專利名稱：一株馬紅球菌及其在石油微生物增產(chǎn)上的應用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及原油烴類物質(zhì)降解，具體地說是一株馬紅球菌及其在石油微生物增產(chǎn) 上的應用，利用馬紅球菌的菌株降解原油中烴類物質(zhì)生產(chǎn)糖脂類生物表面活性劑的方法。
背景技術(shù)：
近年來，在石油的大規(guī)模開采、加工及運輸過程中，全世界每年有近千萬噸原 油作為污染物進入環(huán)境，污染水體、土壤和大氣。石油污染已經(jīng)成為世界性主要公害之 一。生物降解是自然界消除這類污染物的一個重要途徑。據(jù)統(tǒng)計，迄今為止，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)能 夠降解石油的微生物有200多種，其中細菌有假單胞菌屬(Pseudomonas sp.)、棒桿菌屬 (Corynebacteium sp.)、微球菌屬(Micrococcus sp.)、產(chǎn)喊桿菌屬(Alcaligenes sp.)等。 微生物產(chǎn)生表面活性劑是其代謝原油的機制之一。生物表面活性劑具有乳化原油、可生物 降解的優(yōu)點，在原油污染土壤的修復中具有很高的應用價值，所以高效產(chǎn)表面活性劑并且 降解原油的菌株的篩選已經(jīng)引起了國內(nèi)外學者的廣泛關(guān)注。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及一種利用馬紅球菌的菌株降解原油烴類物質(zhì)生產(chǎn)糖脂類生物表面活 性劑的方法，具體實施方案為一株馬紅球菌，為馬紅球菌BS001，分類命名馬紅球菌Rhodococcus equi.，保藏 于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3 號中國科學院微生物研究所，保藏編號CGMCC No3885，保藏日期2010年06月01日，其對 原油中烴類具有降解能力，且可代謝產(chǎn)生糖脂類生物表面活性劑。所用菌株為馬紅球菌，菌 株來源為由采自大慶油田石油污染土壤樣品中富集篩選所得。1)種子液的制備采用富集培養(yǎng)基對馬紅球菌進行富集培養(yǎng)，培養(yǎng)基配方為蛋 白胨 5-15g/L，酵母粉 2-8g/L，NaCl 2_8g/L，pH 值 6. 0-8. O ；培養(yǎng)溫度為 30-60°C ；2)發(fā)酵液的制備將富集得到的馬紅球菌發(fā)酵液轉(zhuǎn)接入原油培養(yǎng)基中進行培 養(yǎng)，原油培養(yǎng)基配方為=NH4Cl l_5g/L，K2HP04l-3g/L，KH2P04l_5g/L，CaCl2O. 1-lg/L，原油 0. 5-5g/L;培養(yǎng)溫度為30-60°C，培養(yǎng)時間為3-10天，搖床轉(zhuǎn)速為100_200rpm，接種量為 3-10% ；3)烴降解效果的分析利用氣相色譜法對原油降解效果進行分析，所用氣相色譜 為，條件為100°C恒溫2min，以升溫速率為4°C /min升溫到300°C，然后再恒溫20min，載氣 N2 流速 l-2mL/min，H2 流速 35mL/min，空氣流 400mL/min，尾吹氣(N2)流速 26mL/min。4)生物表面活性劑的制備將上述發(fā)酵液用氯仿和甲醇(2 1 3.5 1)作為 萃取劑，按照發(fā)酵液萃取劑=3 1 4 1的比例對發(fā)酵液進行萃取，連續(xù)萃取3次合 并有機相，50°C條件下減壓蒸干得到棕黃色粉末狀物體，即為表面活性劑粗品。將上述表面活性劑粗品采用傅立葉紅外光譜儀和質(zhì)譜進行分析，傅立葉紅外光譜 儀采用德國布魯克光譜儀器公司生產(chǎn)TENS0R27傅立葉紅外光譜儀。
液質(zhì)聯(lián)用采用=HPllOO型液質(zhì)聯(lián)用儀，A相純水，B相乙腈，A/B = 90/10，維持3分 鐘，達到33分鐘時A/B達到10/90，達到63分鐘時，A/B達到0/100，達到73分鐘停止。C18 色譜柱，檢測波長254nm。質(zhì)譜為電噴霧離子源，單四級桿質(zhì)量分析器，運行參數(shù)是干燥氣 流速(drying gas) 8L/min,霧化室壓力(nebulizer pressure) 40psig,干燥氣溫度(drying gas temperature) 350°C，毛細管電壓(capillary voltage) 3000v，源內(nèi) CID 電壓 70v，掃描 范圍 190-1000atmu。特征離子ES(-) [M_H]_[M+C1]。


圖1菌株BS001系統(tǒng)進化樹；圖2菌株BS001發(fā)酵液表面張力與其生長狀態(tài)關(guān)系；圖3菌株BS001產(chǎn)生物表面活性劑紅外光譜圖；圖4表面活性劑高效液相圖(其中黃色紅色為鼠李糖脂標準品，綠色為菌株BS001 產(chǎn)表面活性劑)；圖5菌株BS001原油石蠟降解效率與其生長狀態(tài)關(guān)系；圖6菌株BS001處理前后原油全烴掃描圖譜。馬紅球菌BS001，分類命名馬紅球菌Rhodococcus equi.，保藏于中國微生物菌 種保藏管理委員會普通微生物中心，地址北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中國科學院微 生物研究所，保藏編號CGMCC No3885，保藏日期2010年06月01日，其對原油烴類物質(zhì)具 有降解能力，且可代謝產(chǎn)生糖脂類生物表面活性劑。
具體實施例方式實施例1 本發(fā)明從油田原油污染樣品篩選到一種產(chǎn)糖脂類表面活性劑的菌種， 通過實驗室鑒定純菌株和產(chǎn)糖脂表征。是通過以下方式實現(xiàn)的1.以LB培養(yǎng)基(蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 5g/L，pH值7. 0-7. 2)為富集 培養(yǎng)基，對樣品中馬紅球菌進行富集。以平板劃線法進行多次的劃線分離直至電鏡掃描觀 察為純菌株，16S rDNA測序分析委托Takara (大連)公司。利用NCBI基因序列數(shù)據(jù)庫做 BLAST序列對比分析，選取同源性較高的序列采用Mega4軟件按照鄰位連接法構(gòu)建系統(tǒng)進 化樹(如圖1所示)。菌株為馬紅球菌BS001，分類命名馬紅球菌Rhodococcus equi.，保藏于中國微 生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中國科 學院微生物研究所，保藏編號CGMCCNo3885，保藏日期2010年06月01日，其對原油烴類具 有降解能力，且可代謝產(chǎn)生糖脂類生物表面活性劑。2.分別將菌株BS001置于不同溫度、礦化度和pH值條件下進行培養(yǎng)，觀察菌株生 長最佳條件。經(jīng)優(yōu)化菌株BS001耐受pH范圍為4. 0 9. 0，溫度40 55°C，礦化度0. 8% ；最佳生長條件為溫度40°C，pH = 7. 0，礦化度2% ；表面張力最低為29. 3mN/m。3.菌株BS001的具體發(fā)酵過程按培養(yǎng)基質(zhì)量的3_10%接種，發(fā)酵培養(yǎng)基配方為 NH4Cl l-5g/L，K2HPO4 1-3g/L，KH2PO4 l_5g/L，CaCl2O. 1-lg/L，原油 0. 5_5g/L。培養(yǎng)溫度為 30-60°C，培養(yǎng)時間為3-10天，搖床轉(zhuǎn)速為100-200rpm，得發(fā)酵液。發(fā)酵完成后測定發(fā)酵液的表面張力從61. OmN/m下降到30. lmN/m。取BS001發(fā)酵
4液SOOOrpm，離心20min除去菌體，氯仿和甲醇(2 1 3. 5 1)作為萃取劑，按照發(fā)酵 液萃取劑=3 1 4 1的比例對發(fā)酵液進行萃取，連續(xù)萃取3次合并有機相，50°C條 件下減壓蒸干得到棕黃色粉末狀物體，即為表面活性劑粗品。通過紅外光譜質(zhì)譜分析，初步 判定產(chǎn)生的生物表面活性劑為糖脂類化合物。如圖2-4所示圖2菌株BS001發(fā)酵液表面張力與其生長狀態(tài)關(guān)系；圖3菌株 BS001產(chǎn)生物表面活性劑紅外光譜圖；圖4表面活性劑高效液相圖(其中黃色紅色為鼠李 糖脂標準品，綠色為菌株BS001產(chǎn)表面活性劑)；通過紅外及液質(zhì)聯(lián)用表征，確定篩選得到的紅球菌所產(chǎn)菌株為鼠李糖脂類表面活 性劑。發(fā)酵液表面張力最低能從73mN/m降低到29左右mN/m。實施例2 將篩選得到能夠降解原油和石蠟的菌株BS001，用正十二烷為特征碳源 考察其對原油中烴類的降解率；用原油和石蠟為碳源考察其降解率和時間的關(guān)系。實驗室 是通過以下方案實現(xiàn)的1.配置以正十二烷為單獨碳源的培養(yǎng)基，配方如下正十二烷 3% ； NH4N032g/L ；K2HPO4 1. 5g/L ；KH2P043g/L ；CaCl2O. lg/L ；MgSO4O. lg/L, pH 值調(diào)至 6. 0-8. 0， 121 °C高壓滅菌20min。按培養(yǎng)基質(zhì)量的 5%接種量接種實施例1中篩選得到菌株BS001種子液，具 體組成為，蛋白胨5-15g/L，酵母粉2-8g/L，NaCl 2_8g/L，pH值6. 0-8. 0 ；發(fā)酵條件為溫度 30 37°C，轉(zhuǎn)速150 200rpm，時間36 48h，搖床好氧發(fā)酵。發(fā)酵完成后用分光光度法 測定正十二烷降解率為46. 2%。通過實驗可以看出其對以正十二烷為代表的正構(gòu)烷烴的降解率達到46. 2%，表明 其對正構(gòu)烷烴有很好的降解率。2.配置以原油或石蠟為單獨碳源的培養(yǎng)基，配方如下原油或石蠟 3% ； NH4N032g/L ；K2HPO4L 5g/L ；KH2P043g/L ；CaCl2O. lg/L ；MgSO4O. lg/L, pH 值調(diào)至 6. 0-8. 0， 121 °C高壓滅菌20min。按培養(yǎng)基質(zhì)量的 5%接種量接種實施例1中篩選得到菌株BS001，發(fā)酵條件 為溫度30 37°C，轉(zhuǎn)速150 200rpm，時間36 48h，搖床好氧發(fā)酵。發(fā)酵完成后用分 光光度法測定降解率，用其發(fā)酵液0D_表征其菌體生長情況。如圖5所示，圖5菌株BS001原油石蠟降解效率與其生長狀態(tài)關(guān)系；通過實驗可以看出，菌株對原油降解率達到60 %左右，對石蠟降解率達到37 %， 且原油降解集中在菌株生長對數(shù)期，石蠟降解集中在菌株穩(wěn)定期。菌株對原油和石蠟降解 均有一定的效果。實施例3 篩選得到能夠廣泛降解原油中各正構(gòu)烷烴的純菌株。實驗室是通過以 下方案實現(xiàn)的配置以原油為單獨碳源的培養(yǎng)基，配方如下原油1 % 3% ；NH4N032g/L ； K2HPO4L 5g/L ；KH2P043g/L ；CaCl2O. lg/L ；MgSO4O. lg/L, pH 值調(diào)至 6. 0-8. 0，121°C 高壓滅菌 20mino按培養(yǎng)基質(zhì)量的 5%接種量接種實施例1中篩選得到菌株BS001種子液，具 體組成為，蛋白胨5-15g/L，酵母粉2-8g/L，NaCl 2_8g/L，pH值6. 0-8. 0 ；發(fā)酵條件為溫度 30 37°C，轉(zhuǎn)速150 200rpm，時間36 48h，搖床好氧發(fā)酵。發(fā)酵完成后用正己烷萃取降解后發(fā)酵液中的殘余原油，根據(jù)《SY-T 5779-1995原油全烴氣相色譜分析方法》中的方法 用氣相色譜對其做全烴組分的掃描，以正常原油為對照。從氣相色譜圖(如圖6所示)可以看出，從正庚烷到正二十四烷均有很好的降解 效果，原油中的正庚烷到正十二烷降解率達到95%以上。可以看出其對原油各組分的正構(gòu) 烷烴均有很好的降解效果。本發(fā)明中篩選到的馬紅球菌能夠降解原油和石蠟且能產(chǎn)鼠李糖脂類的表面活性 劑原油降解率可以達到60%，固體石蠟降解率可以達到30%，其代謝產(chǎn)生的糖脂類生物表 面活性劑，可使發(fā)酵液的表面張力降低到30mN/m以下。該菌株在微生物采油領(lǐng)域中有很好 的利用前景。
權(quán)利要求
一株馬紅球菌，所采用的菌種為馬紅球菌BS001，分類命名馬紅球菌Rhodococcus equi.，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所，保藏編號CGMCC 3885，保藏日期2010年06月01日。
2.—種權(quán)利要求1所述馬紅球菌在石油微生物增產(chǎn)上的應用，其特征在于所述馬紅 球菌BS001對原油中烴類物質(zhì)具有降解能力，且可代謝產(chǎn)生糖脂類生物表面活性劑。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應用，其特征在于所述馬紅球菌可采用的富集培養(yǎng)基組成為蛋白胨5-15g/L，酵母粉2-8g/L，NaCl 2-8g/L，pH 值 6. 0-8. 0 ；培養(yǎng)溫度為 30-60°C。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應用，其特征在于所述利用馬紅球菌降解原油烴類物質(zhì)的方法為采用原油培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度為 30-60°C，培養(yǎng)時間為3-10天，搖床轉(zhuǎn)速為100-200rpm，接種量為3-10%。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應用，其特征在于所述利用馬紅球菌生產(chǎn)生物表面活性劑的方法為采用原油培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度為 40-55°C，培養(yǎng)時間為1-3天，搖床轉(zhuǎn)速為100-200rpm，接種量為3-10% ；培養(yǎng)后體系中生物表面活性劑的分離采用有機溶劑萃取法。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于采用有機溶劑萃取法，具體操作步驟為使用體積比2 1 3.5 1的氯仿和甲醇作 為萃取劑，按照發(fā)酵液萃取劑=3 1 4 1的體積比例對發(fā)酵液進行萃取，連續(xù)萃取 2-3次，合并有機相，50°C條件下減壓蒸干得到棕黃色粉末狀物體，即為表面活性劑粗品。
7.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的方法，其特征在于所述原油培養(yǎng)基組分為=NH4Cl l_5g/L，K2HP04l-3g/L，KH2P04l_5g/L，CaCl2O. 1-lg/L， 原油 0. 5-5g/L。
全文摘要
一株馬紅球菌及其在石油微生物增產(chǎn)上的應用。公開了一種利用馬紅球菌降解原油烴類物質(zhì)及生產(chǎn)生物表面活性劑的方法，其特征在于，利用馬紅球菌對原油中烴類物質(zhì)進行降解，原油降解率可以達到60％，固體石蠟降解率可以達到30％，其代謝產(chǎn)生的糖脂類生物表面活性劑，可使發(fā)酵液的表面張力降低到30mN/m以下。
文檔編號A62D3/02GK101935630SQ20101021598
公開日2011年1月5日 申請日期2010年7月2日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月2日
發(fā)明者付步飛, 劉文靜, 劉潤海, 劉瀅, 杜國豐, 楊平, 梅曉丹, 王平, 趙靜, 陳琛 申請人:大連百奧泰科技有限公司