品中的三唑磷的濃度。
[0043]參見圖3，按照氣相色譜法檢測出混合液中三唑磷的含量，降解效率隨降解時間逐漸升高，當降解時間達到9 h，巨大芽孢桿菌TDB-2對50 mg/L的三唑磷降解效率為69.71%。
[0044]實施例4:微生物降解劑在降解三唑磷中的應用。
[0045]采用實施例2的微生物降解劑對含三唑磷的廢水進行處理:
將含有三唑磷的廢水添加到MSY液體培養(yǎng)基中混勻得到混合溶液，其中三唑磷的濃度為50 mg/L。將微生物降解劑按1% (v/v)接種到混合溶液中，以30°C?35°C進行振蕩培養(yǎng)(振蕩速度為150 rpm，在實際的應用過程中，振蕩速度為100?150 rpm均能實施)9小時，用氣象色譜法(Agilent 6890N)測定三唑磷含量。
[0046]測定前用已知濃度的三唑磷標準樣品定性定量，以不加巨大芽孢桿菌TDB-2的實驗培養(yǎng)基為對照(相當于三唑磷未處理，濃度不變)。所有處理重復三次。
[0047]微生物降解劑對三唑磷的降解效率為55.62%。
[0048]以上所述，僅是本發(fā)明的較佳實施例而已，并非對本發(fā)明作任何形式上的限制。雖然本發(fā)明已以較佳實施例揭示如上，然而并非用以限定本發(fā)明。任何熟悉本領域的技術人員，在不脫離本發(fā)明的精神實質和技術方案的情況下，都可利用上述揭示的方法和技術內容對本發(fā)明技術方案做出許多可能的變動和修飾，或修改為等同變化的等效實施例。因此，凡是未脫離本發(fā)明技術方案的內容，依據本發(fā)明的技術實質對以上實施例所做的任何簡單修改、等同替換、等效變化及修飾，均仍屬于本發(fā)明技術方案保護的范圍內。
【權利要求】
1.一種巨大芽孢桿菌，其特征在于，所述巨大芽孢桿菌為巨大芽孢桿菌TDB-2(.Bacillus megaterium TDB-2)，保藏編號為 CCTCC NO:M 2012352。
2.一種以權利要求1所述巨大芽孢桿菌TDB-2為活性成分的微生物降解劑。
3.—種權利要求2所述微生物降解劑的制備方法，其特征在于，包括以下步驟: 51、將巨大芽孢桿菌TDB-2按平板培養(yǎng)法培養(yǎng)至單菌落出現； 52、取所述單菌落接入種子培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)至對數生長期，得到菌液； 53、將所述菌液按1?3%接種量接種到生產培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)至對數生長期，分裝制得微生物降解劑。
4.根據權利要求3所述的制備方法，其特征在于，所述步驟S1中所述平板培養(yǎng)法采用MSY固體培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)溫度為30°C?35°C，所述MSY固體培養(yǎng)基包括0.2g/L的Κ2ΗΡ04、0.8g/L 的 ΚΗ2Ρ04、0.2g/L 的 MgS04、0.lg/L 的 CaS04.2Η20、0.0033g/L 的 NaMo04.2Η20、1.5g/L的酵母膏、3g/L的NaCl和15g/L的瓊脂。
5.根據權利要求3所述的制備方法，其特征在于，所述步驟S2中所述種子培養(yǎng)基為MSY液體培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)溫度為30°C?35°C，振蕩速度為100?150 rpm。
6.根據權利要求3所述的制備方法，其特征在于，所述步驟S3中所述生產培養(yǎng)基為MSY液體培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)溫度為30°C?35°C，振蕩速度為100?150 rpm。
7.根據權利要求5或6所述的制備方法，其特征在于，所述MSY液體培養(yǎng)基包括0.2g/L 的 Κ2ΗΡ04、0.8 g/L 的 ΚΗ2Ρ04、0.2g/L 的 MgS04、0.lg/L 的 CaS04.2Η20、0.0033g/L 的NaMo04.Η20、1.5g/L 的酵母膏和 3g/L 的 NaCl。
8.根據權利要求3至6中任一項所述的制備方法，其特征在于，所述微生物降解劑中巨大芽孢桿菌TDB-2的濃度為108?109 cfu/mL。
9.一種權利要求1所述巨大芽孢桿菌在降解三唑磷中的應用。
10.一種權利要求2所述的微生物降解劑或權利要求3至8中任一項所述制備方法制備得到的微生物降解劑在降解三唑磷中的應用。
【文檔編號】A62D101/28GK104293708SQ201410506986
【公開日】2015年1月21日 申請日期:2014年9月28日 優(yōu)先權日:2014年9月28日
【發(fā)明者】張松柏, 劉勇, 張德詠, 羅香文, 譚新球, 彭靜, 成飛雪, 程菊娥 申請人:湖南省植物保護研究所