專利名稱：芽孢桿菌gzb及其在降解環(huán)境內(nèi)分泌干擾物雙酚a中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種芽孢桿菌(XB在環(huán)保領(lǐng)域中的應(yīng)用， 特別是在生物降解礦化具有環(huán)境荷爾蒙效應(yīng)的內(nèi)分泌干擾素雙酚A中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
雙酚A(BispherK)I A，BPA)是目前已知的一種具有環(huán)境荷爾蒙效應(yīng)的酚甲烷類化合物。自90年代以來已廣泛應(yīng)用于生產(chǎn)環(huán)氧樹脂、聚碳酸酯等高分子材料及增塑劑、阻燃劑、抗氧劑、熱穩(wěn)定劑等化工產(chǎn)品。作為一種全世界生產(chǎn)量最大的化學(xué)物質(zhì)之一，其年產(chǎn)量在2003年已超過200萬噸。而作為一種內(nèi)分泌干擾物，BPA對水生動物，哺乳動物以及兩生類動物都具有一定的生物毒性。2008年10月18日加拿大聯(lián)邦政府正式宣布，決定將BPA 列入有毒物質(zhì)列表中。含有雙酚A的污染物大部分是排放到自然界的水體中，首先被吸收進入水生生物體內(nèi)，然后通過食物鏈的生物積累效應(yīng)傳入食物鏈上方的生物群體對各類生物造成廣泛的影響。因此，對環(huán)境中BPA的高效降解是控制此污染物造成的環(huán)境危害的有效途徑之一。而生物降解由于其低成本，反應(yīng)條件溫和，無二次污染的優(yōu)點被廣泛應(yīng)用于各種有害有機物的降解。據(jù)報道，目前對BPA生物降解的研究有利用鞘氨醇單胞菌(Sphingomonas bisphenolicum),假單胞菌(Pseudomonas sp.),氧化木糖無色桿菌(Achromobacter xylosoxidans)等細(xì)菌以及毛韌革菌(Stereum hirsutum)，異擔(dān)子菌(Heterobasidium insulare)，雅致小克銀漢霉菌(Cunninghamella elegans)等真菌和植物細(xì)胞錦雞兒 (Caraganachamlagu)等生物有機體作為降解制劑。但是BPA降解生成的中間代謝物也同樣具有較大的生物毒性，因此對BPA的徹底礦化才可能完全降低其對生態(tài)環(huán)境的毒害效應(yīng)， 而能夠同時微生物降解礦化BPA的芽孢桿菌尚未見報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的首要目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點與不足，提供一種芽孢桿菌GZB。本發(fā)明的另一目的在于提供所述芽孢桿菌G^在環(huán)保領(lǐng)域中的應(yīng)用，特別是在生物降解礦化具有環(huán)境荷爾蒙效應(yīng)的內(nèi)分泌干擾素雙酚A中的應(yīng)用。本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實現(xiàn)一種芽孢桿菌(Bacillus sp.)GZB, 于2010年12月13日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，保藏編號為CCTCC M 2010345。所述芽孢桿菌(Bacillus sp.)GZB具有如下的形態(tài)和生理生化特性A、采用常規(guī)的細(xì)菌生理生化鑒定方法和透射電鏡觀察，為革蘭氏陽性桿狀細(xì)菌， 菌體(0. 68 0. 66) μ mX (1. 0 2· 0) μ m，周生鞭毛；B、主要的生理生化特征兼性厭氧，具有運動性，接觸酶、氧化酶陽性，水解明膠和淀粉，吲哚試驗陰性。
所述芽孢桿菌(Bacillus sp.)GZB 的 16S rDNA 序列如 SEQ ID :Νο· 3 所示。
所述芽孢桿菌G^在環(huán)保領(lǐng)域中的應(yīng)用，特別優(yōu)選所述芽孢桿菌G^應(yīng)用于微生物降解礦化內(nèi)分泌干擾素雙酚A ；所述芽孢桿菌G^應(yīng)用于微生物降解雙酚A優(yōu)選包含以下步驟將含有雙酚A的無機鹽培養(yǎng)基PH值調(diào)為6. 5 8. 5，然后將OD6tltl值為0. 4 0. 5 (對數(shù)增長期)的芽孢桿菌G^按體積百分比10 40%的接種量添加，于25 42°C進行反應(yīng)；所述的含有雙酚A的物質(zhì)中的雙酚A濃度優(yōu)選為5 20mg/L ；所述反應(yīng)優(yōu)選為振蕩反應(yīng)條件，振蕩速度優(yōu)選為100 200rpm ；所述反應(yīng)的時間優(yōu)選為72 10他。本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術(shù)具有如下的優(yōu)點及效果(1)本發(fā)明首次從廣東省貴嶼地區(qū)土壤中篩選到具有可降解礦化雙酚A的芽孢桿菌 GZB0(2)本發(fā)明的芽孢桿菌(XB能夠降解礦化雙酚A，礦化率可達(dá)35 51%，降解率可達(dá) 90 100%。


圖1是本發(fā)明的芽孢桿菌(XB在透射電鏡下的形態(tài)圖(X 40000)。
具體實施例方式下面結(jié)合實施例及附圖對本發(fā)明作進一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實施方式不限于此。實施例1本發(fā)明所述的具有降解雙酚A能力的芽孢桿菌(XB從廣東省貴嶼鎮(zhèn)電子垃圾高風(fēng)險區(qū)的淤泥中進行分離、純化而得。其分離純化方法如下所用的馴化培養(yǎng)基為無機鹽培養(yǎng)基(g/L) (K2HPO4 4. 35，KH2PO4 1. 7，NH4NO3 2. 1，MgSO4 0. 2，MnSO4 0. 05，F(xiàn)eSO4 · 7H20 0. 01， CaCl2 ·2Η20 0. 03，ρΗ7. 0)。首先將3g污泥加入IOOml含5mg/L雙酚A的無機鹽培養(yǎng)基，37°C 馴化60天后，以體積百分比10%接種量移入含BPA 10mg/L的無機鹽培養(yǎng)基接著馴化一周， 以此類推逐步提高BPA的濃度進行馴化，BPA的使用濃度分別為20mg/L、30mg/L、40mg/L。 馴化結(jié)束后將馴化液涂布于瓊脂平板(牛肉膏3. Og/L，蛋白胨10. 0g/L,NaCl 5. Og/L，瓊脂粉20.0g/L，pH 7. 4 7. 6)上37°C培養(yǎng)48h，挑選單菌落于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基(牛肉膏 3. Og/L，蛋白胨10. Og/L, NaCl 5. 0g/L, pH 7. 4 7. 6)進行富集培養(yǎng)，然后測定降解率，選擇降解率最高的菌種進行純化。降解率的測定將培養(yǎng)18h的培養(yǎng)物以體積百分比15%的接種量接入含有5mg/L BPA的無機鹽培養(yǎng)基中，在37°C，pH 7. 0的條件下在150rpm的搖床反應(yīng)108h，定時取樣通過高效液相色譜法測定降解率。降解率=(初始濃度-終濃度)/初始濃度。高效液相色譜法用以測定BPA的濃度液相色譜條件為80% ν/ν甲醇、18% ν/ν 水、2% ν/ν乙酸，流速為lml/min，BPA的檢測波長為230nm。通過氣相色譜法來測定礦化產(chǎn)物(X)2的生成量以測定BPA的礦化率。將純化得到的菌落進行鑒定，鑒定結(jié)果如下
(1)菌體的形態(tài)特性A、采用常規(guī)的細(xì)菌生理生化鑒定方法和電子顯微鏡觀察，為革蘭氏陽性桿狀細(xì)菌，菌體(0. 68 0. 66) μ mX (1. 0 2· 0) μ m，周生鞭毛；B、主要的生理生化特征兼性厭氧，具有運動性，接觸酶、氧化酶陽性，水解明膠和淀粉，吲哚試驗陰性。(2)采用DNA提取方法提取細(xì)菌總DNA。采用細(xì)菌的16S rDNA通用引物上游引物 F27(5，-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3，)，下游引物 R1522(5，-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3，)擴增其16S rDNA基因。PCR 擴增體系總體積為 50 μ L 超純水 37. 5 μ L, 10XPCR Buffer 5 μ L，2. 5mmol/ L dNTP 4 μ L, 10 μ mol/L 上游弓 | 物 1 μ L，10 μ mol/L 下游弓 I 物 1 μ L，5U/ μ LTaq DNA Polymerase 0.5 μ L0另用超純水代替模板DNA進行空白試驗。PCR反應(yīng)30個循環(huán)，94. 0°C 變性^iin后進入循環(huán)94°C變性60s，55°C退火60s，72°C延伸1. 5min。30個循環(huán)后延伸 IOmin0 PCR產(chǎn)物直接測序，結(jié)果如下(SEQ ID =No. 3)GACCGGGCGGGCGTGCTAAATACATGCAAGTCGAGCGGACAGATGGGAGCTTGCTCCCTGATGTTAGCG GCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGAT GGTTGTTTGAACCGCATGGTTCAGACATAAAAGGTGGCTTCGGCTACCACTTACAGATGGACCCGCGGCGCATTAGC TAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCAACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGA GACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCG CGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTGCCGTTCAAATAGGGCGGCACC TTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTC CGGAATTATTGGGCGTAAAGGGCTCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGG TCATTGGAAACTGGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGT GGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGG ATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGGGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCTGCAGC TAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAG CGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACAATCCTAGAGA TAGGACGTCCCCTTCGGGGGCAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAA GTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAA CCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACAGAA CAAAGGGCAGCGAAACCGCGAGGTTAAGCCAATCCCACAAATCTGTTCTCAGTTCGGATCGCAGTCTGCAACTCGAC TGCGTGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGC CCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCCGAAGTCGGTGAGGTAACCTTTATGGAGCCAGCCGCCGAAGGGTGGACA AGGAGGGGG由以上菌株長1464bp的16S rRNA基因序列與GenBank中已登錄的基因序列進行比對后用鄰接法(Neighbor-Joining)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，可知該菌株與芽孢桿菌Bacillus, sp BSFA3-1在一個分支，系統(tǒng)位置最接近。根據(jù)16S rRNA同源性分析可以判斷該菌種為芽孢桿菌屬(Bacillus sp.)的一個變種。綜合上述的生理生化特性、16S rRNA基因序列測定結(jié)果，本發(fā)明所篩選的細(xì)菌應(yīng)歸屬芽孢桿菌屬(Bacillus sp.)，且為該屬的一個變種，命名為芽孢桿菌(Bacillus sp.)GZB，于2010年12月13日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，保藏編號為CCTCC M 2010345。實施例2將芽孢桿菌(XB單菌落接種于3ml牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中培養(yǎng)18h的培養(yǎng)物 (OD600為0. 45)以體積百分比20%的接種量接入BPA濃度為5mg/L、pH值為8. 0的無機鹽培養(yǎng)基中，在37°C，150rpm的搖床反應(yīng)96h，通過高效液相色譜法測定降解率以及通過氣相色譜法測定BPA礦化率。降解率的測定同實施例1。通過礦化產(chǎn)物CO2的生成量取樣檢測BPA 礦化率。CO2生成量采用氣相色譜法測定釋放到空氣中的濃度，由亨利定律計算出液體中的含量，兩項加和后即為實際生成量。檢測條件進樣口溫度180°C，檢測器溫度230°C，柱溫:150°Co空氣流速:300ml/min,H2流速:30ml/min，N2流速:120ml/min。檢測結(jié)果為降解率為100%，礦化率為51%。實施例3將芽孢桿菌(XB單菌落接種于3ml牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中培養(yǎng)1 的培養(yǎng)物以體積百分比40%的接種量接入BPA濃度為20mg/L、pH值為7. 0的無機鹽培養(yǎng)基中，在25°C， 200rpm的搖床反應(yīng)10他，通過高效液相色譜法測定降解率以及通過氣相色譜法測定BPA礦化率，測定方法同上。檢測結(jié)果為降解率為90%，礦化率為35%。實施例4將芽孢桿菌(XB單菌落接種于3ml牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中培養(yǎng)1 的培養(yǎng)物以體積百分比30%的接種量接入BPA濃度為10mg/L、pH值為6. 5的無機鹽培養(yǎng)基中，在42°C， IOOrpm的搖床反應(yīng)72h，通過高效液相色譜法測定降解率以及通過氣相色譜法測定BPA礦化率，測定方法同上。檢測結(jié)果為降解率為100%，礦化率為45%。實施例5將芽孢桿菌(XB單菌落接種于3ml牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中培養(yǎng)1 的培養(yǎng)物以體積百分比10%的接種量接入BPA濃度為5mg/L、pH值為7. 5的無機鹽培養(yǎng)基中，在35°C， 150rpm的搖床反應(yīng)96h，通過高效液相色譜法測定降解率以及通過氣相色譜法測定BPA礦化率，測定方法同上。檢測結(jié)果為降解率為95%，礦化率為43%。上述實施例為本發(fā)明較佳的實施方式，但本發(fā)明的實施方式并不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化， 均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種芽孢桿菌(Bacillus sp.)GZB，于2010年12月13日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCC M 2010345。
2.權(quán)利要求1所述的芽孢桿菌G^在環(huán)保領(lǐng)域中的應(yīng)用。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的芽孢桿菌(XB在環(huán)保領(lǐng)域中的應(yīng)用，其特征在于所述芽孢桿菌G^應(yīng)用于生物降解礦化內(nèi)分泌干擾素雙酚A。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的芽孢桿菌G^在環(huán)保領(lǐng)域中的應(yīng)用，其特征在于包含以下步驟將含有雙酚A的無機鹽培養(yǎng)基pH值調(diào)為6. 5 8. 5，然后將OD6tltl值為0. 4 0. 5的芽孢桿菌G^按體積百分比10 40%的接種量添加，于25 42°C進行反應(yīng)。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的芽孢桿菌(XB在環(huán)保領(lǐng)域中的應(yīng)用，其特征在于所述含有雙酚A的無機鹽培養(yǎng)基中雙酚A的濃度為5 20mg/L。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的芽孢桿菌(XB在環(huán)保領(lǐng)域中的應(yīng)用，其特征在于所述的反應(yīng)為振蕩反應(yīng)。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的芽孢桿菌(XB在環(huán)保領(lǐng)域中的應(yīng)用，其特征在于所述的振蕩反應(yīng)的振蕩速度為100 200rpm。
8.根據(jù)權(quán)利要求4所述的芽孢桿菌(XB在環(huán)保領(lǐng)域中的應(yīng)用，其特征在于所述反應(yīng)的時間為72 108ho
全文摘要
本發(fā)明提供了一種具有雙酚A降解礦化能力的芽孢桿菌，該菌種從廣東貴嶼鎮(zhèn)電子垃圾高風(fēng)險區(qū)的污泥進行分離、純化獲得，為芽孢桿菌屬的一個變種，命名為芽孢桿菌(Bacillus sp.)GZB，并于2010年12月13日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCC NOM 2010345。該菌種具有能夠降解礦化雙酚A的能力，礦化率可達(dá)35～51％，降解率可達(dá)90～100％，可將其應(yīng)用于生物降解礦化具有環(huán)境荷爾蒙效應(yīng)的內(nèi)分泌干擾素雙酚A。
文檔編號A62D3/02GK102168050SQ20111002549
公開日2011年8月31日 申請日期2011年1月24日 優(yōu)先權(quán)日2011年1月24日
發(fā)明者安太成, 李桂英, 祖蕾 申請人:中國科學(xué)院廣州地球化學(xué)研究所